Summary
Apresenta-se aqui um procedimento cirúrgico para ligadura permanente da artéria coronária esquerda em camundongos. Este modelo pode ser utilizado para investigar a fisiopatologia e a resposta inflamatória associada após o infarto do miocárdio.
Abstract
A doença isquêmica do coração e o subsequente infarto do miocárdio (IM) são uma das principais causas de mortalidade nos Estados Unidos e em todo o mundo. A fim de explorar as alterações fisiopatológicas após o infarto do miocárdio e projetar tratamentos futuros, são necessários modelos de pesquisa de IAM. A ligadura permanente da artéria coronária esquerda (ACL) em camundongos é um modelo popular para investigar a função cardíaca e o remodelamento ventricular pós-IAM. Aqui descrevemos um modelo de IM murino cirúrgico menos invasivo, confiável e reprodutível por ligadura permanente da ACV. Nosso modelo cirúrgico é composto por anestesia geral facilmente reversível, intubação endotraqueal que não requer traqueostomia e toracotomia. A eletrocardiografia e a medição da troponina devem ser realizadas para garantir o IAM. A ecocardiografia no dia 28 após o IM discernirá a função cardíaca e os parâmetros de insuficiência cardíaca. O grau de fibrose cardíaca pode ser avaliado pela coloração tricrômica e ressonância nuclear magnética (RNM) cardíaca. Este modelo de IM é útil para estudar as alterações fisiopatológicas e imunológicas após o IM.
Introduction
A doença cardiovascular é uma grande preocupação de saúde pública que ceifa 17,9 milhões de vidas a cada ano, representando 31% da mortalidade global1. O tipo de anomalia cardiovascular mais prevalente é a doença coronariana, sendo o infarto do miocárdio (IM) uma das principais manifestações da doença coronariana2. O IAM geralmente é causado por oclusão trombótica de uma artéria coronária devido à ruptura de uma placa vulnerável3. A isquemia resultante causa profundas alterações iônicas e metabólicas no miocárdio afetado, bem como uma rápida diminuição da função sistólica. O IAM resulta na morte de cardiomiócitos, o que pode levar ainda mais à disfunção ventricular e insuficiência cardíaca4.
A pesquisa sobre IM em pacientes é limitada devido à escassez de tecidos obtidos de pacientes com IM5. Como tal, os modelos murinos de IAM são úteis tanto no estudo dos mecanismos da doença quanto no desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos. Os modelos murinos atualmente disponíveis de IM incluem modelos de isquemia irreversível (LCA e métodos de ablação) e modelos de reperfusão (isquemia/reperfusão, I/R)6. A ligadura permanente da artéria coronária esquerda (ACV) em camundongos é o método mais utilizado, e imita a fisiopatologia e a imunologia do IAM em pacientes 7,8,9. O IAM permanente também pode ser induzido por métodos de ablação, que envolvem danos elétricos ou criolesão. Os métodos de ablação são capazes de gerar infarto de tamanho uniforme no local exato10. Por outro lado, a formação de cicatrizes, a morfologia do infarto e os mecanismos de sinalização molecular podem variar entre os métodos de ablação10,11. O método de I/R murino é outro importante modelo de IM, pois representa o cenário clínico da terapia de reperfusão12. O modelo de I/R está associado a desafios como tamanho variável do infarto, dificuldade em distinguir respostas da lesão inicial e reperfusão6.
Embora amplamente utilizados, os métodos de ligadura LCA estão associados a baixas taxas de sobrevida e dor pós-operatória13. Este protocolo demonstra o modelo de IM cirúrgico murino de ligadura LCA que envolve o preparo e intubação de camundongos, ligadura LCA, cuidados pós-operatórios e validação de IM. Em vez de usar uma traqueostomia invasiva14, este método emprega a intubação endotraqueal. O animal é entubado iluminando a orofaringe com laringoscópio, tornando o procedimento mais fácil, seguro e menos traumático15. O rato é mantido em suporte ventilatório e sob anestesia com isoflurano durante todo o procedimento. Além disso, a ecocardiografia e a coloração tricrômica de Masson são realizadas para avaliar a função cardíaca e a fibrose cardíaca após o infarto do miocárdio, respectivamente. No geral, este método fornece um modelo murino cirúrgico confiável e reprodutível de IAM que pode ser usado para estudar a fisiopatologia e a inflamação após o IAM.
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Protocol
O protocolo do presente estudo foi revisado e aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Pittsburgh. Oito (sham n = 4 e MI n = 4) fêmeas de 1 ano de idade de camundongos C57BL/6J pesando 24-30 g foram utilizados para esses experimentos. Aproximadamente 100% e pelo menos 80% dos camundongos sobreviveram nos primeiros 24 h e 28 dias, respectivamente.
1. Preparação e intubação endotraqueal dos camundongos
- Pré-aqueça um esterilizador de contas (ver Tabela de Materiais) a 250 °C e coloque instrumentos cirúrgicos autoclavados nele por alguns minutos.
- Anestesiar o rato numa câmara de indução com isoflurano a 3% e 1 L/min de oxigénio durante 5 min.
- Garanta a profundidade da anestesia no rato, verificando a resposta a uma beliscão firme do dedo do pé.
- Pesar o rato para estimar a dosagem do medicamento analgésico pré-operatório, buprenorfina (0,1 mg/kg). Injete a droga por via intraperitonial.
- Apare a pele no lado esquerdo do tórax usando uma navalha elétrica.
- Desinfete o local cirúrgico com iodopovidona e etanol a 70% em seguida, três vezes.
- Coloque o rato na posição supina sobre uma prancha inclinada. Prenda a cabeça e os membros do rato usando um elástico preso aos incisivos superiores e fita adesiva, respectivamente. Aplique lubrificante oftálmico estéril nos olhos para evitar a secura durante a anestesia.
- Abra a mandíbula e puxe suavemente a língua para fora da cavidade oral.
- Identifique a abertura da laringe iluminando a orofaringe usando um laringoscópio (ver Tabela de Materiais).
- Corte cerca de 0,5 cm de uma agulha de cateter 24 G e insira a agulha contundente no escudo de plástico. Direcione a agulha contundente com o escudo de plástico para a traqueia. Retire a agulha, deixando o escudo de plástico na traqueia.
- Ajuste o ventilador (ver Tabela de Materiais) para uma frequência respiratória de 137 batimentos por minuto (otimizado para os ratos utilizados neste estudo) e volume corrente de 0,18 cc. Conecte os tubos do respirador ao escudo do cateter e confirme a intubação correta procurando um movimento torácico sincronizado com o ventilador.
- Desconecte o tubo do respirador do escudo do cateter e coloque o animal na posição supina em uma placa cirúrgica pré-aquecida com temperatura controlada. Reconecte o mouse ao ventilador.
2. Ligadura permanente da artéria coronária esquerda
- Desinfetar o local cirúrgico com iodopovidona e álcool a 70%. Aplique uma cortina estéril com um orifício de um quarto de tamanho no centro para proteger o local cirúrgico. Levante suavemente a pele usando um par de pinças e faça uma pequena incisão transversal cutânea (1,5-2 cm) ao longo da linha entre os músculos peitoral maior e menor esquerdo usando um par de tesouras cirúrgicas.
NOTA: Tesouras foram usadas para fazer a incisão, pois fornece o controle necessário sobre a profundidade e a direção do corte. - Separe os músculos peitorais subjacentes com fórceps e tesouras dissecadas. Os músculos foram separados por meio de afastadores presos a elásticos.
- Faça uma incisão no terceiro espaço intercostal com um par de micro tesouras seguindo o ângulo natural da caixa torácica. Nesta fase, extrema cautela deve ser exercida para evitar lesões no coração e nos pulmões.
- Estique suavemente as costelas usando afastadores para expor o ventrículo esquerdo. Mova a gordura pericárdica para o lado e localize a ACV, que vai da borda do átrio esquerdo em direção ao ápice do coração.
- Passe um 8-0 sutura de nylon sob a ACV com a ajuda de um suporte de agulha. Ligue a ACV com um nó duplo seguido por um segundo nó (nó de um cirurgião modificado).
NOTA: O branqueamento do ventrículo inferior esquerdo confirma uma ligadura LCA bem-sucedida. Além disso, a medição de troponina, a monitorização por ECG (supradesnivelamento do segmento ST), a ressonância nuclear magnética (RNM) eco/in vivo com gma cardíaca ou imagens de microtomografia computadorizada (TC) também são aconselhadas para confirmar as lesões comparáveis do IAM. - Remova os afastadores e insira uma agulha de cateter 22 G na cavidade torácica. Remova a agulha, deixando a ponta do escudo de plástico na cavidade torácica. Feche a caixa torácica usando uma sutura de nylon 4-0.
- Ligue uma seringa ao escudo de plástico 22 G e remova lentamente o excesso de ar preso na cavidade torácica, pressionando suavemente o peito para estabelecer uma pressão de ar negativa. Remova o escudo de plástico.
- Feche a pele com uma sutura de nylon 4-0.
- Desligue o fornecimento de isoflurano. Nesta fase, o rato está no ventilador que fornece oxigénio.
3. Cuidados pós-operatórios
- Desligue o ventilador assim que a respiração espontânea começar.
NOTA: O procedimento leva cerca de 30-35 min por animal desde a preparação dos ratos até esta etapa. - Mantenha o mouse sob uma lâmpada de calor e monitore-o até que esteja acordado. O animal não deve ser deixado sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
- Após a cirurgia, coloque o animal em uma gaiola separada e devolva-o à gaiola original com outros animais somente depois de se recuperar totalmente.
- Monitore o mouse diariamente para qualquer sinal de dor ou desconforto.
- Continue a injeção intraperitoneal de buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 6-8 horas por mais 2 dias após a cirurgia.
4. Avaliação Ecocardiográfica
NOTA: A ecocardiografia foi realizada para avaliar os parâmetros de insuficiência cardíaca no dia 28 após o IM.
- Após 28 dias após a cirurgia, anestesiar os ratos com isoflurano a 3% e oxigênio a 1 L/min, aplicar lubrificante oftálmico estéril nos olhos e remover os pelos do peito usando creme de depilação. Desinfete a área do tórax com iodopovidona e etanol a 70% três vezes.
- Fixe os ratos anestesiados sobre a plataforma de imagem (ver Tabela de Materiais) na posição supina e mantenha um nível constante de anestesia durante todo o procedimento usando um cone nasal conectado ao sistema anestésico (1%-2% de isoflurano e 1 L/min de oxigênio).
- Cole as quatro patas aos eléctrodos de ECG com gel de eléctrodos (ver Tabela de Materiais). Monitore a temperatura do animal inserindo uma sonda retal (consulte Tabela de Materiais).
- Aplique o gel de varredura (ver Tabela de Materiais) no peito, coloque o transdutor verticalmente, abaixe-o até a linha paraesternal (paralela ao tórax) e gire 35° no sentido anti-horário para obter a visão do eixo longo paraesternal do ventrículo esquerdo.
- Toque no botão de imagem de modo B no software de imagem (consulte Tabela de materiais) para obter uma visão completa do eixo longo do coração. Ajuste o tamanho e o brilho do portão e salve as imagens usando Save Clip ou Save Frame para medições posteriores16.
- Mude para o modo M (modo de movimento) e coloque o eixo do modo M ao nível do músculo papilar. Ajuste o tamanho do portão e toque no botão Iniciar no modo M. Salve as imagens usando Salvar clipe ou Salvar quadro16,17.
- Como o processo de aquisição de imagens em modo 4D é automatizado, verifique se os sinais de ECG e respiração estão ativos (Figura 1) antes de adquirir os dados.
- Comece a adquirir os dados no modo B. Abra o painel de digitalização 4D e inicie o motor 3D. Defina os parâmetros da imagem no painel de digitalização 4D e toque no botão Digitalizar para iniciar a digitalização. Depois de revisar as imagens na visualização 2D, carregue as imagens no modo 4D usando o botão Carregar em 4D .
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Representative Results
A Figura 1 demonstra os sinais representativos de ECG e respiração durante a avaliação ecocardiográfica de camundongos sham (Figura 1A) e IM (Figura 1B). A verificação dos sinais ativos de ECG e respiração é importante antes de adquirir os dados ecocardiográficos. A Figura 2 mostra a medida ecocardiográfica dos parâmetros funcionais cardíacos após 28 dias após a ligadura da ACV. A Figura 2 mostra imagens em modo M da visão do eixo curto para esternal dos corações sham (Figura 2A) e MI (Figura 2B). A Figura 2B mostra o movimento defeituoso da parede cardíaca após a ligadura da ACV. Indicadores de insuficiência cardíaca, como aumento da massa do VE (Figura 2C), diminuição da fração de ejeção (Figura 2D) e diminuição do débito cardíaco (Figura 2E), foram observados no grupo IM em relação ao grupo simulado.
Todos os animais foram eutanasiados de acordo com protocolos padronizados utilizando uma dose excessiva de gás CO2 . Os corações foram fixados e congelados em composto de temperatura de corte ideal (OCT). A coloração tricrômica de Masson18 foi realizada para três seções diferentes do ventrículo (inferior, médio e superior) e as imagens foram tiradas usando um scanner de lâmina de pesquisa sob ampliação de 10x para examinar o grau de fibrose cardíaca. A Figura 3 mostra aumento da coloração de colágeno (azul) no coração infarto, indicando aumento da fibrose.
Figura 1: Sinais ativos de ECG e respiração durante a avaliação ecocardiográfica. Sinais representativos de ECG e respiração durante a avaliação ecocardiográfica de camundongos (A) sham e (B) IM. Verde = sinais de ECG, amarelo = sinais de respiração. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação ecocardiográfica dos parâmetros funcionais cardíacos após ligadura da ACV no 28º dia após a cirurgia. Imagens ecocardiográficas representativas do eixo curto paraesternal (PSAX) em modo M de camundongos (A) sham e (B) IM. Avaliação de (C) massa ventricular esquerda (mg), (D) fração de ejeção (%), e (E) débito cardíaco (mL/min) de camundongos simulados e camundongos com IAM. VEA;d = espessura da parede anterior do ventrículo esquerdo em diástole; ATVE;s = espessura da parede anterior do ventrículo esquerdo na sístole; PCVE;d = espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole; PCVE;s = espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na sístole; DDVE;d = diâmetro interno do ventrículo esquerdo na diástole; IDVE;s = diâmetro interno do ventrículo esquerdo na sístole. Os dados são apresentados como DP de ± Média. * P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da fibrose após ligadura da ACV no dia 28 após a cirurgia. Imagens representativas mostrando a coloração tricrômica de Masson de (A) sham e (B) MI corações 28 dias após a cirurgia. As regiões fibróticas no coração infartado são caracterizadas por deposição de colágeno e coradas de azul após a coloração tricrômica de Masson. Barra de escala = 500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo murino de IAM está ganhando popularidade em laboratórios de pesquisa cardiovascular, e este estudo descreve um modelo de IAM reprodutível e clinicamente relevante. Este protocolo melhora o processo de ligadura LCA de várias maneiras. Para começar, evita-se o uso de anestésicos pré-operatórios injetáveis, como xilazina/cetamina ou pentobarbital sódico14,15. Apenas a anestesia com isoflurano foi utilizada, que ajuda a aumentar as taxas de sobrevivência animal (>80% de sobrevida 28 dias após a cirurgia), minimizar as complicações induzidas por drogas e tem efeitos cardíacos mínimos em comparação com outros agentes19. No entanto, o isoflurano também retarda o coração, embora em menor grau em comparação com outros agentes anestésicos20. Esse protocolo envolve intubação endotraqueal menos invasiva, evitando a traqueostomia21, o que reduz a dor e o desconforto pós-operatórios. Estudos prévios de ligadura de ACV murina recomendaram a realização de uma incisão no meio do pescoço para melhorar a visualização da intubação endotraqueal; no entanto, o protocolo atual utiliza um laringoscópio para iluminar a orofaringe15. Lugrin et al. demonstraram recentemente um modelo murino de IAM de ACV sem toracocentese14; no entanto, o protocolo atual inclui uma toracocentese eficaz, que ajudará a remover o excesso de sangue e ar da cavidade torácica, prevenindo o pneumotórax19. Além disso, esse método utiliza gaze estéril para o manejo do sangramento no lugar de um cauterizador, pois o uso de um cauterizador para reduzir o sangramento pode resultar em queimaduras iatrogênicas e pode alterar as leituras inflamatórias21.
Uma das etapas críticas nesse modelo cirúrgico é a identificação e ligadura da ACV. A localização da artéria coronária pode variar dependendo das cepas e genótipos de camundongos9. Na maioria dos casos, a artéria não é visível sob um microscópio. Por experiência, a ligação do tecido miocárdico 2-4 mm abaixo da borda do átrio esquerdo resulta em branqueamento eficiente da parede ventricular esquerda. Além disso, o procedimento pode ser simplesmente modificado para induzir isquemia miocárdica temporária seguida de reperfusão (I/R) pela remoção da ligadura22. Esse modelo animal mimetiza a restauração do fluxo sanguíneo coronariano em pacientes com IAM após intervenção coronária percutânea23,24. Como o modelo de oclusão permanente da ACV difere do modelo de I/R em vários aspectos, como o tamanho da área infartada, a localização do infarto e a infiltração de células inflamatórias, os pesquisadores devem ser cautelosos ao selecionar o modelo relevante, dependendo do estudo 7,14,25.
Existem várias abordagens para garantir a ligadura bem-sucedida da ACV e o subsequente desenvolvimento do IAM. Observar o branqueamento imediato do ventrículo inferior esquerdo é a primeira confirmação de uma ligadura bem-sucedida da ACV. Além disso, a extensão e a localização do infarto do miocárdio podem ser visualizadas pela coloração de todo o coração com o azul de Evan ou cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC)26. A mensuração da troponina cardíaca circulante pode validar ainda mais a lesão do tecido miocárdico21. A eletrocardiografia pode ser utilizada como método não invasivo de confirmação da elevação do segmento ST após o IM17. O grau de fibrose cardíaca associado ao IAM pode ser avaliado pela coloração tricrômica de Masson e RM cardíaca27,28,29. A ecocardiografia pode ser utilizada para avaliar os parâmetros de insuficiência cardíaca nos dias 1 e 28 após o IM. Para examinar o remodelamento cardíaco após o IAM, a coloração do tricoma e o ecocardiograma de Masson podem ser utilizados17. Também é possível usar qPCR e immunoblot para investigar e confirmar a expressão dos genes e proteínas implicados na fibrose, inflamação e insuficiência cardíaca após o IAM14.
A principal limitação da ligadura LCA é a alta incidência de mortalidade, que pode ser decorrente de arritmias cardíacas pós-operatórias, ruptura ventricular, hemorragia, pneumotórax e desconforto pós-operatório19,30. No entanto, uma toracocentese bem-sucedida, minimizando o dano tecidual não alvo, e a dor pós-operatória adequada e o manejo da temperatura podem ajudar a reduzir a morte do animal. Como em qualquer outro modelo cirúrgico, a reprodutibilidade exata é outra limitação desse modelo cirúrgico. Os pesquisadores podem, no entanto, reproduzir o IAM, controlar o tamanho do infarto e melhorar a sobrevida pós-cirúrgica por meio de prática e experiência rigorosas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto Nacional de Saúde (R01HL143967, R01HL142629, R01AG069399 e R01DK129339), AHA Transformational Project Award (19TPA34910142), AHA Innovative Project Award (19IPLOI34760566) e ALA Innovation Project Award (IA-629694) (para PD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter needle | Exel INT | 26741 | Thoracentesis |
| 24 G catheter needle | Exel INT | 26746 | Endotracheal intubation |
| 4-0 nylon suture | Covetrus | 29263 | Suturing of muscles and skin |
| 8-0 nylon suture | S&T | 3192 | Ligation of LAD |
| Anesthetic Vaporizers | Vet equip | VE-6047 | Anesthetic support |
| Animal physiology monitor | Fujifilm | VEVO 3100 | Monitor heart rate,respiration rate and body temperature |
| Betadine solution | PBS animal health | 11205 | Antispetic |
| Buprenorphine | Covetrus | 55175 | Analgesic |
| Disecting microscope | OMANO | OM2300S-V7 | Binocular |
| Electric razor | Wahl | 79300-1001M | Shaving |
| Electrode gel | Parker Laboratories | W60698L | Electrically conductive gel |
| Ethanol | Decon Laboratories | 22-032-601 | Disinfectant |
| Forceps | FST | 11065-07 | Stainless Steel |
| Gauze | Curity | CAR-6339-PK | Sterile |
| Heat lamp | Satco | S4998 | Post surgery care |
| Heating pad | Kent scientific | Surgi-M | Temperature control |
| Hot Bead sterilizer | Germinator 500 | 11503 | Sterilization of surgical instrument |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | Anesthesia |
| Masson’s trichrome staining kit | Thermoscientific | 87019 | Measurement of cardiac Fibrosis |
| Micro Needle Holder | FST | 12500-12 | Stainless Steel |
| Micro scissors | FST | 15000-02 | Stainless Steel |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet | Sterile occular lubricant |
| Scanning Gel | Parker Laboratories | Aquasonic 100 | Aqueous ultrasound transmission gel |
| Scissors | FST | 14060-11 | Stainless Steel |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | Model LS-2-M | Illuminating the oropharynx |
| Small animal ventilator | Harvard apparatus | 557058 | Ventilator support |
| Surgical light | Cole parmer | 41723 | Illuminator Width (in): 7 |
| Vevo 3100 preclinical imaging platform | Fujifilm | VEVO 3100 | Echocardiography |
| VevoLAB software | Fujifilm | VevoLAB 3.2.6 | Echocardiography data analysis |
References
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