Summary
Denne protokollen beskriver den detaljerte metoden for digital dråpe-PCR (dd-PCR) for presis kvantifisering av sirkulære RNA (circRNA) nivåer i celler ved hjelp av divergerende primere.
Abstract
Digital dråpepolymerasekjedereaksjon (dd-PCR) er en av de mest følsomme kvantifiseringsmetodene; det fraksjonerer reaksjonen i nesten 20.000 vann-i-olje-dråper, og PCR forekommer i de enkelte dråpene. DD-PCR har flere fordeler i forhold til konvensjonell sanntids qPCR, inkludert økt nøyaktighet i å oppdage mål med lav overflod, utelate referansegener for kvantifisering, eliminere tekniske replikasjoner for prøver og vise høy motstandskraft mot hemmere i prøvene. Nylig har dd-PCR blitt en av de mest populære metodene for nøyaktig kvantifisering av mål-DNA eller RNA for genuttrykksanalyse og diagnostikk. Sirkulære RNA (circRNA) er en stor familie av nylig oppdagede kovalent lukkede RNA-molekyler som mangler 5 'og 3' ender. De har vist seg å regulere genuttrykk ved å fungere som svamper for RNA-bindende proteiner og mikroRNA. Videre utskilles circRNA i kroppsvæsker, og deres motstand mot eksonukleaser gjør at de tjener som biomarkører for sykdomsdiagnose. Denne artikkelen tar sikte på å vise hvordan man utfører divergerende primerdesign, RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese og dd-PCR-analyse for å nøyaktig kvantifisere spesifikke sirkulære RNA (circRNA) nivåer i celler. Avslutningsvis demonstrerer vi den nøyaktige kvantifiseringen av circRNA ved bruk av dd-PCR.
Introduction
Nylige fremskritt innen RNA-sekvenseringsteknologier og nye beregningsalgoritmer har oppdaget et nytt medlem av den voksende familien av ikke-kodende RNAer, kalt sirkulær RNA (circRNA)1. Som navnet antyder, er circRNA en familie av enkeltstrengede RNA-molekyler uten frie ender. De dannes av ikke-kanonisk spleising fra hode til hale kalt back-splicing, hvor oppstrøms spleiseakseptorstedet går sammen med nedstrøms spleisedonorstedet for å danne en stabil RNA-sirkel 1,2. Denne prosessen kan være mediert av flere faktorer, inkludert inverterte Alu-repeterende elementer som er tilstede i oppstrøms og nedstrøms sirkulæriserte eksoner, eller kan medieres av noen spleisingsfaktorer eller RNA-bindende proteiner (RBP) 2,3. Sirkulære RNA generert utelukkende fra den eksoniske eller introniske sekvensen klassifiseres som eksoniske circRNA og sirkulære introniske RNA eller ci-RNA, mens noen eksoniske circRNAer beholder intronet og kalles ekson-intron circRNA (EIcircRNAs)3,4. Funksjonene til circRNA er mangefasetterte, inkludert sponging miRNA og / eller RBP, regulering av transkripsjon og regulering av cellulær funksjon ved å oversette til peptider 3,5,6,7. Flere rapporter har fremhevet betydningen av circRNA i ulike sykdommer og fysiologiske prosesser8. Videre gjør vevsspesifikke uttrykksmønstre og motstand mot eksonukleasefordøyelse det til en funksjonell biomarkør for sykdomsdiagnose, og den kan også brukes som et egnet terapeutisk mål8. Med tanke på dens betydning for å regulere helse og sykdommer, er den nøyaktige kvantifiseringen av circRNA-uttrykk behovet for timen.
Det er utviklet flere biokjemiske metoder for å kvantifisere circRNA i biologiske prøver9. En av de mest praktiske og allment aksepterte metodene for circRNA-kvantifisering er revers transkripsjon etterfulgt av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ved bruk av divergerende primerpar10. Imidlertid er flertallet av circRNA i lav overflod sammenlignet med lineære mRNA, noe som gjør det utfordrende å kvantifisere dem11. For å løse dette problemet søkte vi å bruke digital dråpe-PCR (dd-PCR) for å kvantifisere antall circRNA i en gitt prøve nøyaktig. DD-PCR er en avansert PCR-teknologi som følger mikrofluidikkprinsippet; det genererer flere vandige dråper i olje, og PCR forekommer i hver dråpe som en individuell reaksjon12. Reaksjonen skjer i individuelle dråper og analyseres ved hjelp av en dråpeleser, som gir antall positive eller negative dråper for genet av interesse12. Det er den mest følsomme teknikken for å nøyaktig kvantifisere et gen av interesse, selv om det bare er en enkelt kopi i en gitt prøve. Redusert følsomhet overfor inhibitorer, bedre presisjon og utelatelse av referansegenet for kvantifisering gjør det mer fordelaktig enn konvensjonell qPCR13,14,15. Det har blitt mye brukt som et forsknings- og diagnostisk verktøy for absolutt kvantifisering av et gen av interesse16,17. Her beskriver vi den detaljerte dd-PCR-protokollen for circRNA-kvantifisering ved differensiering av mus C2C12 myotuber og prolifererende mus C2C12 myoblaster ved bruk av divergerende primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RNA er følsomt for RNases; Derfor bør alle reagenser, instrumenter og arbeidsområder være RNase-frie og håndteres med forsiktighet.
1. Divergerende primerdesign for circRNA (se figur 1)
- Hent den modne sekvensen fra circRNA-merknadsdata ved hjelp av BEDTools eller fra UCSC-genomleseren ved å bli med i ekson / intronsekvensen som er tilstede mellom backsplice-krysskoordinatene18,19.
- Forbered en PCR-malsekvens på 200 nukleotider i lengde ved å bli med de siste 100 nukleotidene av den totale circRNA-sekvenslengden til de første 100 nukleotidene i circRNA-sekvensen10.
MERK: Hvis circRNA-lengden er mindre enn 200 nukleotider, del den deretter i to like halvdeler og bli med nukleotidene fra siste halvdel til begynnelsen av første halvdel. - Bruk malsekvensen ovenfor for primerdesign ved å bruke nettverktøyet Primer3 og angi en PCR-produktlengde fra 120-180 nukleotider i lengde20.
- Bruk standardinnstillingene for Primer3 for andre parametere som Tm og primerlengde. Primersekvensene for circBnc2 er listet opp i tabell 1.
- Bestill de divergerende primersekvensene for syntese fra ethvert oligo-syntetiserende selskap.
2. RNA-isolasjon
MERK: Isoler totalt RNA fra musens C2C12-celler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett eller intern RNA-isolasjonsmetode. Den interne RNA-isolasjonsmetoden som brukes her, er beskrevet tidligere21. De magnetiske silikaperlene fremstilles i laboratoriet ved hjelp av den tidligere publiserte protokollen22. Disse magnetiske perlene kan også anskaffes fra forskjellige leverandører.
- Ta en 10 cm tallerken som inneholder ca 5 x 106 prolifererende C2C12 myoblastceller og en 4-dagers differensiert C2C12 myotube for RNA-isolasjon.
- Vask cellene med 10 ml 1x PBS tre ganger og kast PBS med pipette.
- Skrap cellene i 1 ml 1x PBS ved hjelp av en celleskraper, sentrifuger dem ved 4 °C i 5 minutter ved 750 x g, og kast PBS med en pipette.
- Tilsett 1 ml RNA-isolasjonsreagens (RIR) og lyse cellene ved kraftig pipettering21.
- Tilsett 200 μL (1/5 av volumet av RIR) kloroform og virvel i 15 s. Sentrifuge røret ved 4 °C i 10 minutter ved 12 000 x g.
- Ta 400 μL av det øvre vandige laget, legg det på en silikakolonne og sentrifuge i 1 minutt ved 12.000 x g ved romtemperatur. Ta gjennomstrømningen til et nytt rør og tilsett 600 μL 100% etanol.
- Tilsett 20 μL magnetiske silikaperler og plasser røret på en termomikser satt til 25 ° C og 1,200 o / min i 5 minutter.
MERK: Dråpevolumet kan økes eller reduseres avhengig av de første cellenumrene som er tatt for lysis. Magnetiske silikaperler kan anskaffes fra kommersielle leverandører. - Plasser røret på et magnetisk stativ i 30 s eller til løsningen blir klar. Kast supernatanten forsiktig med en pipette.
- Resuspend de magnetiske silikaperlene i en 500 μL vaskebuffer som inneholder 90% etanol. Plasser røret på magnetstativet i 30 s. Roter røret to ganger på magnetstativet for å vaske perlene. La perlene slå seg ned mot magneten og kast bufferen med en pipette.
- Gjenta trinn 2.9 to ganger. Etter vasken, spinn røret kort og legg det tilbake på magnetstativet i 30 s. Kast den gjenværende vaskebufferen. Lufttørk røret ved 50 °C i 3 minutter på en termomikser, og hold lokket åpent.
- Tilsett 20 μL nukleasefritt vann og resuspend perlene.
MERK: RNA-elueringsvolumet kan reduseres ned til 10 μL for å skalere opp RNA-konsentrasjonen. - Plasser rørene i 2-3 minutter ved romtemperatur. Plasser røret tilbake på magnetstativet og la det sitte i 30 s. Samle det oppløste RNA i et nytt rør for kvantitets- og kvalitetsvurdering ved hjelp av et spektrofotometer.
MERK: RNA kan lagres ved −20 °C eller −80 °C for langtidsoppbevaring. For å få et optimalt resultat, anbefales det å fortsette med cDNA-syntesetrinnet neste dag.
3. cDNA-syntese
- Mål RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer og ta 1 μg RNA for cDNA-syntese.
- Bland 1 μg totalt RNA med 1 μL dNTP-blanding (10 mM hver av dATP, dTTP, dGTP og dCTP), 4 μL av 5x revers transkriptase (RT) buffer, 2 μL av 10x RT tilfeldig primer, 0,25 μL av revers transkriptaseenzym (200 U / μL) og 0,5 μL av RNaseinhibitor (40 U / μL), og utgjør volumet opp til 20 μL ved bruk av nukleasefritt vann.
MERK: Det reverse transkriptaseenzymvolumet kan endres avhengig av den opprinnelige RNA-konsentrasjonen tatt for cDNA-syntese. - Trykk på røret for å blande reaksjonen og spinn kort. Plasser røret ved 25 °C i 10 minutter etterfulgt av ved 50 °C i 1 time.
- For å deaktivere enzymet, plasser røret ved 85 °C i 5 minutter.
- Iskaldt røret i 2 minutter og tilsett 480 μL nukleasefritt vann til røret for å gjøre cDNA-konsentrasjonen til 2 ng / μL.
MERK: cDNA kan oppbevares ved -20 °C eller brukes umiddelbart til dd-PCR-analyse.
4. Digital dråpe PCR (dd-PCR) arbeidsflyt
MERK: Arbeidsflyten til dd-PCR innebærer flere trinn, fra prøvepreparering, etterfulgt av dråpegenerering, PCR-forsterkning, dråpetelling og dataanalyse. Hvert trinn er avgjørende for nøyaktig datagenerering, da dd-PCR innebærer absolutt kvantifisering av produkter og ikke trenger noen standardkurve. Derfor, hvert av de forskjellige trinnene i dd-PCR er beskrevet nedenfor.
- Fremstilling av dd-PCR-reaksjonen.
- Sett opp PCR-reaksjonen på 22 μL i 0,2 ml PCR-rør eller strimler sammen med et negativt kontrollrør og NTC-rør (ikke-malkontroll).
MERK: Hvert forskjellige divergerende primerpar for påvisning av forskjellige circRNA må ha en NTC-reaksjon sammen med testprøver. - Tilsett 11 μL dd-PCR master-mix (f.eks. EvaGreen Supermix) og 11 μL nukleasefritt vann for å sette opp det negative kontrollreaksjonsrøret.
MERK: Tine dd-PCR master-mix ved romtemperatur etterfulgt av en kort virvel for å lage en homogen blanding. Bruk det samme nukleasefrie vannet til å sette opp det negative kontrollreaksjonsrøret og NTC-rørene som ble brukt til fortynning av cDNA. - Tilsett 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-spesifikk fremover- og revers primerblanding av 1 μM-konsentrasjon og 5,5 μL nukleasefritt vann for å sette opp NTC-reaksjonsrørene.
MERK: Fortynn de fremre og omvendte sirkulære RNA-spesifikke divergerende primerne på 100 μM lager og bland for å forberede en 1 μM arbeidskonsentrasjon av fremover og bakover circRNA primerblanding; Dermed er den endelige primerkonsentrasjonen 250 nM i 22 μL-reaksjonen. - Tilsett 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-spesifikk fremover- og reversprimerblanding med 1 μM-konsentrasjon og 5,5 μL cDNA (2 ng / μL) for å sette opp reagensrørene.
- Vortex grundig etterfulgt av kort sentrifugering av alle reaksjonsrørene for å få en homogen reaksjonsblanding i bunnen av rørene.
- Sett opp PCR-reaksjonen på 22 μL i 0,2 ml PCR-rør eller strimler sammen med et negativt kontrollrør og NTC-rør (ikke-malkontroll).
- Dråpegenerering.
- Overfør 20 μL PCR-blandingen fra 0,2 ml PCR-rør til prøvebrønnene på dråpegeneratorpatronen.
- Tilsett 70 μL dråpegenereringsolje til oljebrønnene i dråpegeneratorpatronen forsiktig ved hjelp av en flerkanals pipette.
MERK: Inkuber dråpegenereringsoljen ved romtemperatur i 15 minutter før bruk. - Dekk dråpegeneratorpatronen med gummipakningen og plasser den i dråpegeneratormaskinen for å få prøveoljedråpeblandingen, generert i dråpebrønnene på patronen.
- PCR-forsterkning.
- Overfør 40 μL av prøveoljedråpeblandingen fra dråpebrønnene i dråpegeneratorpatronen til en 96-brønns PCR-plate ved hjelp av en flerkanals pipette.
MERK: Overfør dråpeblandingen av prøveolje forsiktig mens du lager en vinkel mot brønnene gjennom spissene på flerkanalspipetten for å unngå å bryte dråpene mens du overfører dem til dd-PCR 96-brønnplaten. - Forsegl PCR-platen med 96 brønner med aluminiumsfolieforsegleren, plasser den i plateforseglermaskinblokken forvarmet ved 80 °C, og klikktetning for tetting av PCR-platen.
- Plasser nå platen i dd-PCR termisk cycler og sett programmet som nevnt i tabell 2 med lokktemperaturen satt til 105 °C og en rampehastighet på 2 °C/s.
- Overfør 40 μL av prøveoljedråpeblandingen fra dråpebrønnene i dråpegeneratorpatronen til en 96-brønns PCR-plate ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Dråpetelling.
- Når PCR er over, plasser platen på dd-PCR-dråpetellermaskinen med plateholderen i riktig posisjon for å telle dråpene.
- Åpne programvaren for dråpeanalyse, og konfigurer kjøringen ved å gi inndata for eksempelinformasjonen.
- Klikk på oppsettalternativet. Klikk deretter på malalternativet for å åpne en ny mal.
- Definer hver brønn ved å sette detaljene i eksperimentet, for eksempel prøvenavn (cDNA brukt eller negativ kontroll eller NTC), målnavn (circRNA primer navn) og type (ukjent), og eksperimenttype som ABS (absolutt kvantifisering) og Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) brukt, etc.
- Til slutt lagrer du malen og starter kjøringen ved å klikke på kjørealternativet og velge telling etter rad eller kolonnemessig. La maskinen fullføre dråpetellingen, som tar ca. 1 min/brønn.
- Klikk på Analyser-knappen for å analysere dataene etter at dråpeletavlesningen er fullført.
- Klikk på 1D-amplitude-knappen for å se de positive og negative dråpene
- For å skille de positive dråpene fra de negative dråpene, sett en felles terskellinje for alle prøver med samme mål.
MERK: De totale dråpene i hver prøve skal være over 10 000 for å bli vurdert for absolutt kvantifisering. NTC skal ikke vise positive dråpeteller. Tilstedeværelsen av positive dråper i NTC indikerer forurensning av reagensene eller forsterkningen av primerdimerene. Det er vanskelig å finne ut om de positive dråpene har primerdimerer eller uspesifikke produkter i NTC. Det anbefales å sjekke primerne og unngå forurensning av reagensene som en generell praksis for PCR, inkludert dd-PCR. - Klikk på Eksporter-knappen for å eksportere circRNA-teller data som en .csv-fil. De eksporterte dataene viser antall circRNA som er tilstede i hver prøve.
- Beregn manuelt antall circRNA i hver prøve per nanogram RNA ved å vurdere den totale mengden cDNA som brukes i hver reaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det absolutte antallet circRNA i hver prøve kan utledes fra de eksporterte dd-PCR-dataene. Real-time kvantitativ PCR-analyse foreslo differensialuttrykk av circBnc2 i de differensierte C2C12-myorørene (data ikke vist). Her ønsket vi å sjekke det absolutte kopinummeret til circBnc2 i prolifererende C2C12 myoblaster og myorør. Siden uttrykket av circBnc2 sammenlignes i to forhold, er det veldig viktig å behandle alle prøver for RNA-isolasjon, cDNA-syntese og PCR samtidig ved bruk av samme reagenser og prosedyre. For å utføre den absolutte kvantifiseringen av circRNA ved bruk av dd-PCR-reaksjonen, bør en lik mengde innledende totalt RNA brukes til cDNA-syntese for å beregne det nøyaktige antall mål-RNA-molekyler per nanogram totalt RNA. For eksempel ble 1 μg totalt RNA brukt til cDNA-syntese og fortynnet til 500 μL ved bruk av nukleasefritt vann for å få en endelig konsentrasjon på 2 ng / μL før dd-PCR-analysen ble utført (figur 1).
Som vist i figur 2A ble cDNA fra 10 ng RNA fra prolifererende C2C12 myoblastceller (MB) og en 4-dagers differensiert myotube (MT) brukt til å kontrollere forskjellen i ekspresjon av circBnc2 under disse to forholdene. Prøvene ble behandlet for å generere dråpen og utføre PCR, etterfulgt av telling av positive og negative dråper ved hjelp av dråpeanalyseprogramvaren i henhold til produsentens instruksjoner (figur 2B). Siden primere kan forsterke ikke-spesifikke produkter og danne primerdimer, bør NTC brukes til alle primersett. Ideelt sett bør NTC ikke ha noen positive dråpetall.
Som vist i figur 3A, viste alle prøver unntatt MT1 mer enn 12 000 dråpetellinger. Siden det totale dråpetallet var lavt i MT1, ble dette utvalget ikke vurdert for endelig dataanalyse. Det lave totale dråpetallet kan skyldes en feil i dråpegenerering, brudd på dråpene under overføring til PCR-platen eller pipetteringsproblemer. Interessant nok var det en klar forskjell i ekspresjonsmønsteret til circBnc2 i den 4-dagers differensierte myotubetilstanden sammenlignet med myoblastcellene. Analysen av circBnc2 overflod i form av kopinummer indikerte at de tre replikasjonene av C2C12 myoblaster hadde 76,8, 67 og 46 kopier/ng av RNA, mens de to myotubeprøvene hadde 558 og 610 kopier/ng av RNA (figur 3B). Siden en myotubeprøve ikke fungerte bra, er det bedre å ha et større antall biologiske replikasjoner for å studere de statistiske forskjellene i deres uttrykksmønstre i de to forholdene.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av divergerende primerdesign for PCR-forsterkning av circBnc2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: dd-PCR-arbeidsflyten for circRNA-kvantifisering. Den komplette dd-PCR-arbeidsflyten inkluderer mange trinn: (A) RNA-isolasjon og cDNA-forberedelse fra C2C12 myoblast og 4-dagers differensierte myotubceller, PCR-blandingspreparat, (B) dråpegenerering, PCR-forsterkning, dråpetelling og dataanalyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dataanalyse med QuantaSoft programvare. (A) Dataanalyse inkluderer identifisering av positive og negative dråper ved hjelp av kvantifiseringsprogramvaren. (B) Beregning av antall circRNA / ng av RNA i C2C12 myoblasts (MB) og myotubes (MT). Dataene i panel B-stolpediagrammet representerer gjennomsnittet ± STDEV på to til tre biologiske replikasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primer Navn | Sekvens |
| circBnc2 Fremover primer | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 Omvendt primer | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
Tabell 1 Divergerende primersekvenser som brukes til forsterkning av circBnc2.
| Skritt | Temperatur (°C) | Tid | Ingen av sykluser | Rampehastighet |
| Enzymaktivering | 95 | 10 minutter | 1 | ~ 2 ° C / s |
| Denaturering | 94 | 30-tallet | 40 | ~ 2 ° C / s |
| Annealing/Forlengelse | 60 | 1 min | 40 | ~ 2 ° C / s |
| Signalstabilisering | 4 | 5 minutter | 1 | ~ 2 ° C / s |
| Signalstabilisering | 90 | 5 minutter | 1 | ~ 2 ° C / s |
Tabell 2 Betingelser for PCR-forsterkning av circBnc2 på en termisk syklus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CircRNA-forskning har vokst det siste tiåret med oppdagelsen av sekvenseringsteknologier med høy gjennomstrømning. Som et resultat har det blitt ansett som et potensielt molekyl for fremtidige RNA-terapier. I tillegg er det kjent å fungere som en biomarkør ved flere sykdommer, inkludert kreft og hjerte- og karsykdommer 4,8. Imidlertid er identifiseringen av circRNA vanskelig på grunn av sin lave overflod, og den har bare en spesifikk tilbakeslagskrysssekvens som skiller den fra foreldrenes mRNA9. RT-PCR ved hjelp av divergerende primere har vært gullstandardteknikken for å validere circRNA siden oppdagelsen 9,10. Selv om flere molekylære metoder er utviklet for circRNA-kvantifisering, er det utfordrende å måle circRNA-uttrykk nøyaktig på grunn av deres lave overflod. Siden dd-PCR kan forsterke svært lite RNA / DNA-molekyler fra en gitt prøve14, er det en av de beste metodene for nøyaktig kvantifisering av circRNA.
DD-PCR er en endepunktanalyse som gir absolutt kvantifisering av målgenet15. I motsetning til konvensjonell qPCR er den tidkrevende, kjedelig og dyr, noe som gjør den mindre akseptert sammenlignet med sanntids-PCR selv et tiår etter oppdagelsen15. Det gir imidlertid flere fordeler i forhold til den mye brukte qPCR for å studere genuttrykksendringer13,23. For det første kan dd-PCR gi nøyaktig antall kopier av DNA som er tilstede i en gitt prøve. For det andre endrer en endring i housekeeping genuttrykk beregningen av målgenpopulasjonen i en gitt prøve. Dette kan unngås i dd-PCR, som ikke er avhengig av standardkurver eller husholdningsgener for å kvantifisere mål-DNA15. For det tredje, ettersom PCR-reaksjonen forekommer i små rom, gir den høyere fleksibilitet mot tilstedeværelsen av ikke-spesifikke hemmere eller bakgrunns-DNA, noe som gjør det til en mer nøyaktig metode for kvantifisering av målgener23,24.
Vi brukte dd-PCR-teknologien til å kvantifisere circBnc2-uttrykk i prolifererende C2C12-myoblaster og differensierte myotuber ved hjelp av divergerende primere. Spesifikk circRNA-forsterkning med divergerende primerpar uten primer-dimere må imidlertid kontrolleres i vanlig PCR før dd-PCR utføres. Dd-PCR-protokollen må også følges nøye for nøyaktig måling av circRNA-uttrykk. Arbeidsflyten som presenteres her kan enkelt tilpasses for kvantifisering av ethvert circRNA av interesse. Nylige studier har fremhevet de diagnostiske verdiene av circRNA tilstede i vev og kroppsvæsker for påvisning av sykdommer8. Sammen vil denne metoden være et viktig verktøy i forsknings- og diagnostikkindustrien og vil akselerere circRNA-forskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av intramural finansiering fra Institute of Life Sciences, DBT forskningsstipend (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018), og Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2 / 504017] tildelt Amaresh C. Panda. Vi takker andre laboratoriemedlemmer for korrekturlesing av artikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L.
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C.
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
