Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Сбор экссудатов корня люцерны для изучения влияния ди(2-этилгексил)фталата на продукцию метаболитов

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

Секреция корневых экссудатов обычно является внешней стратегией детоксикации растений в стрессовых условиях. В этом протоколе описывается, как оценить влияние ксенобиотиков на люцерну с помощью нецелевого метаболомного анализа.

Abstract

Корневые экссудаты являются основным средством передачи информации и передачи энергии между корнями растений и окружающей средой. Изменение секреции корневых экссудатов обычно является внешней стратегией детоксикации растений в условиях стресса. Этот протокол направлен на введение общих рекомендаций по сбору экссудатов корня люцерны для изучения влияния ди(2-этилгексил)фталата (DEHP) на производство метаболитов. Во-первых, саженцы люцерны выращивают под давлением DEHP в эксперименте по гидропонной культуре. Во-вторых, растения переносят в центрифужные пробирки, содержащие 50 мл стерилизованной сверхчистой воды, в течение 6 часов для сбора корневых экссудатов. Затем растворы лиофилизируют в вакуумной сублимационной сушилке. Замороженные образцы экстрагируют и дериватизируют реагентом бис(триметилсилил)) трифторацетамида (БСТФА). Затем дериватизированные экстракты измеряют с помощью системы газового хроматографа в сочетании с времяпролетным масс-спектрометром (ГХ-ТОФ-МС). Полученные данные о метаболитах затем анализируются на основе биоинформатических методов. Дифференциальные метаболиты и значительно измененные пути метаболизма должны быть глубоко изучены, чтобы выявить влияние DEHP на люцерну с учетом корневых экссудатов.

Introduction

Ди(2-этилгексил)фталат (DEHP) представляет собой синтетическое химическое соединение, которое широко используется в различных пластмассах и полимерах в качестве пластификатора для повышения их пластичности и прочности. В последние несколько лет все большее число исследований показало, что DEHP является эндокринным разрушителем и оказывает неблагоприятное воздействие на дыхательную, нервную и репродуктивную системы человека и других животных 1,2,3. Учитывая риск для здоровья, Агентство по охране окружающей среды США, Европейский Союз и Центр мониторинга окружающей среды Китая включили DEHP в список приоритетных загрязнителей. Почва считается важным поглотителем DEHP в окружающую среду из-за применения пластикового мульчирования и органических удобрений, орошения сточными водами и применения на иловых фермах4. Как и ожидалось, в почвах сельскохозяйственных угодий повсеместно обнаружен DEHP, содержание которого в некоторыхрегионах Китая достигает даже 5,6 миллиграмма на килограмм высохшей почвы. DEHP может проникать в растения главным образом через корни и подвергаться биоусилению на различных трофических уровнях в почвенных экосистемах7. Поэтому в последние десятилетия была высказана серьезная озабоченность по поводу стресса, вызванного DEHP в растениях.

Растения обычно уязвимы к воздействию DEHP. Было замечено, что стресс DEHP оказывает неблагоприятное воздействие на прорастание семян и нормальный обмен веществ, тем самым подавляя рост и развитие растений 8,9. Например, DEHP может вызывать окислительное повреждение клеток мезофилла, уменьшать содержание хлорофилла и осмолитов и повышать активность антиоксидантных ферментов, что в конечном итоге приводит к снижению урожайности и качества съедобных растений10,11. Однако большинство предыдущих исследований реакции растений на стресс DEHP были сосредоточены на окислительном стрессе и физиологических и биохимических характеристиках. Соответствующие механизмы, связанные с метаболизмом растений, менее изучены. Корневые экссудаты — это общий термин, описывающий соединения, которые корни растений выделяют и выделяют в окружающую среду. Они рассматривались как среда взаимодействия между растениями и ризосферной почвой, играющая важную роль в поддержке роста и развития растений12. Хорошо известно, что корневые экссудаты составляют примерно 30-40% всего фотосинтезирующегоуглерода 13. В загрязненной среде корневые экссудаты участвуют в повышении устойчивости растений к стрессу загрязняющих веществ посредством метаболизма или внешнего исключения14. Как следствие, глубокое понимание реакции экссудатов корней растений на стресс загрязнения может помочь выявить основные механизмы, связанные с биохимией клеток и биологическими явлениями15.

Технология метаболомики обеспечивает эффективную стратегию одновременного измерения большого количества низкомолекулярных метаболитов в клетках 16,17, тканях18 и даже экссудатах организмов 19, включая сахара, органические кислоты, аминокислоты и липиды. По сравнению с традиционными или классическими методами химического анализа, метаболомный подход значительно увеличивает количество метаболитов, которые могут быть обнаружены20, что может помочь идентифицировать метаболиты с большей пропускной способностью и определить ключевые метаболические пути. Метаболомика широко используется в области исследований биологической реакции в стрессовых средах, таких как тяжелые металлы21, новые загрязнители22 и наночастицы19. Большинство из этих исследований на растениях были сосредоточены на метаболических изменениях во внутренних тканях растений, в то время как лишь немногие из них были зарегистрированы о реакции корневых экссудатов на стресс окружающей среды. Таким образом, целью данного исследования является введение общих рекомендаций по сбору экссудатов корня люцерны для изучения влияния DEHP на продукцию метаболитов. Результаты послужат методическим руководством для последующего изучения метаболомики растений с помощью DEHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить общий конвейер, от эксперимента по гидропонной культуре до метаболомного анализа, количественно оценивающего влияние DEHP на экссудаты корня люцерны.

1. Эксперимент с гидропонной культурой

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе представлен пример эксперимента по гидропонной культуре люцерны, предназначенного для получения проростков люцерны (Medicago sativa) в условиях стресса различных концентраций DEHP. Были назначены три обработки: контроль без каких-либо добавок и питательный раствор с добавлением 1 мг кг-1 и 10 мг кг-1 ди(DEHP. Концентрации DEHP были установлены в соответствии с реальным содержанием DEHP в почве23. Каждая процедура имела шесть повторений.

  1. Стерилизуют семена люцерны 0,1% гипохлоритом натрия в течение 10 мин и 75% этиловым спиртом в течение 30 мин.
    1. Стерилизованные семена несколько раз промыть дистиллированной водой, а затем прорастить на влажной фильтровальной бумаге в стерильной чашке Петри при 30 °C в темноте.
  2. Перенесите 20 однородных, проросших, больших пухлых семян в корзину для приживления в бутылке для культуры, наполненной питательным раствором, состоящим из (в мкМ): Ca(NO 3)2, 3,500; NH4H2PO4, 1 000; КНО3, 6 000; MgSO4, 2 000; Na2Fe-этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 75; Н 3БО3, 46; МнСО4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; и (NH4) 6Mo7O24, 0,02. Отрегулируйте рН раствора до 7,0 с помощью 0,1 М КОН. Обновляйте все решения еженедельно.
  3. Поместите все бутылки с культурой в контролируемую камеру роста с интенсивностью света 150-180 мкмоль м-2 с-1 с фотопериодом 16 ч каждый день при 27 ° C и 20 ° C, представляющих день (16 ч) и ночь (8 ч) соответственно.
  4. Перенесите 15 однородных проростков люцерны в новую стеклянную бутылку для экспериментов с культурой при стрессе 1 мг кг-1 и 10 мг кг-1 DEHP через 2 недели. Оберните стеклянные бутылки алюминиевой фольгой и парапленкой, чтобы предотвратить фотолиз и улетучивание DEHP. Чтобы применить те же условия, также оберните контрольные бутылки алюминиевой фольгой и парапленкой. Ежедневно дополняйте питательный раствор, чтобы поддерживать уровень жидкости.
  5. Случайным образом размещайте и вращайте бутылки каждые 2 дня, чтобы обеспечить стабильные условия роста саженцев люцерны.
  6. Через 7 дней выращивания достаньте саженцы люцерны из бутылок и несколько раз промойте сверхчистой водой, готовясь к сбору корневых экссудатов.

2. Сбор, экстракция и метаболомный анализ корневых экссудатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол разделен на три части: эксперимент по сбору, эксперимент по экстракции и метаболомный анализ корневых экссудатов. Целью коллекционного эксперимента является перенос метаболитов, выделяемых в образцах растений, в систему растворов для последующей экстракции.

  1. Коллекционный эксперимент
    1. Переложите 10 однородных саженцев люцерны в центрифужные пробирки, заполненные 50 мл стерилизованной деионизированной воды. Погрузите корни в воду для сбора корневых экссудатов на 6 ч; Держите трубки в вертикальном положении. Выполните не менее шести повторений для каждой процедуры.
    2. Оберните пробирки центрифуги алюминиевой фольгой, чтобы защитить корни от света.
    3. Удалите растения и высушите собранную жидкость для профилирования метаболитов.
  2. Экстракционный эксперимент
    1. Добавьте 1,8 мл экстракционного раствора (метанол: H2O = 3: 1, V / V) в пробирки и встряхните в течение 30 с.
    2. Приложите ультразвуковые волны к трубкам на 10 минут на водяной бане.
    3. Центрифугируют образцы при 4 °C и 11 000 × г в течение 15 мин.
    4. Осторожно перелейте 200 мкл надосадочной жидкости в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Возьмите 45 мкл надосадочной жидкости из каждого образца и смешайте его с образцами контроля качества (QC) в конечном объеме 270 мкл, который используется для калибровки данных метаболома образцов.
    5. Сублимационная сушка экстрактов в вакуумном концентраторе. Продолжайте сушку с 5 мкл внутреннего стандарта (рибонуклеола).
    6. После выпаривания в вакуумном концентраторе добавляют в пробирки 30 мкл метоксиаминирования гидрохлорида (растворенного в пиридине в концентрации 20 мг мл-1) и инкубируют пробирки при 80 °С в течение 30 мин. Затем добавьте 40 мкл реагента бис(триметилсилил)трифторацетамида (BSTFA) (с 1% триметилхлорсиланом [TMC], V/V) к образцам и поместите пробирки при 70 ° C на 1,5 ч для дериватизации.
    7. Охладите образцы до комнатной температуры и добавьте 5 мкл метиловых эфиров жирных кислот (FAME) (в хлороформе) к образцам QC.
  3. Метаболомный анализ
    1. Вводят 1,0 мкл дериватизированных экстрактов в систему газового хроматографа, соединенную с времяпролетным масс-спектрометром (GC-TOF-MS) для анализа метаболомного профилирования с использованием безраздельного режима.
      1. Используйте капиллярную колонку (30 м x 250 мкм x 0,25 мкм) для разделения корневых экссудатов с гелием в качестве газа-носителя со скоростью потока 1,0 мл мин-1. Установите температуру впрыска на 280 °C и поддерживайте температуру линии переноса и температуру источника ионов на уровне 280 °C и 250 °C соответственно.
      2. Для сепарации используйте следующую программу печи: 1 мин изотермического нагрева при 50 °C, 10 °C / мин-1 разгон печи до 310 °C и окончательный изотермический нагрев при 310 °C в течение 8 мин.
      3. Выполните режим столкновения электронов с энергией -70 эВ. Получение масс-спектров в режиме контроля полного сканирования с диапазоном масс-сканирования 50-500 м/з со скоростью 12,5 спектр/с.
    2. Отфильтруйте отдельные пики, чтобы удалить шум. Значение отклонения фильтруется на основе межквартильного диапазона.
    3. Заполните отсутствующие значения половиной минимальных значений, стандартизируйте и нормализуйте данные.
    4. Импортируйте окончательные данные в формате .csv в программное обеспечение для статистического анализа для многомерного анализа.
    5. Найдите метаболиты в базе данных Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) (ресурс базы данных для понимания высокоуровневых функций и полезностей биологической системы) и классифицируйте метаболиты по различным категориям, таким как углеводы, кислоты, липиды, спирты и амины. Используйте программное обеспечение для статистического анализа для построения круговой диаграммы, чтобы указать процентное содержание каждой категории во всех корневых экссудатах.
    6. Применение контролируемых ортогональных проекций к анализу латентных структур (OPLS-DA), чтобы продемонстрировать различия между группами.
    7. Скрининг достоверно изменил метаболиты как дифференциальные метаболиты на основе переменной важности в проекции (VIP) > 1 и p < 0,05 (t-критерий Стьюдента).
    8. Используйте данные метаболома для построения тепловых карт с помощью программного обеспечения для статистического анализа и используйте изменения складок при различных методах обработки для построения гистограмм.
    9. Найдите дифференциальные метаболиты в базе данных KEGG и Pubchem и скомпилируйте метаболические пути, содержащие дифференциальные метаболиты. Выполните анализ обогащения путей или анализ топологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом эксперименте экссудаты корня люцерны были собраны, экстрагированы и проанализированы в соответствии с вышеуказанными методами (рис. 1). Были созданы три группы лечения: контрольная, с низкой концентрацией DEHP (1 мг л-1) и с высокой концентрацией DEHP (10 мг л-1).

Всего на хроматографе контроля было обнаружено 778 пиков, из которых 314 метаболитов могли быть идентифицированы по масс-спектрам. Как показано на рисунке 2, эти метаболиты можно разделить на шесть типов в зависимости от относительного распространения: углеводы (28,6%), кислоты (15,58%), липиды (13,87%), спирты (3,91%), амины (0,92%) и другие (37,12%). Метаболиты, на долю которых приходилось менее 0,5%, были сгруппированы как другие вещества (рис. 2А). Кислоты были далее подразделены на жирные кислоты (56,09%), аминокислоты (26,62%), органические кислоты (13,95%) и фенольные кислоты (3,34%) (рис. 2B). Кроме того, некоторые распространенные вещества в корневых экссудатах большинства растений также могут быть обнаружены в экссудатах корня люцерны, включая пиримидины, гидроксипиридины, флавоноиды, фенолы, кетоны, пиримидины, флавоноиды и дитерпены.

Тепловая карта была построена для визуализации вариаций дифференциальных метаболитов между различными видами лечения DEHP на основе оценки VIP (рис. 3). По сравнению с контролем воздействие ДЭГФ достоверно изменило содержание 50 метаболитов в экссудатах корня люцерны, в основном включающих некоторые углеводы и низкомолекулярные органические кислоты. Пять типов углеводов (ликсоза, дигитоксоза, эритроза, трегалоза и фруктоза 2, 6-бихосфат) были повышены в присутствии DEHP, а два из них (ликсоза и дигитоксоза) были значительно увеличены по мере увеличения концентрации DEHP. Кроме того, пять метаболитов были подавлены в присутствии DEHP, включая моносахариды, такие как D-талоза и глюкоза, дисахариды, такие как мальтоза, целлобиоза и трегалоза, и сахарные спирты, такие как D-арабитол. Содержание углеводов рассматривалось как показатель физиологического статуса растений24. Таким образом, снижение уровней моносахаридов и дисахаридов в настоящем документе указывает на физиологический стресс, вызванный стрессом DEHP. По сравнению с углеводами DEHP оказывал большее влияние на кислотный обмен в проростках люцерны. Под воздействием DEHP содержание 11 кислых метаболитов было значительно увеличено, в основном включая 2-амино-2-норборнанкарбоновую кислоту, 5-гидроксииндол-2-карбоновую кислоту, 3-гидрокси-L-пролин, пеларгоновую кислоту и пальмитиновую кислоту. В то же время DEHP также ингибировал метаболизм некоторых флавоноидов в проростках люцерны, включая 4', 5-дигиррокси-7-метоксиизофлавон и неогесперидин.

Метаболические пути, на которые влияет DEHP, описаны на рисунке 4. DEHP значительно ингибирует метаболизм углеводов, таких как некоторые моносахариды и дисахариды, которые являются продуктами фотосинтеза. Следовательно, DEHP может в определенной степени подавлять фотосинтез люцерны. Кроме того, DEHP может способствовать метаболизму жирных кислот, которые помогают растениям противостоять стрессу от DEHP. Основными метаболическими путями, на которые повлиял DEHP, были метаболизм углеводов и метаболизм жирных кислот, в то время как метаболизм аминокислот, метаболизм липидов и цикл трикарбоновых кислот (ТСА) были затронуты в гораздо меньшей степени.

Figure 1
Рисунок 1: Блок-схема нецелевого метаболомного анализа экссудатов корня люцерны. BSTFA представляет собой реагент бис (триметилсилил) трифторацетамид (BSTFA) (с 1% триметилхлорсиланом [TMC], V/V). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Классификация метаболитов. (А) Классификация известных метаболитов и (В) кислот. Процентное содержание каждого типа материала делится на сумму площади пика каждой категории на сумму площади пика всех веществ в контроле. Другие вещества были на уровне <0,5%. Другие кислоты были на уровне <0,5%. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Тепловая карта анализа иерархической кластеризации корневых экссудатов (VIP > 1, p < 0,05) проростков люцерны с различными обработками DEHP. Красный и зеленый обозначают высокую и низкую численность соответственно. ACK представляет элемент управления; 1+AD представляет собой лечение 1 мг L-1 DEHP; 10+AD представляет собой лечение 10 мг L-1 DEHP. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Взаимосвязь между нарушением метаболических путей и изменениями биологических конечных точек (1 мг L-1 DEHP, 10 мг L-1 DEHP). Метаболические пути были установлены на основе базы данных Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). Метаболиты, выделенные зеленым цветом, были метаболитами, обнаруженными в настоящей работе. Знаки «красные прямоугольники» и «синие квадраты» в скобках указывают на то, что метаболиты увеличивали (p < 0,05) или уменьшали (p < 0,05) вклад в биологические конечные точки соответственно. Рисунок можно было прочитать, разделив метаболиты примерно на углеводы, жирные кислоты и белковый обмен, как показано зелеными, красными и черными прямоугольными полями соответственно. ACK представляет элемент управления; 1+AD представляет собой лечение 1 мг L-1 DEHP; 10+AD представляет собой лечение 10 мг L-1 DEHP. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол содержит общие рекомендации по сбору и измерению корневых экссудатов люцерны при стрессе DEHP, а также по анализу данных метаболома. Пристальное внимание необходимо уделить некоторым критическим шагам в этом протоколе. В экспериментах по гидропонным культурам саженцы люцерны культивировали на гидропонике в стеклянных бутылках, наполненных питательными растворами с различными концентрациями DEHP. Стеклянные бутылки следует защищать от света, покрывая их алюминиевой фольгой в течение всего периода культивирования, чтобы предотвратить фотолиз DEHP и обеспечить однородность концентраций DEHP во всех питательных растворах25,26. Концентрации DEHP были установлены на уровне 1 мг L-1 и 10 мг L-1 в соответствии с концентрациями, обычно обнаруживаемыми в почвах, загрязненных DEHP27,28. Во время сбора корневых экссудатов центрифужные пробирки все равно нужно обернуть алюминиевой фольгой, чтобы защитить корни от света. Здесь время сбора было установлено на 6 часов. Если время сбора слишком короткое, концентрация некоторых корневых экссудатов с низкой численностью может быть слишком низкой, чтобы ее можно было обнаружить, поэтому состав корневых экссудатов может не отражать реальную реакцию проростков люцерны при стрессе DEHP. Если время сбора слишком велико, собранный корневой экссудат может быть в определенной степени разрушен микробами в культуральных системах. В этом случае также могут быть обнаружены некоторые микробные метаболиты, изменяющие состав корневых экссудатов29. Кроме того, по крайней мере, шесть повторов должны быть выполнены для каждого лечения, чтобы обеспечить точный анализ данных метаболома.

Только некоторые типы корневых экссудатов, такие как аминокислоты, жирные кислоты, фенольные соединения и другие органические кислоты, могут быть определены с использованием обычных целевых аналитических методов (т.е. поиска известных соединений)30,31,32 с использованием стандартных аналитических методов, таких как спектрофотометрия, жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ), ионная хроматография (IC), газовая хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ГХ-МС/МС) или комбинированная жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС). С развитием методов инструментального анализа появился нецелевой метаболомный анализ, основанный на ГХ-ТОФ-МС, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии высокого разрешения (ЖХ-ХР-МС) и ядерном магнитном резонансе (ЯМР)33. По сравнению с другими традиционными аналитическими методами корневых экссудатов, нецелевой метаболомный анализ значительно расширяет количество обнаруженных корневых экссудатов, что способствует глубокому пониманию метаболических реакций растений на стресс окружающей среды.

Методика в текущем исследовании имеет некоторые ограничения, особенно в количественном анализе метаболитов. Нецелевой метаболомный анализ демонстрирует только относительные количественные отношения между различными метаболитами, а не точные концентрации. Это неблагоприятно для исследований поведения в окружающей среде или экологического воздействия корневых экссудатов34. Для питательных сред проростков люцерны в текущем исследовании были проведены эксперименты с гидропонными культурами, которые обладают такими преимуществами, как простота управления и простота в эксплуатации. Однако искусственная гидропонная среда роста отличается от реальной почвенной среды, что приводит к возможной недооценке валовых скоростей экссудации из-за обратного захвата метаболитов корнями35. По сравнению с гидропонной культурой песчаная культура является относительно более убедительным методом, поскольку она ближе к реальной почвенной среде, облегчая сбор корневых экссудатов в реалистичной среде36. Поэтому в настоящее время ведутся работы по созданию метода культуры песка или даже реальной культуры почвы, чтобы сделать экспериментальные результаты более убедительными, что поможет нам провести более глубокие исследования, показывающие лучшие результаты, имеющие практическое значение для объяснения реакции токсичности.

Основываясь на нецелевом метаболическом анализе, мы можем не только исследовать метаболическую реакцию растений на экологический стресс37, но также определить дифференциальные метаболиты и далее исследовать важную роль дифференциальных метаболитов в экологическом поведении загрязняющих веществ38. Предыдущие исследования показали, что уровень пеларгоновой кислоты можно использовать в качестве индикатора повреждения корневой мембраны, когда растения находятся в состоянии стресса39. Также было обнаружено, что ненасыщенные жирные кислоты (пальмитиновая кислота) увеличивают текучесть мембран40, что может защитить мембраны корня люцерны от повреждения DEHP. Некоторые флавоноиды, ингибируемые DEHP, могут участвовать во взаимодействии между бобовыми и микроорганизмами. Кроме того, взаимодействия между растениями и ризосферным биологическим сообществом могут быть более глубоко расшифрованы с помощью нецелевого метаболического анализа, особенно в условиях стресса загрязняющих веществ41. Другие типы корневых экссудатов будут идентифицированы42 с разработкой аналитических инструментов для нецелевого метаболического анализа, который полезен для построения метаболомных отпечатков экссудатов корней растений43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана совместно Национальным фондом естественных наук Китая (41877139), Крупными проектами Национального фонда естественных наук Китая (41991335), Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2016YFD0800204), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (No BK20161616), Планом «135» и Программой границ Китайской академии наук (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
  2. Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
  3. van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
  4. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  5. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  6. Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
  7. Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
  8. Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
  9. Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
  10. Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
  11. Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
  12. Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
  13. Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
  14. Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
  15. Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
  16. Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
  17. vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
  18. Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
  19. Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
  20. Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
  21. Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
  22. Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
  23. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  24. Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  25. Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
  26. Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
  27. Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
  28. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  29. Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
  30. Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
  31. Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
  32. Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
  33. van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
  34. Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
  35. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  36. Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
  37. Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
  38. Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
  39. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
  40. Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
  41. Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
  42. Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
  43. Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 196
Сбор экссудатов корня люцерны для изучения влияния ди(2-этилгексил)фталата на продукцию метаболитов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter