Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

אוסף של שורש אלפלפה מפריש כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) פתלאט על ייצור מטבוליטים

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

הפרשת ההפרשה של שורשים היא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה על אספסת באמצעות ניתוח מטבולי לא ממוקד.

Abstract

הפרשות שורשים הן המדיה העיקרית של תקשורת מידע והעברת אנרגיה בין שורשי הצמח לסביבה. השינוי בהפרשת ההפרשה של שורשים הוא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה נועד להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) על ייצור מטבוליטים. ראשית, שתילי אספסת גדלים תחת לחץ DEHP בניסוי תרבית הידרופונית. שנית, הצמחים מועברים לצינורות צנטריפוגות המכילים 50 מ"ל מים אולטרה-טהורים מעוקרים למשך 6 שעות כדי לאסוף הפרשות שורשים. לאחר מכן התמיסות מיובשות בהקפאה במייבש בהקפאה בוואקום. הדגימות הקפואות מופקות ומפורקות באמצעות מגיב bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA). לאחר מכן, התמציות המפורקות נמדדות באמצעות מערכת כרומטוגרף גז יחד עם ספקטרומטר מסה בזמן טיסה (GC-TOF-MS). נתוני המטבוליטים שנרכשו מנותחים לאחר מכן על בסיס שיטות ביואינפורמטיקה. מטבוליטים דיפרנציאליים ומסלולי חילוף חומרים שהשתנו באופן משמעותי צריכים להיחקר לעומק כדי לחשוף את ההשפעה של DEHP על אספסת לאור הפרשות שורש.

Introduction

Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) הוא תרכובת כימית סינתטית הנמצאת בשימוש נרחב פלסטיק ופולימרים שונים כמו plasticizer כדי לשפר את הפלסטיות שלהם ואת החוזק. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים הציעו כי DEHP הוא משבש אנדוקריני ויש לו השפעה שלילית על מערכות הנשימה, העצבים והרבייה של בני אדם ובעלי חיים אחרים 1,2,3. בהתחשב בסיכון הבריאותי שלה, הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית, האיחוד האירופי ומרכז ניטור הסביבה של סין סיווגו כולם DEHP ברשימת המזהמים העדיפים. הקרקע נחשבת לכיור חשוב של DEHP בסביבה, בשל יישום חיפוי פלסטיק ודשנים אורגניים, השקיה במי קולחין ויישום חוות בוצה4. כצפוי, DEHP זוהה בכל מקום בקרקעות חקלאיות, שתכולתן מגיעה אפילו עד מיליגרם לקילוגרם של אדמה יבשה באזורים מסוימים בסין 5,6. DEHP יכול להיכנס לצמחים בעיקר דרך השורשים ולעבור הגדלה ביולוגית ברמות טרופיות שונות במערכות אקולוגיות בקרקע7. לכן, הועלה חשש משמעותי לגבי עקה הנגרמת על ידי DEHP בצמחים במהלך העשורים האחרונים.

צמחים בדרך כלל פגיעים לחשיפה ל- DEHP. לחץ DEHP נצפה כגורם להשפעה שלילית על נביטת זרעים ומטבוליזם תקין, ובכך מעכב צמיחה והתפתחות של צמחים 8,9. לדוגמה, DEHP יכול לגרום נזק חמצוני לתאי מזופיל, להפחית את תכולת הכלורופיל והאוסמוליטים, ולהגביר את פעילות האנזימים נוגדי החמצון, מה שבסופו של דבר גורם לירידה ביבול ובאיכות של צמחי מאכל10,11. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים על תגובת צמחים לעקה DEHP התמקדו בעקה חמצונית ובמאפיינים פיזיולוגיים וביוכימיים. המנגנונים המתאימים הקשורים למטבוליזם של צמחים נחקרים פחות. הפרשת שורשים היא מונח גנרי המתאר תרכובות ששורשי הצמח מפרישים ומשחררים לסביבה. הם נחשבו כאמצעי האינטראקציה בין צמחים לאדמת ריזוספרה, וממלאים תפקיד חשוב בתמיכה בצמיחה ובהתפתחות של צמחים12. ידוע כי הפרשות שורשים מהוות כ-30%-40% מכלל הפחמן הפוטוסינתטי13. בסביבות מזוהמות, הפרשות שורשים מעורבות בשיפור הסבילות של צמחים לעקה של מזהמים באמצעות חילוף חומרים או הרחקה חיצונית14. כתוצאה מכך, הבנה מעמיקה של תגובת שורשי הצמח להעקה של זיהום עשויה לסייע בחשיפת המנגנונים הבסיסיים הקשורים לביוכימיה של התא ולתופעות ביולוגיות15.

טכנולוגיית מטבולומיקה מספקת אסטרטגיה יעילה למדידת מספר רב של מטבוליטים של מולקולות קטנות בו זמנית בתוך תאים 16,17, רקמות18, ואפילו הפרשה של אורגניזמים 19, כולל סוכרים, חומצות אורגניות, חומצות אמינו ושומנים. בהשוואה לשיטות ניתוח כימיות מסורתיות או קלאסיות, גישת המטבולומיקה מגדילה מאוד את מספר המטבוליטים שניתן לזהות20, מה שיכול לסייע בזיהוי מטבוליטים בדרך תפוקה גבוהה יותר ובזיהוי מסלולים מטבוליים מרכזיים. מטבולומיקה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המחקר של תגובה ביולוגית בסביבות עקה, כגון מתכות כבדות21, מזהמים מתפתחים22 וננו-חלקיקים19. רוב המחקרים הללו על צמחים התמקדו בשינויים המטבוליים ברקמות הפנים של הצמח, בעוד שמעטים דווחו על התגובה של הפרשת שורשים לעקה סביבתית. לכן, מטרת מחקר זה היא להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של DEHP על ייצור מטבוליטים. התוצאות יספקו הנחיית שיטה למחקר המשך של מטבולומיקה של צמחים על ידי DEHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מטרת פרוטוקול זה היא לספק צינור כללי, מניסוי תרבית הידרופונית ועד אנליזה מטבולית, המכמת את ההשפעה של DEHP על הפרשות שורש אספסת.

1. ניסוי תרבית הידרופונית

הערה: פרוטוקול זה מציג דוגמה לניסוי תרבית הידרופונית אספסת שנועד להשיג שתילי אספסת (Medicago sativa) תחת לחץ של ריכוזים שונים של DEHP. נקבעו שלושה טיפולים: הבקרה ללא תוספות, ותמיסת התזונה זינקה עם 1 מ"ג ק"ג-1 ו-10 מ"ג ק"ג-1 של די(DEHP. ריכוזי DEHP נקבעו על פי התכולה האמיתית של DEHP בקרקע23. לכל טיפול היו שישה עותקים משוכפלים.

  1. יש לעקר זרעי אספסת עם 0.1% נתרן היפוכלוריט למשך 10 דקות ו-75% אלכוהול אתילי למשך 30 דקות.
    1. שטפו את הזרעים המעוקרים מספר פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן נבטו על נייר פילטר לח בצלחת פטרי סטרילית בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בחושך.
  2. מעבירים 20 זרעים אחידים, מונבטים וגדולים ושמנמנים לסלסלת קליטה בבקבוק תרבית מלא בתמיסה מזינה, המורכב (במיקרומטר): Ca(NO 3)2, 3,500; NH 4 H2PO4, 1,000; KNO3, 6,000; MgSO4, 2,000; Na2Fe-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 75; ח 3בו3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0.8; CuSO4, 0.3; וכן (NH4 )6Mo7O24, 0.02. התאם את pH הפתרון ל- 7.0 באמצעות 0.1 M KOH. חדש את כל הפתרונות מדי שבוע.
  3. הניחו את כל בקבוקי התרבית בתא גדילה מבוקר בעוצמת אור של 150-180 μmol m-2 s-1 עם תקופת צילום של 16 שעות בכל יום, ב 27 ° C ו 20 ° C המייצגים יום (16 שעות) ולילה (8 שעות), בהתאמה.
  4. העבירו 15 שתילי אספסת אחידים לבקבוק זכוכית חדש לניסויי תרבית תחת לחץ של 1 מ"ג ק"ג-1 ו-10 מ"ג ק"ג-1 DEHP לאחר שבועיים. עטפו את בקבוקי הזכוכית ברדיד אלומיניום ופרפילם כדי למנוע פוטוליזה ותנודתיות של DEHP. כדי להחיל את אותם תנאים, גם לעטוף את בקבוקי הבקרה עם רדיד אלומיניום parafilm. יש להשלים את התמיסה התזונתית מדי יום כדי לשמור על רמת הנוזלים.
  5. הניחו וסובבו את הבקבוקים באופן אקראי כל יומיים כדי להבטיח תנאי גידול עקביים לשתילי האספסת.
  6. לאחר 7 ימים של טיפוח, להסיר את שתילי אספסת מן הבקבוקים לשטוף עם מים טהורים מספר פעמים, מתכונן לאוסף של exudates שורש.

2. איסוף, מיצוי וניתוח מטבולומי של הפרשות שורשים

הערה: פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים: ניסוי איסוף, ניסוי מיצוי וניתוח מטבולי של הפרשות השורש. מטרת ניסוי האיסוף היא להעביר את המטבוליטים המופרשים בדגימות צמחים למערכת התמיסה לצורך מיצוי לאחר מכן.

  1. ניסוי איסוף
    1. מעבירים 10 שתילי אספסת אחידים לצינורות צנטריפוגות מלאים ב-50 מ"ל מים מעוקרים שעברו דה-יוניזציה. לטבול את השורשים במים כדי לאסוף שורש exudates במשך 6 שעות; שמור על הצינורות זקופים. בצע לפחות שישה עותקים משוכפלים עבור כל טיפול.
    2. עטפו את צינורות הצנטריפוגה ברדיד אלומיניום כדי להגן על השורשים מפני אור.
    3. מוציאים את הצמחים ומייבשים בהקפאה את הנוזל שנאסף לאפיון מטבוליטים.
  2. ניסוי מיצוי
    1. הוסף 1.8 מ"ל של תמיסת מיצוי (מתנול:H2O = 3:1, V/V) לצינורות ולמערבולת למשך 30 שניות.
    2. החל גלי אולטרסאונד על הצינורות במשך 10 דקות באמבט מי קרח.
    3. צנטריפוגה את הדגימות ב 4 ° C ו 11,000 × גרם במשך 15 דקות.
    4. בזהירות להעביר 200 μL של supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. קח 45 μL של supernatant מכל דגימה וערבב אותו לתוך דגימות בקרת איכות (QC) בנפח סופי של 270 μL, המשמש לכיול של נתוני מטבוליזם של דגימות.
    5. ייבשו בהקפאה את התמציות ברכז ואקום. המשך ייבוש עם 5 μL של התקן הפנימי (ribonucleol).
    6. לאחר אידוי ברכז ואקום, להוסיף 30 μL של הידרוכלוריד methoxyamination (מומס בפירידין בריכוז של 20 מ"ג mL-1) לצינורות לדגור את הצינורות ב 80 ° C במשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 40 μL של מגיב bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) (עם 1% trimethylchlorosilane [TMC], V/V) ומקם את הצינורות ב 70 ° C למשך 1.5 שעות עבור derivatization.
    7. קררו את הדגימות לטמפרטורת החדר והוסיפו 5 מיקרוליטר של אסטרי מתיל חומצות שומן (FAMEs) (בכלורופורם) לדגימות QC.
  3. ניתוח מטאבולומי
    1. הזריקו 1.0 μL של התמציות המפורקות למערכת כרומטוגרף גז המצומדת לספקטרומטר מסות זמן טיסה (GC-TOF-MS) לניתוח פרופיל מטאבולומי באמצעות מצב מפוצל.
      1. השתמש בעמוד נימי (30 מ 'x 250 מיקרומטר x 0.25 מיקרומטר) להפרדת הפרשות שורשים, עם הליום כגז מוביל בקצב זרימה של 1.0 מ"ל min-1. הגדר את טמפרטורת ההזרקה ל- 280 ° C, ושמור על טמפרטורת קו ההעברה וטמפרטורת מקור היונים ב- 280 ° C ו- 250 ° C, בהתאמה.
      2. להפרדה, יש להשתמש בתוכנית התנור הבאה: חימום איזותרמי בדקה אחת ב-50°C, כבש תנור בטמפרטורה של 10°C/min-1 בטמפרטורה של 310°C, וחימום איזותרמי סופי ב-310°C למשך 8 דקות.
      3. בצע מצב התנגשות אלקטרונים עם -70 eV של אנרגיה. קבל ספקטרום מסות באמצעות מצב ניטור סריקה מלא עם טווח סריקת מסה של 50-500 m/z בקצב של 12.5 ספקטרום/שנייה.
    2. סנן פסגות בודדות כדי להסיר רעש. ערך הסטייה מסונן בהתבסס על הטווח הבין-רבעוני.
    3. מלא את הערכים החסרים במחצית מערכי המינימום, תקן ונרמל את הנתונים.
    4. ייבא את הנתונים הסופיים בפורמט .csv לתוכנת ניתוח סטטיסטי לצורך ניתוח רב-משתני.
    5. חפש את המטבוליטים במסד הנתונים של האנציקלופדיה לגנים וגנומים של קיוטו (KEGG) (משאב מסד נתונים להבנת פונקציות ושירותים ברמה גבוהה של המערכת הביולוגית), וסווג את המטבוליטים לקטגוריות שונות, כגון פחמימות, חומצות, שומנים, אלכוהולים ואמינים. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי כדי לבנות תרשים עוגה כדי לציין את האחוז של כל קטגוריה בכל הפרשות הבסיס.
    6. החל תחזיות אורתוגונליות מפוקחות על ניתוח מבנים סמויים - הבחנה (OPLS-DA) כדי להדגים את ההבדלים בין קבוצות.
    7. המסך שינה באופן משמעותי מטבוליטים כמטבוליטים דיפרנציאליים בהתבסס על חשיבות משתנה בהקרנה (VIP) > 1 ו - p < 0.05 (מבחן t של סטודנט).
    8. השתמש בנתוני חילוף החומרים כדי לבנות מפות חום עם תוכנת הניתוח הסטטיסטי והשתמש בשינויי הקיפול תחת טיפולים שונים כדי לבנות היסטוגרמות.
    9. חפש את המטבוליטים הדיפרנציאליים במסד הנתונים KEGG וב- Pubchem והידור את המסלולים המטבוליים המכילים את המטבוליטים הדיפרנציאליים. ביצוע ניתוח העשרת מסלולים או ניתוח טופולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניסוי הזה אספו הפרשות שורש אספסת, חילצו ונותחו בהתאם לשיטות לעיל (איור 1). הוקמו שלוש קבוצות טיפול: בקרה, ריכוז נמוך של DEHP (1 מ"ג L−1), וריכוז גבוה של DEHP (10 מ"ג L−1).

בסך הכל התגלו 778 פסגות בכרומטוגרף של הביקורת, מתוכן ניתן לזהות 314 מטבוליטים על פי ספקטרום המסות. כפי שניתן לראות באיור 2, ניתן לסווג את המטבוליטים האלה לשישה סוגים בהתבסס על השפע היחסי: פחמימות (28.6%), חומצות (15.58%), שומנים (13.87%), אלכוהולים (3.91%), אמינים (0.92%) ואחרים (37.12%). מטבוליטים שהיוו פחות מ-0.5% קובצו כחומרים אחרים (איור 2A). החומצות חולקו גם לחומצות שומן (56.09%), חומצות אמינו (26.62%), חומצות אורגניות (13.95%) וחומצות פנוליות (3.34%) (איור 2B). נוסף על כך, ניתן לזהות כמה חומרים נפוצים בהפרשת השורשים של רוב הצמחים גם בהפרשות שורש אספסת, כולל פירימידינים, פירידינים הידרוקסיים, פלבנואידים, פנולים, קטונים, פירימידינים, פלבנואידים ודיטרפנים.

מפת חום שורטטה כדי להמחיש את השונות במטבוליטים דיפרנציאליים בין טיפולי DEHP שונים, בהתבסס על ציון VIP (איור 3). בהשוואה לקבוצת הביקורת, החשיפה ל-DEHP שינתה באופן משמעותי את תכולת 50 המטבוליטים בהפרשות שורש אספסת, בעיקר כולל פחמימות מסוימות וחומצות אורגניות בעלות משקל מולקולרי נמוך. חמישה סוגים של פחמימות (ליקסוז, דיגיטוקסוז, אריתרוז, טרהלוז ופרוקטוז 2, 6-ביזפט) עברו רגולציה מוגברת בנוכחות DEHP, ושניים מהם (ליקסוס ודיגיטוקסוז) הוגדלו באופן משמעותי ככל שריכוז DEHP עלה. בנוסף, חמישה מטבוליטים עברו ירידה ברגולציה בנוכחות DEHP, כולל חד-סוכרים כגון D-talose וגלוקוז, דו-סוכרים כגון מלטוז, צלוליוז וטרהלוז, וסוכרים אלכוהוליים כגון D-ארביטול. תכולת הפחמימות נחשבה כאינדיקטור למצב פיזיולוגי של הצמח24. לכן, הירידה ברמות החד-סוכר והדיסכריד כאן הצביעה על לחץ פיזיולוגי הנגרם על ידי לחץ DEHP. בהשוואה לפחמימות, DEHP השפיע יותר על חילוף החומרים החומצי בשתילי אספסת. תחת חשיפה ל-DEHP, תכולתם של 11 מטבוליטים של חומצה עלתה באופן משמעותי, בעיקר כולל חומצה 2-אמינו-2-נורבורנאןקרבוקסילית, 5-הידרוקסינדול-2-חומצה קרבוקסילית, 3-הידרוקסי-L-פרולין, חומצה פלרגונית וחומצה פלמיטית. במקביל, DEHP גם עיכב את חילוף החומרים של כמה פלבנואידים בשתילי אספסת, כולל 4', 5-dihyrroxy-7-methoxyisoflavone ו neohesperidin.

המסלולים המטבוליים המושפעים מ-DEHP מתוארים באיור 4. DEHP עיכב באופן משמעותי את חילוף החומרים של פחמימות, כגון כמה monosaccharides ו disaccharides, שהם תוצרים של פוטוסינתזה. לכן, DEHP יכול לדכא את הפוטוסינתזה של אספסת במידה מסוימת. יתר על כן, DEHP יכול לקדם את חילוף החומרים של חומצות שומן, אשר מועילות לצמחים להתנגד ללחץ מ- DEHP. המסלולים המטבוליים העיקריים שהושפעו מ- DEHP היו מטבוליזם של פחמימות ומטבוליזם של חומצות שומן, בעוד שמטבוליזם של חומצות אמינו, מטבוליזם שומנים ומחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA) הושפעו במידה פחותה בהרבה.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של אנליזה מטבולומית לא ממוקדת עבור הפרשות שורש אספסת. BSTFA מייצג מגיב bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) (עם 1% trimethylchlorosilane [TMC], V/V). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סיווג של מטבוליטים. (A) סיווג של המטבוליטים הידועים ו-(B) חומצות. האחוז של כל סוג חומר מחולק בסכום שטח השיא של כל קטגוריה בסכום שטח השיא של כל החומרים בבקרה. חומרים אחרים היו אלה ב -<0.5%. חומצות אחרות היו אלה עם 0.5% <%. נתון זה שונה מ- Wang et al.25. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מפת חום של ניתוח אשכולות היררכי עבור הפרשת שורשים (VIP > 1, p < 0.05) של שתילי אספסת עם טיפולי DEHP שונים. אדום וירוק מייצגים שפע גבוה ונמוך, בהתאמה. ACK מייצג את הפקד; 1+AD מייצג את הטיפול עם 1 מ"ג L−1 DEHP; 10+AD מייצג את הטיפול עם 10 מ"ג L−1 DEHP. נתון זה שונה מ- Wang et al.25. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קשרים בין הפרעה במסלולים מטבוליים לבין שינויים בנקודות קצה ביולוגיות (1 מ"ג L−1 DEHP, 10 מ"ג L−1 DEHP). המסלולים המטבוליים הוקמו על בסיס מסד הנתונים של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG). המטבוליטים בטקסט ירוק היו המטבוליטים שזוהו בעבודה הנוכחית. הסימנים "תיבות אדומות" ו"תיבות כחולות" בסוגריים מצביעים על כך שמטבוליטים הגדילו (p < 0.05) או קטנו (p < 0.05) תרומות לנקודות הקצה הביולוגיות, בהתאמה. האיור נעשה קריא על ידי הפרדת המטבוליטים בערך למטבוליזם של פחמימות, חומצות שומן וחלבונים, כפי שמוצג על ידי הקופסאות המלבניות הירוקות, האדומות והשחורות, בהתאמה. ACK מייצג את הפקד; 1+AD מייצג את הטיפול עם 1 מ"ג L−1 DEHP; 10+AD מייצג את הטיפול עם 10 מ"ג L−1 DEHP. נתון זה שונה מ- Wang et al.25. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מספק הדרכה כללית כיצד לאסוף ולמדוד את הפרשות השורש של אספסת תחת לחץ DEHP, כמו גם כיצד לנתח את נתוני חילוף החומרים. יש להקדיש תשומת לב רבה לכמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. בניסויים בתרבית הידרופונית, שתילי אספסת תורבתו הידרופונית בבקבוקי זכוכית מלאים בתמיסות מזון עם ריכוזים שונים של DEHP. יש להגן על בקבוקי הזכוכית מפני אור על ידי כיסויים ברדיד אלומיניום לאורך כל תקופת התרבית, על מנת למנוע פוטוליזה של DEHP ולהבטיח אחידות בריכוזי DEHP בכל פתרונות התרבית25,26. ריכוזי DEHP נקבעו כ-1 מ"ג L-1 ו-10 מ"ג L-1, על פי הריכוזים המצויים בדרך כלל בקרקעות מזוהמותב-DEHP 27,28. במהלך איסוף הפרשות השורש, צינורות הצנטריפוגות עדיין צריכים להיות עטופים ברדיד אלומיניום כדי להגן על השורשים מפני אור. כאן, זמן האיסוף נקבע להיות 6 שעות. אם זמן האיסוף קצר מדי, הריכוז של חלק מההפרשות של שורשים בשפע נמוך עשוי להיות נמוך מכדי שניתן יהיה להבחין בו, כך שהרכב ההפרשה של השורש עשוי שלא לשקף את התגובה האמיתית של שתילי אספסת תחת לחץ DEHP. אם זמן האיסוף ארוך מדי, הפרשות השורש שנאספו עלולות להתפרק במידה מסוימת על ידי מיקרובים במערכות התרבית. במקרה זה, כמה מטבוליטים מיקרוביאליים עשויים גם להיות מזוהים, שינוי הרכב השורש exudates29. יתר על כן, יש לבצע לפחות שישה עותקים משוכפלים עבור כל טיפול על מנת להבטיח ניתוח מדויק של נתוני חילוף החומרים.

רק סוגים מסוימים של הפרשות שורש, כגון חומצות אמינו, חומצות שומן, תרכובות פנוליות וחומצות אורגניות אחרות, ניתנים לקביעה באמצעות שיטות אנליטיות ממוקדות קונבנציונליות (כלומר, חיפוש תרכובות ידועות)30,31,32, תוך שימוש בשיטות אנליטיות סטנדרטיות, כגון ספקטרופוטומטריה, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC), כרומטוגרפיית יונים (IC), כרומטוגרפיית גזים-ספקטרומטריית מסה טנדם (GC-MS/MS), או כרומטוגרפיה נוזלית משולבת עם ספקטרומטריית מסות טנדם (LC-MS/MS). עם התפתחות טכניקות ניתוח אינסטרומנטליות, התפתחה אנליזה מטבולומית לא ממוקדת המבוססת על GC-TOF-MS, כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (LC-HR-MS) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR)33. בהשוואה לשיטות אנליטיות קונבנציונליות אחרות של הפרשת שורשים, ניתוח מטבולי לא ממוקד מרחיב מאוד את מספר הפרשות השורש שזוהו, מה שמאפשר הבנה מעמיקה של תגובות מטבוליות של צמחים לעקה סביבתית.

לטכניקה במחקר הנוכחי יש כמה מגבלות, במיוחד בניתוח כמותי של מטבוליטים. ניתוח מטבולומי לא ממוקד רק מדגים את היחסים הכמותיים היחסיים בין מטבוליטים שונים, ולא ריכוזים מדויקים. זה שלילי עבור חקירות של התנהגויות סביבתיות או השפעות אקולוגיות של הפרשות שורש34. עבור מצע הגידול של שתילי אספסת, בוצעו במחקר הנוכחי ניסויי תרבית הידרופונית, שיש להם את היתרונות של שליטה קלה והפעלה קלה. עם זאת, סביבת הגידול ההידרופונית המלאכותית שונה מסביבת הקרקע האמיתית, מה שמוביל להערכת חסר אפשרית של שיעורי ההפרשה ברוטו עקב ספיגה מחדש של מטבוליטים על ידי שורשים35. בהשוואה לתרבות הידרופונית, תרבית חול היא שיטה משכנעת יותר באופן יחסי, משום שהיא קרובה יותר לסביבת הקרקע האמיתית, ומאפשרת איסוף של הפרשות שורשים בסביבה מציאותית36 . לכן, מתבצעת עבודה להקמת שיטה של תרבית חול או אפילו תרבית קרקע אמיתית כדי להפוך את תוצאות הניסוי למשכנעות יותר, מה שיעזור לנו לערוך מחקר מעמיק יותר, המציג תוצאות טובות יותר בעלות משמעות מעשית להסבר תגובת הרעילות.

בהתבסס על הניתוח המטבולי הלא ממוקד, אנו יכולים לא רק לחקור את התגובה המטבולית של צמחים לעקה סביבתית37, אלא גם לקבוע מטבוליטים דיפרנציאליים ולהמשיך לחקור את התפקיד החשוב של מטבוליטים דיפרנציאליים בהתנהגות הסביבתית של מזהמים38. מחקרים קודמים הראו כי רמת חומצה פלרגונית יכולה לשמש אינדיקטור לנזק לקרום השורש כאשר צמחים נמצאים תחת לחץ39. חומצות שומן בלתי רוויות (חומצה פלמיטית) נמצאו גם כמגבירות את נזילות הממברנה40, מה שעשוי להגן על קרומי שורש האספסת מפני נזקי DEHP. חלק מהפלבנואידים המעוכבים על ידי DEHP יכולים להשתתף באינטראקציה בין קטניות ומיקרואורגניזמים. יתר על כן, יחסי הגומלין בין צמחים לקהילה הביולוגית של ריזוספרה עשויים להיות מפוענחים באופן עמוק יותר באמצעות ניתוח מטבולי לא ממוקד, במיוחד תחת לחץ של מזהמים41. סוגים נוספים של הפרשת שורשים יזוהו42 עם פיתוח מכשירים אנליטיים לאנליזה מטבולית לא ממוקדת, המועילה לבניית טביעת אצבע מטבולית של הפרשות שורש צמח43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41877139), הפרויקטים העיקריים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41991335), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFD0800204), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (מס 'BK20161616), תוכנית "135" ותוכנית הגבולות של האקדמיה הסינית למדעים (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
  2. Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
  3. van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
  4. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  5. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  6. Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
  7. Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
  8. Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
  9. Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
  10. Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
  11. Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
  12. Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
  13. Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
  14. Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
  15. Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
  16. Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
  17. vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
  18. Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
  19. Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
  20. Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
  21. Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
  22. Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
  23. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  24. Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  25. Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
  26. Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
  27. Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
  28. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  29. Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
  30. Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
  31. Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
  32. Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
  33. van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
  34. Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
  35. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  36. Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
  37. Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
  38. Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
  39. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
  40. Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
  41. Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
  42. Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
  43. Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 196
אוסף של שורש אלפלפה מפריש כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) פתלאט על ייצור מטבוליטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter