Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

مجموعة من إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات على إنتاج الأيض

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

عادة ما يكون إفراز إفرازات الجذر استراتيجية خارجية لإزالة السموم للنباتات تحت ظروف الإجهاد. يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم تأثير xenobiotics على البرسيم من خلال التحليل الأيضي غير المستهدف.

Abstract

إفرازات الجذر هي الوسائط الرئيسية لتوصيل المعلومات ونقل الطاقة بين جذور النباتات والبيئة المحيطة. عادة ما يكون التغيير في إفراز إفرازات الجذر استراتيجية خارجية لإزالة السموم للنباتات في ظل ظروف الإجهاد. يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم إرشادات عامة لجمع إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات (DEHP) على إنتاج المستقلب. أولا ، تزرع شتلات البرسيم تحت ضغط DEHP في تجربة الاستزراع المائي. ثانيا ، يتم نقل النباتات إلى أنابيب طرد مركزي تحتوي على 50 مل من الماء المعقم عالي النقاء لمدة 6 ساعات لجمع إفرازات الجذر. ثم يتم تجفيف المحاليل بالتجميد في مجفف تجميد بالفراغ. يتم استخراج العينات المجمدة واشتقاقها باستخدام كاشف ثنائي (ثلاثي ميثيل سيليل)) ثلاثي فلورو أسيتاميد (BSTFA). بعد ذلك ، يتم قياس المستخلصات المشتقة باستخدام نظام كروماتوجراف الغاز إلى جانب مطياف كتلة وقت الرحلة (GC-TOF-MS). ثم يتم تحليل بيانات الأيض المكتسبة بناء على طرق المعلوماتية الحيوية. يجب استكشاف المستقلبات التفاضلية ومسارات التمثيل الغذائي المتغيرة بشكل كبير للكشف عن تأثير DEHP على البرسيم في ضوء إفرازات الجذر.

Introduction

Di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) هو مركب كيميائي اصطناعي يستخدم على نطاق واسع في العديد من المواد البلاستيكية والبوليمرات كملدنات لتحسين اللدونة والقوة. في السنوات القليلة الماضية ، اقترح عدد متزايد من الدراسات أن DEHP هو اضطراب الغدد الصماء وله تأثير سلبي على الجهاز التنفسي والعصبي والتناسلي للبشر والحيوانات الأخرى1،2،3. بالنظر إلى المخاطر الصحية ، صنفت وكالة حماية البيئة الأمريكية والاتحاد الأوروبي ومركز المراقبة البيئية في الصين DEHP في قائمة الملوثات ذات الأولوية. تعتبر التربة بالوعة مهمة ل DEHP في البيئة ، بسبب استخدام التغطية البلاستيكية والأسمدة العضوية ، والري بمياه الصرف الصحي ، وتطبيق مزرعة الحمأة4. كما هو متوقع ، تم اكتشاف DEHP في كل مكان في تربة الأراضي الزراعية ، والتي يصل محتواها إلى ملليغرام لكل كيلوغرام من التربة المجففة في بعض المناطق في الصين 5,6. يمكن أن يدخل DEHP النباتات بشكل رئيسي عن طريق الجذور ويخضع للتضخم الأحيائي على مستويات غذائية مختلفة في النظم الإيكولوجية للتربة7. لذلك ، أثير قلق كبير بشأن الإجهاد الناجم عن DEHP في النباتات على مدى العقود الأخيرة.

عادة ما تكون النباتات عرضة للتعرض ل DEHP. لوحظ أن إجهاد DEHP له تأثير سلبي على إنبات البذور والتمثيل الغذائي الطبيعي ، وبالتالي يمنع نمو النبات وتطوره 8,9. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي DEHP إلى حدوث ضرر تأكسدي لخلايا الميزوفيل ، وتقليل محتويات الكلوروفيل والأوسموليت ، ورفع أنشطة الإنزيم المضاد للأكسدة ، مما يؤدي في النهاية إلى انخفاض في إنتاجية وجودة النباتات الصالحة للأكل10,11. ومع ذلك ، فإن معظم الدراسات السابقة حول استجابة النباتات لإجهاد DEHP قد ركزت على الإجهاد التأكسدي والخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية. الآليات المقابلة المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي للنبات أقل دراسة. إفرازات الجذر مصطلح عام يصف المركبات التي تفرزها جذور النباتات وتطلقها في البيئة. وقد تم اعتبارها وسائط تفاعل بين النباتات وتربة الجذور ، وتلعب دورا مهما في دعم نمو النبات وتطوره12. من المعروف جيدا أن إفرازات الجذر تمثل حوالي 30٪ -40٪ من جميع الكربون الضوئي13. في البيئات الملوثة ، تشارك إفرازات الجذر في تحسين تحمل النباتات لإجهاد الملوثات من خلال التمثيل الغذائي أو الاستبعاد الخارجي14. نتيجة لذلك ، قد يساعد الفهم العميق لاستجابة إفرازات جذور النبات لإجهاد التلوث في الكشف عن الآليات الأساسية المرتبطة بالكيمياء الحيوية للخلايا والظواهر البيولوجية15.

توفر تقنية الأيض استراتيجية فعالة لقياس عدد كبير من مستقلبات الجزيئات الصغيرة في وقت واحد داخل الخلايا 16,17 ، والأنسجة18 ، وحتى إفرازات الكائناتالحية 19 ، بما في ذلك السكريات والأحماض العضوية والأحماض الأمينية والدهون. بالمقارنة مع طرق التحليل الكيميائي التقليدية أو الكلاسيكية ، فإن نهج الأيض يزيد بشكل كبير من عدد المستقلبات التي يمكن اكتشافها20 ، والتي يمكن أن تساعد في تحديد المستقلبات بطريقة إنتاجية أعلى وتحديد المسارات الأيضية الرئيسية. تم استخدام الأيض على نطاق واسع في مجال أبحاث الاستجابة البيولوجية في بيئات الإجهاد ، مثل المعادن الثقيلة21 ، والملوثات الناشئة22 ، والجسيمات النانوية19. ركزت معظم هذه الدراسات على النباتات على التغيرات الأيضية في الأنسجة النباتية الداخلية ، في حين تم الإبلاغ عن القليل منها حول استجابة إفرازات الجذر للإجهاد البيئي. لذلك ، فإن الهدف من هذه الدراسة هو تقديم إرشادات عامة لجمع إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير DEHP على إنتاج الأيض. ستوفر النتائج إرشادات طريقة لدراسة متابعة الأيض النباتي بواسطة DEHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خط أنابيب عام ، من تجربة الاستزراع المائي إلى التحليل الأيضي ، وتحديد تأثير DEHP على إفرازات جذر البرسيم.

1. تجربة الزراعة المائية

ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول مثالا على تجربة الاستزراع المائي البرسيمي المصممة للحصول على شتلات البرسيم (Medicago sativa) تحت ضغط تركيزات مختلفة من DEHP. تم إعداد ثلاث معالجات: التحكم دون أي إضافات ، وارتفع محلول المغذيات مع 1 ملغ كجم -1 و 10 ملغ كجم -1 من di(DEHP. تم تحديد تركيزات DEHP وفقا للمحتوى الحقيقي ل DEHP في التربة23. كان لكل علاج ستة تكرارات.

  1. تعقيم بذور البرسيم مع 0.1٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 10 دقائق و 75٪ الكحول الإيثيلي لمدة 30 دقيقة.
    1. اشطف البذور المعقمة عدة مرات بالماء المقطر ثم تنبت على ورق ترشيح رطب في طبق بتري معقم على حرارة 30 درجة مئوية في الظلام.
  2. نقل 20 بذرة موحدة ، نابتة ، كبيرة ممتلئة الجسم إلى سلة نقش في زجاجة مزرعة مملوءة بمحلول مغذي ، تتكون من (بالميكرومتر): Ca (NO3) 2 ، 3500 ؛ NH 4 H2PO4، 1000 ؛ KNO3 ، 6000 ؛ MgSO4 ، 2000 ؛ Na2حمض الحديد إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، 75 ؛ ح 3بو3 ، 46 ؛ منسو4 ، 9.1 ؛ زنسو4 ، 0.8 ؛ كوسو4 ، 0.3 ؛ و (NH4 )6Mo7O24 ، 0.02. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 7.0 باستخدام 0.1 M KOH. تجديد جميع الحلول أسبوعيا.
  3. ضع جميع زجاجات الاستزراع في غرفة نمو خاضعة للرقابة بكثافة ضوء تبلغ 150-180 ميكرومول م -2 s-1 مع فترة ضوئية تبلغ 16 ساعة كل يوم ، عند 27 درجة مئوية و 20 درجة مئوية تمثل النهار (16 ساعة) والليل (8 ساعات) ، على التوالي.
  4. نقل 15 شتلة البرسيم موحدة إلى زجاجة زجاجية جديدة لتجارب الاستزراع تحت 1 ملغ كجم -1 و 10 ملغ كجم -1 الإجهاد DEHP بعد أسبوعين. لف الزجاجات بورق الألمنيوم والبارافيلم لمنع التحلل الضوئي وتطاير DEHP. لتطبيق نفس الشروط ، قم أيضا بلف زجاجات التحكم بورق الألمنيوم والبارافيلم. تكملة محلول المغذيات يوميا للحفاظ على مستوى السائل.
  5. ضع الزجاجات وقم بتدويرها بشكل عشوائي كل 2 أيام لضمان ظروف نمو متسقة لشتلات البرسيم.
  6. بعد 7 أيام من الزراعة ، قم بإزالة شتلات البرسيم من الزجاجات واغسلها بالماء النقي عدة مرات ، استعدادا لجمع إفرازات الجذر.

2. جمع واستخراج وتحليل التمثيل الغذائي لإفرازات الجذر

ملاحظة: ينقسم هذا البروتوكول إلى ثلاثة أجزاء: تجربة التجميع ، وتجربة الاستخراج ، والتحليل الأيضي لإفرازات الجذر. الهدف من تجربة الجمع هو نقل المستقلبات التي تفرز في عينات النبات إلى نظام المحلول لاستخراجها لاحقا.

  1. تجربة التجميع
    1. نقل 10 شتلات برسيم موحدة إلى أنابيب الطرد المركزي المملوءة ب 50 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. اغمر الجذور في الماء لجمع إفرازات الجذر لمدة 6 ساعات ؛ حافظ على الأنابيب في وضع مستقيم. قم بإجراء ستة تكرارات على الأقل لكل علاج.
    2. لف أنابيب الطرد المركزي بورق الألمنيوم لحماية الجذور من الضوء.
    3. قم بإزالة النباتات وتجفيف السائل الذي تم جمعه لتنميط المستقلب.
  2. تجربة الاستخراج
    1. أضف 1.8 مل من محلول الاستخلاص (الميثانول:H 2O = 3: 1 ، V / V) إلى الأنابيب والدوامة لمدة 30 ثانية.
    2. ضع الموجات فوق الصوتية على الأنابيب لمدة 10 دقائق في حمام ماء مثلج.
    3. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 4 درجات مئوية و 11000 × جم لمدة 15 دقيقة.
    4. انقل بعناية 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. خذ 45 ميكرولتر من المادة الطافية من كل عينة واخلطها في عينات مراقبة الجودة (QC) بحجم نهائي يبلغ 270 ميكرولتر ، والذي يستخدم لمعايرة بيانات الأيض للعينات.
    5. قم بتجميد وتجفيف المستخلصات في مكثف فراغ. استمر في التجفيف باستخدام 5 ميكرولتر من المعيار الداخلي (الريبونوكليول).
    6. بعد التبخر في مكثف فراغ ، أضف 30 ميكرولتر من هيدروكلوريد ميثوكسياأمينيون (مذاب في البيريدين بتركيز 20 مجم مل -1) إلى الأنابيب واحتضان الأنابيب عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 40 ميكرولتر من كاشف ثنائي (ثلاثي ميثيل سيليل) ثلاثي فلورو أسيتاميد (BSTFA) (مع 1٪ ثلاثي ميثيل كلورو سيلان [TMC] ، V / V) إلى العينات وضع الأنابيب عند 70 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للاشتقاق.
    7. قم بتبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة وأضف 5 ميكرولتر من استرات ميثيل الأحماض الدهنية (FAMEs) (في الكلوروفورم) إلى عينات مراقبة الجودة.
  3. التحليل الأيضي
    1. حقن 1.0 ميكرولتر من المستخلصات المشتقة في نظام كروماتوجراف الغاز المقترن بمطياف كتلة وقت الرحلة (GC-TOF-MS) لتحليل التنميط الأيضي باستخدام وضع غير مقسم.
      1. استخدم عمودا شعريا (30 م × 250 ميكرومتر × 0.25 ميكرومتر) لفصل إفرازات الجذر ، مع الهيليوم كغاز ناقل بمعدل تدفق 1.0 مل دقيقة -1. اضبط درجة حرارة الحقن على 280 درجة مئوية ، وحافظ على درجة حرارة خط النقل ودرجة حرارة مصدر الأيونات عند 280 درجة مئوية و 250 درجة مئوية على التوالي.
      2. للفصل ، استخدم برنامج الفرن التالي: 1 دقيقة تسخين متساوي الحرارة عند 50 درجة مئوية ، منحدر فرن 10 درجة مئوية / دقيقة -1 إلى 310 درجة مئوية ، وتسخين نهائي متساوي الحرارة عند 310 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
      3. أداء وضع تصادم الإلكترون مع -70 فولت من الطاقة. الحصول على أطياف الكتلة باستخدام وضع مراقبة المسح الكامل مع نطاق مسح كتلي من 50-500 م / ض بمعدل 12.5 أطياف / ثانية.
    2. تصفية القمم الفردية لإزالة الضوضاء. تتم تصفية قيمة الانحراف بناء على النطاق الربيعي.
    3. املأ القيم المفقودة بنصف القيم الدنيا وقم بتوحيد البيانات وتطبيعها.
    4. استيراد البيانات النهائية بتنسيق .csv إلى برنامج التحليل الإحصائي للتحليل متعدد المتغيرات.
    5. ابحث عن المستقلبات في قاعدة بيانات موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) (مورد قاعدة بيانات لفهم الوظائف والمرافق عالية المستوى للنظام البيولوجي) ، وصنف المستقلبات إلى فئات مختلفة ، مثل الكربوهيدرات والأحماض والدهون والكحول والأمينات. استخدم برنامج التحليل الإحصائي لإنشاء مخطط دائري للإشارة إلى النسبة المئوية لكل فئة في جميع إفرازات الجذر.
    6. تطبيق الإسقاطات المتعامدة الخاضعة للإشراف على تحليل تمييز الهياكل الكامنة (OPLS-DA) لتوضيح الاختلافات بين المجموعات.
    7. شاشة المستقلبات تغيرت بشكل كبير كمستقلبات تفاضلية بناء على أهمية متغيرة في الإسقاط (VIP) > 1 و p < 0.05 (اختبار t للطالب).
    8. استخدم بيانات الأيض لإنشاء خرائط حرارية باستخدام برنامج التحليل الإحصائي واستخدم تغييرات الطيات تحت معالجات مختلفة لبناء الرسوم البيانية.
    9. ابحث عن المستقلبات التفاضلية في قاعدة بيانات KEGG و Pubchem وقم بتجميع المسارات الأيضية التي تحتوي على المستقلبات التفاضلية. إجراء تحليل إثراء المسار أو تحليل الطوبولوجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه التجربة ، تم جمع إفرازات جذر البرسيم واستخراجها وتحليلها وفقا للطرق المذكورة أعلاه (الشكل 1). تم إنشاء ثلاث مجموعات علاجية: السيطرة ، تركيز منخفض من DEHP (1 ملغ L − 1) ، وتركيز عال من DEHP (10 ملغ L − 1).

تم اكتشاف ما مجموعه 778 قمة في كروماتوجراف التحكم ، منها 314 مستقلبا يمكن تحديدها وفقا لأطياف الكتلة. كما هو موضح في الشكل 2 ، يمكن تصنيف هذه المستقلبات إلى ستة أنواع بناء على الوفرة النسبية: الكربوهيدرات (28.6٪) ، والأحماض (15.58٪) ، والدهون (13.87٪) ، والكحول (3.91٪) ، والأمينات (0.92٪) ، وغيرها (37.12٪). تم تجميع المستقلبات التي تمثل أقل من 0.5٪ كمواد أخرى (الشكل 2 أ). تم تقسيم الأحماض إلى أحماض دهنية (56.09٪) وأحماض أمينية (26.62٪) وأحماض عضوية (13.95٪) وأحماض فينولية (3.34٪) (الشكل 2 ب). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا اكتشاف بعض المواد الشائعة في إفرازات جذر معظم النباتات في إفرازات جذر البرسيم ، بما في ذلك البيريميدين ، والهيدروكسي بيريدينات ، والفلافونويد ، والفينولات ، والكيتونات ، والبيريميدين ، والفلافونويد ، والديتيربين.

تم رسم خريطة حرارية لتصور التباين في المستقلبات التفاضلية بين علاجات DEHP المختلفة ، بناء على درجة VIP (الشكل 3). بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، أدى التعرض ل DEHP إلى تغيير كبير في محتوى 50 مستقلبا في إفرازات جذر البرسيم ، بما في ذلك بشكل أساسي بعض الكربوهيدرات والأحماض العضوية منخفضة الوزن الجزيئي. تم تنظيم خمسة أنواع من الكربوهيدرات (الليكسوس ، الديجيتوكوز ، الإريثروز ، الترهالوز ، والفركتوز 2 ، 6-bihosphate) في وجود DEHP ، واثنان منها (الليكوز والديجيتوكسوز) تمت زيادتهما بشكل كبير مع زيادة تركيز DEHP. بالإضافة إلى ذلك ، تم تخفيض تنظيم خمسة مستقلبات في وجود DEHP ، بما في ذلك السكريات الأحادية مثل D-talose والجلوكوز ، والسكريات الثنائية مثل المالتوز ، والسليوبيوز ، والتريهالوز ، وكحول السكر مثل D-arabitol. تم اعتبار محتوى الكربوهيدرات مؤشرا على الحالة الفسيولوجية للنبات24. لذلك ، فإن الانخفاض في مستويات السكريات الأحادية والسكاريد هنا يشير إلى الإجهاد الفسيولوجي الناجم عن إجهاد DEHP. بالمقارنة مع الكربوهيدرات ، كان ل DEHP تأثير أكبر على استقلاب الحمض في شتلات البرسيم. تحت التعرض ل DEHP ، زادت محتويات 11 مستقلبا حمضيا بشكل كبير ، بما في ذلك بشكل رئيسي حمض 2-amino-2-norbornanecarboxylic ، و 5-hydroxyindole-2-carboxylic acid ، و 3-hydroxy-L-proline ، وحمض pelargonic ، وحمض النخيل. في الوقت نفسه ، قام DEHP أيضا بتثبيط عملية التمثيل الغذائي لبعض مركبات الفلافونويد في شتلات البرسيم ، بما في ذلك 4 '، 5-dihyrroxy-7-methoxyisoflavone و neohesperidin.

يتم وصف المسارات الأيضية المتأثرة ب DEHP في الشكل 4. DEHP تثبيط بشكل كبير عملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات ، مثل بعض السكريات الأحادية والسكاريد ، والتي هي نتاج التمثيل الضوئي. لذلك ، يمكن ل DEHP قمع التمثيل الضوئي للبرسيم إلى حد ما. علاوة على ذلك ، يمكن أن يعزز DEHP عملية التمثيل الغذائي للأحماض الدهنية ، والتي تساعد النباتات على مقاومة الإجهاد الناتج عن DEHP. كانت المسارات الأيضية الرئيسية المتأثرة ب DEHP هي استقلاب الكربوهيدرات واستقلاب الأحماض الدهنية ، بينما تأثرت استقلاب الأحماض الأمينية واستقلاب الدهون ودورة حمض الكربوكسيل (TCA) بدرجة أقل بكثير.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي للتحليل الأيضي غير المستهدف لإفرازات جذر البرسيم. يمثل BSTFA كاشف ثنائي (ثلاثي ميثيل سيليل) ثلاثي فلورو أسيتاميد (BSTFA) (مع 1٪ ثلاثي ميثيل كلورو سيلان [TMC] ، V / V). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصنيف الأيضات. أ: تصنيف المستقلبات المعلومة، ب: الأحماض. يتم تقسيم النسبة المئوية لكل نوع من المواد على مجموع منطقة الذروة لكل فئة على مجموع منطقة الذروة لجميع المواد في السيطرة. وكانت المواد الأخرى تلك التي بلغت <0.5٪. وكانت الأحماض الأخرى تلك التي بلغت <0.5٪. تم تعديل هذا الرقم من Wang et al.25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: خريطة حرارية لتحليل التجميع الهرمي لإفرازات الجذر (VIP > 1 ، p < 0.05) لشتلات البرسيم مع علاجات DEHP المختلفة. يمثل الأحمر والأخضر وفرة عالية ومنخفضة ، على التوالي. ACK يمثل عنصر التحكم. 1 + AD يمثل العلاج مع 1 ملغ L−1 DEHP. 10 + AD يمثل العلاج مع 10 ملغ L−1 DEHP. تم تعديل هذا الرقم من Wang et al.25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: العلاقات بين اضطراب المسارات الأيضية والتغيرات في نقاط النهاية البيولوجية (1 مجم L−1 DEHP ، 10 مجم L−1 DEHP). تم إنشاء المسارات الأيضية بناء على قاعدة بيانات موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG). كانت المستقلبات في النص الأخضر هي المستقلبات المكتشفة في هذا العمل. تشير علامات "المربعات الحمراء" و "المربعات الزرقاء" بين قوسين إلى أن المستقلبات زادت (p < 0.05) أو انخفضت (p < 0.05) مساهمات في نقاط النهاية البيولوجية ، على التوالي. أصبح الشكل قابلا للقراءة عن طريق فصل المستقلبات تقريبا إلى استقلاب الكربوهيدرات والأحماض الدهنية والبروتين ، كما هو موضح في المربعات المستطيلة الخضراء والحمراء والسوداء ، على التوالي. ACK يمثل عنصر التحكم. 1 + AD يمثل العلاج مع 1 ملغ L−1 DEHP. 10 + AD يمثل العلاج مع 10 ملغ L−1 DEHP. تم تعديل هذا الرقم من Wang et al.25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول إرشادات عامة حول كيفية جمع وقياس إفرازات جذر البرسيم تحت ضغط DEHP ، وكذلك كيفية تحليل بيانات الأيض. يجب إيلاء اهتمام وثيق لبعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. في تجارب الاستزراع المائي ، تم استزراع شتلات البرسيم في الماء في زجاجات زجاجية مملوءة بمحاليل مغذية بتركيزات مختلفة من DEHP. يجب حماية الزجاجات من الضوء من خلال تغطيتها بورق الألمنيوم طوال فترة الاستزراع ، من أجل منع DEHP من التحلل الضوئي وضمان توحيد تركيزات DEHP في جميع حلول الاستزراع25,26. تم تحديد تركيزات DEHP على أنها 1 مجم L-1 و 10 مجم L-1 ، وفقا للتركيزات الموجودة عادة في التربة الملوثة ب DEHP 27,28. أثناء جمع إفرازات الجذر ، لا تزال أنابيب الطرد المركزي بحاجة إلى لفها بورق الألمنيوم لحماية الجذور من الضوء. هنا ، تم ضبط وقت التجميع ليكون 6 ساعات. إذا كان وقت التجميع قصيرا جدا ، فقد يكون تركيز بعض إفرازات الجذور منخفضة الوفرة منخفضا جدا بحيث لا يمكن اكتشافه ، وبالتالي فإن تكوين إفرازات الجذر قد لا يعكس الاستجابة الحقيقية لشتلات البرسيم تحت ضغط DEHP. إذا كان وقت الجمع طويلا جدا ، فقد تتحلل إفرازات الجذر المجمعة إلى حد ما بواسطة الميكروبات في أنظمة الاستزراع. في هذه الحالة ، قد يتم أيضا اكتشاف بعض المستقلبات الميكروبية ، مما يؤدي إلى تغيير تكوين إفرازات الجذر29. علاوة على ذلك ، يجب إجراء ستة نسخ متماثلة على الأقل لكل علاج لضمان تحليل دقيق لبيانات الأيض.

يمكن تحديد بعض أنواع معينة فقط من إفرازات الجذر ، مثل الأحماض الأمينية والأحماض الدهنية والمركبات الفينولية والأحماض العضوية الأخرى ، باستخدام الطرق التحليلية التقليدية المستهدفة (أي البحث عن المركبات المعروفة)30،31،32 ، باستخدام الطرق التحليلية القياسية ، مثل القياس الطيفي ، أو كروماتوغرافيا السائل عالي الضغط (HPLC) ، أو اللوني الأيوني (IC) ، أو كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي الترادفي (GC-MS / MS) ، أو الكروماتوغرافيا السائلة مجتمعة مع قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS / MS). مع تطور تقنيات التحليل الآلي ، ظهر التحليل الأيضي غير المستهدف بناء على GC-TOF-MS ، وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة للكروماتوغرافيا السائلة (LC-HR-MS) ، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) 33. بالمقارنة مع الطرق التحليلية التقليدية الأخرى لإفرازات الجذر ، فإن التحليل الأيضي غير المستهدف يوسع بشكل كبير عدد إفرازات الجذر المكتشفة ، مما يسهل الفهم العميق للاستجابات الأيضية النباتية للإجهاد البيئي.

تحتوي التقنية في الدراسة الحالية على بعض القيود ، خاصة في التحليل الكمي للمستقلبات. يوضح التحليل الأيضي غير المستهدف فقط العلاقات الكمية النسبية بين المستقلبات المختلفة ، بدلا من التركيزات الدقيقة. هذا غير موات للتحقيقات في السلوكيات البيئية أو الآثار البيئية لإفرازات الجذر34. بالنسبة لوسائط نمو شتلات البرسيم ، تم إجراء تجارب الاستزراع المائي في الدراسة الحالية ، والتي تتميز بمزايا التحكم السهل والتشغيل السهل. ومع ذلك ، فإن بيئة النمو المائية الاصطناعية تختلف عن بيئة التربة الحقيقية ، مما يؤدي إلى احتمال التقليل من معدلات النضح الإجمالي بسبب امتصاص الجذورللمستقلب 35. بالمقارنة مع الاستزراع المائي ، فإن زراعة الرمل هي طريقة أكثر إقناعا نسبيا لأنها أقرب إلى بيئة التربة الحقيقية ، مما يسهل جمع إفرازات الجذر في بيئة واقعية36. لذلك ، يجري العمل لإنشاء طريقة لزراعة الرمال أو حتى زراعة التربة الحقيقية لجعل النتائج التجريبية أكثر إقناعا ، مما سيساعدنا على إجراء أبحاث أكثر تعمقا ، وإظهار نتائج أفضل ذات أهمية عملية لشرح استجابة السمية.

استنادا إلى التحليل الأيضي غير المستهدف ، لا يمكننا فقط استكشاف الاستجابة الأيضية للنباتات للإجهاد البيئي37 ، ولكن أيضا تحديد المستقلبات التفاضلية ومواصلة التحقيق في الدور المهم للمستقلبات التفاضلية في السلوك البيئي للملوثات38. أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن استخدام مستوى حمض البلارجونيك كمؤشر على تلف غشاء الجذر عندما تكون النباتات تحت الضغط39. كما تم العثور على الأحماض الدهنية غير المشبعة (حمض البالمتيك) لزيادة سيولة الغشاء40 ، والتي قد تحمي أغشية جذر البرسيم من تلف DEHP. يمكن لبعض مركبات الفلافونويد التي يثبطها DEHP المشاركة في التفاعل بين البقوليات والكائنات الحية الدقيقة. علاوة على ذلك ، قد يتم فك رموز التفاعلات بين النباتات والمجتمع البيولوجي للجذور بشكل أعمق من خلال التحليل الأيضي غير المستهدف ، خاصة تحت ضغط الملوثات41. سيتم تحديد المزيد من أنواع إفرازات الجذر42 مع تطوير أدوات تحليلية للتحليل الأيضي غير المستهدف ، وهو أمر مفيد لبناء البصمة الأيضية لإفرازات جذر النبات43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل بشكل مشترك من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (41877139) ، والمشاريع الرئيسية للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (41991335) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFD0800204) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (رقم BK20161616) ، وخطة "135" ، وبرنامج الحدود للأكاديمية الصينية للعلوم (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
  2. Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
  3. van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
  4. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  5. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  6. Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
  7. Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
  8. Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
  9. Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
  10. Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
  11. Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
  12. Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
  13. Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
  14. Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
  15. Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
  16. Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
  17. vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
  18. Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
  19. Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
  20. Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
  21. Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
  22. Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
  23. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  24. Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  25. Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
  26. Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
  27. Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
  28. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  29. Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
  30. Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
  31. Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
  32. Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
  33. van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
  34. Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
  35. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  36. Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
  37. Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
  38. Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
  39. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
  40. Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
  41. Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
  42. Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
  43. Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).

Tags

العلوم البيئية، العدد 196،
مجموعة من إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات على إنتاج الأيض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter