Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Indsamling af lucernerodsekssudater for at undersøge virkningen af di(2-ethylhexyl)phthalat på metabolitproduktionen

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

Sekretionen af rodekssudater er normalt en ekstern afgiftningsstrategi for planter under stressforhold. Denne protokol beskriver, hvordan man vurderer virkningen af xenobiotika på lucerne via ikke-målrettet metabolomisk analyse.

Abstract

Rodekssudater er de vigtigste medier for informationskommunikation og energioverførsel mellem planterødder og det omgivende miljø. Ændringen i udskillelsen af rodekssudater er normalt en ekstern afgiftningsstrategi for planter under stressforhold. Denne protokol har til formål at indføre generelle retningslinjer for indsamling af lucernerodsekssudater for at undersøge virkningen af di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) på metabolitproduktionen. For det første dyrkes lucerneplanter under DEHP-stress i et hydroponisk kultureksperiment. For det andet overføres planterne til centrifugerør indeholdende 50 ml steriliseret ultrarent vand i 6 timer for at opsamle rodekssudater. Opløsningerne frysetørres derefter i en vakuumfrysetørrer. De frosne prøver ekstraheres og derivatiseres med bis(trimethylsilyl)) trifluoracetamid (BSTFA) reagens. Derefter måles de derivatiserede ekstrakter ved hjælp af et gaskromatografsystem kombineret med et time-of-flight massespektrometer (GC-TOF-MS). De erhvervede metabolitdata analyseres derefter baseret på bioinformatiske metoder. Differentielle metabolitter og signifikant ændrede metabolismeveje bør undersøges grundigt for at afsløre virkningen af DEHP på lucerne i lyset af rodekssudater.

Introduction

Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) er en syntetisk kemisk forbindelse, der i vid udstrækning anvendes i forskellige plastmaterialer og polymerer som blødgøringsmiddel for at forbedre deres plasticitet og styrke. I de seneste år har et stigende antal undersøgelser antydet, at DEHP er hormonforstyrrende og har en negativ indvirkning på luftvejene, nervesystemet og reproduktionssystemet hos mennesker og andre dyr 1,2,3. I betragtning af dets sundhedsrisiko har United States Environmental Protection Agency, EU og Environmental Monitoring Center of China alle klassificeret DEHP på listen over prioriterede forurenende stoffer. Jord er blevet betragtet som et vigtigt dræn for DEHP i miljøet på grund af anvendelsen af plastmulkning og organisk gødning, kunstvanding med spildevand og anvendelse af slam4. Som forventet er DEHP blevet allestedsnærværende påvist i landbrugsjord, hvis indhold endda når op til milligram pr. kg tørret jord i nogle regioner i Kina 5,6. DEHP kan hovedsageligt trænge ind i planter via rødderne og undergå biomagnificering på forskellige trofiske niveauer i jordøkosystemer7. Derfor er der i de seneste årtier blevet udtrykt betydelig bekymring over DEHP-induceret stress i anlæg.

Planter er normalt sårbare over for DEHP-eksponering. Det er observeret, at DEHP-stress har en negativ virkning på frøspiring og normal metabolisme og derved hæmmer plantevækst og -udvikling 8,9. For eksempel kan DEHP fremkalde oxidativ skade på mesofylceller, reducere indholdet af klorofyl og osmolytter og hæve antioxidative enzymaktiviteter, hvilket i sidste ende resulterer i et fald i udbyttet og kvaliteten af spiselige planter10,11. Imidlertid har de fleste af de tidligere undersøgelser af planters reaktion på DEHP-stress fokuseret på oxidativt stress og fysiologiske og biokemiske egenskaber. De tilsvarende mekanismer forbundet med plantemetabolisme er mindre undersøgt. Root exudates er et generisk udtryk, der beskriver forbindelser, som planterødder udskiller og frigiver i miljøet. De er blevet betragtet som interaktionsmediet mellem planter og rhizosfærejord og spiller en vigtig rolle i at understøtte plantevækst og udvikling12. Det har været velkendt, at rodekssudater tegner sig for ca. 30% -40% af alt fotosyntetisk kulstof13. I forurenede miljøer er rodekssudater involveret i at forbedre planternes tolerance over for stress af forurenende stoffer gennem metabolisme eller ekstern udelukkelse14. Som følge heraf kan en dyb forståelse af planterodsekssudaternes reaktion på forureningsstress hjælpe med at afsløre de underliggende mekanismer forbundet med cellebiokemi og biologiske fænomener15.

Metabolomics-teknologi giver en effektiv strategi til måling af et stort antal små molekylemetabolitter samtidigt i celler 16,17, væv18 og endda ekssudater af organismer 19, herunder sukkerarter, organiske syrer, aminosyrer og lipider. Sammenlignet med traditionelle eller klassiske kemiske analysemetoder øger metabolomics-tilgangen i høj grad antallet af metabolitter, der kan detekteres20, hvilket kan hjælpe med at identificere metabolitter på en højere gennemstrømningsmåde og identificere vigtige metaboliske veje. Metabolomics har været meget udbredt inden for forskningsområdet biologisk respons i stressmiljøer, såsom tungmetaller21, nye forurenende stoffer22 og nanopartikler19. De fleste af disse undersøgelser af planter har fokuseret på de metaboliske ændringer i indre plantevæv, mens få er blevet rapporteret om responsen af rodekssudater på miljøstress. Formålet med denne undersøgelse er derfor at indføre generelle retningslinjer for indsamling af lucernerodsekssudater for at undersøge virkningen af DEHP på metabolitproduktionen. Resultaterne vil give en metodevejledning til DEHP's opfølgende undersøgelse af plantemetabolomics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en generel pipeline fra et hydroponisk kultureksperiment til metabolomisk analyse, der kvantificerer virkningen af DEHP på lucernerodekssudater.

1. Hydroponisk kultur eksperiment

BEMÆRK: Denne protokol præsenterer et eksempel på et alfalfa hydroponisk kultureksperiment designet til at opnå lucerne (Medicago sativa) frøplanter under stress af forskellige koncentrationer af DEHP. Tre behandlinger blev oprettet: kontrol uden tilsætninger, og næringsopløsningen spikede med 1 mg kg-1 og 10 mg kg-1 di(DEHP. Koncentrationerne af DEHP blev fastsat på grundlag af det reelle indhold af DEHP i jord23. Hver behandling havde seks replikater.

  1. Steriliser lucernefrø med 0,1% natriumhypochlorit i 10 min og 75% ethylalkohol i 30 min.
    1. Skyl de steriliserede frø flere gange med destilleret vand og spir derefter på fugtigt filterpapir i en steril petriskål ved 30 °C i mørke.
  2. Overfør 20 ensartede, spirede, store fyldige frø til en engraftmentkurv i en kulturflaske fyldt med næringsopløsning, sammensat af (i μM): Ca(NO 3)2, 3.500; NH4H2PO4, 1.000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2.000; Na2Fe-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 75; H 3BO3, 46; MnSO,4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; og (NH4 )6Mo7O24, 0,02. Opløsningen indstilles pH til 7,0 ved hjælp af 0,1 M KOH. Forny alle løsninger ugentligt.
  3. Alle kulturflaskerne anbringes i et kontrolleret vækstkammer med en lysintensitet på 150-180 μmol m-2 s-1 med en fotoperiode på 16 timer hver dag ved 27 °C og 20 °C, der repræsenterer henholdsvis dag (16 timer) og nat (8 timer).
  4. Overfør 15 ensartede lucerneplanter til en ny glasflaske til dyrkningsforsøg under 1 mg kg-1 og 10 mg kg-1 DEHP-stress efter 2 uger. Pak glasflaskerne ind med aluminiumsfolie og parafilm for at forhindre fotolyse og fordampning af DEHP. For at anvende de samme betingelser skal du også pakke kontrolflaskerne med aluminiumsfolie og parafilm. Suppler næringsopløsningen dagligt for at opretholde væskeniveauet.
  5. Placer og drej flaskerne tilfældigt hver 2. dag for at sikre ensartede vækstbetingelser for lucerneplanterne.
  6. Efter 7 dages dyrkning fjernes lucerneplanterne fra flaskerne og vaskes med ultrarent vand flere gange og forbereder sig på indsamling af rodekssudater.

2. Indsamling, ekstraktion og metabolomisk analyse af rodekssudater

BEMÆRK: Denne protokol er opdelt i tre dele: et indsamlingseksperiment, et ekstraktionseksperiment og metabolomisk analyse af rodekssudaterne. Målet med indsamlingsforsøget er at overføre metabolitterne udskilt i planteprøver til opløsningssystemet til efterfølgende ekstraktion.

  1. Indsamling eksperiment
    1. Overfør 10 ensartede lucerneplanter til centrifugerør fyldt med 50 ml steriliseret deioniseret vand. Nedsænk rødderne i vand for at samle rodekssudater i 6 timer; Hold rørene lodret. Udfør mindst seks replikater for hver behandling.
    2. Pak centrifugerørene ind med aluminiumsfolie for at beskytte rødderne mod lys.
    3. Fjern planterne og frysetør den opsamlede væske til metabolitprofilering.
  2. Ekstraktionseksperiment
    1. Tilsæt 1,8 ml ekstraktionsopløsning (methanol: H2O = 3: 1, V / V) til rørene og hvirvelstrømmen i 30 s.
    2. Påfør ultralydbølger på rørene i 10 minutter i et isvandbad.
    3. Prøverne centrifugeres ved 4 °C og 11.000 × g i 15 minutter.
    4. 200 μL supernatant overføres forsigtigt til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Der udtages 45 μl supernatant fra hver prøve, som blandes i kvalitetskontrolprøver ved et slutvolumen på 270 μl, som anvendes til kalibrering af prøvernes metabolomdata.
    5. Frysetør ekstrakterne i en vakuumkoncentrator. Tørringen fortsættes med 5 μL intern standard (ribonukleol).
    6. Efter inddampning i en vakuumkoncentrator tilsættes 30 μL methoxyamineringshydrochlorid (opløst i pyridin i en koncentration på 20 mg ml-1) til glassene, og glassene inkuberes ved 80 °C i 30 minutter. Derefter tilsættes 40 μL bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-reagens (med 1 % trimethylchlorosilan [TMC], V/V) til prøverne, og glassene anbringes ved 70 °C i 1,5 timer til derivatisering.
    7. Prøverne afkøles til stuetemperatur, og der tilsættes 5 μL fedtsyremethylestere (FAME'er) (i chloroform) til QC-prøverne.
  3. Metabolomisk analyse
    1. 1,0 μL af de derivatiserede ekstrakter injiceres i et gaskromatografsystem koblet til et time-of-flight-massespektrometer (GC-TOF-MS) til metabolomisk profilanalyse ved hjælp af en splitless tilstand.
      1. Brug en kapillærsøjle (30 m x 250 μm x 0,25 μm) til adskillelse af rodekssudater med helium som bæregas ved en strømningshastighed på 1,0 ml min-1. Indstil injektionstemperaturen til 280 °C, og hold overførselsledningens temperatur og ionkildetemperaturen på henholdsvis 280 °C og 250 °C.
      2. Til adskillelse skal du bruge følgende ovnprogram: 1 min isotermisk opvarmning ved 50 °C, en 10 °C/min-1 ovnrampe til 310 °C og en endelig isotermisk opvarmning ved 310 °C i 8 min.
      3. Udfør elektronkollisionstilstand med -70 eV energi. Få massespektre ved hjælp af fuld scanningsovervågningstilstand med et massescanningsområde på 50-500 m / z med en hastighed på 12,5 spektre / s.
    2. Filtrer individuelle toppe for at fjerne støj. Afvigelsesværdien filtreres baseret på interkvartilområdet.
    3. Udfyld de manglende værdier med halvdelen af minimumsværdierne, standardiser og normaliser dataene.
    4. Importer de endelige data i .csv format til statistisk analysesoftware til multivariat analyse.
    5. Slå metabolitterne op i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database (en databaseressource til forståelse af funktioner og hjælpeprogrammer på højt niveau i det biologiske system), og klassificer metabolitterne i forskellige kategorier, såsom kulhydrater, syrer, lipider, alkoholer og aminer. Brug statistisk analysesoftware til at konstruere et cirkeldiagram for at angive procentdelen af hver kategori i alle rodekssudater.
    6. Anvend overvågede ortogonale fremskrivninger til latent strukturdiskrimineringsanalyse (OPLS-DA) for at demonstrere forskellene mellem grupper.
    7. Screene signifikant ændrede metabolitter som differentielle metabolitter baseret på en variabel betydning i projektion (VIP) > 1 og p < 0,05 (Student's t test).
    8. Brug metabolomdataene til at konstruere varmekort med den statistiske analysesoftware, og brug foldændringerne under forskellige behandlinger til at konstruere histogrammer.
    9. Slå differentialmetabolitterne op i KEGG-databasen og Pubchem, og kompiler de metaboliske veje, der indeholder differentialmetabolitterne. Udfør pathway berigelsesanalyse eller topologianalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette eksperiment blev lucernerodekssudater opsamlet, ekstraheret og analyseret i henhold til ovenstående metoder (figur 1). Der blev oprettet tre behandlingsgrupper: kontrol, lav koncentration af DEHP (1 mg L-1) og høj koncentration af DEHP (10 mg L-1).

I alt 778 toppe blev påvist i kontrollens kromatograf, hvoraf 314 metabolitter kunne identificeres i henhold til massespektrene. Som vist i figur 2 kunne disse metabolitter klassificeres i seks typer baseret på den relative overflod: kulhydrater (28,6%), syrer (15,58%), lipider (13,87%), alkoholer (3,91%), aminer (0,92%) og andre (37,12%). Metabolitter, der udgjorde mindre end 0,5 %, blev grupperet som andre stoffer (figur 2A). Syrerne blev yderligere opdelt i fedtsyrer (56,09%), aminosyrer (26,62%), organiske syrer (13,95%) og phenolsyrer (3,34%) (figur 2B). Derudover kunne nogle almindelige stoffer i rodekssudaterne fra de fleste planter også påvises i lucernerodekssudater, herunder pyrimidiner, hydroxypyridiner, flavonoider, phenoler, ketoner, pyrimidiner, flavonoider og diterpener.

Et varmekort blev plottet for at visualisere variationen i differentielle metabolitter blandt forskellige DEHP-behandlinger baseret på VIP-score (figur 3). Sammenlignet med kontrollen ændrede eksponeringen for DEHP signifikant indholdet af 50 metabolitter i lucernerodekssudater, hovedsageligt inklusive nogle kulhydrater og organiske syrer med lav molekylvægt. Fem typer kulhydrater (lyxose, digitoxose, erythrose, trehalose og fruktose 2, 6-bihosphat) blev opreguleret ved tilstedeværelse af DEHP, og to af disse (lyxose og digitoxose) blev signifikant øget, da koncentrationen af DEHP steg. Derudover blev fem metabolitter nedreguleret i nærvær af DEHP, herunder monosaccharider såsom D-talose og glucose, disaccharider såsom maltose, cellobiose og trehalose og sukkeralkoholer såsom D-arabitol. Kulhydratindhold er blevet betragtet som en indikator for plantens fysiologiske status24. Derfor indikerede faldet i monosaccharid- og disaccharidniveauerne heri fysiologisk stress forårsaget af DEHP-stress. Sammenlignet med kulhydrater udøvede DEHP en større effekt på syremetabolismen i lucerneplanter. Under eksponering for DEHP blev indholdet af 11 syremetabolitter signifikant forøget, hovedsageligt inklusive 2-amino-2-norbornanecarboxylsyre, 5-hydroxyindol-2-carboxylsyre, 3-hydroxy-L-prolin, pelargonsyre og palmitinsyre. Samtidig hæmmede DEHP også metabolismen af nogle flavonoider i lucerneplanter, herunder 4', 5-dihyrroxy-7-methoxyisoflavon og neohesperidin.

De metaboliske veje, der påvirkes af DEHP, er beskrevet i figur 4. DEHP hæmmede signifikant metabolismen af kulhydrater, såsom nogle monosaccharider og disaccharider, som er produkter af fotosyntese. Derfor kan DEHP til en vis grad undertrykke lucernes fotosyntese. Desuden kan DEHP fremme metabolismen af fedtsyrer, som er nyttige for planter til at modstå stress fra DEHP. De vigtigste metaboliske veje, der blev påvirket af DEHP, var kulhydratmetabolisme og fedtsyremetabolisme, mens aminosyremetabolisme, lipidmetabolisme og tricarboxylsyrecyklussen (TCA) blev påvirket i meget mindre grad.

Figure 1
Figur 1: Et rutediagram over ikke-målrettet metabolomisk analyse for lucernerodekssudater. BSTFA repræsenterer bis(trimethylsilyl)trifluoracetamidreagens (BSTFA) (med 1% trimethylchlorosilan [TMC], V/V). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Klassificering af metabolitter. (A) Klassificering af de kendte metabolitter og (B) syrer. Procentdelen af hver materialetype divideres med summen af toparealet for hver kategori med summen af toparealet af alle stofferne i kontrollen. Andre stoffer var dem på <0,5%. Andre syrer var dem på <0,5%. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Varmekort over hierarkisk klyngeanalyse for rodekssudater (VIP > 1, p < 0,05) af lucerneplanter med forskellige DEHP-behandlinger. Rød og grøn repræsenterer henholdsvis høj og lav overflod. ACK repræsenterer kontrollen; 1+AD repræsenterer behandlingen med 1 mg L-1 DEHP; 10+AD repræsenterer behandlingen med 10 mg L-1 DEHP. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Forholdet mellem forstyrrelsen af stofskifteveje og ændringerne i biologiske endepunkter (1 mg L-1 DEHP, 10 mg L-1 DEHP). De metaboliske veje blev etableret baseret på Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database. Metabolitterne i grøn tekst var de metabolitter, der blev påvist i dette arbejde. Tegnene "røde bokse" og "blå bokse" i parentes indikerer, at metabolitter steg (p < 0,05) eller faldt (p < 0,05) bidrag til de biologiske endepunkter. Figuren er gjort læsbar ved at adskille metabolitterne groft i kulhydrat, fedtsyre og proteinmetabolisme, som vist ved henholdsvis de grønne, røde og sorte rektangulære kasser. ACK repræsenterer kontrollen; 1+AD repræsenterer behandlingen med 1 mg L-1 DEHP; 10+AD repræsenterer behandlingen med 10 mg L-1 DEHP. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol giver generel vejledning i, hvordan man indsamler og måler lucernes rodekssudater under DEHP-stress, samt hvordan man analyserer metabolomdataene. Der skal lægges stor vægt på nogle kritiske trin i denne protokol. I hydroponiske kulturforsøg blev lucerneplanter hydroponisk dyrket i glasflasker fyldt med næringsopløsninger med forskellige koncentrationer af DEHP. Glasflaskerne skal beskyttes mod lys ved at dække dem med aluminiumsfolie i hele dyrkningsperioden for at forhindre DEHP i fotolyse og sikre ensartetheden af DEHP-koncentrationer i alle kulturopløsninger25,26. DEHP-koncentrationerne blev fastsat til 1 mg L-1 og 10 mg L-1 i henhold til de koncentrationer, der normalt findes i jord, der er forurenet med DEHP27,28. Under samlingen af rodekssudater skal centrifugerørene stadig pakkes med aluminiumsfolie for at beskytte rødderne mod lys. Her blev indsamlingstiden sat til 6 timer. Hvis indsamlingstiden er for kort, kan koncentrationen af nogle rodekssudater med lav forekomst være for lav til at blive detekteret, så sammensætningen af rodekssudaterne afspejler muligvis ikke lucerneplanternes reelle respons under DEHP-stress. Hvis indsamlingstiden er for lang, kan de indsamlede rodekssudater til en vis grad nedbrydes af mikrober i dyrkningssystemerne. I dette tilfælde kan nogle mikrobielle metabolitter også detekteres, idet ændring af sammensætningen af roden ekssudater29. Desuden bør der udføres mindst seks replikater for hver behandling for at sikre nøjagtig analyse af metabolomdata.

Kun nogle bestemte typer rodekssudater, såsom aminosyrer, fedtsyrer, phenolforbindelser og andre organiske syrer, kan bestemmes ved hjælp af konventionelle målrettede analysemetoder (dvs. søgning efter kendte forbindelser)30,31,32 ved hjælp af standardanalysemetoder, såsom spektrofotometri, højtryksvæskekromatografi (HPLC), ionkromatografi (IC), gaskromatografi-tandemmassespektrometri (GC-MS/MS) eller væskekromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Med udviklingen af instrumentelle analyseteknikker er der opstået ikke-målrettet metabolomisk analyse baseret på GC-TOF-MS, væskekromatografi-massespektrometri med høj opløsning (LC-HR-MS) og kernemagnetisk resonans (NMR)33. Sammenlignet med andre konventionelle analysemetoder for rodekssudater udvider ikke-målrettet metabolomisk analyse i høj grad antallet af detekterede rodekssudater, hvilket letter dyb forståelse af plantemetaboliske reaktioner på miljøstress.

Teknikken i den aktuelle undersøgelse har nogle begrænsninger, især i den kvantitative analyse af metabolitter. Ikke-målrettet metabolomisk analyse viser kun de relative kvantitative forhold mellem forskellige metabolitter snarere end nøjagtige koncentrationer. Dette er ugunstigt for undersøgelser af miljøadfærd eller økologiske virkninger af rodekssudater34. For vækstmedierne af lucerneplanter blev hydroponiske kultureksperimenter udført i den nuværende undersøgelse, som har fordelene ved nem kontrol og nem betjening. Det kunstige hydroponiske vækstmiljø er imidlertid forskelligt fra det virkelige jordmiljø, hvilket fører til mulig undervurdering af bruttoekssudationshastighederne som følge af metabolitgenoptagelse af rødder35. Sammenlignet med hydroponisk kultur er sandkultur en relativt mere overbevisende metode, fordi den er tættere på det virkelige jordmiljø, hvilket letter indsamlingen af rodekssudater i et realistisk miljø36. Derfor arbejdes der på at etablere en metode til sandkultur eller endda ægte jordkultur for at gøre de eksperimentelle resultater mere overbevisende, hvilket vil hjælpe os med at gennemføre mere dybtgående forskning, der viser bedre resultater af praktisk betydning for forklaring af toksicitetsresponsen.

Baseret på den ikke-målrettede metaboliske analyse kan vi ikke kun undersøge planters metaboliske respons på miljøstress37, men også bestemme differentielle metabolitter og yderligere undersøge differentialmetabolitternes vigtige rolle i forurenende stoffers miljøadfærd38. Tidligere undersøgelser har vist, at pelargonsyreniveauet kan bruges som indikator for rodmembranskader, når planter er under stress39. Umættede fedtsyrer (palmitinsyre) viste sig også at øge membranfluiditeten40, hvilket kan beskytte lucernerodmembraner mod DEHP-skader. Nogle flavonoider hæmmet af DEHP kan deltage i interaktionen mellem bælgfrugter og mikroorganismer. Desuden kan interaktionerne mellem planter og rhizosfærens biologiske samfund dechiffreres dybere med ikke-målrettet metabolisk analyse, især under stress af forurenende stoffer41. Flere typer rodekssudater vil blive identificeret42 med udviklingen af analytiske instrumenter til ikke-målrettet metabolisk analyse, hvilket er nyttigt til at konstruere metabolomisk fingeraftryk af planterodsekssudater43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have syntes at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet i fællesskab af National Natural Science Foundation of China (41877139), de store projekter fra National Natural Science Foundation of China (41991335), National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (nr. BK20161616), "135" -planen og grænseprogrammet for det kinesiske videnskabsakademi (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
  2. Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
  3. van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
  4. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  5. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  6. Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
  7. Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
  8. Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
  9. Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
  10. Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
  11. Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
  12. Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
  13. Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
  14. Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
  15. Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
  16. Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
  17. vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
  18. Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
  19. Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
  20. Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
  21. Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
  22. Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
  23. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  24. Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  25. Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
  26. Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
  27. Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
  28. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  29. Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
  30. Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
  31. Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
  32. Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
  33. van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
  34. Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
  35. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  36. Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
  37. Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
  38. Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
  39. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
  40. Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
  41. Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
  42. Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
  43. Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).

Tags

Miljøvidenskab nr. 196
Indsamling af lucernerodsekssudater for at undersøge virkningen af di(2-ethylhexyl)phthalat på metabolitproduktionen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter