Summary
Die Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Wirkung von Xenobiotika auf Luzerne durch eine nicht zielgerichtete metabolomische Analyse bewertet werden kann.
Abstract
Wurzelexsudate sind die wichtigsten Medien der Informationskommunikation und des Energietransfers zwischen Pflanzenwurzeln und der Umgebung. Die Veränderung der Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, allgemeine Richtlinien für die Sammlung von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um die Auswirkungen von Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Zunächst werden Luzerne-Sämlinge unter DEHP-Stress in einem hydroponischen Kulturexperiment gezüchtet. Zweitens werden die Pflanzen für 6 h in Zentrifugenröhrchen mit 50 ml sterilisiertem Reinstwasser überführt, um Wurzelexsudate zu sammeln. Anschließend werden die Lösungen in einem Vakuum-Gefriertrockner gefriergetrocknet. Die gefrorenen Proben werden extrahiert und mit Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Reagenz derivatisiert. Anschließend werden die derivatisierten Extrakte mit einem Gaschromatographensystem in Verbindung mit einem Flugzeit-Massenspektrometer (GC-TOF-MS) gemessen. Die gewonnenen Metabolitendaten werden dann mit bioinformatischen Methoden analysiert. Differentielle Metaboliten und signifikant veränderte Stoffwechselwege sollten eingehend erforscht werden, um die Auswirkungen von DEHP auf Luzerne im Hinblick auf Wurzelexsudate aufzudecken.
Introduction
Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP) ist eine synthetische chemische Verbindung, die in verschiedenen Kunststoffen und Polymeren als Weichmacher verwendet wird, um deren Plastizität und Festigkeit zu verbessern. In den letzten Jahren deuten immer mehr Studien darauf hin, dass DEHP ein endokriner Disruptor ist und sich nachteilig auf die Atemwege, Nerven und Fortpflanzungssysteme von Menschen und anderen Tieren auswirkt 1,2,3. In Anbetracht seines Gesundheitsrisikos haben die Umweltschutzbehörde der Vereinigten Staaten, die Europäische Union und das Environmental Monitoring Center of China DEHP in die Liste der prioritären Schadstoffe aufgenommen. Der Boden wurde aufgrund der Anwendung von Kunststoffmulch und organischem Dünger, der Bewässerung mit Abwasser und der Anwendung von Schlammfarmen als wichtige Senke von DEHP in der Umwelt angesehen4. Erwartungsgemäß wurde DEHP ubiquitär in landwirtschaftlich genutzten Böden nachgewiesen, deren Gehalt in einigen Regionen Chinas sogar bis zu Milligramm pro Kilogramm getrockneter Böden erreicht 5,6. DEHP kann hauptsächlich über die Wurzeln in Pflanzen eindringen und auf verschiedenen trophischen Ebenen in Bodenökosystemen biomagnifikiert werden7. Daher wurde in den letzten Jahrzehnten erhebliche Besorgnis über DEHP-induzierten Stress in Pflanzen geäußert.
Pflanzen sind in der Regel anfällig für eine DEHP-Exposition. Es wurde beobachtet, dass DEHP-Stress eine nachteilige Wirkung auf die Samenkeimung und den normalen Stoffwechsel ausübt und dadurch das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen hemmt 8,9. Zum Beispiel kann DEHP oxidative Schäden an Mesophyllzellen induzieren, den Gehalt an Chlorophyll und Osmolyten verringern und die antioxidative Enzymaktivität erhöhen, was schließlich zu einer Abnahme des Ertrags und der Qualität essbarer Pflanzen führt10,11. Die meisten bisherigen Studien über die Reaktion von Pflanzen auf DEHP-Stress konzentrierten sich jedoch auf oxidativen Stress und physiologische und biochemische Eigenschaften. Die entsprechenden Mechanismen, die mit dem pflanzlichen Stoffwechsel verbunden sind, sind weniger erforscht. Wurzelexsudate ist ein Oberbegriff, der Verbindungen beschreibt, die Pflanzenwurzeln absondern und in die Umwelt abgeben. Sie gelten als Interaktionsmedien zwischen Pflanzen und dem Boden der Rhizosphäre und spielen eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung12. Es ist bekannt, dass Wurzelexsudate etwa 30%-40% des gesamten photosynthetischenKohlenstoffs ausmachen 13. In verschmutzten Umgebungen sind Wurzelausscheidungen an der Verbesserung der Toleranz von Pflanzen gegenüber dem Stress von Schadstoffen durch Stoffwechsel oder äußeren Ausschluss beteiligt14. Folglich könnte ein tiefes Verständnis der Reaktion von Pflanzenwurzelexsudaten auf Verschmutzungsstress dazu beitragen, die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken, die mit der Zellbiochemie und biologischen Phänomenen verbunden sind15.
Die Metabolomik-Technologie bietet eine effiziente Strategie zur gleichzeitigen Messung einer großen Anzahl von niedermolekularen Metaboliten in Zellen 16,17, Geweben18 und sogar Exsudaten von Organismen 19, einschließlich Zuckern, organischen Säuren, Aminosäuren und Lipiden. Im Vergleich zu herkömmlichen oder klassischen chemischen Analysemethoden erhöht der Metabolomik-Ansatz die Anzahl der nachweisbaren Metaboliten erheblich20, was dazu beitragen kann, Metaboliten mit höherem Durchsatz zu identifizieren und wichtige Stoffwechselwege zu identifizieren. Die Metabolomik ist im Forschungsbereich der biologischen Reaktion in Stressumgebungen, wie z. B. Schwermetalle21, neu auftretende Schadstoffe22 und Nanopartikel19, weit verbreitet. Die meisten dieser Studien an Pflanzen konzentrierten sich auf die metabolischen Veränderungen im inneren Pflanzengewebe, während nur wenige über die Reaktion von Wurzelexsudaten auf Umweltstress berichtet wurden. Ziel dieser Studie ist es daher, allgemeine Richtlinien für die Entnahme von Luzernewurzelexsudaten einzuführen, um den Einfluss von DEHP auf die Metabolitenproduktion zu untersuchen. Die Ergebnisse dienen als methodischer Leitfaden für die Folgestudie der pflanzlichen Metabolomik mittels DEHP.
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Protocol
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine allgemeine Pipeline von einem hydroponischen Kulturexperiment bis hin zu metabolomischen Analysen bereitzustellen, um die Wirkung von DEHP auf Luzernewurzelexsudate zu quantifizieren.
1. Hydroponisches Kulturexperiment
HINWEIS: Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel für ein hydroponisches Luzerne-Kulturexperiment, das entwickelt wurde, um Luzerne-Sämlinge (Medicago sativa) unter dem Stress verschiedener DEHP-Konzentrationen zu erhalten. Es wurden drei Behandlungen durchgeführt: die Kontrolle ohne Zusätze und die Nährlösung mit 1 mg kg-1 und 10 mg kg-1 di(DEHP. Die DEHP-Konzentrationen wurden entsprechend dem tatsächlichen DEHP-Gehalt im Boden23 festgelegt. Jede Behandlung hatte sechs Replikate.
- Luzernesamen mit 0,1 % Natriumhypochlorit für 10 Minuten und 75 % Ethylalkohol für 30 Minuten sterilisieren.
- Spülen Sie die sterilisierten Samen mehrmals mit destilliertem Wasser ab und keimen Sie dann auf feuchtem Filterpapier in einer sterilen Petrischale bei 30 °C im Dunkeln.
- Übertragen Sie 20 einheitliche, gekeimte, große, pralle Samen in einen Pfropfkorb in einer mit Nährlösung gefüllten Kulturflasche, bestehend aus (in μM): Ca(NO 3)2, 3.500; NH4H2PO4, 1.000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2.000; Na2Fe-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 75; H3 BO3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; und (NH4)6Mo7O24, 0,02. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 0,1 M KOH auf 7,0 ein. Erneuern Sie alle Lösungen wöchentlich.
- Stellen Sie alle Kulturflaschen in eine kontrollierte Wachstumskammer mit einer Lichtintensität von 150-180 μmol m-2 s-1 mit einer Photoperiode von 16 h pro Tag, bei 27 °C bzw. 20 °C, was Tag (16 h) bzw. Nacht (8 h) darstellt.
- Übertragen Sie 15 einheitliche Luzerne-Sämlinge in eine neue Glasflasche für Kulturexperimente unter 1 mg kg-1 und 10 mg kg-1 DEHP-Stress nach 2 Wochen. Wickeln Sie die Glasflaschen mit Alufolie und Parafilm ein, um eine Photolyse und Verflüchtigung des DEHP zu verhindern. Um die gleichen Bedingungen anzuwenden, wickeln Sie die Kontrollflaschen auch mit Alufolie und Parafolie ein. Ergänzen Sie die Nährlösung täglich, um den Flüssigkeitsstand aufrechtzuerhalten.
- Platzieren und drehen Sie die Flaschen alle 2 Tage nach dem Zufallsprinzip, um konsistente Wachstumsbedingungen für die Luzerne-Sämlinge zu gewährleisten.
- Nehmen Sie nach 7 Tagen Kultivierung die Luzernesämlinge aus den Flaschen und waschen Sie sie mehrmals mit Reinstwasser, um sich auf die Sammlung von Wurzelexsudaten vorzubereiten.
2. Sammlung, Extraktion und metabolomische Analyse von Wurzelexsudaten
HINWEIS: Dieses Protokoll ist in drei Teile unterteilt: ein Entnahmeexperiment, ein Extraktionsexperiment und eine metabolomische Analyse der Wurzelexsudate. Ziel des Sammelexperiments ist es, die in Pflanzenproben sezernierten Metaboliten zur anschließenden Extraktion in das Lösungssystem zu übertragen.
- Sammlungs-Experiment
- Übertragen Sie 10 gleichmäßige Luzerne-Sämlinge in Zentrifugenröhrchen, die mit 50 ml sterilisiertem deionisiertem Wasser gefüllt sind. Tauchen Sie die Wurzeln 6 Stunden lang in Wasser, um Wurzelausscheidungen zu sammeln. Halten Sie die Schläuche aufrecht. Führen Sie für jede Behandlung mindestens sechs Wiederholungen durch.
- Wickeln Sie die Zentrifugenröhrchen mit Alufolie ein, um die Wurzeln vor Licht zu schützen.
- Entfernen Sie die Pflanzen und gefrieren Sie die gesammelte Flüssigkeit für die Erstellung von Metabolitenprofilen.
- Extraktions-Experiment
- 1,8 ml Extraktionslösung (Methanol:H2O= 3:1, V/V) in die Röhrchen geben und 30 s lang wirbeln.
- Wenden Sie 10 Minuten lang Ultraschallwellen in einem Eiswasserbad auf die Röhren an.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 °C und 11.000 × g für 15 min.
- Übertragen Sie vorsichtig 200 μl Überstand in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Aus jeder Probe werden 45 μl Überstand entnommen und mit einem Endvolumen von 270 μl in Qualitätskontrollproben (QC) gemischt, die zur Kalibrierung der Metabolomdaten der Proben verwendet werden.
- Gefriertrocknen Sie die Extrakte in einem Vakuumkonzentrator. Trocknen Sie mit 5 μl des internen Standards (Ribonukleol) weiter.
- Nach dem Verdampfen in einem Vakuumkonzentrator werden 30 μl Methoxyaminierungshydrochlorid (gelöst in Pyridin in einer Konzentration von 20 mg ml-1) in die Röhrchen gegeben und die Röhrchen bei 80 °C 30 min lang inkubiert. Geben Sie dann 40 μl Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Reagenz (mit 1 % Trimethylchlorsilan [TMC], V/V) zu den Proben und stellen Sie die Röhrchen für 1,5 h bei 70 °C zur Derivatisierung auf.
- Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur ab und fügen Sie den QC-Proben 5 μl Fettsäuremethylester (FAMEs) (in Chloroform) hinzu.
- Metabolomische Analyse
- Injizieren Sie 1,0 μl der derivatisierten Extrakte in ein Gaschromatographensystem, das mit einem Flugzeit-Massenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt ist, um die metabolomische Profilerstellung im splitlosen Modus zu analysieren.
- Verwenden Sie eine Kapillarsäule (30 m x 250 μm x 0,25 μm) zur Abtrennung von Wurzelexsudaten, mit Helium als Trägergas bei einer Flussrate von 1,0 mL min-1. Stellen Sie die Injektionstemperatur auf 280 °C ein und halten Sie die Temperatur der Transferleitung und die Temperatur der Ionenquelle bei 280 °C bzw. 250 °C.
- Zum Trennen verwenden Sie folgendes Ofenprogramm: 1 min isotherme Erwärmung auf 50 °C, 10 °C/min-1 Ofenrampe auf 310 °C und eine abschließende isotherme Erwärmung auf 310 °C für 8 min.
- Führen Sie den Elektronenkollisionsmodus mit einer Energie von -70 eV durch. Erhalten Sie Massenspektren im Vollscan-Überwachungsmodus mit einem Massenscanbereich von 50-500 m/z bei einer Rate von 12,5 Spektren/s.
- Filtern Sie einzelne Spitzen, um Rauschen zu entfernen. Der Abweichungswert wird basierend auf dem Interquartilsabstand gefiltert.
- Füllen Sie die fehlenden Werte mit der Hälfte der Mindestwerte, standardisieren und normalisieren Sie die Daten.
- Importieren Sie die endgültigen Daten in .csv Format in eine statistische Analysesoftware für die multivariate Analyse.
- Schlagen Sie die Metaboliten in der Datenbank der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) nach (eine Datenbankressource zum Verständnis der allgemeinen Funktionen und Nützlichkeiten des biologischen Systems) und klassifizieren Sie die Metaboliten in verschiedene Kategorien wie Kohlenhydrate, Säuren, Lipide, Alkohole und Amine. Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um ein Kreisdiagramm zu erstellen, das den Prozentsatz jeder Kategorie in allen Wurzelexsudaten angibt.
- Wenden Sie überwachte orthogonale Projektionen auf die Diskriminationsanalyse latenter Strukturen (OPLS-DA) an, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu demonstrieren.
- Das Screening signifikant veränderte Metaboliten als differentielle Metaboliten basierend auf einer variablen Wichtigkeit in der Projektion (VIP) > 1 und p < 0,05 (Student's t Test).
- Verwenden Sie die Metabolomdaten, um Heatmaps mit der statistischen Analysesoftware zu erstellen, und verwenden Sie die Faltungsänderungen unter verschiedenen Behandlungen, um Histogramme zu erstellen.
- Schlagen Sie die differentiellen Metaboliten in der KEGG-Datenbank und in Pubchem nach und stellen Sie die Stoffwechselwege zusammen, die die differentiellen Metaboliten enthalten. Führen Sie eine Analyse der Pfadanreicherung oder der Topologie durch.
- Injizieren Sie 1,0 μl der derivatisierten Extrakte in ein Gaschromatographensystem, das mit einem Flugzeit-Massenspektrometer (GC-TOF-MS) gekoppelt ist, um die metabolomische Profilerstellung im splitlosen Modus zu analysieren.
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Representative Results
In diesem Experiment wurden Luzernewurzelexsudate gesammelt, extrahiert und nach den oben genannten Methoden analysiert (Abbildung 1). Es wurden drei Behandlungsgruppen eingerichtet: Kontrollgruppe, niedrige Konzentration von DEHP (1 mg L−1) und hohe Konzentration von DEHP (10 mg L−1).
Im Chromatographen der Kontrollgruppe wurden insgesamt 778 Peaks detektiert, von denen 314 Metaboliten anhand der Massenspektren identifiziert werden konnten. Wie in Abbildung 2 dargestellt, können diese Metaboliten basierend auf der relativen Häufigkeit in sechs Typen eingeteilt werden: Kohlenhydrate (28,6 %), Säuren (15,58 %), Lipide (13,87 %), Alkohole (3,91 %), Amine (0,92 %) und andere (37,12 %). Metaboliten, die weniger als 0,5 % ausmachten, wurden als sonstige Substanzen gruppiert (Abbildung 2A). Die Säuren wurden weiter unterteilt in Fettsäuren (56,09 %), Aminosäuren (26,62 %), organische Säuren (13,95 %) und Phenolsäuren (3,34 %) (Abbildung 2B). Darüber hinaus konnten einige häufige Substanzen in den Wurzelausscheidungen der meisten Pflanzen auch in Luzernewurzelexsudaten nachgewiesen werden, darunter Pyrimidine, Hydroxypyridine, Flavonoide, Phenole, Ketone, Pyrimidine, Flavonoide und Diterpene.
Eine Heatmap wurde erstellt, um die Variation der differentiellen Metaboliten zwischen verschiedenen DEHP-Behandlungen basierend auf dem VIP-Score zu visualisieren (Abbildung 3). Im Vergleich zur Kontrolle veränderte die Exposition gegenüber DEHP signifikant den Gehalt an 50 Metaboliten in Luzernewurzelexsudaten, darunter hauptsächlich einige Kohlenhydrate und niedermolekulare organische Säuren. Fünf Arten von Kohlenhydraten (Lyxose, Digizose, Erythrose, Trehalose und Fructose-2,6-Bihosphat) wurden in Gegenwart von DEHP hochreguliert, und zwei davon (Lyxose und Digizokose) waren mit zunehmender DEHP-Konzentration signifikant erhöht. Darüber hinaus wurden fünf Metaboliten in Gegenwart von DEHP herunterreguliert, darunter Monosaccharide wie D-Talose und Glucose, Disaccharide wie Maltose, Cellobiose und Trehalose sowie Zuckeralkohole wie D-Arabitol. Der Kohlenhydratgehalt gilt als Indikator für den physiologischen Status der Pflanze24. Daher deutet die Abnahme der Monosaccharid- und Disaccharidspiegel hierin auf physiologischen Stress hin, der durch DEHP-Stress verursacht wird. Im Vergleich zu Kohlenhydraten übte DEHP einen größeren Einfluss auf den Säurestoffwechsel bei Luzerne-Keimlingen aus. Unter Exposition mit DEHP waren die Gehalte von 11 Säuremetaboliten signifikant erhöht, darunter hauptsächlich 2-Amino-2-norbornancarbonsäure, 5-Hydroxyindol-2-carbonsäure, 3-Hydroxy-L-Prolin, Pelargonsäure und Palmitinsäure. Gleichzeitig hemmte DEHP auch den Stoffwechsel einiger Flavonoide in Luzernekeimlingen, darunter 4', 5-Dihyrroxy-7-methoxyisoflavon und Neohesperidin.
Die durch DEHP beeinflussten Stoffwechselwege sind in Abbildung 4 beschrieben. DEHP hemmte signifikant den Stoffwechsel von Kohlenhydraten, wie z. B. einigen Monosacchariden und Disacchariden, die Produkte der Photosynthese sind. Daher kann DEHP die Photosynthese von Luzerne bis zu einem gewissen Grad unterdrücken. Darüber hinaus kann DEHP den Stoffwechsel von Fettsäuren fördern, die für Pflanzen hilfreich sind, um Stress durch DEHP zu widerstehen. Die wichtigsten Stoffwechselwege, die von DEHP beeinflusst werden, waren der Kohlenhydratstoffwechsel und der Fettsäurestoffwechsel, während der Aminosäurestoffwechsel, der Fettstoffwechsel und der Tricarbonsäurezyklus (TCA) in viel geringerem Maße betroffen waren.
Abbildung 1: Ein Flussdiagramm der nicht-gezielten metabolomischen Analyse von Luzernewurzelexsudaten. BSTFA steht für Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)-Reagenz (mit 1% Trimethylchlorsilan [TMC], V/V). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Klassifikation der Metaboliten. (A) Klassifikation der bekannten Metaboliten und (B) Säuren. Der prozentuale Anteil jeder Materialart wird durch die Summe der Peakfläche jeder Kategorie durch die Summe der Peakfläche aller Stoffe in der Kontrolle dividiert. Andere Stoffe waren solche mit <0,5 %. Andere Säuren waren solche mit <0,5 %. Diese Zahl wurde von Wang et al.25 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Heatmap der hierarchischen Clustering-Analyse für Wurzelexsudate (VIP > 1, S . < 0,05) von Luzernekeimlingen mit unterschiedlichen DEHP-Behandlungen. Rot und Grün stehen für eine hohe bzw. niedrige Häufigkeit. ACK stellt das Steuerelement dar. 1+AD steht für die Behandlung mit 1 mg L−1 DEHP; 10+AD steht für die Behandlung mit 10 mg L−1 DEHP. Diese Zahl wurde von Wang et al.25 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Zusammenhänge zwischen der Störung von Stoffwechselwegen und den Veränderungen biologischer Endpunkte (1 mg L−1 DEHP, 10 mg L−1 DEHP). Die Stoffwechselwege wurden auf der Grundlage der Datenbank der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ermittelt. Bei den Metaboliten in grüner Schrift handelte es sich um die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen Metaboliten. Die Zeichen "rote Kästchen" und "blaue Kästchen" in Klammern zeigen an, dass die Metaboliten ihren Beitrag zu den biologischen Endpunkten erhöht (p < 0,05) bzw. verringert (p < 0,05) haben. Die Abbildung wurde lesbar gemacht, indem die Metaboliten grob in Kohlenhydrat-, Fettsäure- und Proteinstoffwechsel unterteilt wurden, wie die grünen, roten bzw. schwarzen rechteckigen Kästchen zeigen. ACK stellt das Steuerelement dar. 1+AD steht für die Behandlung mit 1 mg L−1 DEHP; 10+AD steht für die Behandlung mit 10 mg L−1 DEHP. Diese Zahl wurde von Wang et al.25 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet eine allgemeine Anleitung zur Erfassung und Messung der Wurzelexsudate von Luzerne unter DEHP-Stress sowie zur Analyse der Metabolomdaten. Einigen kritischen Schritten in diesem Protokoll muss besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. In hydroponischen Kulturexperimenten wurden Luzerne-Sämlinge hydroponisch in Glasflaschen kultiviert, die mit Nährlösungen mit unterschiedlichen DEHP-Konzentrationen gefüllt waren. Die Glasflaschen sollten während der gesamten Kulturperiode vor Licht geschützt werden, indem sie mit Aluminiumfolie abgedeckt werden, um die Photolyse von DEHP zu verhindern und die Gleichmäßigkeit der DEHP-Konzentrationen in allen Kulturlösungen zu gewährleisten25,26. Die DEHP-Konzentrationen wurden auf 1 mg L-1 und 10 mg L-1 festgelegt, entsprechend den Konzentrationen, die normalerweise in mit DEHP kontaminierten Böden27,28 zu finden sind. Bei der Entnahme von Wurzelexsudaten müssen die Zentrifugenröhrchen noch mit Alufolie umwickelt werden, um die Wurzeln vor Licht zu schützen. Hier wurde die Abholzeit auf 6 h festgelegt. Wenn die Sammelzeit zu kurz ist, kann die Konzentration einiger Wurzelexsudate mit geringer Abundanz zu niedrig sein, um nachgewiesen zu werden, so dass die Zusammensetzung der Wurzelexsudate möglicherweise nicht die tatsächliche Reaktion von Luzernesämlingen unter DEHP-Stress widerspiegelt. Wenn die Sammelzeit zu lang ist, können die gesammelten Wurzelexsudate bis zu einem gewissen Grad von Mikroben in den Kultursystemen abgebaut werden. In diesem Fall können auch einige mikrobielle Metaboliten nachgewiesen werden, die die Zusammensetzung der Wurzelexsudateverändern 29. Darüber hinaus sollten für jede Behandlung mindestens sechs Replikate durchgeführt werden, um eine genaue Analyse der Metabolomdaten zu gewährleisten.
Nur einige bestimmte Arten von Wurzelexsudaten, wie z. B. Aminosäuren, Fettsäuren, phenolische Verbindungen und andere organische Säuren, können mit herkömmlichen gezielten Analysemethoden (d. h. der Suche nach bekannten Verbindungen)30,31,32 unter Verwendung von Standardanalysemethoden wie Spektrophotometrie, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), Ionenchromatographie (IC), Gaschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (GC-MS/MS) oder Flüssigkeitschromatographie kombiniert bestimmt werden mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Mit der Entwicklung instrumenteller Analysetechniken hat sich die nicht-zielgerichtete metabolomische Analyse auf der Grundlage von GC-TOF-MS, Flüssigkeitschromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HR-MS) und Kernspinresonanz (NMR) herausgebildet33. Im Vergleich zu anderen konventionellen Analysemethoden von Wurzelexsudaten erweitert die nicht-zielgerichtete metabolomische Analyse die Anzahl der nachgewiesenen Wurzelexsudate erheblich, was ein tiefes Verständnis der pflanzlichen Stoffwechselreaktionen auf Umweltstress ermöglicht.
Die Technik in der vorliegenden Studie weist einige Einschränkungen auf, insbesondere bei der quantitativen Analyse von Metaboliten. Die nicht zielgerichtete metabolomische Analyse zeigt nur die relativen quantitativen Beziehungen zwischen verschiedenen Metaboliten und keine genauen Konzentrationen. Dies ist ungünstig für Untersuchungen des Umweltverhaltens oder der ökologischen Auswirkungen von Wurzelexsudaten34. Für die Nährmedien von Luzerne-Sämlingen wurden in der aktuellen Studie hydroponische Kulturexperimente durchgeführt, die die Vorteile einer einfachen Steuerung und einfachen Bedienung aufweisen. Die künstliche hydroponische Wachstumsumgebung unterscheidet sich jedoch von der realen Bodenumgebung, was zu einer möglichen Unterschätzung der Bruttoexsudationsraten aufgrund der Wiederaufnahme von Metaboliten durch die Wurzeln führt35. Im Vergleich zur hydroponischen Kultur ist die Sandkultur eine relativ überzeugendere Methode, da sie näher an der realen Bodenumgebung liegt, was die Sammlung von Wurzelausscheidungen in einer realistischen Umgebung erleichtert36. Daher wird daran gearbeitet, eine Methode der Sandkultur oder sogar der echten Bodenkultur zu etablieren, um die experimentellen Ergebnisse überzeugender zu machen, was uns helfen wird, tiefergehende Forschungen durchzuführen und bessere Ergebnisse von praktischer Bedeutung für die Erklärung der Toxizitätsreaktion zu zeigen.
Basierend auf der nicht-gezielten Stoffwechselanalyse können wir nicht nur die metabolische Reaktion von Pflanzen auf Umweltstress37 untersuchen, sondern auch differentielle Metaboliten bestimmen und die wichtige Rolle der differentiellen Metaboliten im Umweltverhalten von Schadstoffen38 weiter untersuchen. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Pelargonsäurespiegel als Indikator für die Schädigung der Wurzelmembran verwendet werden kann, wenn Pflanzen unter Stress stehen39. Es wurde auch festgestellt, dass ungesättigte Fettsäuren (Palmitinsäure) die Fließfähigkeitder Membran erhöhen 40, was die Membranen der Luzernewurzel vor DEHP-Schäden schützen kann. Einige Flavonoide, die durch DEHP gehemmt werden, können an der Interaktion zwischen Leguminosen und Mikroorganismen beteiligt sein. Darüber hinaus können die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und der biologischen Gemeinschaft der Rhizosphäre mit einer nicht-gezielten Stoffwechselanalyse tiefer entschlüsselt werden, insbesondere unter dem Stress von Schadstoffen41. Mit der Entwicklung von Analyseinstrumenten für die nicht-zielgerichtete Stoffwechselanalyse, die für die Konstruktion des metabolomischen Fingerabdrucks von Pflanzenwurzelexsudaten43 hilfreich ist, werden weitere Arten von Wurzelexsudaten identifiziert42.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (41877139), den Großprojekten der National Natural Science Foundation of China (41991335), dem National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), der Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nr. BK20161616), dem "135"-Plan und dem Frontiers Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (ISSASIP1615) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
References
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
- van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
- Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
- Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
- Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
- Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
- Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
- Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L.
- Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
- Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
- Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
- Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
- vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
- Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
- Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
- Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
- Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
- Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Koch, K. E.
- Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
- Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
- Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
- Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
- Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
- van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
- Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
- Oburger, E., Jones, D. L.
- Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
- Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
- Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
- Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
- Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
- Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).
