Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Di (2-etilheksil) Ftalatın Metabolit Üretimi Üzerindeki Etkisini İncelemek için Yonca Kökü Eksüdalarının Toplanması

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

Kök eksüdalarının salgılanması genellikle stres koşulları altındaki bitkiler için harici bir detoksifikasyon stratejisidir. Bu protokol, ksenobiyotiklerin yonca üzerindeki etkisinin hedefsiz metabolomik analiz yoluyla nasıl değerlendirileceğini açıklar.

Abstract

Kök eksüdaları, bitki kökleri ile çevre arasındaki bilgi iletişimi ve enerji transferinin ana ortamıdır. Kök eksüdalarının salgılanmasındaki değişiklik genellikle stres koşulları altındaki bitkiler için harici bir detoksifikasyon stratejisidir. Bu protokol, di (2-etilheksil) ftalatın (DEHP) metabolit üretimi üzerindeki etkisini incelemek için yonca kökü eksüdalarının toplanması için genel kılavuzlar getirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, yonca fideleri topraksız bir kültür deneyinde DEHP stresi altında yetiştirilir. İkincisi, bitkiler kök eksüdalarını toplamak için 6 saat boyunca 50 mL sterilize ultra saf su içeren santrifüj tüplerine aktarılır. Çözeltiler daha sonra vakumlu dondurarak kurutucuda dondurularak kurutulur. Dondurulmuş numuneler bis(trimetilsilil)) trifloroasetamid (BSTFA) reaktifi ile ekstrakte edilir ve türetilir. Daha sonra, türetilmiş ekstraktlar, uçuş zamanı kütle spektrometresi (GC-TOF-MS) ile birleştirilmiş bir gaz kromatograf sistemi kullanılarak ölçülür. Elde edilen metabolit verileri daha sonra biyoinformatik yöntemlere dayanarak analiz edilir. Diferansiyel metabolitler ve önemli ölçüde değişmiş metabolizma yolakları, kök eksüdaları açısından DEHP'nin yonca üzerindeki etkisini ortaya çıkarmak için derinlemesine araştırılmalıdır.

Introduction

Di (2-etilheksil) ftalat (DEHP), plastisitelerini ve mukavemetlerini arttırmak için çeşitli plastik ve polimerlerde plastikleştirici olarak yaygın olarak kullanılan sentetik bir kimyasal bileşiktir. Son birkaç yılda, giderek artan sayıda çalışma, DEHP'nin bir endokrin bozucu olduğunu ve insanların ve diğer hayvanların solunum, sinir ve üreme sistemleri üzerinde olumsuz etkisi olduğunu ileri sürmüştür 1,2,3. Sağlık riski göz önüne alındığında, Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı, Avrupa Birliği ve Çin Çevre İzleme Merkezi, DEHP'yi öncelikli kirleticiler listesinde sınıflandırmıştır. Toprak, plastik malçlama ve organik gübrelerin uygulanması, atık su ile sulama ve çamur çiftliği uygulaması nedeniyle DEHP'nin çevrede önemli bir lavabosu olarak kabul edilmiştir4. Beklendiği gibi, DEHP, içeriği Çin'deki bazı bölgelerde kilogram kuru toprak başına miligrama kadar ulaşan tarım arazisi topraklarında her yerde tespit edilmiştir 5,6. DEHP, bitkilere esas olarak kökler yoluyla girebilir ve toprak ekosistemlerinde farklı trofik seviyelerde biyomagnifikasyona uğrayabilir7. Bu nedenle, son yıllarda bitkilerde DEHP'nin neden olduğu stres hakkında önemli endişeler ortaya çıkmıştır.

Bitkiler genellikle DEHP maruziyetine karşı savunmasızdır. DEHP stresinin tohum çimlenmesi ve normal metabolizma üzerinde olumsuz bir etki yarattığı ve böylece bitki büyümesini ve gelişimini engellediği gözlenmiştir 8,9. Örneğin, DEHP mezofil hücrelerine oksidatif hasara neden olabilir, klorofil ve ozmolit içeriğini azaltabilir ve antioksidatif enzim aktivitelerini yükseltebilir, sonuçta yenilebilir bitkilerin veriminde ve kalitesinde bir düşüşe neden olabilir10,11. Bununla birlikte, bitkilerin DEHP stresine tepkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların çoğu, oksidatif strese ve fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere odaklanmıştır. Bitki metabolizması ile ilişkili karşılık gelen mekanizmalar daha az çalışılmıştır. Kök eksüdaları, bitki köklerinin salgıladığı ve çevreye saldığı bileşikleri tanımlayan genel bir terimdir. Bitkiler ve rizosfer toprağı arasındaki etkileşim ortamı olarak kabul edilmişlerdir ve bitki büyümesini ve gelişimini desteklemede önemli bir rol oynamaktadırlar12. Kök eksüdalarının tüm fotosentetik karbon13'ün yaklaşık% 30-40'ını oluşturduğu iyi bilinmektedir. Kirlenmiş ortamlarda, kök eksüdaları, bitkilerin metabolizma veya dış dışlama yoluyla kirleticilerin stresine karşı toleransını arttırmada rol oynar14. Sonuç olarak, bitki kökü eksüdalarının kirlilik stresine tepkisinin derinlemesine anlaşılması, hücre biyokimyası ve biyolojik fenomenlerle ilişkili temel mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir15.

Metabolomik teknoloji, hücreler 16,17, dokular18 ve hatta şekerler, organik asitler, amino asitler ve lipitler dahil olmak üzere organizmalarıneksüdaları 19 içinde aynı anda çok sayıda küçük molekül metabolitini ölçmek için etkili bir strateji sağlar. Geleneksel veya klasik kimyasal analiz yöntemleriyle karşılaştırıldığında, metabolomik yaklaşım, tespit edilebilen metabolit sayısını büyük ölçüde artırır20, bu da metabolitleri daha yüksek verimli bir şekilde tanımlamaya ve anahtar metabolik yolları tanımlamaya yardımcı olabilir. Metabolomik, ağır metaller21, ortaya çıkan kirleticiler22 ve nanopartiküller19 gibi stres ortamlarında biyolojik tepkinin araştırma alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitkiler üzerinde yapılan bu çalışmaların çoğu, iç bitki dokularındaki metabolik değişikliklere odaklanırken, kök eksüdalarının çevresel strese tepkisi hakkında çok az şey bildirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, DEHP'nin metabolit üretimi üzerindeki etkisini incelemek için yonca kökü eksüdalarının toplanması için genel kılavuzları tanıtmaktır. Sonuçlar, DEHP tarafından bitki metabolomiklerinin takip çalışması için bir yöntem rehberliği sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolün amacı, DEHP'nin yonca kökü eksüdaları üzerindeki etkisini ölçen bir hidroponik kültür deneyinden metabolomik analize kadar genel bir boru hattı sağlamaktır.

1. Topraksız kültür deneyi

NOT: Bu protokol, farklı DEHP konsantrasyonlarının stresi altında yonca (Medicago sativa) fideleri elde etmek için tasarlanmış bir yonca hidroponik kültür deneyinin bir örneğini sunmaktadır. Üç tedavi kuruldu: herhangi bir ilaveler olmadan kontrol ve besin çözeltisi 1 mg kg-1 ve 10 mg kg-1 di (DEHP. DEHP'nin konsantrasyonları, DEHP'nin toprak23'teki gerçek içeriğine göre ayarlanmıştır. Her tedavinin altı kopyası vardı.

  1. Yonca tohumlarını 10 dakika boyunca% 0.1 sodyum hipoklorit ve% 75 etil alkol ile 30 dakika boyunca sterilize edin.
    1. Sterilize edilmiş tohumları damıtılmış suyla birkaç kez durulayın ve daha sonra karanlıkta 30 ° C'de steril bir Petri kabında nemli filtre kağıdında çimlenin.
  2. 20 üniform çimlenmiş, büyük dolgun tohumu, (μM cinsinden) oluşan besin çözeltisi ile doldurulmuş bir kültür şişesinde bir engraftment sepetine aktarın: Ca (NO 3) 2, 3.500; NH4H2PO4, 1.000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2.000; Na2Fe-etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 75; H3 BO3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0.3; ve (NH4 )6Mo7O24, 0.02. 0,1 M KOH kullanarak çözelti pH'ını 7,0'a ayarlayın. Tüm çözümleri haftalık olarak yenileyin.
  3. Tüm kültür şişelerini, sırasıyla gündüz (16 saat) ve geceyi (8 saat) temsil eden 27 ° C ve 20 ° C'de, her gün 16 saatlik bir fotoperiyotla, 150-180 μmol m-2 s-1 ışık yoğunluğuna sahip kontrollü bir büyüme odasına yerleştirin.
  4. 2 hafta sonra 1 mg kg-1 ve 10 mg kg-1 DEHP stresi altındaki kültür deneyleri için 15 üniform yonca fidanını yeni bir cam şişeye aktarın. DEHP'nin fotolizini ve uçuculaşmasını önlemek için cam şişeleri alüminyum folyo ve parafilm ile sarın. Aynı koşulları uygulamak için, kontrol şişelerini alüminyum folyo ve parafilm ile de sarın. Sıvı seviyesini korumak için besin çözeltisini günlük olarak takviye edin.
  5. Yonca fideleri için tutarlı büyüme koşulları sağlamak için şişeleri her 2 günde bir rastgele yerleştirin ve döndürün.
  6. 7 günlük ekimden sonra, yonca fidelerini şişelerden çıkarın ve kök eksüdalarının toplanmasına hazırlanarak birkaç kez ultra saf suyla yıkayın.

2. Kök eksüdalarının toplanması, ekstraksiyonu ve metabolomik analizi

NOT: Bu protokol üç bölüme ayrılmıştır: bir toplama deneyi, bir ekstraksiyon deneyi ve kök eksüdalarının metabolomik analizi. Toplama deneyinin amacı, bitki örneklerinde salgılanan metabolitleri daha sonraki ekstraksiyon için çözelti sistemine aktarmaktır.

  1. Koleksiyon denemesi
    1. 10 üniform yonca fidesini 50 mL sterilize deiyonize su ile doldurulmuş santrifüj tüplerine aktarın. 6 saat boyunca kök eksüdalarını toplamak için kökleri suya batırın; Tüpleri dik tutun. Her tedavi için en az altı çoğaltma yapın.
    2. Kökleri ışıktan korumak için santrifüj tüplerini alüminyum folyo ile sarın.
    3. Bitkileri çıkarın ve metabolit profillemesi için toplanan sıvıyı dondurarak kurutun.
  2. Ekstraksiyon deneyi
    1. Tüplere ve girdaba 30 s boyunca 1,8 mL ekstraksiyon çözeltisi (metanol:H2O = 3: 1, V / V) ekleyin.
    2. Bir buzlu su banyosunda 10 dakika boyunca tüplere ultrason dalgaları uygulayın.
    3. Numuneleri 4 °C'de ve 11.000 × g'da 15 dakika boyunca santrifüjleyin.
    4. 200 μL süpernatantı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. Her numuneden 45 μL süpernatant alın ve numunelerin metabolom verilerinin kalibrasyonu için kullanılan 270 μL'lik son hacimde kalite kontrol (QC) numunelerine karıştırın.
    5. Ekstraktları bir vakum konsantratöründe dondurarak kurutun. 5 μL iç standart (ribonükleol) ile kurutmaya devam edin.
    6. Bir vakum konsantratöründe buharlaştıktan sonra, tüplere 30 μL metoksiaminasyon hidroklorür (20 mg mL-1 konsantrasyonunda piridin içinde çözülmüş) ekleyin ve tüpleri 80 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, numunelere 40 μL bis (trimetilsilil) trifloroasetamid (BSTFA) reaktifi (% 1 trimetilklorosilane [TMC], V / V ile) ekleyin ve tüpleri türevlendirme için 1,5 saat boyunca 70 ° C'de yerleştirin.
    7. Numuneleri oda sıcaklığına soğutun ve QC numunelerine 5 μL yağ asidi metil esteri (FAME) (kloroformda) ekleyin.
  3. Metabolomik analiz
    1. Türetilmiş ekstraktların 1,0 μL'sini, bölünmez bir mod kullanarak metabolomik profil oluşturma analizi için uçuş zamanı kütle spektrometresine (GC-TOF-MS) bağlı bir gaz kromatograf sistemine enjekte edin.
      1. Kök eksüdalarının ayrılması için bir kılcal sütun (30 m x 250 μm x 0.25 μm) kullanın, helyum 1.0 mL min-1 akış hızında bir taşıyıcı gaz olarak kullanılır. Enjeksiyon sıcaklığını 280 ° C'ye ayarlayın ve transfer hattı sıcaklığını ve iyon kaynağı sıcaklığını sırasıyla 280 ° C ve 250 ° C'de tutun.
      2. Ayırma için aşağıdaki fırın programını kullanın: 50 ° C'de 1 dakika izotermal ısıtma, 310 ° C'de 10 ° C / dak 1 fırın rampası ve 8 dakika boyunca 310 ° C'de son izotermal ısıtma.
      3. -70 eV enerji ile elektron çarpışma modunu gerçekleştirin. 12,5 spektrum/sn hızında 50-500 m/z kütle tarama aralığına sahip tam tarama izleme modunu kullanarak kütle spektrumları elde edin.
    2. Gürültüyü gidermek için tek tek tepe noktalarını filtreleyin. Sapma değeri, çeyrekler arası aralığa göre filtrelenir.
    3. Eksik değerleri minimum değerlerin yarısıyla doldurun, verileri standartlaştırın ve normalleştirin.
    4. Çok değişkenli analiz için nihai verileri .csv formatta istatistiksel analiz yazılımına aktarın.
    5. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) veritabanındaki (biyolojik sistemin üst düzey işlevlerini ve yardımcı programlarını anlamak için bir veritabanı kaynağı) metabolitleri arayın ve metabolitleri karbonhidratlar, asitler, lipitler, alkoller ve aminler gibi farklı kategorilere ayırın. Tüm kök eksüdalardaki her kategorinin yüzdesini göstermek üzere bir pasta grafik oluşturmak için istatistiksel analiz yazılımı kullanın.
    6. Gruplar arasındaki farklılıkları göstermek için gizli yapılar-ayrımcı analize (OPLS-DA) denetimli ortogonal projeksiyonlar uygulayın.
    7. Ekran, projeksiyonda (VIP) değişken bir öneme dayanarak diferansiyel metabolitler olarak metabolitleri anlamlı olarak değiştirdi > 1 ve p < 0.05 (Student's t testi).
    8. İstatistiksel analiz yazılımı ile ısı haritaları oluşturmak için metabolom verilerini kullanın ve histogramları oluşturmak için farklı işlemler altında kıvrım değişikliklerini kullanın.
    9. KEGG veritabanında ve Pubchem'de diferansiyel metabolitleri arayın ve diferansiyel metabolitleri içeren metabolik yolları derleyin. Yol zenginleştirme analizi veya topoloji analizi gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu deneyde, yonca kökü eksüdaları yukarıdaki yöntemlere göre toplanmış, ekstrakte edilmiş ve analiz edilmiştir (Şekil 1). Üç tedavi grubu oluşturuldu: kontrol, düşük DEHP konsantrasyonu (1 mg L-1) ve yüksek DEHP konsantrasyonu (10 mg L-1).

Kontrolün kromatografında toplam 778 pik tespit edildi ve bunların 314 metaboliti kütle spektrumlarına göre tanımlanabildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu metabolitler göreceli bolluğa göre altı tipte sınıflandırılabilir: karbonhidratlar (% 28.6), asitler (% 15.58), lipitler (% 13.87), alkoller (% 3.91), aminler (% 0.92) ve diğerleri (% 37.12). % 0.5'ten daha azını oluşturan metabolitler diğer maddeler olarak gruplandırıldı (Şekil 2A). Asitler ayrıca yağ asitleri (% 56.09), amino asitler (% 26.62), organik asitler (% 13.95) ve fenolik asitler (% 3.34) olarak alt bölümlere ayrıldı (Şekil 2B). Ek olarak, çoğu bitkinin kök eksüdalarındaki bazı yaygın maddeler, pirimidinler, hidroksi piridinler, flavonoidler, fenoller, ketonlar, pirimidinler, flavonoidler ve diterpenler dahil olmak üzere yonca kökü eksüdalarında da tespit edilebilir.

VIP skoruna dayanarak, farklı DEHP tedavileri arasındaki diferansiyel metabolitlerdeki varyasyonu görselleştirmek için bir ısı haritası çizildi (Şekil 3). Kontrol ile karşılaştırıldığında, DEHP'ye maruz kalma, yonca kökü eksüdalarında, esas olarak bazı karbonhidratlar ve düşük moleküler ağırlıklı organik asitler dahil olmak üzere 50 metabolitin içeriğini önemli ölçüde değiştirdi. DEHP varlığında beş tip karbonhidrat (likoz, digitoksoz, eritroz, trehaloz ve fruktoz 2, 6-bihosfat) yukarı regüle edildi ve bunlardan ikisi (likoz ve digitoksoz) DEHP konsantrasyonu arttıkça önemli ölçüde arttı. Ek olarak, DEHP varlığında, D-taloz ve glikoz gibi monosakaritler, maltoz, selofoz ve trehaloz gibi disakkaritler ve D-arabitol gibi şeker alkolleri de dahil olmak üzere beş metabolit aşağı regüle edildi. Karbonhidrat içeriği bitkinin fizyolojik durumunun bir göstergesi olarak kabul edilmiştir24. Bu nedenle, buradaki monosakkarit ve disakkarit seviyelerindeki azalma, DEHP stresinin neden olduğu fizyolojik stresi göstermiştir. Karbonhidratlarla karşılaştırıldığında, DEHP yonca fidelerinde asit metabolizması üzerinde daha büyük bir etki göstermiştir. DEHP'ye maruz kalma altında, esas olarak 2-amino-2-norbornanekarboksilik asit, 5-hidroksiyindol-2-karboksilik asit, 3-hidroksi-L-prolin, pelargonik asit ve palmitik asit dahil olmak üzere 11 asit metabolitinin içeriği önemli ölçüde artmıştır. Aynı zamanda, DEHP ayrıca yonca fidelerinde 4', 5-dihyrroxy-7-methoxyisoflavone ve neohesperidin dahil olmak üzere bazı flavonoidlerin metabolizmasını da inhibe etti.

DEHP'den etkilenen metabolik yollar Şekil 4'te açıklanmıştır. DEHP, fotosentez ürünleri olan bazı monosakaritler ve disakkaritler gibi karbonhidratların metabolizmasını önemli ölçüde inhibe etti. Bu nedenle, DEHP yoncanın fotosentezini bir dereceye kadar baskılayabilir. Dahası, DEHP, bitkilerin DEHP'den gelen strese direnmesine yardımcı olan yağ asitlerinin metabolizmasını teşvik edebilir. DEHP'den etkilenen başlıca metabolik yollar karbonhidrat metabolizması ve yağ asidi metabolizması iken, amino asit metabolizması, lipid metabolizması ve trikarboksilik asit (TCA) döngüsü çok daha az ölçüde etkilenmiştir.

Figure 1
Şekil 1: Yonca kökü eksüdaları için hedeflenmemiş metabolomik analizin akış şeması. BSTFA, BIS (TRIMETILSILIL) TRIFLOROASETAMID (BSTFA) REAKTIFINI (% 1 trimetilklorosilane [TMC], V / V ile) temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Metabolitlerin sınıflandırılması. (A) Bilinen metabolitlerin ve (B) asitlerin sınıflandırılması. Her malzeme tipinin yüzdesi, her kategorinin tepe alanının toplamına, kontroldeki tüm maddelerin tepe alanının toplamına bölünür. Diğer maddeler% <0.5 olanlardı. Diğer asitler% <0.5 olanlardı. Bu rakam Wang ve ark.25'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Farklı DEHP işlemlerine sahip yonca fidanlarının kök eksüdaları (VIP > 1, p < 0.05) için hiyerarşik kümeleme analizinin ısı haritası. Kırmızı ve yeşil, sırasıyla yüksek ve düşük bolluğu temsil eder. ACK kontrolü temsil eder; 1 + AD, 1 mg L-1 DEHP ile tedaviyi temsil eder; 10 + AD, 10 mg L-1 DEHP ile tedaviyi temsil eder. Bu rakam Wang ve ark.25'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Metabolik yolakların bozulması ile biyolojik sonlanım noktalarındaki değişiklikler arasındaki ilişkiler (1 mg L-1 DEHP, 10 mg L-1 DEHP). Metabolik yollar, Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) veritabanına dayanarak kuruldu. Yeşil metindeki metabolitler, bu çalışmada tespit edilen metabolitlerdi. Parantez içindeki "kırmızı kutular" ve "mavi kutular" işaretleri, metabolitlerin biyolojik sonlanım noktalarına katkılarını sırasıyla arttırdığını (p < 0.05) veya azaldığını (p < 0.05) gösterir. Şekil, sırasıyla yeşil, kırmızı ve siyah dikdörtgen kutularda gösterildiği gibi, metabolitleri kabaca karbonhidrat, yağ asidi ve protein metabolizmasına ayırarak okunabilir hale getirilmiştir. ACK kontrolü temsil eder; 1 + AD, 1 mg L-1 DEHP ile tedaviyi temsil eder; 10 + AD, 10 mg L-1 DEHP ile tedaviyi temsil eder. Bu rakam Wang ve ark.25'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, DEHP stresi altında yonca kök eksüdalarının nasıl toplanacağı ve ölçüleceği ve metabolom verilerinin nasıl analiz edileceği konusunda genel rehberlik sağlar. Bu protokoldeki bazı kritik adımlara çok dikkat edilmesi gerekiyor. Hidroponik kültür deneylerinde, yonca fideleri, farklı konsantrasyonlarda DEHP'ye sahip besin çözeltileri ile doldurulmuş cam şişelerde hidroponik olarak kültürlenmiştir. Cam şişeler, DEHP'nin fotolizini önlemek ve tüm kültür çözeltilerinde DEHP konsantrasyonlarının homojenliğini sağlamak için kültür dönemi boyunca alüminyum folyo ile kaplanarak ışıktan korunmalıdır25,26. DEHP konsantrasyonları, genellikle DEHP27,28 ile kontamine olmuş topraklarda bulunan konsantrasyonlara göre 1 mg L-1 ve 10 mg L-1 olarak ayarlanmıştır. Kök eksüdalarının toplanması sırasında, kökleri ışıktan korumak için santrifüj tüplerinin hala alüminyum folyo ile sarılması gerekir. Burada toplama süresi 6 saat olarak ayarlandı. Toplama süresi çok kısaysa, bazı düşük bolluktaki kök eksüdalarının konsantrasyonu tespit edilemeyecek kadar düşük olabilir, bu nedenle kök eksüdalarının bileşimi DEHP stresi altındaki yonca fidelerinin gerçek tepkisini yansıtmayabilir. Toplama süresi çok uzunsa, toplanan kök eksüdaları kültür sistemlerindeki mikroplar tarafından bir dereceye kadar parçalanabilir. Bu durumda, kök eksüdalarının bileşimini değiştirerek bazı mikrobiyal metabolitler de tespit edilebilir29. Ayrıca, doğru metabolom veri analizini sağlamak için her tedavi için en az altı replikasyon yapılmalıdır.

Sadece amino asitler, yağ asitleri, fenolik bileşikler ve diğer organik asitler gibi bazı belirli kök eksüda türleri, spektrofotometri, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC), iyon kromatografisi (IC), gaz kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (GC-MS / MS) veya kombine sıvı kromatografisi gibi standart analitik yöntemler kullanılarak geleneksel hedefli analitik yöntemler kullanılarak (yani, bilinen bileşiklerin aranması)30,31,32 belirlenebilir tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile. Enstrümental analiz tekniklerinin gelişmesiyle GC-TOF-MS, sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (LC-HR-MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR)33'e dayanan hedefsiz metabolomik analizler ortaya çıkmıştır. Kök eksüdalarının diğer geleneksel analitik yöntemleriyle karşılaştırıldığında, hedeflenmemiş metabolomik analiz, tespit edilen kök eksüdalarının sayısını büyük ölçüde genişletir ve bu da çevresel strese karşı bitki metabolik tepkilerini derinlemesine anlamayı kolaylaştırır.

Bu çalışmadaki teknik, özellikle metabolitlerin kantitatif analizinde bazı sınırlamalara sahiptir. Hedeflenmemiş metabolomik analiz, doğru konsantrasyonlardan ziyade, yalnızca farklı metabolitler arasındaki göreceli nicel ilişkileri gösterir. Bu, kök eksüdalarının çevresel davranışları veya ekolojik etkileri üzerine yapılan araştırmalar için elverişsizdir34. Yonca fidelerinin büyüme ortamı için, mevcut çalışmada kolay kontrol ve kolay kullanım avantajlarına sahip hidroponik kültür deneyleri yapılmıştır. Bununla birlikte, yapay topraksız büyüme ortamı gerçek toprak ortamından farklıdır ve bu da kök35 tarafından metabolit geri alımı nedeniyle brüt eksüdasyon oranlarının olası hafife alınmasına yol açmaktadır. Topraksız kültür ile karşılaştırıldığında, kum kültürü nispeten daha ikna edici bir yöntemdir, çünkü gerçek toprak ortamına daha yakındır ve kök eksüdalarının gerçekçi bir ortamda toplanmasını kolaylaştırır36. Bu nedenle, deneysel sonuçları daha ikna edici hale getirmek için bir kum kültürü yöntemi veya hatta gerçek toprak kültürü oluşturmak için çalışmalar devam etmektedir, bu da toksisite tepkisini açıklamak için pratik öneme sahip daha iyi sonuçlar göstererek daha derinlemesine araştırma yapmamıza yardımcı olacaktır.

Hedeflenmemiş metabolik analize dayanarak, sadece bitkilerin çevresel strese metabolik tepkisini araştırmakla kalmaz37, aynı zamanda diferansiyel metabolitleri belirleyebilir ve diferansiyel metabolitlerin kirleticilerin çevresel davranışındaki önemli rolünü daha fazla araştırabiliriz38. Önceki çalışmalar, pelargonik asit seviyesinin, bitkiler stres altındayken kök zarı hasarının bir göstergesi olarak kullanılabileceğini göstermiştir39. Doymamış yağ asitlerinin (palmitik asit) ayrıca yonca kökü zarlarını DEHP hasarından koruyabilen membran akışkanlığını40 arttırdığı bulunmuştur. DEHP tarafından inhibe edilen bazı flavonoidler, baklagiller ve mikroorganizmalar arasındaki etkileşime katılabilir. Dahası, bitkiler ve rizosfer biyolojik topluluğu arasındaki etkileşimler, özellikle kirleticilerin stresi altında, hedeflenmemiş metabolik analizlerle daha derinden deşifre edilebilir41. Bitki kökü eksüdalarının metabolomik parmak izini oluşturmak için yardımcı olan hedefsiz metabolik analiz için analitik aletlerin geliştirilmesiyle daha fazla kök eksüda türü42 tanımlanacaktır43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek bilinen rakip finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan etmektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (41877139), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (41991335) Büyük Projeleri, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFD0800204), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. BK20161616), "135" Planı ve Çin Bilimler Akademisi Sınır Programı (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
  2. Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
  3. van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
  4. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  5. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  6. Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
  7. Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
  8. Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
  9. Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
  10. Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
  11. Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
  12. Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
  13. Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
  14. Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
  15. Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
  16. Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
  17. vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
  18. Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
  19. Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
  20. Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
  21. Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
  22. Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
  23. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  24. Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  25. Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
  26. Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
  27. Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
  28. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  29. Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
  30. Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
  31. Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
  32. Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
  33. van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
  34. Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
  35. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  36. Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
  37. Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
  38. Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
  39. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
  40. Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
  41. Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
  42. Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
  43. Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).

Tags

Çevre Bilimleri Sayı 196
Di (2-etilheksil) Ftalatın Metabolit Üretimi Üzerindeki Etkisini İncelemek için Yonca Kökü Eksüdalarının Toplanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter