Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Innsamling av alfalfarot ekssudater for å studere virkningen av di (2-etylheksyl) ftalat på metabolittproduksjon

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

Sekresjonen av rotekssudater er vanligvis en ekstern avgiftningsstrategi for planter under stressforhold. Denne protokollen beskriver hvordan man vurderer virkningen av xenobiotika på alfalfa via ikke-målrettet metabolomisk analyse.

Abstract

Rotekssudater er hovedmediet for informasjonskommunikasjon og energioverføring mellom planterøtter og omgivelsene. Endringen i sekresjon av rotekssudater er vanligvis en ekstern avgiftningsstrategi for planter under stressforhold. Denne protokollen tar sikte på å introdusere generelle retningslinjer for innsamling av alfalfarotekssudater for å studere virkningen av di (2-etylheksyl) ftalat (DEHP) på metabolittproduksjon. For det første dyrkes alfalfaplanter under DEHP-stress i et hydroponisk kultureksperiment. For det andre overføres plantene til sentrifugerør som inneholder 50 ml sterilisert ultrarent vann i 6 timer for å samle rotekssudater. Løsningene frysetørkes deretter i en vakuumfrysetørker. De frosne prøvene ekstraheres og derivatiseres med bis(trimetylsilyl)) trifluoracetamid (BSTFA) reagens. Deretter måles de derivatiserte ekstraktene ved hjelp av et gasskromatografsystem kombinert med et time-of-flight massespektrometer (GC-TOF-MS). De ervervede metabolittdataene analyseres deretter basert på bioinformatiske metoder. Differensialmetabolitter og signifikant endrede metabolismeveier bør undersøkes dypt for å avsløre virkningen av DEHP på alfalfa i lys av rotekssudater.

Introduction

Di (2-etylheksyl) ftalat (DEHP) er en syntetisk kjemisk forbindelse som er mye brukt i forskjellige plast og polymerer som mykner for å forbedre plastisiteten og styrken. I løpet av de siste årene har et økende antall studier antydet at DEHP er hormonforstyrrende og har negativ effekt på respiratoriske, nervøse og reproduktive systemer hos mennesker og andre dyr 1,2,3. Med tanke på helserisikoen har USAs miljøvernbyrå, EU og Environmental Monitoring Center of China alle klassifisert DEHP i listen over prioriterte forurensende stoffer. Jord har blitt ansett som en viktig vask av DEHP i miljøet, på grunn av påføring av plastmulching og organisk gjødsel, vanning med avløpsvann og slambruk4. Som forventet har DEHP blitt allestedsnærværende oppdaget i jordbruksjord, hvis innhold til og med når opp til milligram per kilo tørket jord i noen regioner i Kina 5,6. DEHP kan gå inn i planter hovedsakelig via røttene og gjennomgå biomagnifisering på forskjellige trofiske nivåer i jordøkosystemer7. Derfor har det blitt reist betydelig bekymring for DEHP-indusert stress i planter de siste tiårene.

Planter er vanligvis sårbare for DEHP-eksponering. DEHP-stress har blitt observert å utøve en negativ effekt på frøspredning og normal metabolisme, og dermed hemme plantevekst og utvikling 8,9. For eksempel kan DEHP indusere oksidativ skade på mesofyllceller, redusere innholdet av klorofyll og osmolytter, og heve antioksidative enzymaktiviteter, noe som til slutt resulterer i en nedgang i utbyttet og kvaliteten på spiselige planter10,11. Imidlertid har de fleste av de tidligere studiene på planters respons på DEHP-stress fokusert på oksidativt stress og fysiologiske og biokjemiske egenskaper. De tilsvarende mekanismene forbundet med plantemetabolisme er mindre studert. Rotekssudater er et generisk begrep som beskriver forbindelser som planterøtter skiller ut og slipper ut i miljøet. De har blitt betraktet som interaksjonsmediet mellom planter og jord i rhizosfæren, og spiller en viktig rolle i å støtte plantevekst og utvikling12. Det har vært velkjent at rotekssudater står for omtrent 30% -40% av alt fotosyntetisk karbon13. I forurensede miljøer er rotekssudater involvert i å forbedre plantens toleranse for stress av forurensende stoffer gjennom metabolisme eller ekstern ekskludering14. Som en konsekvens kan en dyp forståelse av responsen av planterot ekssudater til forurensningsstress bidra til å avsløre de underliggende mekanismene forbundet med cellebiokjemi og biologiske fenomener15.

Metabolomics-teknologi gir en effektiv strategi for å måle et stort antall småmolekylære metabolitter samtidig i celler 16,17, vev18, og til og med ekssudater av organismer 19, inkludert sukkerarter, organiske syrer, aminosyrer og lipider. Sammenlignet med tradisjonelle eller klassiske kjemiske analysemetoder, øker metabolomics-tilnærmingen i stor grad antall metabolitter som kan detekteres20, noe som kan bidra til å identifisere metabolitter på en høyere gjennomstrømningsmåte og identifisere viktige metabolske veier. Metabolomics har vært mye brukt i forskningsfeltet biologisk respons i stresmiljøer, som tungmetaller21, nye forurensninger22 og nanopartikler19. De fleste av disse studiene på planter har fokusert på metabolske endringer i indre plantevev, mens få har blitt rapportert om responsen av rotekssudater til miljøstress. Derfor er målet med denne studien å introdusere generelle retningslinjer for innsamling av alfalfarotekssudater for å studere virkningen av DEHP på metabolittproduksjon. Resultatene vil gi en metodeveiledning for DEHPs oppfølgingsstudie av plantemetabolomikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Målet med denne protokollen er å gi en generell rørledning, fra et hydroponisk kultureksperiment til metabolomisk analyse, kvantifisere effekten av DEHP på alfalfarotekssudater.

1. Hydroponisk kultureksperiment

MERK: Denne protokollen presenterer et eksempel på et alfalfa hydroponisk kultureksperiment designet for å oppnå alfalfa (Medicago sativa) frøplanter under stress av forskjellige konsentrasjoner av DEHP. Tre behandlinger ble satt opp: kontrollen uten tilsetninger, og næringsoppløsningen tilsatt 1 mg kg-1 og 10 mg kg-1 di (DEHP. Konsentrasjonene av DEHP ble satt i henhold til det virkelige innholdet av DEHP i jord23. Hver behandling hadde seks replikater.

  1. Steriliser alfalfafrø med 0,1% natriumhypokloritt i 10 minutter og 75% etylalkohol i 30 minutter.
    1. Skyll de steriliserte frøene flere ganger med destillert vann og spir deretter på fuktig filterpapir i en steril petriskål ved 30 °C i mørket.
  2. Overfør 20 ensartede, spirede, store klumpete frø til en engraftmentkurv i en kulturflaske fylt med næringsoppløsning, sammensatt av (i μM): Ca(NO 3)2, 3,500; NH4H2PO4, 1,000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2,000; Na2Fe-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 75; H 3BO3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; og (NH4 )6Mo7O24, 0,02. Juster oppløsningens pH til 7,0 med 0,1 M KOH. Forny alle løsninger ukentlig.
  3. Plasser alle dyrkningsflaskene i et kontrollert vekstkammer med en lysintensitet på 150-180 μmol m-2 s-1 med en fotoperiode på 16 timer hver dag, henholdsvis 27 °C og 20 °C som representerer dag (16 timer) og natt (8 timer).
  4. Overfør 15 ensartede alfalfaplanter til en ny glassflaske for kultureksperimenter under 1 mg kg-1 og 10 mg kg-1 DEHP stress etter 2 uker. Pakk glassflaskene med aluminiumsfolie og parafilm for å forhindre fotolyse og fordampning av DEHP. For å bruke de samme forholdene, pakk også kontrollflaskene med aluminiumsfolie og parafilm. Tilsett næringsoppløsningen daglig for å opprettholde væskenivået.
  5. Plasser og roter flaskene tilfeldig hver 2. dag for å sikre konsistente vekstforhold for alfalfaplanter.
  6. Etter 7 dager med dyrking, fjern alfalfaplanter fra flasker og vask med ultrarent vann flere ganger, forbereder innsamling av rotekssudater.

2. Innsamling, ekstraksjon og metabolomisk analyse av rotekssudater

MERK: Denne protokollen er delt inn i tre deler: et samlingseksperiment, et ekstraksjonseksperiment og metabolomisk analyse av rotekssudatene. Målet med innsamlingsforsøket er å overføre metabolittene som skilles ut i planteprøver til løsningssystemet for senere ekstraksjon.

  1. Eksperiment med innsamling
    1. Overfør 10 ensartede alfalfaplanter til sentrifugerør fylt med 50 ml sterilisert avionisert vann. Senk røttene i vann for å samle rotekssudater i 6 timer; Hold rørene oppreist. Utfør minst seks replikater for hver behandling.
    2. Pakk sentrifugerørene med aluminiumsfolie for å beskytte røttene mot lys.
    3. Fjern plantene og frysetørk den oppsamlede væsken for metabolittprofilering.
  2. Ekstraksjonseksperiment
    1. Tilsett 1,8 ml ekstraksjonsløsning (metanol:H2O= 3:1, V/V) til rørene og virvelen i 30 s.
    2. Påfør ultralydbølger på rørene i 10 minutter i et isvannsbad.
    3. Sentrifuger prøvene ved 4 °C og 11 000 × g i 15 minutter.
    4. Overfør forsiktig 200 μl supernatant til et mikrosentrifugerør på 1,5 ml. Ta 45 μL supernatant fra hver prøve og bland det inn i kvalitetskontrollprøver (QC) ved et endelig volum på 270 μL, som brukes til kalibrering av metabolomdataene til prøver.
    5. Frysetørke ekstraktene i en vakuumkonsentrator. Fortsett å tørke med 5 μL av den interne standarden (ribonukleo).
    6. Etter fordampning i en vakuumkonsentrator, tilsett 30 μL metoksyamineringshydroklorid (oppløst i pyridin i en konsentrasjon på 20 mg ml-1) til rørene og inkuber rørene ved 80 ° C i 30 minutter. Deretter tilsettes 40 μL bis(trimetylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA) reagens (med 1% trimetylklorsilan [TMC], V/V) til prøvene og plasser rørene ved 70 °C i 1,5 timer for derivatisering.
    7. Avkjøl prøvene til romtemperatur og tilsett 5 μL fettsyremetylestere (FAME) (i kloroform) til QC-prøvene.
  3. Metabolomisk analyse
    1. Injiser 1,0 μL av de derivatiserte ekstraktene i et gasskromatografsystem koblet til et time-of-flight massespektrometer (GC-TOF-MS) for metabolomisk profileringsanalyse ved hjelp av en delt modus.
      1. Bruk en kapillærkolonne (30 m x 250 μm x 0,25 μm) for separasjon av rotekssudater, med helium som bærergass ved en strømningshastighet på 1,0 ml min-1. Sett injeksjonstemperaturen til 280 °C, og hold overføringslinjetemperaturen og ionkildetemperaturen på henholdsvis 280 °C og 250 °C.
      2. For separasjon, bruk følgende ovnsprogram: 1 min isotermisk oppvarming ved 50 °C, en ovnsrampe på 10 °C/min-1 til 310 °C og en endelig isotermisk oppvarming ved 310 °C i 8 minutter.
      3. Utfør elektronkollisjonsmodus med -70 eV energi. Oppnå massespektra ved hjelp av full skanneovervåkingsmodus med et masseskanningsområde på 50-500 m / z med en hastighet på 12,5 spektra / s.
    2. Filtrer individuelle topper for å fjerne støy. Avviksverdien filtreres basert på interkvartilbredden.
    3. Fyll de manglende verdiene med halvparten av minimumsverdiene, standardiser og normaliser dataene.
    4. Importer de endelige dataene i .csv format til statistisk analyseprogramvare for multivariabel analyse.
    5. Slå opp metabolittene i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database (en databaseressurs for å forstå funksjoner og verktøy på høyt nivå i det biologiske systemet), og klassifiser metabolittene i forskjellige kategorier, for eksempel karbohydrater, syrer, lipider, alkoholer og aminer. Bruk statistisk analyse programvare for å konstruere et kakediagram for å indikere prosentandelen av hver kategori i alle roten ekssudater.
    6. Bruk veiledede ortogonale projeksjoner til latente strukturer-diskriminerende analyse (OPLS-DA) for å demonstrere forskjellene mellom grupper.
    7. Skjermingssignifikant endrede metabolitter som differensialmetabolitter basert på variabel viktighet i projeksjon (VIP) > 1 og p < 0,05 (Student t test).
    8. Bruk metabolomdataene til å konstruere varmekart med statistisk analyseprogramvare og bruk foldeendringene under forskjellige behandlinger for å konstruere histogrammer.
    9. Slå opp differensialmetabolittene i KEGG-databasen og Pubchem og kompiler de metabolske veiene som inneholder differensialmetabolittene. Utfør baneberikelsesanalyse eller topologianalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette eksperimentet ble alfalfarotekssudater samlet, ekstrahert og analysert i henhold til metodene ovenfor (figur 1). Tre behandlingsgrupper ble satt opp: kontroll, lav konsentrasjon av DEHP (1 mg L-1) og høy konsentrasjon av DEHP (10 mg L-1).

Totalt 778 topper ble detektert i kromatografen til kontrollgruppen, hvorav 314 metabolitter kunne identifiseres i henhold til massespektrene. Som vist i figur 2, kan disse metabolittene klassifiseres i seks typer basert på relativ overflod: karbohydrater (28,6%), syrer (15,58%), lipider (13,87%), alkoholer (3,91%), aminer (0,92%) og andre (37,12%). Metabolitter som utgjorde mindre enn 0,5 % ble gruppert som andre stoffer (figur 2A). Syrene ble videre delt inn i fettsyrer (56,09 %), aminosyrer (26,62 %), organiske syrer (13,95 %) og fenoliske syrer (3,34 %) (figur 2B). I tillegg kan noen vanlige stoffer i rotekssudatene til de fleste planter også oppdages i alfalfarotekssudater, inkludert pyrimidiner, hydroksypyridiner, flavonoider, fenoler, ketoner, pyrimidiner, flavonoider og diterpener.

Et varmekart ble plottet for å visualisere variasjonen i differensialmetabolitter mellom ulike DEHP-behandlinger, basert på VIP-skår (figur 3). Sammenlignet med kontrollen endret eksponeringen for DEHP signifikant innholdet av 50 metabolitter i alfalfarotekssudater, hovedsakelig inkludert noen karbohydrater og organiske syrer med lav molekylvekt. Fem typer karbohydrater (lyxose, digitoxose, erythrose, trehalose og fruktose 2, 6-bihosfat) ble oppregulert i nærvær av DEHP, og to av disse (lyxose og digitoxose) ble signifikant økt da konsentrasjonen av DEHP økte. I tillegg ble fem metabolitter nedregulert i nærvær av DEHP, inkludert monosakkarider som D-talose og glukose, disakkarider som maltose, cellobiose og trehalose, og sukkeralkoholer som D-arabitol. Karbohydratinnhold har blitt vurdert som en indikator på plantefysiologisk status24. Derfor indikerte reduksjonen i monosakkarid- og disakkaridnivåer her fysiologisk stress forårsaket av DEHP-stress. Sammenlignet med karbohydrater utøvde DEHP en større effekt på syremetabolismen i alfalfaplanter. Ved eksponering for DEHP økte innholdet i 11 syremetabolitter signifikant, hovedsakelig inkludert 2-amino-2-norbornanekarboksylsyre, 5-hydroksyindol-2-karboksylsyre, 3-hydroksy-L-prolin, pelargonsyre og palmitinsyre. Samtidig hemmet DEHP også metabolismen av noen flavonoider i alfalfaplanter, inkludert 4', 5-dihyrroxy-7-methoxyisoflavone og neohesperidin.

De metabolske veiene påvirket av DEHP er beskrevet i figur 4. DEHP hemmet signifikant metabolismen av karbohydrater, slik som noen monosakkarider og disakkarider, som er produkter av fotosyntese. Derfor kan DEHP undertrykke fotosyntesen av alfalfa til en viss grad. Videre kan DEHP fremme metabolismen av fettsyrer, som er nyttige for planter å motstå stress fra DEHP. De viktigste metabolske veiene påvirket av DEHP var karbohydratmetabolisme og fettsyremetabolisme, mens aminosyremetabolisme, lipidmetabolisme og trikarboksylsyre (TCA) -syklusen ble påvirket i mye mindre grad.

Figure 1
Figur 1: Et flytskjema for ikke-målrettet metabolomisk analyse for alfalfarotekssudater. BSTFA representerer bis(trimetylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA) reagens (med 1% trimetylklorsilan [TMC], V/V). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Klassifisering av metabolitter. (A) Klassifisering av kjente metabolitter og (B) syrer. Prosentandelen av hver type materiale er delt på summen av toppområdet i hver kategori med summen av toppområdet for alle stoffene i kontrollen. Andre stoffer var de på < 0,5%. Andre syrer var de på <0,5%. Denne figuren er modifisert fra Wang et al.25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Varmekart over hierarkisk klyngeanalyse for rotekssudater (VIP > 1, p < 0,05) av alfalfaplanter med forskjellige DEHP-behandlinger. Rødt og grønt representerer henholdsvis høy og lav overflod. ACK representerer kontrollen; 1 + AD representerer behandlingen med 1 mg L-1 DEHP; 10+AD representerer behandlingen med 10 mg L-1 DEHP. Denne figuren er modifisert fra Wang et al.25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Sammenhenger mellom forstyrrelsen av metabolske veier og endringene i biologiske endepunkter (1 mg L-1 DEHP, 10 mg L-1 DEHP). De metabolske veiene ble etablert basert på databasen Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Metabolittene i grønn tekst var metabolittene som ble påvist i det foreliggende arbeidet. Tegnene «røde bokser» og «blå bokser» i parentes indikerer at metabolittene økte (p < 0,05) eller reduserte (p < 0,05) bidrag til de biologiske endepunktene. Figuren er gjort lesbar ved å separere metabolittene grovt sett i karbohydrat-, fettsyre- og proteinmetabolisme, som vist ved henholdsvis de grønne, røde og svarte rektangulære boksene. ACK representerer kontrollen; 1 + AD representerer behandlingen med 1 mg L-1 DEHP; 10+AD representerer behandlingen med 10 mg L-1 DEHP. Denne figuren er modifisert fra Wang et al.25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir generell veiledning om hvordan man samler inn og måler rotekssudatene av alfalfa under DEHP-stress, samt hvordan man analyserer metabolomdataene. Det må legges stor vekt på noen kritiske trinn i denne protokollen. I hydroponiske kultureksperimenter ble alfalfaplanter hydroponisk dyrket i glassflasker fylt med næringsoppløsninger med forskjellige konsentrasjoner av DEHP. Glassflaskene skal beskyttes mot lys ved å dekke dem med aluminiumsfolie gjennom hele kulturperioden, for å forhindre DEHP fra fotolyse og sikre ensartethet av DEHP-konsentrasjoner i alle kulturløsninger25,26. DEHP-konsentrasjoner ble satt til 1 mg L-1 og 10 mg L-1, i henhold til konsentrasjonene som vanligvis finnes i jord forurenset med DEHP27,28. Under samlingen av rotekssudater må sentrifugerørene fortsatt pakkes inn med aluminiumsfolie for å beskytte røttene mot lys. Her ble oppsamlingstiden satt til 6 timer. Hvis samlingstiden er for kort, kan konsentrasjonen av noen rotekssudater med lav overflod være for lav til å bli oppdaget, slik at sammensetningen av rotekssudatene kanskje ikke gjenspeiler den virkelige responsen til alfalfaplanter under DEHP-stress. Hvis oppsamlingstiden er for lang, kan de innsamlede rotekssudatene til en viss grad brytes ned av mikrober i dyrkningssystemene. I dette tilfellet kan noen mikrobielle metabolitter også oppdages, endring av sammensetningen av roten ekssudater29. Videre bør minst seks replikater utføres for hver behandling for å sikre nøyaktig metabolomdataanalyse.

Bare noen bestemte typer rotekssudater, som aminosyrer, fettsyrer, fenolforbindelser og andre organiske syrer, kan bestemmes ved hjelp av konvensjonelle målrettede analytiske metoder (dvs. søke etter kjente forbindelser)30,31,32, ved hjelp av standard analytiske metoder, for eksempel spektrofotometri, høytrykksvæskekromatografi (HPLC), ionekromatografi (IC), gasskromatografi-tandemmassespektrometri (GC-MS / MS) eller væskekromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (LC-MS/MS). Med utviklingen av instrumentelle analyseteknikker har ikke-målrettet metabolomisk analyse dukket opp basert på GC-TOF-MS, væskekromatografi-høyoppløselig massespektrometri (LC-HR-MS) og kjernemagnetisk resonans (NMR)33. Sammenlignet med andre konvensjonelle analytiske metoder for rotekssudater, utvider ikke-målrettet metabolomisk analyse i stor grad antall detekterte rotekssudater, noe som letter dyp forståelse av plantemetabolske responser på miljøstress.

Teknikken i denne studien har noen begrensninger, spesielt i den kvantitative analysen av metabolitter. Ikke-målrettet metabolomisk analyse demonstrerer bare de relative kvantitative forholdene mellom forskjellige metabolitter, snarere enn nøyaktige konsentrasjoner. Dette er ugunstig for undersøkelser av miljøatferd eller økologiske effekter av rotekssudater34. For vekstmediet av alfalfaplanter ble hydroponiske kultureksperimenter utført i den nåværende studien, som har fordelene med enkel kontroll og enkel betjening. Imidlertid er det kunstige hydroponiske vekstmiljøet forskjellig fra det virkelige jordmiljøet, noe som fører til mulig underestimering av brutto ekssudasjonshastigheter på grunn av metabolittopptak av røtter35. Sammenlignet med hydroponisk kultur er sandkultur en relativt mer overbevisende metode fordi den er nærmere det virkelige jordmiljøet, noe som letter samlingen av rotekssudater i et realistisk miljø36. Derfor pågår det arbeid for å etablere en metode for sandkultur eller til og med ekte jordkultur for å gjøre de eksperimentelle resultatene mer overbevisende, noe som vil hjelpe oss med å utføre mer grundig forskning, og vise bedre resultater av praktisk betydning for å forklare toksisitetsresponsen.

Basert på den ikke-målrettede metabolske analysen, kan vi ikke bare utforske plantens metabolske respons på miljøstress37, men også bestemme differensialmetabolitter og videre undersøke differensialmetabolittenes viktige rolle i miljøoppførselen til forurensninger38. Tidligere studier har vist at pelargonsyrenivået kan brukes som en indikator på rotmembranskader når planter er under stress39. Umettede fettsyrer (palmitinsyre) ble også funnet å øke membranfluiditeten40, noe som kan beskytte alfalfarotmembraner mot DEHP-skade. Noen flavonoider hemmet av DEHP kan delta i samspillet mellom belgfrukter og mikroorganismer. Videre kan interaksjonene mellom planter og rhizosfærens biologiske samfunn bli dypere dechiffrert med ikke-målrettet metabolsk analyse, spesielt under stress av forurensninger41. Flere typer rotekssudater vil bli identifisert42 med utvikling av analytiske instrumenter for ikke-målrettet metabolsk analyse, noe som er nyttig for å konstruere metabolomisk fingeravtrykk av planterotekssudater43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha syntes å påvirke arbeidet rapportert i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet i fellesskap av National Natural Science Foundation of China (41877139), de store prosjektene til National Natural Science Foundation of China (41991335), National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (nr. BK20161616), "135" -planen og grenseprogrammet til det kinesiske vitenskapsakademiet (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
  2. Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
  3. van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
  4. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  5. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  6. Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
  7. Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
  8. Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
  9. Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
  10. Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
  11. Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
  12. Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
  13. Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
  14. Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
  15. Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
  16. Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
  17. vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
  18. Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
  19. Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
  20. Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
  21. Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
  22. Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
  23. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  24. Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  25. Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
  26. Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
  27. Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
  28. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  29. Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
  30. Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
  31. Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
  32. Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
  33. van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
  34. Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
  35. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  36. Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
  37. Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
  38. Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
  39. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
  40. Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
  41. Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
  42. Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
  43. Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).

Tags

Miljøvitenskap utgave 196
Innsamling av alfalfarot ekssudater for å studere virkningen av di (2-etylheksyl) ftalat på metabolittproduksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter