Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse av T-cellereseptorindusert kalsiuminnstrømning i primære Murine T-celler ved fullspektret flowcytometri

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64526
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

Summary

Kalsiuminnstrømning, et mål på T-cellesignalering, er en effektiv måte å analysere responser på T-cellereseptorstimulering. Denne protokollen for multipleksing av Indo-1 med paneler av antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler utnytter de svært fleksible egenskapene til fullspektret flowcytometri.

Abstract

Kalsiuminnstrømning som respons på T-cellereseptorstimulering er et vanlig mål for T-cellesignalering. Flere kalsiumindikatorfargestoffer er utviklet for å vurdere kalsiumsignalering ved hjelp av båndpassflowcytometri. Denne protokollen er utformet for å måle kalsiumresponser i primære murine T-celler ved bruk av fullspektret flowcytometri. Totale splenocytter er merket med ratiometrisk kalsiumindikatorfargestoff Indo-1, sammen med et panel av fluorokrom-konjugerte antistoffer mot celleoverflatemolekyler. Utnyttelse av egenskapene til fullspektret flowcytometri gir en plattform for å utnytte et bredt utvalg av celleoverflateflekker i kombinasjon med Indo-1. Cellene analyseres deretter i sanntid ved 37 °C før og etter tilsetning av et anti-CD3-antistoff for å stimulere T-cellereseptoren. Etter å ha blandet spektralsignalene, beregnes forholdet mellom kalsiumbundet og kalsiumfritt Indo-1 og kan visualiseres over tid for hver inngjerdede populasjon av splenocytter. Denne teknikken kan tillate samtidig analyse av kalsiumresponser i flere cellepopulasjoner.

Introduction

T-cellereseptor (TCR) indusert kalsiuminnstrømning er et nyttig mål på T-celleaktivering og brukes ofte til å avgjøre om en populasjon av T-celler har svekkede responser i de proksimale trinnene i TCR-signalveien1. Målinger av kalsiuminnstrømning utføres vanligvis ved å forhåndsmerke T-cellene med ett eller et par fluorescerende kalsiumindikatorfargestoffer, og deretter undersøke de fluorescerende signalene ved hjelp av flowcytometri i sanntid etter TCR-kryssbinding 2,3,4. Indo-1, et forholdsmetrisk kalsiumfargestoff, er begeistret av UV-laseren med topputslipp ved to forskjellige bølgelengder avhengig av kalsiumbinding5, og er et vanlig brukt indikatorfargestoff for flowcytometrianalyse av kalsiumresponser i levende lymfocytter. Siden emisjonsprofilen til Indo-1 er ganske bred, kan det være utfordrende å kombinere Indo-1-vurdering med samtidig analyse av flere celleoverflatemarkører ved hjelp av båndpassflowcytometri. Denne begrensningen begrenser bruken av flowcytometrianalyse av kalsiumresponser til forhåndsrensede populasjoner av T-celler eller til populasjoner identifisert av et begrenset sett med molekyler på celleoverflaten.

For å løse begrensningene ved måling av kalsiumrespons på heterogene populasjoner av primære lymfocytter ved bruk av båndpassflowcytometri, ble det utviklet en protokoll for å måle Indo-1-fluorescens ved bruk av fullspektret flowcytometri. Denne metoden tillater multipleksing av Indo-1 med paneler av antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler, og utnytter de svært fleksible egenskapene til fullspektret flowcytometri. Fordelen med å bruke fullspektret flowcytometri fremfor konvensjonell flowcytometri er evnen til å skille fluorescerende signaler fra sterkt overlappende fargestoffer, og dermed øke antall overflatemarkører som kan vurderes samtidig i hver prøve. Konvensjonell flowcytometri bruker båndpassfiltre og er begrenset til ett fluorokrom per detektorsystem6. Full spektrum flowcytometri samler signaler over hele spekteret av fluorokrom ved hjelp av 64 detektorer på et fem-laser spektralt flowcytometrisystem 7,8. I tillegg utnytter fullspektret flowcytometri APD-detektorer (Avalanche Photo Diode) som har økt følsomhet i forhold til fotomultiplikatorrørdetektorer som finnes på konvensjonelle strømningscytometre8. Følgelig er denne tilnærmingen ideell for heterogene cellepopulasjoner, for eksempel mononukleære celler i perifert blod eller murine sekundære lymfoide organcellesuspensjoner, da det eliminerer behovet for isolering av spesifikke T-cellepopulasjoner før kalsiumfargestoffmerking. I stedet kan ekspresjonsprofiler for celleoverflatemarkører og flowcytometrigating etter datainnsamling brukes til å vurdere kalsiumresponser i hver populasjon av interesse. Som vist i denne rapporten, kan Indo-1 lett kombineres med åtte fluorokrom-konjugerte antistoffer, noe som resulterer i totalt 10 unike spektrale signaturer. Videre kan denne metoden lett brukes på blandinger av celler fra kongenisk distinkte muselinjer, noe som muliggjør samtidig analyse av kalsiumresponser i villtype T-celler sammenlignet med de fra en genmålrettet muselinje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus ble opprettholdt ved University of Colorado Anschutz Medical campus i samsvar med IACUC-protokoller. Alle mus ble avlivet i henhold til AAALAC-standarder.

1. Forberedelse av immunceller fra musmilten

MERK: Avlive naive mus med CO2 eutanasi. C57BL/6 mus kjøpt fra Jackson Laboratories og avlet internt brukes til eksperimenter ved 6-12 ukers alder. Både hann- og hunnmus brukes til eksperimenter.

  1. Desinfiser musehuden med 70% etanol for å redusere muligheten for at eksterne forurensninger kommer inn i prøven.
  2. Dissekere musmilten ved hjelp av disseksjonsverktøy, kirurgisk saks og tang. Høst milten og legg den frittliggende milten i 50 ml konisk rør med ~5 ml komplett RPMI-medium (cRPMI) på is.
    MERK: Komplett RPMI består av 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 1% penicillin / streptomycin.
    1. For å høste musemilten, gjør et 5 cm snitt i pelsen og huden langs venstre side av musen halvveis mellom for- og bakbena med saks. Åpne kroppshulen ~5 cm og fjern milten med tang. Milten er fargen på en nyrebønne og er lengre og flatere enn nabonyren.
  3. Hell innholdet i trinn 1.2 på et sterilt 70 μm filter festet til et nytt 50 ml konisk rør. Separer milten mekanisk i en encellesuspensjon ved å skyve milten gjennom filteret med et 5 ml sprøytestempel til det ikke er miltmasse igjen på filteroverflaten.
  4. Pellet miltocytter ved hjelp av en utsvingbar rotor benkeplate sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
  5. Dekanter forsiktig supernatanten. De pelleterte splenocytter forblir på bunnen av 50 ml konisk rør.
  6. For å fjerne røde blodlegemer, resuspender de pelleterte splenocytter i 1 ml ACK lysisbuffer i 3 minutter i henhold til produsentens instruksjoner. Bland godt.
  7. Slukk ACK lysisbufferen med 15 ml cRPMI.
  8. Pellet lymfocyttene som anvist i trinn 1.4.
  9. Suspender cellesuspensjonen på nytt i 5 ml cRPMI i en 50 ml konisk slange. Legg prøvene på is.
    1. For å telle cellene, overfør 10 μL av cellesuspensjonen til et 0,6 ml mikrosentrifugerør og fortynn i forholdet 1:1 med Trypan-blå oppløsning. Deretter overfører du til et hemocytometer eller automatisert celletellingssystem.
  10. Etter telling, avhengig av cellekonsentrasjonen i cellesuspensjon som i trinn 1.9, pellet cellene i en bordplatesentrifuge ved 500 x g ved 4 °C i 5 minutter for å forberede tilsetning av cRMPI media som inneholder Indo-1 AM esterfargestoff.
  11. Beregn volumet for re-suspensjon av cellene for å oppnå 10-12 x 106 celler / ml. Dette er en 2x konsentrasjon av det totale celletallet som kreves.
  12. Suspender cellene på nytt i volumet av cRPMI beregnet i trinn 1.11. Plasser cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i enten et 50 ml konisk rør med ventilert lokk eller en vevskulturplate.

2. Indo-1-forholdsmetrisk fargestoff og fluorescerende antistoffmerking

  1. I henhold til produsentens instruksjoner, tilsett 50 μL DMSO i et hetteglass som inneholder 50 μg Indo-1 AM. Konsentrasjonen av stamløsningen er 1 μg/μL.
    MERK: DMSO leveres i mikrohetteglass med settet for å forhindre oksidasjon av DMSO.
  2. Fortynn stampilkoten (1 μg/μL) til passende eksperimentelt volum (etablert i 1,11) cRPMI ved en konsentrasjon på 6 μg/ml, en 2x konsentrasjon. Indo-1 skal ikke oppbevares i vandig oppløsning.
    MERK: Andre buffere med tilsatt kalsium kan brukes avhengig av cellebehovet.
  3. Sett komplette medier med Indo-1 til side i et vannbad ved 37 °C.
    MERK: Bruk minimumskonsentrasjonen av Indo-1 AM-ester som er nødvendig for å oppnå et tilstrekkelig signal. Dette må titreres for ulike celletyper. Vanligvis er en konsentrasjon mellom 3-5 μM tilstrekkelig. For primære T-celler øker lasting av celler med Indo-1 i en konsentrasjon >5 μg / ml gjennomsnittlig fluorescerende intensitet (MFI) over en logg på 6 på spektrale strømningscytometre. Hvis dette skjer, reduser UV-laserintensiteten og titrer Indo-1 til en lavere konsentrasjon.
  4. Fortynn tidligere tilberedt cellesuspensjon (i trinn 1.12), 1:1 i cRPMI, inkludert 2x Indo-1-mediet laget i trinn 2.2. Sørg for at cellene har en konsentrasjon mellom 5-6 x 106/ml.
    MERK: Ikke farg ubeiset enkeltflekkkontroll eller overflatemarkør enkeltflekkcellekontroller med Indo-1. Legge Indo-1 til enkelt flekk antistoff kontroller vil skape en flerfarget prøve på grunn av Indo-1 lagt til enkelt farget celler. Inkluder indo-1 (kalsiumfri) EGTA lagt kontroll til prøveplaten opprettet i trinn 2.6.
  5. Tilsett 1 ml celler / brønn / eksperimentell tilstand i en 12-brønns vevskulturplate.
  6. Opprett en enkelt farget kontroll for Indo-1 (kalsiumfri) prøve ved hjelp av tidligere Indo-1 fargestoffbelastede celler og legg til EGTA til en endelig konsentrasjon på 2 mM. EGTA vil chelate kalsium i cellesuspensjonen, noe som gir en renere kontrollprøve.
    1. Opprett en Indo-1 positiv kontroll (Indo-1 kalsiumbundet) ved å tilsette 50 μM ionomycin til den fargestoffbelastede cellesuspensjonen ved flowcytometeret. Ionomycin er en membranpermeabel kalsiumionofor som binder kalsiumioner og letter overføringen av kalsiumioner til celler.
  7. Lag en brønn for biologisk negativ kontroll uten fluorforer eller Indo-1-fargestoff.
  8. Lag en brønn for enkle flekkkontroller for eventuelle ekstra cellepopulasjoner av interesse (antistoffer brukerdefinert) ved hjelp av antistoffkonjugerte fluoroforer i en flowcytometripaneldesign. Disse vil ikke inkludere Indo-1 ratiometrisk fargestoff.
  9. Legg til Fc-reseptorblokkerende antistoff (~ 2 μg / 1 x 106 celler), i henhold til produsentens instruksjoner, før du legger til ytterligere fluorokrom-konjugerte antistoffer for overflatefarging.
  10. Inkuber platen i 45 minutter ved 37 °C med 5 % CO2.
  11. Resuspender cellene i en 12-brønns plate ved å banke forsiktig på platen hvert 15. minutt.
  12. Bland og fjern hele volumet av celler suspendert i media fra 12-brønnplaten. Deretter tilsettes cellesuspensjonen til 1,7 ml mikrosentrifugerør.
  13. Pellet cellene i en mikrosentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Dekanter supernatanten og vask cellene ved å tilsette 1 ml forvarmet cRPMI. Pellet igjen og dekanter supernatanten.
    MERK: Vasking av cellene fjerner eventuelle gjenværende FC-blokkerende antistoffer.
  14. Resuspender cellene i 1 ml cRPMI i 1,7 ml mikrosentrifugerør og inkuber hvert rør ved 37 °C i ytterligere 30 minutter ved 5 % CO2, slik at toppen av røret er litt åpen for å tillate gassutveksling. Dette muliggjør fullstendig de-esterifisering av de intracellulære AM-estere.
  15. Overfør cellene tilbake til en 12-brønns vevskulturplate, om nødvendig. Ytterligere brukerdefinerte titrerte fluorokromkonjugerte antistoffer kan tilsettes i en hvilefase.
    MERK: Markører som brukes i metodepanelet inkluderer: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 og CD1d/α-galcer tetramer. Markører er valgt for å analysere T-celle undergrupper.
    1. Lag en masterblanding av alle brukerdefinerte fluorokromkonjugerte antistoffer i henhold til celletyper av interesse ved et tidligere titrert volum i et 1,7 ml mikrosentrifugerør.
    2. Legg til en beregnet masterblanding for 1 ml av cellevolumet, avhengig av titrerte antistoffer mot hvilende celler.
      MERK: Fordelen med farging i trinn 2.15 i stedet for senere trinn 2.18 er at farging i trinn 2.15 vil redusere den totale inkubasjonstiden for eksperimentet. Farging i et totalvolum på 1 ml i trinn 2.15 øker imidlertid antistoffbruken.
  16. Etter hvile, pellet cellene ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Celler i en 12-brønns vevskulturplate kan pelleteres i platen med et platesentrifugetilbehør. Ellers pellet cellene i et 1,7 ml mikrosentrifugerør.
  17. Vask cellene ved å resuspendere pelleten i 1 ml 4 °C kald cRPMI og pellet cellene igjen som i trinn 2.16. Plasser cellene på is.
    MERK: Hvis overflatefarging celler separat, etter de-esterification i trinn 2.18, er mindre antistoffvolum nødvendig. Overflatefarging på dette trinnet kan utføres etter hvilefasen i kaldstrømningsbuffer (1x DPBS tilsatt 1% FBS), ved bruk av brukerdefinerte antistoffer, på is i 30 minutter. Vask cellene etter flekken i cRPMI som i trinn 2.17.
    1. Legg levedyktig flekk Ghost540 fortynnet 1: 7,500 i DPBS til prøver i henhold til produsentens instruksjoner. Varme dreper cellene ved 55 °C på en oppvarmingsblokk for enkeltfarget levende / død kontroll.
      MERK: Levedyktig funksjonell fargefarging for å eliminere døde celler i flowcytometrisk analyse utføres uten FBS. FBS kan samhandle med aminfargestoffer i henhold til produsentens instruksjoner.
  18. Suspender individuelle prøver på nytt i 500 μL cRPMI (fenol rødfritt) ved hjelp av et 5 ml polystyrenstrømningsrør med en hette.
    MERK: Cellene kan stå ved 4 °C i opptil en time.
  19. Varm hver 5 ml tube inneholdende celler, individuelt, til 37 °C ved hjelp av et perlebad i 7 minutter før analysen av flowcytometeret, slik at tiden er konsistent mellom prøvene. Bruk en tidtaker.

3. Perlebadrør: opprettholde temperaturen under kalsiumfluxanalyse

  1. Legg badeperler til et lite vannbad, uten vann tilsatt; varme opp til 37 °C.
  2. Skjær forsiktig et 50 ml konisk rør i to, ved 25 ml-merket, med et barberblad; Kast toppen av røret.
  3. Fyll det halverte røret 3/4 av veien med badeperler.
  4. Plasser røret som ble opprettet i trinn 3.2, i perlebadet som ble opprettet i trinn 3.1. Før tuben og perlene til 37 °C.
  5. Koble perlebadet til en stikkontakt ved siden av strømningscytometeret for å opprettholde temperaturen som forberedelse til prøveanalyse.
  6. Legg til en 50 ml konisk Styrofoam rack kutt for å holde ett rør for å plassere røret på plass mens du kjører på flow cytometer. Dette vil eliminere behovet for å holde røret manuelt i løpet av kurveanalysen.

4. Oppkjøp av kalsiuminnstrømning ved hjelp av flowcytometrisk analyse

  1. Logg på flowcytometerprogramvaren på en strømningsanalysator.
  2. Klikk på Bibliotek-fanen for å legge til Indo-1 (kalsiumbundet) og Indo-1 (kalsiumfri) fluorescerende koder. Velg Fluorescerende tagger på programvaremenyen til venstre. Velg UV-laser under fluorescerende taggrupper og klikk på + legg til for å legge til et fluorescerende merkenavn (Indo-1 (kalsiumbundet) / Indo-1 (kalsiumfritt)) til biblioteket. Velg lasereksitasjonsbølgelengden og emisjonsbølgelengden, og klikk deretter på Lagre. Fortsett til det eksperimentelle oppsettet.
    MERK: Indo-1 er begeistret av UV-laseren ved en bølgelengde på 355 nm. Emisjonsbølgelengden til Indo-1 (kalsiumbundet) er 372 nm. Utslippsbølgelengden til Indo-1 (kalsiumfri) er 514 nm.
  3. Klikk på fanen Oppkjøp. Åpne/opprett et nytt eksperiment og legg til de ønskede fluorescerende kodene i eksperimentet.
  4. Opprett referansegruppe og en ny prøvegruppe(r) for eksperimentet. Merk både prøvene og referansegruppene etter behov.
  5. Under Anskaffelser-fanen angir du hendelsene som skal registreres til maksimum: 10 000 000.
  6. Sett stoppvolumet til maksimalt volum: 3,000 μL.
  7. Sett stopptiden til maksimal tid: 36 000 s.
  8. Skaff enkeltfargede kontroller for definerte konjugerte antistoffer inkludert i flerfargepanelet.
  9. Skaff enkeltfargede kontroller for Indo-1 funksjonelt fargestoff.
    1. Tilsett 50 μM ionomycin til den kalsiumbundne Indo-1 positive kontrollen. Vortex å blande. Legg strømningsrøret til injeksjonsporten i prøven og klikk på Record.
    2. Legg til kalsiumfri Indo-1 negativ kontroll til flowcytometeret og klikk på Record. EGTA ble lagt til i trinn 2.6.
    3. Bland ut de enkle fargede kontrollene ved å klikke på Unmix-knappen .
      MERK: Alle enkeltfargede kontroller fra alle konjugerte antistoffer og funksjonelle fargestoffer må registreres før unmixing prøvene. For at Unmix-knappen skal fungere, må alle referansekontrollene registreres først. Unmixing kan gjøres før eller etter prøveinnsamling.
  10. Når blandingen er fullført, oppretter du sekvensielle plott ved hjelp av det ublandede regnearket. SSC-A versus FSC-A fjerner rusk fra prøven, SSC-A versus SSC-H for å fjerne dubletter. Dette etterfølges av en levedyktig oppryddingsgate sammen med ytterligere gating på populasjoner av interesse. For å lage porter, klikk på Plot. Legg til et plott i regnearket, og dobbeltklikk i porten for å opprette en nedstrøms inngjerdet populasjon. Fortsett til alle populasjonene av interesse er gjort rede for.
  11. Varm enkeltfarget kontrollprøve (fra trinn 2.6-2.9 i avsnitt Indo-1 ratiometrisk fargestoff og fluorescerende antistoffmerking) til 37 ° C for sekvensiell analyse. Sett opp flowcytometri-programvaren.
  12. Kjør DI-vann på cytometeret i 2-3 minutter for å sikre fluidstabiliteten til strømningscytometeret.
  13. Sett opp sekvensielle plott i det ublandede regnearket ved å opprette porter ved hjelp av knappene Polygon, Rektangel eller Ellipseport. Gate for å inkludere populasjonen av interesse (dvs. lymfocytter som bruker SSC-A vs. FSC-A [diskriminering av størrelse / lymfocytter]). Negative populasjoner vises gruppert rundt null, mens positive populasjoner kan visualiseres ved å øke MFI. Populasjoner av interesse vil bli brukerdefinert basert på det biologiske spørsmålet.
  14. Dobbeltklikk inne i porten som er opprettet, og endre parametere for Y-akse og X-akse til SSC-A versus SSC-H (singletdiskriminering). Fullfør definisjonen av akseparametrene ved å venstreklikke på ordene på aksen.
  15. Lag et plott med SSC-A versus levedyktig fargesignal (levedyktighetsportparametere). Gate på levende celler, som er negative for aminfargefarging. Levende celler, negative for levende dødfarging, vil klynge seg ved 0-merket på både Y- og X-aksen.
  16. Dobbeltklikk på innsiden av plottet for å lage et nytt plott som bare inneholder encellede levende lymfocytter. Endre Y-aksen til Indo-1 (bundet-kalsium) (V1) og/eller Indo-1 (fritt kalsium) (V7) versus tid på X-aksen for visualisering av kalsiuminnstrømningen.
  17. Plasser den oppvarmede biologiske prøven på maskinens SIT og kjør prøvene ved 2,500-3,000 hendelser / s på medium for å tillate visualisering av kalsiuminnstrømning i begrensede celletallpopulasjoner (f.eks. iNKT).
    MERK: Ved å resuspendere cellene i en konsentrasjon på 1 x 106 / ml, bør cellehendelsene samlet ved middels strømningshastighet være lik 2,500-3,000 hendelser / s. Senk strømningshastigheten under innsamlingskontroll ved å klikke på rullegardinmenyen eller fortynn prøven hvis cellesuspensjonen har økt konsentrasjon. Å kjøre prøvene med høy strømningshastighet kan øke spredningen av signalet fra en fluorofor til andre fluoroforer i panelet.
  18. Legg neste tube til perlebadet for å varme opp til 37 °C.
  19. I innsamlingskontrollen trykker du på Record for å registrere de opprinnelige dataene i 30 s for å oppnå et basalt nivå av kalsiumsignalering i prøven.
  20. I anskaffelseskontrollen klikker du på Stopp og fjerner røret fra Sample Injection Port (SIP).
  21. Tilsett 30 μg ukonjugert anti-CD3 direkte inn i prøverøret for å initiere kalsiuminnstrømning. Den endelige konsentrasjonen per rør er 60 μg / ml.
    MERK: Det er ikke noe vasketrinn etter tilsetning av anti-CD3.
  22. Plasser røret tilbake på maskinens SIP så raskt som mulig og trykk på Record i programvaren.
  23. Registrer data i 7 minutter, se tiden som har gått under innsamlingskontrollene i programvaren, for å observere tidsforløpet for kalsiuminnstrømning i prøvepopulasjonene.
  24. Etter 7 min, trykk Stopp i programvaren og tilsett 1 μg / ml ionomycin. Ta opp i 30 s for å oppnå maksimalt kalsiumsignal i cellene av interesse. For å begrense overføring av ionomycin til neste prøve, fullfør to SIT-spylinger på instrumentet mellom prøvene.
  25. Fortsett til neste prøve og gjenta arbeidsflyten til alle prøvene er samlet inn.
  26. Lagre eksperimentet og klikk på eksport-zip-filen. Ublandede filer (.fsc) lastes opp til ekstern programvare for flowcytometrianalyse.

5. Kalsiumkurveanalyse

  1. Ved hjelp av en analyseprogramvare6 for flowcytometri, konverter Indo-1 fluorescerende signaler til et forhold for time-lapse kalsiummålinger. Utled parametere under verktøyfanen ved å sette inn referanser Indo-1 (kalsiumbundet) / Indo-1 (fritt kalsium) ved hjelp av en lineær skala. Sett minimum til null og maksimum i henhold til tilstrømningen av kalsiumforhold, vanligvis rundt 10. Maksimumsforholdet varierer etter celletype og MFI av Indo-1.
  2. Merk den valgte parameteren. Legg til kinetisk analyse under verktøy for å velge parameter ved å klikke på kategorien Kinetikk . Sett Y-aksen til avledet.
  3. Velg MFI (gjennomsnittlig fluorescerende intensitet) i kategorien Kinetikk.
  4. Tilsett Gaussisk utjevning, om ønskelig. For å legge til Gaussisk utjevning, velg alternativet i rullegardinmenyen for statistikk i programvaren for strømningsanalyse. Gaussisk glatting kan legges til for å jevne visualiseringen av kalsiuminnstrømningskurven for analyse.
  5. Lag flere områder for statistikk langs kalsiumflukstidskurset for biologiske sammenligninger i prøvene.
  6. Dra eksemplene til layoutredigereren og legg til statistikken etter behov. Statistisk analyse varierer avhengig av det biologiske spørsmålet. For publiseringsformål analyseres flere replikater ved hjelp av t-test eller ANOVA.
  7. For et øyeblikks tidsanalyse, sett porten på et bestemt øyeblikk i tid langs kalsiumfluksen. Undersøk de ønskede overflatemarkørene og porten på populasjonen av interesse; Deretter vurderer du et todimensjonalt punktplott av Indo-1 (kalsiumfritt) versus Indo-1 (kalsiumbundet) for inngjerdede celler i det øyeblikket i tidsområdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den eksperimentelle arbeidsflyten for å vurdere kalsiumresponser i primære murine T-celler ved bruk av et Indo-1-ratiometrisk fargestoff med multipleksende overflateflekker er vist i figur 1. Etter høsting og bearbeiding av musens miltocytter i en enkeltcellesuspensjon, blir cellene farget med en Indo-1 AM-ester og overflatefarget med fluorokrombundne antistoffer. Når fargestoffbelastningen og antistofffargingen er fullført, varmes lymfocyttprøvene opp til en biologisk temperatur (37 °C). Prøvene analyseres deretter med fullspektret flowcytometri for Indo-1-fluorescens etter gating på de enkelte celletypene som ønskes, uten behov for å sortere prøvene før analyse. For å kunne bruke APD-detektorer (Avalanche Photo Diode) i fullspektret strømningscytometer, er det nødvendig å konvertere topputslippsbølgelengden fra en bandpassfilterbølgelengde målt i nm til dens respektive kanal på APD. Tabellen vist i figur 2 gir en retningslinje, men de optimale detektorene for de to fluorescenssignaturene til Indo-1 (kalsiumbundet versus kalsiumfri) må bestemmes empirisk. Dette oppnås ved å forberede enkeltfargede Indo-1-prøver ved hjelp av ionomycin for å generere Indo-1 (kalsiumbundet) signal, og EGTA, et kalsiumchelaterende middel, for å generere Indo-1 (kalsiumfritt) signal. Etter analyse ved bruk av fullspektret flowcytometri kan kanalen som viser maksimal fluorescensintensitet for hver Indo-1-signatur visualiseres (figur 3A). Ved å normalisere MFI av de positive populasjonene til de negative populasjonene, kan skiftet i Indo-1-fluorescens fra kalsiumfri til kalsiumbundet bestemmes (figur 3B). Denne visningen genereres i en arbeidsbok (.xls) ved hjelp av referansekontroller for både bundet og fri Indo-1, og tegner en negativ og positiv intervallport med klare positive og negative porter for MFI-normalisering som vist i (figur 3A). Eksempel MFI statistikk kan også fås ved å høyreklikke på statistikken tabellen. I programvaren, bestem MFI-forholdet ved å dele den positive befolkningen med den negative befolkningen og legg de to spektrene på en enkelt skjerm (figur 3B, høyre). Den gule stiplede pilen viser de normaliserte spektrale forskjellene mellom spektralsignaturene til både bundet og fri Indo-1.

For å evaluere kalsiumresponser etter T-cellereseptorstimulering, vurderes Indo-1-fluorescensen etter gating på cellepopulasjonene av interesse, som vist i figur 4. Først undersøkes et plott av tid versus sidespredning (SSC-A) for å vurdere fluidisk stabilitet; et stabilt konsistent signal over tidsaksen indikerer stabilitet (figur 4A). Deretter visualiseres forover-mot-side-spredningen (FSC-A vs. SSC-A), og lymfocyttpopulasjonen styres som vist i (figur 4B). Etter lymfocyttporten påføres en enkeltcellediskrimineringsport ved å generere et plott med sidespredningshøyde mot område (SSC-H vs. SSC-A), og singletene, som faller på diagonalen, er inngjerdet som vist i figur 4C. Singlettene blir deretter vurdert for levedyktighet, ved å undersøke farging med levedyktighetsfargen og gating på den negative populasjonen (figur 4D). Til slutt, for å analysere T-celler, påføres en B-celledump/intern negativ kontrollport ved å gating på den CD19-negative populasjonen (figur 4E). Den CD19-negative populasjonen blir deretter vurdert for T-celleundergrupper ved hjelp av antistoffer mot CD4 og CD8 (figur 4F); eksemplet vist undersøker CD4 + T-celler for kalsiumresponser ved å visualisere Indo-1 (kalsiumbundet) fluorescens versus tid (figur 4G). Etter gating på et tidssegment kan Indo-1 (kalsiumfri) versus Indo-1 (kalsiumbundet) plott også genereres (figur 4H). Denne analysen vil senere bli brukt til å utlede Indo-1-forholdet (se metoder kalsium tilstrømningskurve analyse i flowcytometri analyse programvare).

På dette punktet i analysen kan det være nyttig å analysere øyeblikk i tid innenfor det todimensjonale plottet av Indo-1 (kalsiumbundet) versus tid i individuelle cellepopulasjoner av interesse. De optimale tidspunktene inkluderer baseline kalsium bundet til Indo-1 før TCR-stimulering, maksimal respons, et tidspunkt flere minutter etter toppresponsen når intracellulære kalsiumnivåer synker, og til slutt kalsiumresponsen fremkalt ved å legge til ionomycin (figur 5A). I baselineprøven før tillegg av anti-CD3-antistoff detekteres et svakt Indo-1 (kalsiumbundet) signal. Under toppresponsen viser cellene et sterkt Indo-1 (kalsiumbundet) signal og en redusert fluorescens av Indo-1 (kalsiumfri). Ved 5 minutter etter topp returnerte Indo-1-fluorescensen nesten til baseline. Etter at ionomycin er tilsatt til prøven, kan et robust signal fra Indo-1 (kalsiumbundet) visualiseres, noe som sikrer tilstrekkelig fargebelastning av cellene. Sjeldne cellepopulasjoner (<1 %) kan være vanskelige for derivert analyse; For å overvinne denne begrensningen kan analyse av de sjeldne populasjonene utføres ved å plotte Indo-1 (kalsiumbundet) versus Indo-1 (kalsiumfri) etter å ha gatet på hver populasjon av interesse, for eksempel CD4+-celler, TCRb+-celler, TCRyg+-celler, CD25+-celler, iNKT-celler og CD19+-celler (figur 5B,C). Legg merke til den lett påviselige kalsiumresponsen i TCRγδ+ T-celler og iNKT-celler (CD1d/α-galcer+). For sammenligning av overflateproteiner i en blandet murine T-cellepopulasjon ble todimensjonale plott opprettet som viser delmengder av interesse. Nedenfor vises analysen av kalsiumresponsen over hele tidsforløpet for hver undergruppe (figur 5C).

Denne analysen kan også brukes til å etablere biologiske forskjeller i T-celler fra villtype versus genmålrettede mus eller i T-celler ubehandlet versus behandlet med farmakologiske hemmere. I eksempelet vist i figur 6 ble T-celler behandlet med PRN694, en småmolekylær hemmer av T-celletyrosinkinasene, ITK og RLK 9,10. Hemming av ITK/RLK demper T-cellereseptorsignalering, noe som fører til redusert kalsiumrespons etter T-cellereseptorstimulering11 (figur 6A). For å kvantifisere effekten av ITK / RLK-hemming, kan kurvene som viser forholdet mellom Indo-1 (kalsiumbundet) og Indo-1 (kalsiumfri) fluorescens deretter analyseres for området under kurven (AUC) eller kurvens helning for hver tilstand (figur 6B, C). Denne kvantifiseringen utføres ved å seksjonere tidsforløpet for kalsiumresponsen i diskrete segmenter (figur 6A), og vurdere arealet under kurven eller kurvens helning for hvert segment, som vist (figur 6B,C). Samlet sett viser denne protokollen at fullspektret flowcytometri kan brukes til å måle kalsiuminnstrømning sammen med flere celleoverflatemarkører i immuncellepopulasjoner som undersøkes. Disse resultatene viser at celleundergrupper representert på mer enn 1% av den totale befolkningen kan vurderes for kalsiuminnstrømning over tid. I motsetning til dette krever mindre rikelig celleundergrupper alternativ analyse ved hjelp av øyeblikk av tid.

Statistisk analyse av kalsiumresponsdata er spesifikk for det eksperimentelle spørsmålet og de biologiske analysene som utføres. I dataene som ble presentert i manuskriptet, ble det utført eksperimenter med replikater for å sikre eksperimentell nøyaktighet og robustheten til metodikken; Det ble imidlertid ikke utført flere forsøk på ulike biologiske prøver over ulike dager. Det vil derfor ikke være hensiktsmessig å gjøre statistiske analyser av dataene som presenteres.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt for kalsiumanalyser. Bruken av Indo-1 AM-esterkalsiumindikatorfargestoffet gir et verktøy for å visualisere tilstrømningen av kalsium i immunceller og deres underpopulasjoner. Dette skjemaet skisserer arbeidsflyten for analyse av kalsiumresponser i murine milt T-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Konvertering av PMT-bølgelengder til APD-kanaler. Fullspektret flowcytometer har 16 detektorer for å oppdage fluorescerende utslipp etter eksitering av UV-laseren. Spesifikasjonene til hver detektor er angitt i tabellen. Uthevet er de to detektorene som ble brukt til vurdering av Indo-1 fluorescens, som ble bestemt empirisk ved hjelp av enkeltfargede kontroller. Konverteringer til APD-bølgelengde og brukerhåndbok for spektralstrømningscytometer er tilgjengelig11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Visualisering av Indo-1 spektral signatur. (A) Øverst: Spektral signatur av Indo-1 fluorescens i CD8 + T-celler etter ionomycin introduksjon for å fremkalle en robust tilstrømning av kalsium. Toppen av Indo-1 (kalsiumbundet) kan visualiseres i UV1. Bunn: Spektral signatur av Indo-1 (kalsiumfri) som viser topp fluorescens i UV7. Denne kontrollprøven ble generert ved å behandle Indo-1-lastede celler med EGTA12 for å chelate ekstracellulært fritt kalsium. (B) Kombinert fem laserspektrum overlegg av Indo-1 signatur, som viser rå spektral MFI til venstre og normalisert spektra av Indo-1 bundet versus fri Indo-1 til høyre. Visualisering av skiftet fra Indo-1 (kalsiumfritt) i oransje til Indo-1 (kalsiumbundet) i blått kan lett oppdages. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Gating strategi for visualisering av kalsiumresponser. Arbeidsflyten for sekvensiell gating av eksemplene er skissert. (A) Fluidisk stabilitet undersøkes ved hjelp av en tid versus SSC-A-port. (B) FSC-A versus SSC-A brukes til å gate på lymfocytter, og dermed eliminere celleavfall og gjenværende røde blodlegemer i prøven. (C) Enkeltceller styres ved hjelp av et SSC-H versus SSC-A-plott. (D). Singletporten brukes deretter på et plott av levende død Ghost540 versus SSC-A; gating på Ghost540-negative celler eliminerer ikke-levedyktige celler fra senere analyse. (E) Levende celler analyseres for CD19 versus SSC-A, og CD19-negative celler (ikke-B-celler) er gated på. (F) De CD19-negative cellene undersøkes for CD4 versus CD8-farging. (G) CD4 + celler blir deretter gated på for å visualisere tid versus Indo-1 (kalsiumbundet). (H) Et øyeblikk er valgt for å representere initiering av kalsiuminnstrømningsresponsen etter anti-CD3-antistofftilsetning ved å visualisere Indo-1 (kalsiumfri) versus Indo-1 (kalsiumbundet) fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Visualisering av Indo-1-fluorescens i inngjerdede populasjoner av murine tymocytter ved diskrete tidspunkter i kalsiumresponsen. Totale tymocytter ble stimulert med anti-CD3 antistoff etterfulgt av ionomycin etter 6 min av prøvetakingen. Ved fire diskrete tidspunkter, som angitt i de rektangulære boksene skissert på de todimensjonale tidsplottene versus Indo-1 (kalsiumbundet), ble forskjellige subpopulasjoner av tymocytter undersøkt for kalsiumresponser. (A) Todimensjonale plott som viser gating for baseline Indo-1-signalet, toppresponsen, 5 minutter etter topprespons og responsen på ionomycin. Under hvert plott vises CD4 versus CD8-farging (venstre) og plottet av Indo-1 (kalsiumfritt) versus Indo-1 (kalsiumbundet) på inngjerdede CD4-enkeltpositive (SP) tymocytter. (B) Plott av Indo-1 (kalsiumfritt) versus Indo-1 (kalsiumbundet) på inngjerdede undergrupper av tymocytter er vist på hvert av de fire tidspunktene, ved bruk av gating-strategien vist i (A). (C) Todimensjonale plott ble opprettet som viser farging av totale tymocytter med de angitte antistoffene. Spesifikke undergrupper ble styrt (øverste rad) på og undersøkt for kalsiumresponser versus tid (nederst). Lyseblå (SP) CD8+-populasjon, rød (SP) CD4-populasjon, som viser størst tilstrømning av kalsium, oransje CD4+CD8+ dobbeltpositive tymocytter, mørkegrønne iNKT-celler, lysegrønne CD25+, lilla TCRγδ+ T-celler og svarte CD19+ B-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Hemming av kalsiumresponsen i CD8+ T-celler behandlet med en småmolekylær hemmer av ITK/RLK. Under Indo-1-fargestoffbelastningen ble miltocytter behandlet med to doser PRN694, 100 nM (mørkegrå) og 200 nM (lysegrå). (A) Indo-1 ratio (kalsiumbundet/kalsiumfritt) er vist versus tid for ubehandlede celler (rød) og celler behandlet med PRN694. Kurver viser kalsiumrespons av gated CD8 + T-celler. Den svarte linjen representerer den negative kontrollen av splenocytter lastet med Indo-1 og overflatefarget, men ikke stimulert med anti-CD3-antistoff. (B,C) Dataene kan analyseres ved å dele tidsaksen vist i (A) i åtte segmenter, visualisert med svarte stiplede linjer, og beregne arealet under kurven (AUC) (B), eller stigningstallet for hver kurve (stigningstall) (C) ved hvert tidsintervall for responsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en optimalisert analyse designet for å måle kalsiumresponser i primære murine T-celler lastet med titrert Indo-1 ratiometrisk indikatorfargestoff ved bruk av fullspektret flowcytometri 7,8. Fordelen med å utføre kalsiumfluksanalyser ved bruk av fullspektret flowcytometri er evnen til å multiplekse overflatecellemarkørfarging i kombinasjon med vurdering av Indo-1-fluorescens. Fullspektret flowcytometri har fordelen av å tillate bruk av svært overlappende fargestoffer, og dermed øke antall markører som kan brukes i et panel. Dette skyldes det faktum at fullspektret strømningscytometer samler alt laserlyset som sendes ut over en rekke detektorer for hver prøve som analyseres, i stedet for å ha en detektor dedikert til en fluorokrom. Bruk av hele spekteret av hvert fluor muliggjør høyere følsomhet for analysen og gir et middel til å identifisere spektralt unike fluorokromer som ville ha overlappende signaler hvis de samles inn på et båndpass-flowcytometer. Dette eliminerer også behovet for pre-isolering av en celleundergruppe som undersøkes.

I denne studien ble et panel av celleoverflatemarkører vurdert med fluorokromkonjugerte antistoffer. Dette panelet inkluderte αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 og CD1d-αgal-cer tetramer-APC; i tillegg inkluderte panelet det levende døde fargestoffet Ghost540. Den optimale kanalen for å oppdage hver av disse fluorokromene er tilgjengelig i brukerhåndboken for fullspektret flowcytometer13. I motsetning til dette ble deteksjonen av Indo-1 (kalsiumfri) og Indo-1 (kalsiumbundet) empirisk bestemt, selv om en omtrentlig toppkanal for deteksjon av hver fluorescerende signatur ble estimert basert på de kjente topputslippsbølgelengdene for de to formene for Indo-1. Det er også mulig å konvertere topputslippsbølgelengdene fra båndpassfilterbølgelengder som brukes på konvensjonelle strømningscytometre og målt i nm til deres respektive kanaler på Avalanche Photo Diode (APD) detektorer som brukes av fullspektret strømningscytometer; Dette kan også gi et estimat av optimale kanaler for å oppdage henholdsvis Indo-1 (kalsiumfri) og Indo-1 (kalsiumbundet). Siden enkeltfargede kontroller er inkludert for hver fluorescerende tag, deconvolutes unmixing-prosessen fluorescerende signaturer, slik at visualisering av hver fluorokroms intensitet på celler i hver prøve. Som beskrevet i denne metoden, kan dataanalyse utføres ved gating på celle delmengder av interesse og visualisere forholdet mellom oppdage Indo-1 (kalsiumfri) og Indo-1 (kalsiumbundet) versus tid.

Det er begrensninger i denne analysen. For eksempel tillot konsentrasjoner av Indo-1 under 3 μM ikke vellykket visualisering av kalsiuminnstrømningsresponsen i T-celler. Siden denne analysen også omfatter multipleksingsmålinger av kalsiumresponsen med analyse av flere celleoverflatemarkører på heterogene populasjoner av celler ved bruk av fullspektret flowcytometri, er det viktig å nøye titrere alle fluorescerende merkede antistoffer som brukes, inkludert de som brukes til enkeltfargede kontroller. Dette er viktig for vellykket implementering av den svært følsomme lineære unmixing-algoritmen14. I tillegg kunne et komplett tidsforløp av kalsiuminnstrømning ikke visualiseres for celleundergrupper som representerer mindre enn 1% av den totale populasjonen som analyseres. I stedet krevde en vurdering av kalsiumresponsen i disse sjeldne undergruppene en alternativ analysestrategi ved hjelp av momenter i tid15. Momentene i tidsanalysen gir øyeblikksbilder av de fluorescerende signalene til Indo-1 (kalsiumfri) versus Indo-1 (kalsiumbundet) i diskrete stadier av kalsiumresponsen, i stedet for hele tidsforløpet av responsen. Til slutt er det også viktig å gjenkjenne begrensningene ved å bruke enkle overflatemarkører for å definere delmengder av T-celler. For eksempel er farging av tymocytter med α-CD25-antistoff ikke tilstrekkelig til å skille CD4+ regulatoriske T-celler fra alle andre thymocyttpopulasjoner. Dette skyldes det faktum at flertallet av tidlige thymocyte progenitorceller (CD4-CD8-) celler også uttrykker CD2516. Dette vil sannsynligvis forklare fraværet av en påviselig kalsiuminnstrømningsrespons i gated CD4 + CD25 + tymocytter.

Optimaliseringen av denne protokollen krevde nøye vurdering av flere variabler som var nøkkelen til analysesuksess. Disse inkluderer optimalisering av den spesifikke klonen av anti-CD3-antistoff som brukes, titrering av den optimale konsentrasjonen av dette antistoffet og behovet for antistoffkryssbinding ved bruk av det tradisjonelle biotin/streptavidin-systemet. For murine T-celler ble konsentrasjonen av 30 μg/prøve for 6 x 106 celler i et volum på 500 μL funnet å være den minste mengden antistoff som var nødvendig for optimal kalsiumrespons. Interessant nok ble robuste kalsiumresponser observert med anti-CD3-antistoffklon 17A2, men ikke med klon 145-2C11; Ved bruk av klon 17A2 var det dessuten unødvendig å legge til et sekundært kryssbindingsreagens17. Tester med biotinylert anti-CD3-klon 17A2 med eller uten streptavidin viste ingen forsterkning av kalsiumresponsen ved tilstedeværelse av streptavidin-tverrbinding. Det er mulig at dette antistoffet inkluderte aggregater, og at disse aggregatene utgjorde antistoffets stimuleringseffekt i fravær av åpen kryssbinding. Imidlertid, da disse forsøkene ble utført i løpet av mange måneder med forskjellige hetteglass med dette anti-CD3-antistoffet, var de oppnådde resultatene svært reproduserbare; Derfor er det ikke sannsynlig at dette antistoffets evne til å stimulere T-celler vil variere mellom brukere.

Robuste kalsiumresponser i primære T-celler krever vedlikehold av cellene ved den biologiske temperaturen på 37 °C gjennom hele prøveinnsamlingen; I motsetning til dette vil primære B-celler vise en kalsiumrespons på anti-IgM-antistoff ved romtemperatur. Basert på følsomheten til T-cellekalsiumresponsen på temperatur, er det avgjørende å sikre at hver prøve behandles likt; For eksempel må hver prøve varmes opp til 37 °C med samme metode og i samme tidsperiode. I fravær av denne konsistensen kan variasjoner i kalsiumresponser observeres, men kan ikke indikere biologisk relevante forskjeller mellom prøvene.

Oppsummert beskriver denne protokollen detaljene for å utføre kalsiumfluksanalyser basert på vurderingen av Indo-1-fluorescens ved bruk av fullspektret flowcytometri i kombinasjon med multiplex overflatecellemarkørfarging. Metoden gjør det mulig for etterforskere å unngå behovet for isolering eller sortering av spesifikke cellepopulasjoner før kalsiumfargestoffmerking. Videre skisserer denne protokollen en ekstra analysemetodikk som brukes til å visualisere kalsiumresponser på diskrete øyeblikk i tid i forskjellige cellepopulasjoner. Moments in time-analysen kan med hell brukes på sjeldne (<1% av totale) cellepopulasjoner, som ellers ikke kan oppdages når man vurderer hele kalsiumresponskurven. I fremtiden kan denne analysen utvides til bruk av ytterligere fluorokromkonjugerte antistoffer, og dra nytte av de omfattende egenskapene til fullspektret strømningscytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å oppgi.

Acknowledgments

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Tusen takk til våre kolleger i Cytek for kontinuerlige diskusjoner om full spektral cytometrisk analyse av programvaren Aurora og SpectroFlo. Figurer ble laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 190
Analyse av T-cellereseptorindusert kalsiuminnstrømning i primære Murine T-celler ved fullspektret flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L.… More

Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter