Summary
In dit werk wordt een robuuste methode beschreven voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in de gist Saccharomyces cerevisiae . Deze methode is met name nuttig voor de kwantificering van pre-zygote barrières in soortvormingsstudies.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae is een veelgebruikt modelorganisme in de genetica, evolutie en moleculaire biologie. In de afgelopen jaren is het ook een populair modelorganisme geworden om problemen met betrekking tot soortvorming te bestuderen. De levenscyclus van gist omvat zowel aseksuele als seksuele voortplantingsfasen. Het gemak van het uitvoeren van evolutie-experimenten en de korte generatietijd van het organisme maken de studie van de evolutie van voortplantingsbarrières mogelijk. De efficiëntie waarmee de twee paringstypen (a en α) paren om de a/α diploïde te vormen, wordt de paringsefficiëntie genoemd. Elke afname van de paringsefficiëntie tussen haploïden duidt op een pre-zygote barrière. Om de mate van reproductieve isolatie tussen twee haploïden te kwantificeren, is dus een robuuste methode nodig om de paringsefficiëntie te kwantificeren. Hiertoe wordt hier een eenvoudig en zeer reproduceerbaar protocol gepresenteerd. Het protocol omvat vier hoofdstappen, waaronder het patchen van de haploïden op een YPD-plaat, het mengen van de haploïden in gelijke aantallen, verdunnen en plateren voor afzonderlijke kolonies en ten slotte het berekenen van de efficiëntie op basis van het aantal kolonies op een drop-out plaat. Auxotrofe markers worden gebruikt om duidelijk het onderscheid te maken tussen haploïden en diploïden.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae, gewoonlijk ontluikende gist genoemd, is een eencellige eukaryoot. Het heeft twee paringstypen, een en α, en vertoont zowel aseksuele als seksuele voortplantingscycli. De a- en α-paringstypen zijn haploïden en kunnen mitoïde delen in afwezigheid van het andere paringstype in de omgeving, dat de aseksuele cyclus van gist vertegenwoordigt. Wanneer de twee paringstypen dicht bij elkaar zijn, stoppen ze mitotisch met delen en fuseren ze tot een diploïde cel. De diploïde gist kan zich mitotisch delen wanneer voedingsstoffen aanwezig zijn of meiose ondergaan onder de omstandigheden van stikstofgebrek in de aanwezigheid van een slechte koolstofbron die niet-fermenteerbaar is, zoals acetaat1. Dit resulteert in de vorming van sporen, die slapend blijven totdat er gunstige groeiomstandigheden zijn. De levenscyclus is voltooid wanneer deze sporen ontkiemen en de twee haploïde typen weer worden vrijgegeven aan de haploïde pool 2,3 (figuur 1).
De paring van gistcellen omvat verschillende stappen, zoals agglutinatie, de vorming van een paringsprojectie of "shmoo", gevolgd door cel- en kernfusie 4,5. De twee paringstypen a en α produceren respectievelijk a-factor en α-factor om de paring te initiëren. Deze factoren zijn polypeptideferomonen die binden aan de receptoren (Ste2 en Ste3) die aanwezig zijn op het celoppervlak van het tegenovergestelde paringstype5. De binding van de feromonen aan de receptoren initieert de feromoonresponsroute, de mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) signaaltransductieroute 6,7,8. Dit resulteert in het stoppen van de celcyclus in de G1-fase, wat leidt tot een metabolisch actieve stationaire fase9. De cellen stoppen dan met mitotisch delen en de eiwitten die nodig zijn voor de paring worden gesynthetiseerd. Omdat de haploïde cellen niet naar elkaar toe kunnen bewegen, wordt een paringsprojectie of "shmoo" gericht op de paringspartner. Wanneer de cellen in contact komen, wordt de celwand afgebroken en fuseert de cytoplasmatische inhoud, wat resulteert in paring om een diploïde cel te vormen10,11. De paringsefficiëntie tussen haploïden is gebruikt als een maat voor soortvorming in laboratorium-geëvolueerde stammen, evenals tussen bestaande soorten12.
Omdat het een eenvoudig eukaryoot organisme is, is gist het model bij uitstek voor een groot aantal onderzoeksvragen die verband houden met complexe eukaryote organismen. Een dergelijke vraag houdt verband met soortvorming en de evolutie van voortplantingsbarrières13,14. Voor seksueel reproducerende organismen wordt een soort gedefinieerd door het biologische soortconcept (BSC) voorgesteld door Ernst Mayr15. Volgens dit concept wordt gezegd dat twee individuen van een populatie tot twee verschillende soorten behoren als ze niet kunnen kruisen en reproductief geïsoleerd zijn. Afbraak van de seksuele voortplantingscyclus (die de fusie van gameten omvat om een zygote te vormen, de ontwikkeling van de zygote tot een nageslacht en het bereiken van seksuele volwassenheid in het nageslacht) leidt tot reproductieve isolatie. Zoals te zien is in figuur 1, is de levenscyclus van S. cerevisiae vergelijkbaar met de seksuele voortplantingscyclus: a) de fusie van de twee paringstypen a en α is vergelijkbaar met de fusie van gameten in seksueel reproducerende organismen; b) het vermogen van de diploïde om mitotische deling te ondergaan is gelijk aan de zygote die zich ontwikkelt tot nakomelingen; en c) de diploïde die sporulatie ondergaat is vergelijkbaar met het proces van gametogenese14.
Pre-zygote isolatie treedt op wanneer assortatieve paring wordt waargenomen. Gegeven een gelijke kans om te paren met twee genetisch verschillende a-types , paart een α type bij voorkeur met de ene boven de andere of omgekeerd14. In het geval van evolutie-experimenten waarbij haploïden in verschillende omgevingen zijn geëvolueerd, kan de aanwezigheid van een pre-paringsbarrière worden bepaald door een paringstest uit te voeren. Een afname van de paringsefficiëntie in vergelijking met de voorouder duidt op de evolutie van een pre-paringsbarrière. Post-zygote isolatie kan ontstaan als gevolg van het onvermogen van de diploïde om effectieve mitotische deling en/of sporulatie te ondergaan om haploïde sporen te vormen14. Deze kunnen worden gekwantificeerd door respectievelijk de groeisnelheid van de diploïden te meten en de sporulatie-efficiëntie te berekenen. Om de evolutie van voortplantingsbarrières te bestuderen, zijn daarom robuuste methoden nodig voor het kwantificeren van (a) de paringsefficiëntie, (b) de mitotische groei van de diploïde en (c) de sporulatie-efficiëntie van de diploïde. In dit werk wordt een robuuste methode gerapporteerd om de paringsefficiëntie van giststammen te kwantificeren.
In laboratoriumexperimenten is een van de manieren waarop het optreden van paring kan worden gedetecteerd, door auxotrofe markers te gebruiken die de voedingsbehoeften aanvullen. Wanneer de twee paringstypen auxotroof zijn voor twee verschillende aminozuren, kan alleen de diploïde cel gevormd door de fusie van de twee paringstypen groeien op een medium met een tekort aan beide aminozuren. Aujobtrofe markers zijn dus nuttig voor het detecteren van paring, zowel kwalitatief als kwantitatief. Een kwalitatieve test volstaat om het paringstype van een stam na meiosete identificeren 16. Kwantitatieve tests zijn essentieel wanneer men geïnteresseerd is in het identificeren van een vermindering van de paring tijdens het bestuderen van de genen die betrokken zijn bij de paringsroute17,18. Bovendien, met gist die steeds vaker wordt gebruikt in soortvormingsstudies, is een handige en reproduceerbare paringstest noodzakelijk, omdat de kwantificering van de paringsefficiëntie een maat is voor de pre-zygote barrière.
De paringsefficiëntie tussen de twee gistparingstypen is eerder gekwantificeerd16,19,20. De meeste van de eerder gebruikte methoden zijn vergelijkbaar in hun ontwerp met een paar variaties 16,21,22,23,24,25. Sommigen van hen gebruiken vroege logfaseculturen, terwijl een paar anderen mid-logfaseculturen van haploïde stammen gebruiken. Er zijn variaties in de verhoudingen waarin de twee paringstypen worden gemengd. Bijna alle protocollen gebruiken een nitrocellulosemembraan. Suspensies van beide paringstypen uit eerder gekweekte culturen worden gemengd en gefilterd op een nitrocellulosemembraan dat op een YPD-plaat wordt geplaatst. In een van de varianten van het protocol wordt de haploïde suspensie direct gepatcht op een YPD-plaat21. In experimenten die zich bezighouden met de genen die betrokken zijn bij de feromoonproductie van de twee paringstypen, worden de feromonen extern toegevoegd terwijl de suspensies van de twee paringstypen24 worden gemaakt.
Na incubatie gedurende een paar uur (meestal ongeveer 5 uur) na het mengen van de haploïden, worden de cellen van het membraan afgewassen, verdund en verguld op selectieve media. In een van de eerdere methoden die in 1973 werden gerapporteerd, werd de efficiëntie van zygotevorming of paring berekend door het aantal budded cells, unbudded cells en paringsparen onder een microscoop te tellen met behulp van een hemocytometer26. De meeste later gerapporteerde methoden gebruiken echter auxotrofe markers om haploïden en diploïden te onderscheiden. Paringsefficiëntie wordt berekend als het percentage diploïde cellen ten opzichte van het aantal diploïde en haploïde cellen in de cellulaire pool 16,21,23.
Ondanks een aantal rapporten die gist als modelorganisme gebruiken om soortvorming te bestuderen, is er tot nu toe geen gestandaardiseerd protocol in de literatuur gerapporteerd voor het berekenen van de efficiëntie van paring. Cellen in de logfase zijn mogelijk niet ideaal voor de kwantificering van de paringsefficiëntie. Tijdens de paring wordt de celcyclus van de twee haploïden gestopt en daarom delen de cellen tijdens de paring niet9. Omdat ook bekend is dat de celcyclus op dezelfde manier wordt gestopt in cellen in de stationaire fase27, kan het gebruik van dergelijke cellen het protocol reproduceerbaarder maken. Stationaire fasecellen kunnen worden gemengd en op YPD-platen (d.w.z. een voedingsrijke omgeving) worden gelegd om te paren. De conventionele procedures vereisen ook een nitrocellulosemembraan en het afwassen van de cellen, waardoor het proces omslachtig is en vatbaar voor verwerkingsfouten. Bovendien kwantificeren de protocollen die tot nu toe zijn gebruikt de paringsefficiëntie in termen van één haploïde. Bij het meten van reproductieve isolatie wordt de paringsefficiëntie echter gekwantificeerd voor een bepaalde combinatie van haploïden in plaats van een enkele haploïde.
Om deze problemen aan te pakken, rapporteren we hier een robuuste methode voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in gist die zeer reproduceerbaar en gemakkelijk te gebruiken is. Bovendien kunnen deze methode en de giststammen die hier worden gebruikt ook worden gebruikt in studies die het effect van genstroom op de evolutie van paringsbarrières onderzoeken.
In deze studie werden twee verschillende stammen van S. cerevisiae gebruikt. Een van de stammen is afgeleid van de SK1-achtergrond; dit werd in ons laboratorium aangepast door toevoeging van de auxotrofe markers in de buurt van de MAT-locus. De resulterende genotypen van de haploïden zijn weergegeven in tabel 128,29,30. In de SK1-stam had de a haploïde het TRP1-gen ingebracht in de buurt van de MAT-locus en de α haploïde had het LEU2-gen ingebracht in de buurt van de MAT-locus. In de ScAM-stam werden de TRP1- en URA3-genen ingebracht in respectievelijk de a- en α haploïden. De plaats van insertie was in het ARS-gebied van chromosoom III (Chr III: 197378..197609). Voor het hier gerapporteerde protocol zouden auxotrofe markers overal op het genoom voldoende zijn. Het hebben van de auxotrofe markers in de buurt van de MAT-locus betekent echter dat deze stammen ook kunnen worden gebruikt voor studies die het effect van genstroom op soortvorming31,32 onderzoeken. De markers werden dicht bij de MAT-locus toegevoegd om te voorkomen dat de markers opnieuw worden geherschikt als gevolg van recombinatie. Daarom kan dit protocol worden gebruikt om de paringsefficiëntie te kwantificeren in studies met soortvorming en ook om de verandering van paringsefficiëntie te identificeren bij het bestuderen van de eiwitten die betrokken zijn bij de paringsroute.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het protocol omvat in grote lijnen de volgende stappen: (1) het patchen van de haploïden in de paringsefficiëntieroosters op een YPD-plaat, (2) het mengen van de haploïden in gelijke aantallen na 24 uur incubatie en het geven van de gemengde haploïden een paar uur om te paren (7 uur in deze studie), (3) het plateren van de gemengde cellen op YPD voor het isoleren van enkele kolonies na 7 uur bij 30 °C, en ten slotte (4) het bepalen van het aantal diploïden gevormd met behulp van de auxotrofe markers. Deze stappen worden hieronder in detail besproken (zie ook figuur 2).
1. Patchen van haploïden in de paringsefficiëntieroosters
- Laat de haploïden a en α uit diepvriesvoorraden herleven door op een YPD-agarplaat te strepen (2% agar, 2% dextrose, 1% pepton, 0,5% gistextract) en laat ze 48 uur groeien bij 30 °C om geïsoleerde enkele kolonies te verkrijgen.
- Ent enkele kolonies van de YPD-plaat in 5 ml YPD-medium (2% dextrose, 1% pepton, 0,5% gistextract) en incubeer bij 30 °C gedurende 48 uur met 250 tpm schudden. De cellen bevinden zich na deze incubatietijd in de stationaire groeifase.
- Teken een paringsefficiëntierooster op een verse YPD-plaat. Teken het raster als een rechthoek van 1 cm x 1,5 cm, verdeeld in drie vakken, zodat elk een afmeting van 1 cm x 0,5 cm heeft, zoals weergegeven in figuur 2A.
- Patch 5 μL van de YPD-cultuur van de twee paringstypen op de meest linkse en meest rechtse rechthoeken (figuur 2B). Dit volume komt overeen met ongeveer 5 x 105 haploïde cellen in elke sectie. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 30 °C.
OPMERKING: Het doel van het raster is om de experimentele metingen nauwkeurig te maken (zoals het aantal cellen in het experiment). De rastergrootte is klein genoeg dat het experimenteel traceerbaar is, maar groot genoeg om gemakkelijk te kunnen worden gemanipuleerd (zoals het optillen van cellen uit een raster) en niet vatbaar voor drift of toevallige gebeurtenissen.
2. Mengen van haploïden en paring
OPMERKING: Na 24 uur (figuur 2C) wordt een gelijk aantal cellen van de twee haploïde typen van de twee rasters geschraapt, gemengd en in de middelste rechthoek gelegd (figuur 2D).
- Om een gelijk aantal cellen te mengen, verwijdert u ongeveer 1/3 van de pleister die in de buitenste dozen is gelegd met behulp van een steriele tandenstoker en resuspensie in 20 μL water in een steriele injectieflacon van 1,5 ml voor elk van de haploïden.
- Verdun 5 μL van deze suspensie in 2 ml water. Meet de OD van deze verdunde suspensie met behulp van een spectrofotometer bij 600 nm. Meng een gelijk aantal cellen van de twee stammen, gebaseerd op de OD-waarde en het aantal cellen/ml in 1 OD voor die specifieke stam. Bereken het volume dat moet worden gemengd en zuig het op uit de resterende 15 μL van de individuele haploïde suspensie.
OPMERKING: Het aantal cellen dat in de middelste rechthoek is gepatcht, is zodanig dat de cellen een monolaag vormen. Aangezien de gistcel een bol is met een straal van 2,58 μm33, zou een rechthoekige doos van 1 cm x 0,5 cm ongeveer 1,7 x 106 cellen nodig hebben om een monolaag te vormen. Er moet voor worden gezorgd dat er geen fysieke aanraking is tussen de cellen die zijn gepatcht voor paring en de twee haploïde celrasters. Omdat gelijke aantallen van elk type haploïde cellen moeten worden gemengd, worden 8,5 x 105 cellen toegevoegd van elke stam. Het celgetal wordt berekend op basis van OD-metingen, waarbij 1 OD bij 600 nm ongeveer overeenkomt met 1 x 107 cellen34. Als bijvoorbeeld de OD600 van de haploïde suspensie 0,17 is en die van de α haploïde 0,11, kan het aantal cellen in 5 μL van elke haploïde suspensie worden berekend. Om ervoor te zorgen dat 8,5 x 105 cellen van elk haploïde type, 1,25 μL van de a haploïde en 1,93 μL van de α haploïde suspensies worden gemengd. - Voeg de vereiste volumes van beide haploïden toe in een verse en steriele injectieflacon van 1,5 ml en meng goed met een pipet. Het uiteindelijke volume van deze suspensie is over het algemeen ongeveer 6-8 μL. Patch deze ophanging in het middenrooster. Incubeer de plaat bij 30 °C gedurende 7 uur, zodat de haploïden voldoende tijd hebben om te paren (figuur 2E).
3. Plating van gemengde cellen op YPD-agar
- Schraap na de incubatietijd van 7 uur de cellen uit de middelste rechthoek met behulp van een tandenstoker of een pipetpunt en verdun in 2 ml steriel water. Verspreid vervolgens de celsuspensie op YPD-agar om enkele kolonies te verkrijgen. Om de verdunningsfactor te bepalen die nodig is om afzonderlijke kolonies te verkrijgen, meet u de OD van de eerste buis waarin de geschraapte cellen worden toegevoegd. Voor elk celtype/elke gebruikte stam moeten specifieke verdunningsfactoren worden bepaald.
OPMERKING: Een OD600 van 0,15 komt bijvoorbeeld overeen met 3 x 106 cellen in een suspensie van 2 ml (rekening houdend met 1 OD = 1 x 107 cellen / ml). Om een paar honderd kolonies op de YPD-plaat te verkrijgen, wordt de celsuspensie tweemaal serieel verdund met 1:20 en vervolgens wordt 100 μL van de uiteindelijke verdunning gebruikt voor verspreiding. - Incubeer na het plateren de YPD-platen bij 30 °C gedurende 36-48 uur totdat er enkele kolonies zijn. Zorg ervoor dat uit elk paringsexperiment een paar honderd individuele kolonies worden verkregen voor screening om ervoor te zorgen dat statistische significantie in de gegevens kan worden gedetecteerd (figuur 2F).
4. Screening op diploïden met behulp van auxotrofe markers
- Bepaal welke fractie van de verkregen kolonies diploïde is. Om de diploïde kolonies op de plaat te identificeren, brengt u de enkele kolonies over door ze afzonderlijk op een dubbele drop-out plaat te strepen (2% glucose, 0,66% stikstofbase, 0,05% dubbel drop-out aminozuurmengsel en 2% agar) zonder de aminozuren waarvoor de stammen auxotroof zijn, zoals weergegeven in figuur 2G. Incubeer de platen bij 30 °C gedurende 48 uur.
OPMERKING: De kolonies kunnen ook worden overgebracht op de dubbele uitvalplaat met behulp van replicabeplating. In deze studie werd tryptofaan en leucine (trp− leu−) drop-out medium gebruikt bij het kwantificeren van de paringsefficiëntie van de SK1AM stammen, en tryptofaan en uracil (trp− ura−) drop-out medium werd gebruikt voor de ScAM stammen. Alleen de diploïde kolonies groeien op de dubbele uitvalplaat omdat ze beide auxotrofe markers hebben: TRP1- en LEU2-genen in de SK1AM-stammen en TRP1- en URA3-genen in de ScAM-stammen. - Bovendien, streep of replicaplaat de kolonies op enkele drop-out media (trp− of leu− of ura−) om de frequentie van elk van de twee soorten haploïde in de populatie te kwantificeren.
- Bereken de paringsefficiëntie, η, als volgt:
Eq (1)
waarbij het aantal gepaarde haploïden eenvoudigweg gelijk is aan tweemaal het aantal diploïden dat op de dubbele uitvalplaat is geïdentificeerd (aangezien elke diploïde het gevolg is van de paring van twee haploïden). Het totale aantal haploïden is gelijk aan de som van het aantal haploïden gestreept plus tweemaal het aantal diploïden gestreept.
OPMERKING: Als er bijvoorbeeld slechts 60 kolonies groeien na het streaken / repliceren van 100 kolonies op een dubbel drop-out medium, kan de paringsefficiëntie worden gekwantificeerd als 75% (aangezien 60 x 2 haploïden paren om de 60 diploïden te vormen en 40 haploïden niet paren).
Eq (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kwantificering van de paringsefficiëntie van de twee paringstypen
Het hier beschreven protocol werd gebruikt om de paringsefficiëntie tussen twee giststammen te kwantificeren - tussen SK1AM a en SK1AM α en tussen ScAMa en ScAMα (figuur 3A). In deze experimenten werd de paring tussen de twee haploïden minstens 12 keer herhaald. In elk van de herhalingen van het experiment werden minstens 100 kolonies gestreept op dubbele drop-out media. De robuustheid van het protocol maakte een eenvoudige differentiatie van de paringsefficiëntie tussen de twee stammen, SK1AM en ScAM, mogelijk. Terwijl de SK1-stammen gepaard gingen met een zeer hoog rendement, paren de ScAM-stammen met een relatief lagere efficiëntie (figuur 3A). Dit is misschien niet verwonderlijk, aangezien de ScAM-stammen zijn ontstaan uit hybride paring tussen de stammen S. cerevisiae en S. carlsbergensis 35.
Naast het onderscheiden van de paringsefficiëntie tussen de stammen, kan deze methode ook worden gebruikt om de verschillen in de paringsefficiëntie van de stammen in verschillende omgevingen te kwantificeren. Zoals te zien is in figuur 3B, daalde de paringsefficiëntie van de ScAM-stammen aanzienlijk wanneer de omgeving geen glucose als primaire koolstofbron bevatte. Paring is een energetisch duur proces en groei op alternatieve koolstofbronnen vermindert kwalitatief de efficiëntie van de paring.
Dynamiek van paringsefficiëntie
De hoge herhaalbaarheid van de methode maakt het ook mogelijk om de dynamiek van de paringsefficiëntie te volgen. Wanneer toegestaan om te paren voor verschillende tijdsperioden (figuur 3C), werd geen paring waargenomen gedurende de eerste 4-5 uur; De eerste diploïden verschenen pas na deze duur. Vermoedelijk is dit de tijd die nodig is om het paringsproces in de gegeven omgeving te voltooien. Daarna nam de paringsefficiëntie snel toe. Na 7 uur worden paringsefficiëntieberekeningen echter beïnvloed door het feit dat mitotische groei op de plaat begint te gebeuren. De identificatie en selectie van vroege of late diploïden op deze manier kan het ontwerp van experimenten mogelijk maken die gericht zijn op het ontwikkelen van snelle of vertraagde paring tussen haploïden. Het precieze tijdstip waarop de paringsefficiëntie piekt, is variabel voor elke stam. Met behulp van groeikinetiek hebben we bijvoorbeeld experimenteel vastgesteld dat de ScAM-stam een groeisnelheid vertoont die lager is dan die van andere S. cerevisiae-stammen (zoals SK1), en dit beïnvloedt waarschijnlijk ook de dynamiek van de paring.
Figuur 1: Levenscyclus van Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae heeft twee paringstypen, a en α, en vertoont zowel aseksuele als seksuele voortplantingsfasen. De twee paringstypen verdelen zich, bij afwezigheid van de andere, mitotisch. Wanneer ze echter in de buurt van elkaar aanwezig zijn, stoppen ze met mitotisch delen en fuseren de cellulaire en nucleaire inhoud tot een diploïde. De diploïde cel kan zich mitotisch verder delen. In aanwezigheid van ongunstige omstandigheden (uithongering) ondergaat het echter meiose om sporen te produceren die vier haploïden bevatten. Deze sporen ontkiemen onder gunstige omstandigheden om twee haploïden van elke soort vrij te geven, waardoor de levenscyclus wordt voltooid. De werkzaamheid waarmee de twee haploïden a en α paren wordt de paringsefficiëntie genoemd. Elke afname van deze paringsefficiëntie duidt op een pre-zygote barrière voor paring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stappen die betrokken zijn bij de paringsefficiëntietest . (A) Een paringsefficiëntierooster van 1 cm x 1,5 cm, dat verder is verdeeld in dozen van elk 1 cm x 0,5 cm, wordt op een YPD-plaat getekend. (B) Haploïde cellen worden gepatcht op de extreme dozen. (C) De groei van haploïde cellen na 24 uur bij 30 °C. (D) Een derde van de haploïde pleisters wordt verwijderd met behulp van een tandenstoker, gemengd in gelijke celaantallen (gebaseerd op OD600) en gepatcht in het middelste raster. (E) De groei van de cellen die na 7 uur bij 30 °C in het middenrooster zijn gepatcht. Dit bevat de nieuwe diploïden gevormd en de haploïden die niet hebben gepaard. (F) Geïsoleerde afzonderlijke kolonies verkregen op een YPD-plaat na de verdunning en plating van de cellen geschraapt van het middenrooster. Deze plaat werd geïncubeerd bij 30 °C gedurende 36-48 h. (G) Om het aantal diploïden op de YPD-plaat te identificeren, worden de kolonies overgebracht naar een dubbele drop-out plaat zonder tryptofaan en leucine. Alleen diploïden kunnen op deze plaat groeien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Paringsefficiëntie van de giststammen . (A) De paringsefficiëntie van de twee haploïden a en α van de SK1- en ScAM-stammen op een YPD-plaat. (B) De paringsefficiëntie van de twee haploïden a en α van de ScAM-stam op YP-platen die 2% galactose bevatten en op glycerol/lactaatplaten. c) De dynamiek van paring in de ScAM-stam in een glucoseomgeving. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SD van 12 onafhankelijke herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stammen | Genotype | Commentaar | Referentie |
| SK1AMeen | ars314::TRP1, MATa, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Deze stam heeft het TRP1-gen en kan dus groeien in afwezigheid van tryptofaan in de media. | |
| SK1AMα | ars314::LEU2, MATalpha, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Deze stam heeft het LEU2-gen en kan dus groeien in afwezigheid van leucine in de media. | |
| ScAMa | ars314::TRP1, MATa, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII ura3‐52 | Deze stam heeft het TRP1-gen en kan dus groeien in afwezigheid van tryptofaan in de media. | Afgeleid van ScPJB644a in referentie 28 |
| ScAMα | ars314::URA3, MATalpha, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII, ura3‐52 | Deze stam heeft het URA3-gen en kan dus groeien in afwezigheid van uracil in de media. | Afgeleid van ScPJB644α in referentie 28 |
Tabel 1: Genotypen van de in dit onderzoek gebruikte S. cerevisiae-stammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kwantificering van de paringsefficiëntie in S. cerevisiae is essentieel voor het uitvoeren van studies met betrekking tot de genen die betrokken zijn bij paringsroutes of het bestuderen van de invloed van de externe omgeving op paringsgedrag. In de afgelopen twee decennia is S. cerevisiae ook een populair model geworden om vragen met betrekking tot soortvorming 14,36,37,38 te beantwoorden. De aanwezigheid van twee paringstypen en het gemak van genetische manipulatie en onderhoud in laboratoriumomgevingen heeft het een geschikt organisme gemaakt om de evolutie van reproductieve barrières in realtime te bestuderen. De kwantificering van de paringsefficiëntie is essentieel omdat het een maat geeft voor de pre-zygote voortplantingsbarrière. Daarom is een handig protocol met een hoge reproduceerbaarheid vereist.
Met behulp van het bovenstaande protocol werd de paringsefficiëntie van twee verschillende stammen die totaal verschillend paringsgedrag vertonen, gekwantificeerd. Daarom kan het protocol op elke stam worden toegepast, omdat de meeste laboratoriumgiststammen auxotrofieën bevatten die kunnen worden gebruikt voor selectie39. Er zijn echter een paar belangrijke overwegingen bij het gebruik van dit protocol. De tijdsduur die nodig is voor de initiële YPD-culturen om de stationaire fase te bereiken, is afhankelijk van de stam. Een langzaam groeiende soort kan meer dan 48 uur incubatie bij 30 °C nodig hebben. Het te mengen volume haploïden wordt berekend op basis van OD-metingen in een spectrofotometer. De in de literatuur gerapporteerde waarde ligt in de orde van grootte van 107 cellen/ml voor 1 OD34; het is echter beter om deze waarde voor een bepaalde stam te karakteriseren met behulp van een plot van OD versus het aantal cellen. Het volume dat nodig is om het mengen van gelijke aantallen cellen te garanderen, kan worden berekend op basis van de OD-waarde en het aantal cellen/ml in 1 OD, die worden verkregen uit de karakterisering van de stam. Men moet ervoor zorgen dat de cellen die in het middenraster worden gepatcht na het mengen van de haploïden ruwweg een monolaag vormen die niet erg dik is. Men moet er ook voor zorgen dat het volume dat wordt gemengd ongeveer 6-8 μL is. Een hoger volume kan leiden tot overlapping met de haploïde patches die zich aan weerszijden van het middenraster bevinden.
Deze methode kan ook worden gebruikt om pre-zygote voortplantingsbarrières tussen ecologische isolaten van gist te bestuderen. Voor dergelijke gevallen moet het HO-endonucleasegen echter eerst uit het genoom van het organisme worden verwijderd, omdat stammen die HO-endonuclease dragen automatisch diploïden vormen vanwege de schakelactiviteit van het paringstype40. De haploïden geïsoleerd uit de gesporuleerde diploïde kunnen worden geïdentificeerd als een of α door de sequentie aanwezig op de MAT-locus te identificeren met behulp van de specifieke primers die eerder zijn genoemd41. De HO-marker kan worden vervangen door twee verschillende antibioticaresistentiegenen als markers om onderscheid te maken tussen de twee haploïde paringstypen. Dit detail is afhankelijk van de spanningsconstructie die in het specifieke onderzoek wordt gebruikt.
Een van de beperkingen van deze methode is dat het gebruik van auxotrofe markers vereist dat de kolonies van de YPD-plaat naar de drop-outplaten worden overgebracht. Het gebruik van fluorescentiemarkers om onderscheid te maken tussen haploïde en diploïde cellen kan helpen de experimentele tijd te verkorten. Het gebruik van fluorescentiemarkers kan echter de groeidynamiek van de cellen beïnvloeden, omdat er extra kosten verbonden zijn aan de productie van de fluorescerende eiwitten, die dus de metabole en fysiologische toestand van een cel kunnen veranderen42. Als alternatief kunnen de auxotrofe markers om de twee haploïden te identificeren worden vervangen door antibioticamarkers.
Sommige van de vorige methoden die zijn gebruikt voor de karakterisering van paringsefficiëntie melden het gebruik van een overmaat van een van de paringstypen in een verhouding van 10: 1 16,21,24. Uit ervaring blijkt dat het gebruik van een vertekende verhouding van de twee haploïden resulteert in mitotische groei van de haploïde in overmaat. Daarom gebruikt de huidige methode een 1:1 mix van de twee haploïden.
Aangezien de auxotrofe markers in de stammen die in dit onderzoek worden gebruikt, dicht bij de MAT-locus worden ingebracht, verbreekt recombinatie tijdens meiose de associatie tussen de auxotrofe marker en het paringstype niet. Als gevolg hiervan veranderen de auxotrofie en het paringstype van een bepaalde haploïde niet, zelfs niet als de stammen meiose mogen ondergaan. Dit maakt het mogelijk om vragen te beantwoorden met betrekking tot de impact van genstroom als variabele op aanpassing en soortvorming43. Over het algemeen presenteert dit protocol dus een eenvoudige en robuuste methode om de paringsefficiëntie tussen verschillende giststammen te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben in dit werk. De auteurs delen graag de SK1-afgeleide soorten voor alle non-profit gebruik.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een DBT/Wellcome Trust (India Alliance) subsidie (IA/S/19/2/504632) aan S.S. P.N. is een Research Fellow ondersteund door een DBT/Wellcome Trust (India Alliance) beurs (IA/S/19/2/504632). AM wordt ondersteund door de Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Government of India, als Senior Research Fellow (09/087(0873)/2017-EMR-I). De auteurs bedanken Paike Jayadeva Bhat voor de discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Powder regular grade for bacteriology | SRL | 19661 (0140186) | |
| Ammonium Sulphate, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glucose | Sigma Life Science | G8270 | |
| Glass Petri plates | HiMedia | PW008 | 90 mm x 15 mm dimension |
| L-Arginine | Sigma Life Science | A8094 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Life Science | A7219 | |
| L-Histidine monochloride monohydrate | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lysine | Aldrich | 62840 | |
| L-Methionine | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tyrosine | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-Valine | Sigma Life Science | V0513 | |
| Mating efficiency grid | 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate | ||
| Microcentrifuge tubes | Tarsons | 500010 | |
| Peptone | HiMedia | RM001 | |
| Uracil | Sigma Life Science | U0750 | |
| Yeast Extract Powder | HiMedia | RM027 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate | BD Difco | 233520 |
References
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: How yeast cells do it. Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).
- Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).
- Bardwell, L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).
- Reid, B. J., Hartwell, L. H. Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).
- Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production. Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).
- Bagnat, M., Simons, K. Cell surface polarization during yeast mating. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).
- Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).
- Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology. Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).
- Greig, D.
- Mayr, E. Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1999).
- Sprague, G. F.
- McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).
- Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones. Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).
- Maclean, C. J., Greig, D. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).
- Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations. Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).
- Leu, J. Y., Murray, A. W. Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast. Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).
- Kim, J., Hirsch, J. P. A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone. Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).
- Jin, M., et al. Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency. Science Signaling. 4 (186), (2011).
- Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D.
- McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination. Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S.
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
- Johnston, S. A., Hopper, J. E. Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).
- Mahilkar, A. Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , Indian Institute of Technology. Bombay, Mumbai. PhD thesis (2021).
- Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).
- Rice, W. R., Hostert, E. E. Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years. Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).
- White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. The past and future of experimental speciation. Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).
- Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).
- Domitrovic, T., et al. Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance. PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).
- Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G.
- Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast. Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).
- Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins. EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).
- Lee, H. Y., et al. Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species. Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).
- Pronk, J. T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).
- Madhani, H. D. From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, New York. (2007).
- Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow. Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).
