Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestimmung der Paarungseffizienz von Haploiden in Saccharomyces cerevisiae

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64596
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

In dieser Arbeit wird eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Diese Methode eignet sich besonders für die Quantifizierung präzygotischer Barrieren in Artbildungsstudien.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae ist ein weit verbreiteter Modellorganismus in Genetik, Evolution und Molekularbiologie. In den letzten Jahren hat es sich auch zu einem beliebten Modellorganismus entwickelt, um Probleme im Zusammenhang mit der Artbildung zu untersuchen. Der Lebenszyklus von Hefepilzen umfasst sowohl ungeschlechtliche als auch sexuelle Fortpflanzungsphasen. Die einfache Durchführung von Evolutionsexperimenten und die kurze Generationszeit des Organismus ermöglichen es, die Evolution von Fortpflanzungsbarrieren zu untersuchen. Der Wirkungsgrad, mit dem sich die beiden Steckarten (a und α) paaren, um das a/α-Diploid zu bilden, wird als Steckwirkungsgrad bezeichnet. Jede Abnahme der Paarungseffizienz zwischen Haploiden deutet auf eine präzygotische Barriere hin. Um das Ausmaß der reproduktiven Isolation zwischen zwei Haploiden zu quantifizieren, ist daher eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz erforderlich. Zu diesem Zweck wird hier ein einfaches und hochgradig reproduzierbares Protokoll vorgestellt. Das Protokoll umfasst vier Hauptschritte, darunter das Patchen der Haploiden auf einer YPD-Platte, das Mischen der Haploiden in gleicher Anzahl, das Verdünnen und Ausplattieren für einzelne Kolonien und schließlich die Berechnung der Effizienz basierend auf der Anzahl der Kolonien auf einer Drop-out-Platte. Auxotrophe Marker werden verwendet, um die Unterscheidung zwischen Haploiden und Diploiden klar zu machen.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, umgangssprachlich als knospende Hefe bezeichnet, ist ein einzelliger Eukaryot. Es hat zwei Paarungstypen, einen und einen α, und weist sowohl asexuelle als auch sexuelle Fortpflanzungszyklen auf. Die Paarungstypen a und α sind haploide und können sich mitotisch teilen, wenn der andere Paarungstyp in der Umgebung fehlt, der den ungeschlechtlichen Zyklus der Hefe darstellt. Wenn sich die beiden Paarungstypen in unmittelbarer Nähe befinden, hören sie auf, sich mitotisch zu teilen, und verschmelzen zu einer diploiden Zelle. Die diploide Hefe kann sich entweder mitotisch teilen, wenn Nährstoffe vorhanden sind, oder sich unter den Bedingungen des Stickstoffmangels in Gegenwart einer schlechten, nicht fermentierbaren Kohlenstoffquelle, wie z. B. Acetat1, einer Meiose unterziehen. Dies führt zur Bildung von Sporen, die ruhen, bis günstige Wachstumsbedingungen herrschen. Der Lebenszyklus ist abgeschlossen, wenn diese Sporen keimen und die beiden haploiden Typen wieder in den haploiden Pool freigesetzt werden 2,3 (Abbildung 1).

Die Paarung von Hefezellen umfasst mehrere Schritte, wie z.B. die Agglutination, die Bildung eines Paarungsvorsprungs oder "Shmoo", gefolgt von der Zell- und Kernfusion 4,5. Die beiden Paarungstypen a und α erzeugen einen a-Faktor bzw. einen α-Faktor, um die Paarung einzuleiten. Bei diesen Faktoren handelt es sich um Polypeptidpheromone, die an die Rezeptoren (Ste2 und Ste3) binden, die auf der Zelloberfläche des entgegengesetzten Paarungstyps5 vorhanden sind. Die Bindung der Pheromone an die Rezeptoren initiiert den Pheromon-Antwortweg, den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Signaltransduktionsweg 6,7,8. Dies führt zum Stillstand des Zellzyklus in der G1-Phase, was zu einer metabolisch aktiven stationären Phase9 führt. Die Zellen hören dann auf, sich mitotisch zu teilen, und die für die Paarung notwendigen Proteine werden synthetisiert. Da sich die haploiden Zellen nicht aufeinander zubewegen können, wird ein Paarungsvorsprung oder "Shmoo" auf den Paarungspartner gerichtet. Wenn die Zellen in Kontakt kommen, wird die Zellwand abgebaut und der zytoplasmatische Inhalt verschmilzt, was zur Paarung führt, um eine diploide Zellezu bilden 10,11. Die Paarungseffizienz zwischen Haploiden wurde als Maß für die Artbildung in im Labor entwickelten Stämmen sowie zwischen rezenten Arten verwendet12.

Als einfacher eukaryotischer Organismus ist Hefe das Modell der Wahl für eine Vielzahl von Forschungsfragen im Zusammenhang mit komplexen eukaryotischen Organismen. Eine dieser Fragen ist mit der Artbildung und der Evolution von Fortpflanzungsbarrieren verbunden13,14. Für sich sexuell fortpflanzende Organismen wird eine Art durch das von Ernst Mayr vorgeschlagene biologische Artkonzept (BSC) definiert15. Nach diesem Konzept werden zwei Individuen einer Population als zu zwei verschiedenen Arten gehörend bezeichnet, wenn sie sich nicht kreuzen können und fortpflanzungstechnisch isoliert sind. Der Zusammenbruch des sexuellen Fortpflanzungszyklus (der die Verschmelzung von Gameten zu einer Zygote, die Entwicklung der Zygote zu einer Nachkommenschaft und das Erreichen der Geschlechtsreife bei den Nachkommen umfasst) führt zu reproduktiver Isolation. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ist der Lebenszyklus von S. cerevisiae vergleichbar mit dem sexuellen Fortpflanzungszyklus: a) Die Verschmelzung der beiden Paarungstypen a und α ähnelt der Verschmelzung von Gameten in sich sexuell fortpflanzenden Organismen; b) die Fähigkeit des Diploiden zur mitotischen Teilung ist gleichbedeutend mit der Entwicklung der Zygote zu Nachkommen; und c) die diploide Sporulation ist vergleichbar mit dem Prozess der Gametogenese14.

Eine präzygotische Isolation tritt auf, wenn eine assortative Paarung beobachtet wird. Bei gleicher Chance, sich mit zwei genetisch unterschiedlichen a-Typen zu paaren, paart sich ein α-Typ bevorzugt mit dem einen oder umgekehrt14. Im Falle von Evolutionsexperimenten, in denen Haploide in verschiedenen Umgebungen entwickelt wurden, kann das Vorhandensein einer Prä-Paarungsbarriere durch die Durchführung eines Paarungstests bestimmt werden. Eine Abnahme der Paarungseffizienz im Vergleich zum Vorgänger deutet auf die Evolution einer Barriere vor der Paarung hin. Eine postzygotische Isolierung könnte aufgrund der Unfähigkeit des Diploiden entstehen, eine effektive mitotische Teilung und/oder Sporulation zu durchlaufen, um haploide Sporen zu bilden14. Diese können quantifiziert werden, indem die Wachstumsrate der Diploiden gemessen bzw. die Sporulationseffizienz berechnet wird. Um die Evolution reproduktiver Barrieren zu untersuchen, sind daher robuste Methoden zur Quantifizierung (a) der Paarungseffizienz, (b) des mitotischen Wachstums des Diploiden und (c) der Sporulationseffizienz des Diploiden erforderlich. In dieser Arbeit wird eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz von Hefestämmen vorgestellt.

In Laborexperimenten kann das Auftreten von Paarungen unter anderem durch die Verwendung von auxotrophen Markern nachgewiesen werden, die den Nährstoffbedarf ergänzen. Wenn die beiden Paarungstypen für zwei verschiedene Aminosäuren auxotroph sind, kann nur die diploide Zelle, die durch die Fusion der beiden Paarungstypen gebildet wird, auf einem Medium wachsen, dem beide Aminosäuren fehlen. Daher sind auxotrophe Marker nützlich, um Paarungen sowohl qualitativ als auch quantitativ nachzuweisen. Ein qualitativer Test reicht aus, um den Paarungstyp eines Stammes nach Meiosezu bestimmen 16. Quantitative Tests sind unerlässlich, wenn man daran interessiert ist, eine Verringerung der Paarung zu identifizieren und gleichzeitig die Gene zu untersuchen, die am Paarungsweg beteiligt sind17,18. Da Hefe zunehmend in Artbildungsstudien verwendet wird, ist außerdem ein bequemer und reproduzierbarer Paarungstest erforderlich, da die Quantifizierung der Paarungseffizienz ein Maß für die präzygotische Barriere ist.

Die Paarungseffizienz zwischen den beiden Hefe-Paarungstypen wurde zuvor mit16,19,20 quantifiziert. Die meisten der bisher verwendeten Methoden sind in ihrem Aufbau ähnlich mit einigen Variationen 16,21,22,23,24,25. Einige von ihnen verwenden Kulturen der frühen logarithmischen Phase, während einige andere Kulturen der mittleren logarithmischen Phase haploider Stämme verwenden. Es gibt Variationen in den Verhältnissen, in denen die beiden Steckarten gemischt werden. Fast alle Protokolle verwenden eine Nitrozellulosemembran. Suspensionen beider Paarungstypen aus zuvor gezüchteten Kulturen werden gemischt und auf eine Nitrozellulosemembran filtriert, die auf einer YPD-Platte platziert ist. In einer der Varianten des Protokolls wird die haploide Suspension direkt auf eine YPD-Platte21 geflickt. In Experimenten, die sich mit den Genen befassen, die an der Pheromonproduktion der beiden Paarungstypen beteiligt sind, werden die Pheromone extern hinzugefügt, während die Suspensionen der beiden Paarungstypen24 gebildet werden.

Nach einer Inkubationszeit von einigen Stunden (typischerweise ca. 5 h) nach dem Mischen der Haploide werden die Zellen von der Membran abgewaschen, verdünnt und auf selektiven Medien plattiert. Bei einer der früheren Methoden, über die 1973 berichtet wurde, wurde die Effizienz der Zygotenbildung oder -paarung berechnet, indem die Anzahl der knospenden, nicht knospenden Zellen und Paarungspaare unter einem Mikroskop mit einem Hämozytometergezählt wurde 26. Die meisten Methoden, über die später berichtet wurde, verwenden jedoch auxotrophe Marker, um Haploide und Diploide zu unterscheiden. Die Paarungseffizienz wird berechnet als Prozentsatz der diploiden Zellen im Verhältnis zur Anzahl der diploiden und haploiden Zellen im Zellpool 16,21,23.

Trotz einer Reihe von Berichten, in denen Hefe als Modellorganismus zur Untersuchung der Artbildung verwendet wird, gibt es in der Literatur bisher kein standardisiertes Protokoll zur Berechnung der Effizienz der Paarung. Zellen in der logarithmischen Phase sind möglicherweise nicht ideal für die Quantifizierung der Paarungseffizienz. Während der Paarung wird der Zellzyklus der beiden Haploiden gestoppt, so dass sich die Zellen während der Paarung nicht teilen9. Da auch bekannt ist, dass der Zellzyklus in Zellen in der stationären Phase27 in ähnlicher Weise angehalten wird, kann die Verwendung solcher Zellen das Protokoll reproduzierbarer machen. Stationäre Phasenzellen können gemischt und zur Paarung auf YPD-Platten (d.h. in einer nährstoffreichen Umgebung) ausgelegt werden. Die herkömmlichen Verfahren erfordern zudem eine Nitrozellulose-Membran und das Abwaschen der Zellen, was den Prozess umständlich und anfällig für Handhabungsfehler macht. Darüber hinaus quantifizieren die bisher verwendeten Protokolle die Paarungseffizienz in Form von einem Haploiden. Bei der Messung der reproduktiven Isolation wird die Paarungseffizienz jedoch für eine bestimmte Kombination von Haploiden und nicht für einen einzelnen Haploiden quantifiziert.

Um diese Probleme anzugehen, stellen wir hier eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz in Hefe vor, die hochgradig reproduzierbar und einfach anzuwenden ist. Darüber hinaus können diese Methode und die hier verwendeten Hefestämme auch in Studien eingesetzt werden, die den Einfluss des Genflusses auf die Evolution von Paarungsbarrieren untersuchen.

In dieser Studie wurden zwei verschiedene Stämme von S. cerevisiae verwendet. Einer der Stämme stammt aus dem SK1-Hintergrund; Dies wurde in unserem Labor modifiziert, indem die auxotrophen Marker in der Nähe des MAT-Locus hinzugefügt wurden. Die resultierenden Genotypen der Haploiden sind in Tabelle 128,29,30 dargestellt. Im SK1-Stamm war das TRP1-Gen in der Nähe des MAT-Locus eingefügt, und beim α haploiden hatte das LEU2-Gen in der Nähe des MAT-Locus eingefügt. Im ScAM-Stamm wurden die TRP1- und URA3-Gene in die a- bzw. α-Haploiden eingefügt. Der Ort der Insertion befand sich in der ARS-Region des Chromosoms III (Chr III: 197378..197609). Für das hier beschriebene Protokoll würden auxotrophe Marker an einer beliebigen Stelle des Genoms ausreichen. Da sich die auxotrophen Marker jedoch in der Nähe des MAT-Locus befinden, können diese Stämme auch für Studien verwendet werden, die den Einfluss des Genflusses auf die Artbildung untersuchen31,32. Die Marker wurden in der Nähe des MAT-Locus hinzugefügt, um ein erneutes Mischen der Marker aufgrund von Rekombinationen zu verhindern. Daher kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Paarungseffizienz in Studien mit Artbildung zu quantifizieren und auch um die Veränderung der Paarungseffizienz bei der Untersuchung der am Paarungsweg beteiligten Proteine zu identifizieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ANMERKUNG: Das Protokoll umfasst im Großen und Ganzen die folgenden Schritte: (1) Patchen der Haploiden in den Paarungseffizienzgittern auf einer YPD-Platte, (2) Mischen der Haploiden in gleicher Anzahl nach 24-stündiger Inkubation und Geben der gemischten Haploiden einige Stunden Zeit zur Paarung (7 h in dieser Studie), (3) Ausplattieren der gemischten Zellen auf YPD zur Isolierung einzelner Kolonien nach 7 h bei 30 °C, und schließlich (4) die Bestimmung der Anzahl der gebildeten Diploiden unter Verwendung der auxotrophen Marker. Diese Schritte werden im Folgenden ausführlich erläutert (siehe auch Abbildung 2).

1. Ausbessern von Haploiden in den Paarungseffizienzgittern

  1. Beleben Sie die Haploiden a und α aus Tiefkühlbeständen, indem Sie sie auf eine YPD-Agarplatte (2 % Agar, 2 % Dextrose, 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt) streifen, und lassen Sie sie 48 h bei 30 °C wachsen, um isolierte Einzelkolonien zu erhalten.
  2. Einzelne Kolonien von der YPD-Platte in 5 ml YPD-Medium (2 % Dextrose, 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt) beimpfen und bei 30 °C 48 h unter Schütteln mit 250 U/min inkubieren. Nach dieser Inkubationszeit befinden sich die Zellen in der stationären Wachstumsphase.
  3. Zeichne ein Gitter für die Effizienz der Paarung auf eine frische YPD-Platte. Zeichnen Sie das Raster als 1 cm x 1,5 cm großes Rechteck, das in drei Kästchen unterteilt ist, die jeweils eine Abmessung von 1 cm x 0,5 cm haben, wie in Abbildung 2A dargestellt.
  4. Patch 5 μL der YPD-Kultur der beiden Paarungstypen auf dem Rechteck ganz links und ganz rechts (Abbildung 2B). Dieses Volumen entspricht etwa 5 x 105 haploiden Zellen, die in jedem Abschnitt angeordnet sind. Die Platten 24 h bei 30 °C inkubieren.
    HINWEIS: Der Zweck des Rasters besteht darin, die experimentellen Messungen (z. B. die Anzahl der Zellen im Experiment) präzise zu machen. Die Gittergröße ist klein genug, um experimentell handhabbar zu sein, aber groß genug, dass sie leicht manipuliert werden kann (wie das Anheben von Zellen aus einem Gitter) und nicht anfällig für Drift oder Zufallsereignisse ist.

2. Vermischung von Haploiden und Paarung

ANMERKUNG: Nach 24 Stunden (Abbildung 2C) wird eine gleiche Anzahl von Zellen der beiden haploiden Typen von den beiden Gittern abgekratzt, gemischt und in das mittlere Rechteck gelegt (Abbildung 2D).

  1. Um eine gleiche Anzahl von Zellen zu mischen, entfernen Sie etwa 1/3 des Pflasters, das in die äußeren Schachteln gelegt wurde, mit einem sterilen Zahnstocher und resuspendieren Sie es in 20 μl Wasser in einem sterilen 1,5-ml-Fläschchen für jedes der Haploiden.
  2. Verdünnen Sie 5 μl dieser Suspension in 2 ml Wasser. Messen Sie den OD dieser verdünnten Suspension mit einem Spektralphotometer bei 600 nm. Mischen Sie eine gleiche Anzahl von Zellen aus den beiden Stämmen, basierend auf dem OD-Wert und der Anzahl der Zellen/ml in 1 OD für diesen bestimmten Stamm. Berechnen Sie das Volumen, das gemischt werden muss, und saugen Sie es aus den verbleibenden 15 μl der einzelnen haploiden Suspension ab.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen, die im mittleren Rechteck gepatcht sind, ist so, dass die Zellen eine Monoschicht bilden. Betrachtet man die Hefezelle als Kugel mit einem Radius von 2,58 μm33, so bräuchte ein rechteckiger Kasten von 1 cm x 0,5 cm etwa 1,7 x 106 Zellen, um eine Monoschicht zu bilden. Es sollte darauf geachtet werden, dass es keine physische Berührung zwischen den für die Paarung geflickten Zellen und den beiden haploiden Zellgittern gibt. Da von jedem Typ haploider Zellen gleich viele gemischt werden müssen, werden von jedem Stamm 8,5 x 105 Zellen hinzugefügt. Die Zellzahl wird auf der Grundlage von OD-Messungen berechnet, wobei 1 OD bei 600 nm als ungefähr äquivalent zu 1 x 107 Zellen34 angesehen wird. Wenn beispielsweise der OD600 der haploiden Suspension 0,17 und der der α haploiden 0,11 beträgt, kann die Anzahl der Zellen in 5 μL jeder haploiden Suspension berechnet werden. Um 8,5 x 105 Zellen jedes haploiden Typs zu gewährleisten, werden 1,25 μl der a-haploiden und 1,93 μl der α haploiden Suspensionen gemischt.
  3. Geben Sie die erforderlichen Mengen beider Haploide in eine frische und sterile 1,5-ml-Durchstechflasche und mischen Sie sie mit einer Pipette gut. Das Endvolumen dieser Suspension liegt in der Regel bei etwa 6–8 μL. Patchen Sie diese Suspension in das mittlere Gitter. Die Platte wird 7 h lang bei 30 °C inkubiert, damit die Haploiden genügend Zeit haben, sich zu paaren (Abbildung 2E).

3. Plattierung von gemischten Zellen auf YPD-Agar

  1. Nach der Inkubationszeit von 7 h kratzen Sie die Zellen mit einem Zahnstocher oder einer Pipettenspitze vom mittleren Rechteck ab und verdünnen Sie sie mit 2 ml sterilem Wasser. Verteilen Sie dann die Zellsuspension auf YPD-Agar, um einzelne Kolonien zu erhalten. Um den Verdünnungsfaktor zu bestimmen, der für die Gewinnung einzelner Kolonien erforderlich ist, messen Sie den Außendurchmesser des ersten Röhrchens, in das die geschabten Zellen gegeben werden. Für jeden verwendeten Zelltyp/Stamm müssen spezifische Verdünnungsfaktoren bestimmt werden.
    HINWEIS: Ein OD600 von 0,15 entspricht beispielsweise 3 x 106 Zellen in einer 2-ml-Suspension (unter Berücksichtigung von 1 OD = 1 x 107 Zellen/ml). Um einige hundert Kolonien auf der YPD-Platte zu erhalten, wird die Zellsuspension zweimal im Maßstab 1:20 seriell verdünnt und dann 100 μL der Endverdünnung zum Verteilen verwendet.
  2. Nach dem Ausplattieren werden die YPD-Platten bei 30 °C für 36–48 h inkubiert, bis einzelne Kolonien vorhanden sind. Stellen Sie sicher, dass aus jedem Paarungsexperiment einige hundert einzelne Völker für das Screening gewonnen werden, um sicherzustellen, dass die statistische Signifikanz in den Daten erkannt werden kann (Abbildung 2F).

4. Screening auf Diploide mit auxotrophen Markern

  1. Bestimmen Sie, welcher Anteil der erhaltenen Kolonien diploid ist. Um die diploiden Kolonien auf der Platte zu identifizieren, übertragen Sie die einzelnen Kolonien, indem Sie sie einzeln auf eine doppelte Drop-out-Platte (2 % Glukose, 0,66 % Stickstoffbase, 0,05 % doppelte Drop-out-Aminosäuremischung und 2 % Agar) übertragen, der die Aminosäuren fehlen, für die die Stämme auxotroph sind, wie in Abbildung 2G gezeigt. Die Platten bei 30 °C 48 h inkubieren.
    HINWEIS: Die Kolonien können auch mittels Nachbildung auf die doppelte Ausfallplatte übertragen werden. In dieser Studie wurde Tryptophan und Leucin (trp− leu−) Drop-out-Medium verwendet, um die Paarungseffizienz der SK1AM-Stämme zu quantifizieren, und Tryptophan und Uracil (trp− ura−) Drop-out-Medium wurde für die ScAM-Stämme verwendet. Nur die diploiden Kolonien wachsen auf der doppelten Drop-out-Platte, da sie beide auxotrophen Marker tragen: TRP1- und LEU2-Gene in den SK1AM-Stämmen und TRP1- und URA3-Gene in den ScAM-Stämmen.
  2. Zusätzlich werden die Kolonien auf einzelnen Drop-out-Medien (trp− oder leu− oder ura−) gestreift oder repliziert, um die Häufigkeit jeder der beiden Arten von Haploiden in der Population zu quantifizieren.
  3. Berechnen Sie den Steckwirkungsgrad η wie folgt:
    Equation 1Gl (1)
    wobei die Anzahl der verpaarten Haploiden einfach doppelt so groß ist wie die Anzahl der Diploiden, die auf der doppelten Ausfallplatte identifiziert wurden (da jedes Diploid aus der Paarung zweier Haploiden resultierte). Die Gesamtzahl der Haploiden entspricht der Summe der Anzahl der gestreiften Haploiden plus der doppelten Anzahl der gestreiften Diploiden.
    ANMERKUNG: Wenn z. B. nur 60 Kolonien wachsen, nachdem 100 Kolonien auf einem doppelten Drop-out-Medium plattiert wurden, kann die Paarungseffizienz mit 75 % quantifiziert werden (da sich 60 x 2 Haploide paarten, um die 60 Diploiden zu bilden, und 40 Haploide sich nicht paarten).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Quantifizierung der Steckeffizienz der beiden Steckarten
Das hier beschriebene Protokoll wurde verwendet, um die Paarungseffizienz zwischen zwei Hefestämmen zu quantifizieren - zwischen SK1AM a und SK1AM α und zwischen ScAMa und ScAMα (Abbildung 3A). In diesen Experimenten wurde die Paarung zwischen den beiden Haploiden mindestens 12 Mal wiederholt. In jeder Wiederholung des Experiments wurden mindestens 100 Kolonien auf doppelten Drop-out-Medien gestreift. Die Robustheit des Protokolls ermöglichte eine einfache Unterscheidung der Paarungseffizienz zwischen den beiden Stämmen SK1AM und ScAM. Während die SK1-Stämme mit einem sehr hohen Wirkungsgrad gepaart wurden, paarten sich die ScAM-Stämme mit einem relativ geringeren Wirkungsgrad (Abbildung 3A). Dies ist vielleicht nicht verwunderlich, da die ScAM-Stämme aus einer Hybridpaarung zwischen den Stämmen S. cerevisiae und S. carlsbergensis stammen35.

Neben der Unterscheidung der Paarungseffizienz zwischen den Stämmen kann diese Methode auch verwendet werden, um die Unterschiede in der Paarungseffizienz der Stämme in verschiedenen Umgebungen zu quantifizieren. Wie in Abbildung 3B gezeigt, sank die Paarungseffizienz der ScAM-Stämme signifikant, wenn die Umgebung keine Glukose als primäre Kohlenstoffquelle enthielt. Die Paarung ist ein energetisch teurer Prozess, und das Wachstum auf alternativen Kohlenstoffquellen verringert qualitativ die Effizienz der Paarung.

Dynamik der Steckwirkung
Die hohe Wiederholgenauigkeit des Verfahrens ermöglicht es auch, die Dynamik der Steckeffizienz zu verfolgen. Wenn man sie für verschiedene Zeiträume paaren durfte (Abbildung 3C), wurde in den ersten 4-5 Stunden keine Paarung beobachtet; Die ersten Diploiden traten erst nach dieser Dauer auf. Vermutlich ist dies die Zeit, die benötigt wird, um den Paarungsprozess in der gegebenen Umgebung abzuschließen. Danach stieg die Paarungseffizienz rapide an. Nach 7 Stunden werden die Berechnungen der Paarungseffizienz jedoch durch die Tatsache beeinflusst, dass das mitotische Wachstum auf der Platte beginnt. Die Identifizierung und Selektion von frühen oder späten Diploiden auf diese Weise kann die Planung von Experimenten ermöglichen, die darauf abzielen, eine schnelle oder verzögerte Paarung zwischen Haploiden zu entwickeln. Der genaue Zeitpunkt, zu dem die Steckeffizienz ihren Höhepunkt erreicht, ist für jede Dehnung variabel. Zum Beispiel haben wir mit Hilfe der Wachstumskinetik experimentell festgestellt, dass der ScAM-Stamm eine geringere Wachstumsrate aufweist als die anderer S. cerevisiae-Stämme (wie SK1), und dies beeinflusst wahrscheinlich auch die Dynamik der Paarung.

Figure 1
Abbildung 1: Lebenszyklus von Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae hat zwei Paarungstypen, a und α, und weist sowohl eine asexuelle als auch eine sexuelle Fortpflanzungsphase auf. Die beiden Paarungstypen teilen sich in Abwesenheit des anderen mitotisch. Wenn sie sich jedoch in der Nähe voneinander befinden, hören sie auf, sich mitotisch zu teilen, und der zelluläre und der Kerninhalt verschmelzen zu einem Diploid. Die diploide Zelle kann sich mitotisch weiter teilen. Bei ungünstigen Bedingungen (Hunger) durchläuft es jedoch eine Meiose, um Sporen zu produzieren, die vier Haploide enthalten. Diese Sporen keimen unter günstigen Bedingungen, um zwei Haploide jeder Art freizusetzen und so den Lebenszyklus abzuschließen. Die Wirksamkeit, mit der sich die beiden Haploiden a und α paaren, wird als Paarungseffizienz bezeichnet. Jede Abnahme dieser Paarungseffizienz deutet auf eine präzygotische Barriere für die Paarung hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 

Figure 2
Abbildung 2: Schritte des Steckeffizienz-Assays . (A) Ein Gitter für die Paarungseffizienz von 1 cm x 1,5 cm, das weiter in Kästchen von jeweils 1 cm x 0,5 cm unterteilt ist, wird auf eine YPD-Platte gezeichnet. (B) Haploide Zellen sind auf die äußersten Kästchen gepatcht. (C) Das Wachstum haploider Zellen nach 24 h bei 30 °C. (D) Ein Drittel der haploiden Flecken wird mit einem Zahnstocher entfernt, in gleicher Zellzahl (basierend auf OD600) gemischt und im mittleren Gitter geflickt. (E) Das Wachstum der im Mittelgitter gepatchten Zellen nach 7 h bei 30 °C. Diese enthält die neu gebildeten Diploiden und die Haploiden, die sich nicht gepaart haben. (F) Isolierte Einzelkolonien, die auf einer YPD-Platte nach der Verdünnung und Plattierung der Zellen erhalten wurden, die aus dem mittleren Gitter gekratzt wurden. Diese Platte wurde bei 30 °C für 36-48 h inkubiert. (G) Um die Anzahl der auf der YPD-Platte vorhandenen Diploiden zu bestimmen, werden die Kolonien auf eine doppelte Drop-out-Platte ohne Tryptophan und Leucin überführt. Auf dieser Platte können nur Diploide wachsen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Paarungseffizienz der Hefestämme. (A) Die Paarungseffizienz der beiden haploiden Stämme a und α der Stämme SK1 und ScAM auf einer YPD-Platte. (B) Die Paarungseffizienz der beiden Haploiden a und α des ScAM-Stammes auf YP-Platten mit 2 % Galaktose und auf Glycerin/Laktat-Platten. (C) Die Dynamik der Paarung im ScAM-Stamm in einer Glukoseumgebung. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD aus 12 unabhängigen Wiederholungen angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Stämme Genotyp Kommentar Referenz
SK1AMa  ars314::TRP1, MATa, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG Diese Sorte hat das TRP1-Gen und kann daher in Abwesenheit von Tryptophan in den Medien wachsen.
SK1AMα ars314::LEU2, MATalpha, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG Diese Sorte hat das LEU2-Gen und kann daher in Abwesenheit von Leucin in den Medien wachsen.
ScAMa ars314::TRP1, MATa, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII ura3‐52 Diese Sorte hat das TRP1-Gen und kann daher in Abwesenheit von Tryptophan in den Medien wachsen. Abgeleitet von ScPJB644a in Referenz 28
ScAMα ars314::URA3, MATalpha, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII, ura3‐52 Diese Sorte hat das URA3-Gen und kann daher in Abwesenheit von Uracil in den Medien wachsen. Abgeleitet von ScPJB644α in Referenz 28

Tabelle 1: Genotypen der in dieser Studie verwendeten S. cerevisiae-Stämme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die Quantifizierung der Paarungseffizienz in S. cerevisiae ist essentiell für die Durchführung von Studien zu den Genen, die an Paarungswegen beteiligt sind, oder für die Untersuchung des Einflusses der äußeren Umgebung auf das Paarungsverhalten. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich S. cerevisiae auch zu einem beliebten Modell entwickelt, um Fragen im Zusammenhang mit der Artbildung zu beantworten 14,36,37,38. Das Vorhandensein von zwei Paarungstypen und die einfache genetische Manipulation und Wartung in Laborumgebungen haben ihn zu einem geeigneten Organismus gemacht, um die Evolution von Fortpflanzungsbarrieren in Echtzeit zu untersuchen. Die Quantifizierung der Paarungseffizienz ist von entscheidender Bedeutung, da sie ein Maß für die präzygotische Fortpflanzungsbarriere liefert. Daher ist ein komfortables Protokoll mit hoher Reproduzierbarkeit erforderlich.

Mit Hilfe des obigen Protokolls wurde die Paarungseffizienz von zwei verschiedenen Stämmen quantifiziert, die ein völlig unterschiedliches Paarungsverhalten aufweisen. Daher kann das Protokoll auf jeden Stamm angewendet werden, da die meisten Laborhefestämme Auxotrophien tragen, die für die Selektion verwendet werden können39. Bei der Verwendung dieses Protokolls gibt es jedoch einige wichtige Überlegungen. Die Zeitdauer, die die initialen YPD-Kulturen benötigen, um die stationäre Phase zu erreichen, ist stammabhängig. Ein langsam wachsender Stamm kann mehr als 48 Stunden Inkubationszeit bei 30 °C benötigen. Das Volumen der zu mischenden Haploide wird anhand von OD-Messungen in einem Spektralphotometer berechnet. Der in der Literatur angegebene Wert liegt in der Größenordnung von 107 Zellen/ml für 1 OD34; Es ist jedoch besser, diesen Wert für eine bestimmte Dehnung zu charakterisieren, indem ein Diagramm von OD im Vergleich zur Anzahl der Zellen verwendet wird. Das Volumen, das erforderlich ist, um die Vermischung einer gleichen Anzahl von Zellen zu gewährleisten, kann auf der Grundlage des OD-Wertes und der Anzahl der Zellen/ml in 1 OD berechnet werden, die sich aus der Charakterisierung der Dehnung ergeben. Man sollte darauf achten, dass die Zellen, die nach dem Mischen der Haploide im mittleren Gitter gepatcht werden, grob eine Monolage bilden, die nicht sehr dick ist. Man muss auch darauf achten, dass das zu mischende Volumen etwa 6-8 μl beträgt. Ein höheres Volumen kann zu einer Überlappung mit den haploiden Flecken führen, die sich auf beiden Seiten des mittleren Gitters befinden.

Diese Methode kann auch verwendet werden, um präzygotische Fortpflanzungsbarrieren zwischen ökologischen Hefeisolaten zu untersuchen. Für solche Fälle muss das HO-Endonuklease-Gen jedoch zunächst aus dem Genom des Organismus entfernt werden, da Stämme, die HO-Endonuklease tragen, aufgrund seiner Paarungstyp-Schaltaktivität automatisch Diploide bilden40. Die aus dem sporulierten Diploid isolierten Haploiden können als a oder α identifiziert werden, indem die am MAT-Locus vorhandene Sequenz unter Verwendung der zuvor erwähnten spezifischen Primer identifiziert wird41. Der HO-Marker kann durch zwei verschiedene Antibiotikaresistenzgene als Marker ersetzt werden, um zwischen den beiden haploiden Paarungstypen zu unterscheiden. Dieses Detail hängt von der in der jeweiligen Studie verwendeten Dehnungskonstruktion ab.

Eine der Einschränkungen dieser Methode besteht darin, dass die Verwendung von auxotrophen Markern die Übertragung der Kolonien von der YPD-Platte auf die Drop-out-Platten erfordert. Die Verwendung von Fluoreszenzmarkern zur Unterscheidung zwischen haploiden und diploiden Zellen kann dazu beitragen, die Versuchszeit zu verkürzen. Die Verwendung von Fluoreszenzmarkern kann jedoch die Wachstumsdynamik der Zellen beeinflussen, da zusätzliche Kosten für die Herstellung der fluoreszierenden Proteine anfallen, die somit den metabolischen und physiologischen Zustand einer Zelle verändern können42. Alternativ können die auxotrophen Marker zur Identifizierung der beiden Haploiden durch antibiotische Marker ersetzt werden.

Einige der bisherigen Methoden, die zur Charakterisierung der Paarungseffizienz verwendet wurden, berichten über die Verwendung eines Überschusses einer der Paarungsarten in einem Verhältnis von 10:1 16,21,24. Erfahrungsgemäß führt die Verwendung eines verzerrten Verhältnisses der beiden Haploiden zu einem mitotischen Wachstum des Haploiden im Überschuss. Daher wird bei der aktuellen Methode eine 1:1-Mischung der beiden Haploiden verwendet.

Da die auxotrophen Marker in den in dieser Studie verwendeten Stämmen in der Nähe des MAT-Locus eingefügt werden, unterbricht die Rekombination während der Meiose nicht die Assoziation zwischen dem auxotrophen Marker und dem Paarungstyp. Infolgedessen ändern sich die Auxotrophie und der Paarungstyp eines bestimmten Haploiden nicht, selbst wenn die Stämme eine Meiose durchlaufen dürfen. Dies ermöglicht die Beantwortung von Fragen im Zusammenhang mit dem Einfluss des Genflusses als Variable auf Anpassung und Artbildung43. Insgesamt stellt dieses Protokoll eine einfache und robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz zwischen verschiedenen Hefestämmen dar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte an dieser Arbeit haben. Die Autoren freuen sich, die von SK1 abgeleiteten Stämme für alle gemeinnützigen Zwecke zur Verfügung zu stellen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein DBT/Wellcome Trust (India Alliance) Stipendium (IA/S/19/2/504632) an S.S. P.N. ist ein Research Fellow, der durch ein DBT/Wellcome Trust (India Alliance) Stipendium unterstützt wird (IA/S/19/2/504632). A.M. wird vom Council of Scientific and Industrial Research (CSIR) der indischen Regierung als Senior Research Fellow unterstützt (09/087(0873)/2017-EMR-I). Die Autoren danken Paike Jayadeva Bhat für das Gespräch.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Sigma Life Science A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology SRL 19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR HiMedia GRM1273
D-(+)-glucose Sigma Life Science G8270
Glass Petri plates HiMedia PW008  90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine Sigma Life Science A8094
L-Aspartic acid Sigma Life Science A7219
L-Histidine monochloride monohydrate Sigma Life Science H5659
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Life Science L8912
L-Lysine Aldrich 62840
L-Methionine Sigma Life Science M5308
L-Phenylalanine Sigma Life Science P5482
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tyrosine Sigma Life Science T8566
L-Valine Sigma Life Science V0513
Mating efficiency grid 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes Tarsons 500010
Peptone HiMedia RM001
Uracil Sigma Life Science U0750
Yeast Extract Powder HiMedia RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate BD Difco 233520

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  2. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  3. Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
  4. Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).
  5. Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: How yeast cells do it. Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).
  6. Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).
  7. Bardwell, L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).
  8. Reid, B. J., Hartwell, L. H. Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).
  9. Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production. Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).
  10. Bagnat, M., Simons, K. Cell surface polarization during yeast mating. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).
  11. Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).
  12. Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).
  13. Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology. Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).
  14. Greig, D. Reproductive isolation in Saccharomyces. Heredity. 102 (1), 39-44 (2009).
  15. Mayr, E. Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1999).
  16. Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods in Enzymology. 194, 77-93 (1991).
  17. McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).
  18. Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones. Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).
  19. Maclean, C. J., Greig, D. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).
  20. Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations. Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).
  21. Leu, J. Y., Murray, A. W. Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast. Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).
  22. Kim, J., Hirsch, J. P. A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone. Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).
  23. Jin, M., et al. Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency. Science Signaling. 4 (186), (2011).
  24. Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D. Experimental evolution of species recognition. Current Biology. 25 (13), 1753-1758 (2015).
  25. McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination. Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).
  26. Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (5), 1373-1377 (1973).
  27. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
  28. Johnston, S. A., Hopper, J. E. Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).
  29. Mahilkar, A. Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , Indian Institute of Technology. Bombay, Mumbai. PhD thesis (2021).
  30. Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).
  31. Rice, W. R., Hostert, E. E. Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years. Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).
  32. White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. The past and future of experimental speciation. Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).
  33. Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).
  34. Domitrovic, T., et al. Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance. PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).
  35. Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G. Mendelian inheritance of adaptive enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 30 (11), 346-352 (1944).
  36. Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast. Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).
  37. Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins. EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).
  38. Lee, H. Y., et al. Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species. Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).
  39. Pronk, J. T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).
  40. Madhani, H. D. From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, New York. (2007).
  41. Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).
  42. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  43. Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow. Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).

Tags

Retraction Heft 190 Saccharomyces cerevisiae Paarungseffizienz haploid diploid Pheromone shmoo a/α
Bestimmung der Paarungseffizienz von Haploiden in <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahilkar, A., Nagendra, P., Saini,… More

Mahilkar, A., Nagendra, P., Saini, S. Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (190), e64596, doi:10.3791/64596 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter