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Biology

सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में अगुणित की संभोग क्षमता का निर्धारण

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64596
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

इस काम में, खमीर सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में संभोग दक्षता की मात्रा का ठहराव करने के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन किया गया है। यह विधि विशेष रूप से प्रजातिकरण अध्ययनों में पूर्व-युग्मक बाधाओं की मात्रा का ठहराव करने के लिए उपयोगी है।

Abstract

सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया आनुवंशिकी , विकास और आणविक जीव विज्ञान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल जीव है। हाल के वर्षों में, यह प्रजातिकरण से संबंधित समस्याओं का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव भी बन गया है। खमीर के जीवन चक्र में अलैंगिक और यौन प्रजनन चरण दोनों शामिल हैं। विकास प्रयोगों को करने में आसानी और जीव की छोटी पीढ़ी का समय प्रजनन बाधाओं के विकास के अध्ययन की अनुमति देता है। जिस दक्षता के साथ दो संभोग प्रकार (ए और α) ए / α द्विगुणित बनाने के लिए संभोग करते हैं, उसे संभोग दक्षता के रूप में जाना जाता है। अगुणित के बीच संभोग दक्षता में कोई भी कमी एक पूर्व-युग्मक बाधा को इंगित करती है। इस प्रकार, दो अगुणित के बीच प्रजनन अलगाव की सीमा को निर्धारित करने के लिए, संभोग दक्षता को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत विधि की आवश्यकता होती है। इस अंत में, एक सरल और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल में चार मुख्य चरण शामिल हैं, जिसमें वाईपीडी प्लेट पर अगुणित को पैच करना, अगुणित को समान संख्या में मिलाना, एकल कॉलोनियों के लिए पतला और चढ़ाना और अंत में, ड्रॉप-आउट प्लेट पर कॉलोनियों की संख्या के आधार पर दक्षता की गणना करना शामिल है। ऑक्सोट्रोफिक मार्करों को स्पष्ट रूप से अगुणित और द्विगुणित के बीच अंतर करने के लिए नियोजित किया जाता है।

Introduction

सैकरोमाइसेस सेरेविसिया, जिसे आमतौर पर नवोदित खमीर कहा जाता है, एक एककोशिकीय यूकेरियोट है। इसमें दो संभोग प्रकार हैं, ए और α, और अलैंगिक और यौन प्रजनन चक्र दोनों प्रदर्शित करता है। ए और α संभोग प्रकार अगुणित होते हैं और आसपास के वातावरण में अन्य संभोग प्रकार की अनुपस्थिति में माइटोटिक रूप से विभाजित हो सकते हैं, जो खमीर के अलैंगिक चक्र का प्रतिनिधित्व करता है। जब दो संभोग प्रकार निकटता में होते हैं, तो वे माइटोटिक रूप से विभाजित करना बंद कर देते हैं और एक द्विगुणित कोशिका बनाने के लिए फ्यूज होते हैं। द्विगुणित खमीर या तो माइटोटिक रूप से विभाजित हो सकता है जब पोषक तत्व मौजूद होते हैं या एक खराब कार्बन स्रोत की उपस्थिति में नाइट्रोजन भुखमरी की स्थितियों के तहत अर्धसूत्रीविभाजन से गुजर सकते हैं जो गैर-किण्वित है, जैसे कि एसीटेट1। इसके परिणामस्वरूप बीजाणुओं का निर्माण होता है, जो अनुकूल विकास की स्थिति होने तक निष्क्रिय रहते हैं। जीवन चक्र तब पूरा होता है जब ये बीजाणु अंकुरित होते हैं और दो अगुणित प्रकार अगुणित पूल 2,3 (चित्रा 1) में वापस जारी किए जाते हैं।

खमीर कोशिकाओं के संभोग में कई चरण शामिल हैं, जैसे कि एग्लूटीनेशन, एक संभोग प्रक्षेपण या "शमू" का गठन, इसके बाद सेल और परमाणु संलयन 4,5। संभोग शुरू करने के लिए दो संभोग प्रकार ए और α क्रमशः ए-फैक्टर और α-फैक्टर का उत्पादन करते हैं। ये कारक पॉलीपेप्टाइड फेरोमोन हैं जो विपरीत संभोग प्रकार5 की कोशिका सतह पर मौजूद रिसेप्टर्स (स्टे 2 और स्टे 3) से बंधते हैं। रिसेप्टर्स के लिए फेरोमोन का बंधन फेरोमोन प्रतिक्रिया मार्ग, माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एमएके) सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्ग 6,7,8 शुरू करता है। इसके परिणामस्वरूप जी 1 चरण में कोशिका चक्र की गिरफ्तारी होती है, जिससे चयापचय रूप से सक्रिय स्थिर चरण9 होता है। कोशिकाएं तब माइटोटिक रूप से विभाजित करना बंद कर देती हैं, और संभोग के लिए आवश्यक प्रोटीन संश्लेषित होते हैं। चूंकि अगुणित कोशिकाएं एक-दूसरे की ओर नहीं बढ़ सकती हैं, इसलिए एक संभोग प्रक्षेपण या "शमू" को संभोग साथी की ओर निर्देशित किया जाता है। जब कोशिकाएं संपर्क में आती हैं, तो कोशिका भित्ति खराब हो जाती है, और साइटोप्लाज्मिक सामग्री फ्यूज हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप एक द्विगुणित कोशिका10,11 बनाने के लिए संभोग होता है। अगुणित के बीच संभोग दक्षता का उपयोग प्रयोगशाला-विकसित उपभेदों में प्रजातिकरण के माप के रूप में किया गया है, साथ ही साथ मौजूदा प्रजातियों12 के बीच भी किया गया है।

एक साधारण यूकेरियोटिक जीव होने के नाते, खमीर जटिल यूकेरियोटिक जीवों से जुड़े बड़ी संख्या में शोध प्रश्नों के लिए पसंद का मॉडल है। ऐसा ही एक प्रश्न प्रजातिकरण और प्रजनन बाधाओं के विकास से जुड़ा हुआ है13,14. यौन प्रजनन करने वाले जीवों के लिए, एक प्रजाति को अर्न्स्ट मायर15 द्वारा प्रस्तावित जैविक प्रजाति अवधारणा (बीएससी) द्वारा परिभाषित किया गया है। इस अवधारणा के अनुसार, एक आबादी के दो व्यक्तियों को दो अलग-अलग प्रजातियों से संबंधित कहा जाता है यदि वे इंटरब्रीड नहीं कर सकते हैं और प्रजनन रूप से अलग हैं। यौन प्रजनन चक्र का टूटना (जिसमें युग्मनज बनाने के लिए युग्मकों का संलयन शामिल है, एक संतान में युग्मनज का विकास, और संतान में यौन परिपक्वता की प्राप्ति) प्रजनन अलगाव की ओर जाता है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, एस सेरेविसिया का जीवन चक्र यौन प्रजनन चक्र के बराबर है: ए) दो संभोग प्रकारों ए और α का संलयन यौन प्रजनन जीवों में युग्मकों के संलयन के समान है; बी) माइटोटिक विभाजन से गुजरने के लिए द्विगुणित की क्षमता संतान में विकसित होने वाले युग्मनज के बराबर है; और ग) स्पोरुलेशन से गुजरने वाला द्विगुणित युग्मकजनन की प्रक्रिया के बराबर है।

पूर्व-युग्मक अलगाव तब होता है जब संभोग देखा जाता है। आनुवंशिक रूप से भिन्न दो प्रकारों के साथ संभोग करने का समान अवसर दिया जाता है , एक α प्रकार अधिमानतः एक के साथ दूसरे के साथ संभोग करता है या इसके विपरीत14। विकास प्रयोगों के मामले में जिसमें विभिन्न वातावरणों में अगुणित विकसित हुए हैं, एक संभोग परख का प्रदर्शन करके पूर्व-संभोग बाधा की उपस्थिति निर्धारित की जा सकती है। पूर्वज की तुलना में संभोग दक्षता में कमी एक पूर्व-संभोग बाधा के विकास को इंगित करती है। पोस्ट-जाइगोटिक अलगाव द्विगुणित की अक्षमता के कारण उत्पन्न हो सकता है जो प्रभावी माइटोटिक विभाजन से गुजरने में असमर्थता और / या अगुणित बीजाणुओंको बनाने के लिए स्पोरुलेशन करता है। इन्हें क्रमशः द्विगुणित की वृद्धि दर को मापकर और स्पोरुलेशन दक्षता की गणना करके निर्धारित किया जा सकता है। इसलिए, प्रजनन बाधाओं के विकास का अध्ययन करने के लिए, (ए) संभोग दक्षता, (बी) द्विगुणित की माइटोटिक वृद्धि, और (सी) द्विगुणित की स्पोरुलेशन दक्षता को निर्धारित करने के लिए मजबूत तरीकों की आवश्यकता होती है। इस काम में, खमीर उपभेदों की संभोग दक्षता को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत विधि की सूचना दी गई है।

प्रयोगशाला प्रयोगों में, संभोग की घटना का पता लगाने के तरीकों में से एक ऑक्सोट्रोफिक मार्करों का उपयोग करके है जो पोषण संबंधी आवश्यकताओं के पूरक हैं। जब दो संभोग प्रकार दो अलग-अलग अमीनो एसिड के लिए ऑक्सोट्रोफिक होते हैं, तो केवल दो संभोग प्रकारों के संलयन द्वारा गठित द्विगुणित कोशिका दोनों अमीनो एसिड में कमी वाले माध्यम पर बढ़ सकती है। इस प्रकार, ऑक्सोट्रोफिक मार्कर गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से संभोग का पता लगाने के लिए उपयोगी हैं। अर्धसूत्रीविभाजन16 के बाद तनाव के संभोग प्रकार की पहचान करने के लिए एक गुणात्मक परीक्षण पर्याप्त होगा। मात्रात्मक परीक्षण आवश्यक हैं जब कोई संभोग मार्ग17,18 में शामिल जीन का अध्ययन करते समय संभोग में कमी की पहचान करने में रुचि रखता है। इसके अलावा, प्रजातिकरण अध्ययनों में खमीर का तेजी से उपयोग किया जा रहा है, एक सुविधाजनक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संभोग परख आवश्यक है, क्योंकि संभोग दक्षता का परिमाणीकरण पूर्व-युग्मक बाधा का एक उपाय है।

दो खमीर संभोग प्रकारों के बीच संभोग दक्षता को पहले 16,19,20 निर्धारित किया गया है। पहले इस्तेमाल किए गए अधिकांश तरीके अपने डिजाइन में कुछ विविधताओं के साथ समान हैं 16,21,22,23,24,25। उनमें से कुछ प्रारंभिक लॉग चरण संस्कृतियों का उपयोग करते हैं, जबकि कुछ अन्य अगुणित उपभेदों के मध्य-लॉग चरण संस्कृतियों का उपयोग करते हैं। उन अनुपातों में भिन्नताएं हैं जिनमें दो संभोग प्रकार मिश्रित होते हैं। लगभग सभी प्रोटोकॉल एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली का उपयोग करते हैं। पहले से उगाई गई संस्कृतियों से लिए गए दोनों संभोग प्रकारों के निलंबन को वाईपीडी प्लेट पर रखे नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर मिश्रित और फ़िल्टर किया जाता है। प्रोटोकॉल की विविधताओं में से एक में, अगुणित निलंबन को सीधे वाईपीडी प्लेट21 पर पैच किया जाता है। दो संभोग प्रकारों के फेरोमोन उत्पादन में शामिल जीन से निपटने वाले प्रयोगों में, फेरोमोन को बाहरी रूप से जोड़ा जाता है जबकि दो संभोग प्रकार24 के निलंबन होते हैं।

अगुणित मिश्रण के बाद कुछ घंटों (आमतौर पर लगभग 5 घंटे) के लिए इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को झिल्ली से धोया जाता है, पतला किया जाता है, और चयनात्मक मीडिया पर चढ़ाया जाता है। 1973 में रिपोर्ट की गई पहले की विधियों में से एक में, युग्मनज गठन या संभोग की दक्षता की गणना हेमोसाइटोमीटर26 का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत बुडेड कोशिकाओं, अनब्यूडेड कोशिकाओं और संभोग जोड़े की संख्या की गणना करके की गई थी। हालांकि, बाद में रिपोर्ट किए गए अधिकांश तरीके अगुणित और द्विगुणित को अलग करने के लिए ऑक्सोट्रोफिक मार्करों का उपयोग करते हैं। संभोग दक्षता की गणना सेलुलर पूल 16,21,23 में द्विगुणित और अगुणित कोशिकाओं की संख्या के सापेक्ष द्विगुणित कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में की जाती है।

हालांकि, प्रजातिकरण का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में खमीर का उपयोग करने वाली कई रिपोर्टों के बावजूद, संभोग की दक्षता की गणना के लिए अब तक साहित्य में कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं है। लॉग चरण में कोशिकाएं संभोग दक्षता की मात्रा का ठहराव के लिए आदर्श नहीं हो सकती हैं। संभोग के दौरान, दो अगुणित के कोशिका चक्र को गिरफ्तार किया जाता है, और इसलिए, संभोग के दौरान कोशिकाएं9 विभाजित नहीं होती हैं। चूंकि सेल चक्र को स्थिर चरण27 में कोशिकाओं में इसी तरह गिरफ्तार करने के लिए भी जाना जाता है, ऐसी कोशिकाओं का उपयोग प्रोटोकॉल को अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बना सकता है। स्थिर चरण कोशिकाओं को संभोग के लिए वाईपीडी प्लेटों (यानी, पोषण समृद्ध वातावरण) पर मिश्रित और रखा जा सकता है। पारंपरिक प्रक्रियाओं में नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली और कोशिकाओं को धोने की भी आवश्यकता होती है, जिससे प्रक्रिया बोझिल हो जाती है और त्रुटियों को संभालने के लिए उत्तरदायी हो जाती है। इसके अलावा, आज तक उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल एक अगुणित के संदर्भ में संभोग दक्षता को मापते हैं। हालांकि, प्रजनन अलगाव को मापते समय, संभोग दक्षता को एकल अगुणित के बजाय अगुणित के एक विशेष संयोजन के लिए निर्धारित किया जाता है।

इन मुद्दों को हल करने के लिए, यहां, हम खमीर में संभोग दक्षता की मात्रा का ठहराव करने के लिए एक मजबूत विधि की रिपोर्ट करते हैं जो अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उपयोग करने में आसान है। इसके अलावा, इस विधि और यहां नियोजित खमीर उपभेदों का उपयोग संभोग बाधाओं के विकास पर जीन प्रवाह के प्रभाव की जांच करने वाले अध्ययनों में भी किया जा सकता है।

इस अध्ययन में एस सेरेविसिया के दो अलग-अलग उपभेदों का उपयोग किया गया था। उपभेदों में से एक एसके 1 पृष्ठभूमि से लिया गया है; यह हमारी प्रयोगशाला में एमएटी लोकस के पास ऑक्सोट्रोफिक मार्करों को जोड़कर संशोधित किया गया था। अगुणित के परिणामी जीनोटाइप तालिका 1 28,29,30 में प्रदान किए गए हैं। एसके 1 स्ट्रेन में, एक अगुणित में एमएटी लोकस के पास टीआरपी 1 जीन डाला गया था, और α अगुणित में एलईयू 2 जीन मैट लोकस के पास डाला गया था। एससीएएम स्ट्रेन में, टीआरपी 1 और यूआरए 3 जीन क्रमशः ए और α अगुणित में डाले गए थे। सम्मिलन का स्थान क्रोमोसोम III के ARS क्षेत्र में था (Chr III: 197378..197609)। यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल के लिए, जीनोम पर कहीं भी ऑक्सोट्रोफिक मार्कर पर्याप्त होंगे। हालांकि, एमएटी लोकस के पास ऑक्सोट्रोफिक मार्कर होने का मतलब है कि इन उपभेदों का उपयोगप्रजातिकरण 31,32 पर जीन प्रवाह के प्रभाव की जांच करने वाले अध्ययनों के लिए भी किया जा सकता है। पुनर्संयोजन के कारण मार्करों के फेरबदल को रोकने के लिए मार्करों को एमएटी लोकस के करीब जोड़ा गया था। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रजातिकरण से जुड़े अध्ययनों में संभोग दक्षता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और संभोग मार्ग में शामिल प्रोटीन का अध्ययन करते समय संभोग दक्षता के परिवर्तन की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल में मोटे तौर पर निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (1) वाईपीडी प्लेट पर संभोग दक्षता ग्रिड में अगुणित को पैच करना, (2) इनक्यूबेशन 24 घंटे के बाद अगुणित को समान संख्या में मिलाना और मिश्रित अगुणित को संभोग करने के लिए कुछ घंटे देना (इस अध्ययन में 7 घंटे), (3) 30 डिग्री सेल्सियस पर 7 घंटे के बाद एकल कॉलोनियों को अलग करने के लिए वाईपीडी पर मिश्रित कोशिकाओं को चढ़ाना, और अंत में, (4) ऑक्सोट्रोफिक मार्करों का उपयोग करके गठित द्विगुणित की संख्या का निर्धारण करना। इन चरणों पर नीचे विस्तार से चर्चा की गई है ( चित्र 2 भी देखें)।

1. संभोग दक्षता ग्रिड में अगुणित का पैचिंग

  1. वाईपीडी एगर प्लेट (2% एगर, 2% डेक्सट्रोज, 1% पेप्टोन, 0.5% खमीर निकालने) पर लकीरें लगाकर फ्रीजर स्टॉक से अगुणित ए और α को पुनर्जीवित करें, और उन्हें पृथक एकल उपनिवेश प्राप्त करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे तक बढ़ने की अनुमति दें।
  2. वाईपीडी माध्यम के 5 एमएल (2% डेक्सट्रोज, 1% पेप्टोन, 0.5% खमीर निकालने) में वाईपीडी प्लेट से एकल कॉलोनियों को टीका लगाएं, और 250 आरपीएम झटकों के साथ 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाएं इस इनक्यूबेशन अवधि के बाद विकास के स्थिर चरण में हैं।
  3. एक ताजा वाईपीडी प्लेट पर एक संभोग दक्षता ग्रिड खींचें। ग्रिड को 1 सेमी x 1.5 सेमी आयत के रूप में तीन बक्सों में विभाजित करें, जैसे कि प्रत्येक का आयाम 1 सेमी x 0.5 सेमी है, जैसा कि चित्र 2 ए में दिखाया गया है।
  4. बाईं और दाईं ओर आयताकार पर दो संभोग प्रकारों के वाईपीडी संस्कृति का पैच 5 μL (चित्रा 2B)। यह मात्रा प्रत्येक खंड में रखी गई लगभग 5 x 105 अगुणित कोशिकाओं से मेल खाती है। प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ग्रिड का उद्देश्य प्रयोगात्मक उपायों को सटीक बनाना है (जैसे कि प्रयोग में कोशिकाओं की संख्या)। ग्रिड का आकार इतना छोटा है कि यह प्रयोगात्मक रूप से वापस लेने योग्य है लेकिन इतना बड़ा है कि इसे आसानी से हेरफेर किया जा सकता है (जैसे ग्रिड से कोशिकाओं को उठाना) और बहाव या मौका की घटनाओं के लिए अतिसंवेदनशील नहीं है।

2. अगुणित और संभोग का मिश्रण

नोट: 24 घंटे (चित्रा 2 सी) के बाद, दो अगुणित प्रकारों की कोशिकाओं की एक समान संख्या को दो ग्रिडों से हटा दिया जाता है, मिश्रित किया जाता है, और केंद्र आयत में रखा जाता है (चित्रा 2 डी)।

  1. समान संख्या में कोशिकाओं को मिलाने के लिए, एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करके बाहरी बक्से में रखे गए पैच के लगभग 1/3 को हटा दें, और प्रत्येक अगुणित के लिए बाँझ 1.5 एमएल शीशी में 20 μL पानी में पुन: निलंबित करें।
  2. इस निलंबन के 5 μL को 2 mL पानी में पतला करें। 600 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके इस पतला निलंबन के ओडी को मापें। उस विशेष तनाव के लिए 1 ओडी में ओडी मान और कोशिकाओं / एमएल की संख्या के आधार पर दो उपभेदों से समान संख्या में कोशिकाओं को मिलाएं। मिश्रित होने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें, और इसे व्यक्तिगत अगुणित निलंबन के शेष 15 μL से एस्पिरेट करें।
    नोट: केंद्र आयत में पैच की गई कोशिकाओं की संख्या ऐसी है कि कोशिकाएं एक मोनोलेयर बनाती हैं। खमीर कोशिका को 2.58 μm33 की त्रिज्या वाला एक गोला मानते हुए, 1 सेमी x 0.5 सेमी के आयताकार बॉक्स को मोनोलेयर बनाने के लिए लगभग 1.7 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता होगी। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि संभोग के लिए पैच की गई कोशिकाओं और दो अगुणित सेल ग्रिड के बीच कोई शारीरिक स्पर्श न हो। चूंकि प्रत्येक प्रकार की अगुणित कोशिकाओं की समान संख्या को मिश्रित किया जाना है, इसलिए प्रत्येक तनाव से 8.5 x 105 कोशिकाओं को जोड़ा जाता है। सेल संख्या की गणना ओडी माप के आधार पर की जाती है, 600 एनएम पर 1 ओडी को लगभग 1 x 107 कोशिकाओं34 के बराबर माना जाता है। उदाहरण के लिए, यदि अगुणित निलंबन का ओडी600 0.17 है और α अगुणित का 0.11 है, तो प्रत्येक अगुणित निलंबन के 5 μL में कोशिकाओं की संख्या की गणना की जा सकती है। प्रत्येक अगुणित प्रकार की8.5 x 10 5 कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए, अगुणित के 1.25 μL और α अगुणित निलंबन के 1.93 μL को मिश्रित किया जाता है।
  3. एक ताजा और बाँझ 1.5 एमएल शीशी में दोनों अगुणित के आवश्यक वॉल्यूम जोड़ें, और पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह मिलाएं। इस निलंबन की अंतिम मात्रा आम तौर पर लगभग 6-8 μL होती है। इस निलंबन को केंद्र ग्रिड में पैच करें। प्लेट को 7 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जिससे अगुणित को संभोग करने के लिए पर्याप्त समय मिल सके (चित्रा 2 ई)।

3. वाईपीडी एगर पर मिश्रित कोशिकाओं की चढ़ाना

  1. 7 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के बाद, टूथपिक या पिपेट टिप का उपयोग करके केंद्र आयत से कोशिकाओं को खुरचें, और 2 एमएल बाँझ पानी में पतला करें। फिर, एकल कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए वाईपीडी एगर पर सेल निलंबन फैलाएं। एकल कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने वाले कारक को निर्धारित करने के लिए, पहली ट्यूब के ओडी को मापें जिसमें स्क्रैप कोशिकाओं को जोड़ा जाता है। उपयोग किए जा रहे प्रत्येक सेल प्रकार / तनाव के लिए विशिष्ट कमजोर पड़ने वाले कारकों को निर्धारित करने की आवश्यकता होती है।
    नोट: उदाहरण के लिए, 0.15 का OD600 2 mL निलंबन में 3 x 106 कोशिकाओं से मेल खाता है (1 OD = 1 x 107 कोशिकाओं / mL पर विचार करते हुए)। वाईपीडी प्लेट पर कुछ सौ कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए, सेल निलंबन को दो बार 1:20 पर क्रमिक रूप से पतला किया जाता है, और फिर प्रसार के लिए अंतिम कमजोर पड़ने के 100 μL का उपयोग किया जाता है।
  2. चढ़ाना के बाद, वाईपीडी प्लेटों को 36-48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि एकल उपनिवेश न हों। सुनिश्चित करें कि स्क्रीनिंग के लिए प्रत्येक संभोग प्रयोग से कुछ सौ व्यक्तिगत उपनिवेश प्राप्त किए जाते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि डेटा में सांख्यिकीय महत्व का पता लगाया जा सके (चित्रा 2 एफ)।

4. ऑक्सोट्रोफिक मार्करों का उपयोग करके द्विगुणित के लिए स्क्रीनिंग

  1. निर्धारित करें कि प्राप्त कॉलोनियों का कौन सा अंश द्विगुणित है। प्लेट पर द्विगुणित कॉलोनियों की पहचान करने के लिए, एकल कॉलोनियों को व्यक्तिगत रूप से डबल ड्रॉप-आउट प्लेट (2% ग्लूकोज, 0.66% नाइट्रोजन बेस, 0.05% डबल ड्रॉप-आउट एमिनो एसिड मिश्रण, और 2% एगर) पर स्थानांतरित करें, जिसमें अमीनो एसिड की कमी होती है, जिसके लिए उपभेद ऑक्सोट्रोफिक हैं, जैसा कि चित्र 2 जी में दिखाया गया है। प्लेटों को 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रतिकृति चढ़ाना का उपयोग करके कॉलोनियों को डबल ड्रॉप-आउट प्लेट पर भी स्थानांतरित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, एसके 1 एएम उपभेदों की संभोग दक्षता को निर्धारित करते समय ट्रिप्टोफैन और ल्यूसीन (टीआरपी- ल्यू-) ड्रॉप-आउट माध्यम का उपयोग किया गया था, और ट्रिप्टोफैन और यूरैसिल (टीआरपी- यूआरए-) ड्रॉप-आउट माध्यम का उपयोग एससीएएम उपभेदों के लिए किया गया था। केवल द्विगुणित कॉलोनियां डबल ड्रॉप-आउट प्लेट पर बढ़ती हैं क्योंकि उनके पास दोनों ऑक्सोट्रोफिक मार्कर होते हैं: एसके 1 एएम उपभेदों में टीआरपी 1 और एलईयू 2 जीन और एससीएएम उपभेदों में टीआरपी 1 और यूआरए 3 जीन।
  2. इसके अतिरिक्त, जनसंख्या में दो प्रकार के अगुणित में से प्रत्येक की आवृत्ति को निर्धारित करने के लिए एकल ड्रॉप-आउट मीडिया (टीआरपी - या ल्यू - या यूरा -) पर कॉलोनियों को लकीर या प्रतिकृति प्लेट करें।
  3. संभोग दक्षता की गणना करें, η, निम्नानुसार:
    Equation 1समीकरण (1)
    जहां अगुणित पदार्थों की संख्या डबल ड्रॉप-आउट प्लेट पर पहचाने गए द्विगुणित की संख्या के दोगुने के बराबर है (क्योंकि प्रत्येक द्विगुणित दो अगुणित के संभोग के परिणामस्वरूप होता है)। अगुणित की कुल संख्या अगुणित लकीरों की संख्या के योग के बराबर होती है और द्विगुणित लकीरों की संख्या से दोगुनी होती है।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि डबल ड्रॉप-आउट मीडिया पर 100 कॉलोनियों को लकीर/प्रतिकृति चढ़ाने के बाद केवल 60 कॉलोनियां बढ़ती हैं, तो संभोग दक्षता को 75% के रूप में निर्धारित किया जा सकता है (क्योंकि 60 x 2 अगुणित 60 द्विगुणित बनाने के लिए जुड़े हुए हैं, और 40 अगुणित संभोग नहीं करते हैं)।

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Representative Results

दो संभोग प्रकारों की संभोग दक्षता का परिमाणीकरण
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग दो खमीर उपभेदों के बीच संभोग दक्षता को निर्धारित करने के लिए किया गया था- एसके 1 एएमए और एसके 1 एएमα के बीच और एससीएएमए और एससीएएमα के बीच (चित्रा 3 ए)। इन प्रयोगों में, दो अगुणित के बीच संभोग को कम से कम 12 बार दोहराया गया था। प्रयोग के प्रत्येक दोहराव में, कम से कम 100 कॉलोनियों को डबल ड्रॉप-आउट मीडिया पर खींचा गया था। प्रोटोकॉल की मजबूती ने दो उपभेदों, एसके 1 एएम और एससीएएम के बीच संभोग दक्षता के आसान भेदभाव को सक्षम किया। जबकि एसके 1 उपभेदों को बहुत उच्च दक्षता के साथ जोड़ा गया था, एससीएएम उपभेदों को अपेक्षाकृत कम दक्षता (चित्रा 3 ए) के साथ जोड़ा गया था। यह शायद आश्चर्य की बात नहीं है, क्योंकि एससीएएम उपभेदों की उत्पत्ति एस सेरेविसिया और एस कार्ल्सबर्गेंसिस उपभेदों 35 के बीच संकर संभोग से हुई थी।

उपभेदों के बीच संभोग दक्षता को अलग करने के अलावा, इस विधि का उपयोग विभिन्न वातावरणों में उपभेदों की संभोग दक्षता में अंतर को निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है। जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, एससीएएम उपभेदों की संभोग दक्षता में काफी गिरावट आई जब पर्यावरण में प्राथमिक कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज नहीं था। संभोग एक ऊर्जावान रूप से महंगी प्रक्रिया है, और वैकल्पिक कार्बन स्रोतों पर वृद्धि गुणात्मक रूप से संभोग की दक्षता को कम करती है।

संभोग दक्षता की गतिशीलता
विधि की उच्च पुनरावृत्ति भी संभोग दक्षता की गतिशीलता को ट्रैक करने की अनुमति देती है। जब अलग-अलग समय अवधि (चित्रा 3 सी) के लिए संभोग करने की अनुमति दी गई, तो पहले 4-5 घंटे के लिए कोई संभोग नहीं देखा गया; इस अवधि के बाद ही पहला द्विगुणित दिखाई दिया। संभवतः, यह दिए गए वातावरण में संभोग प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक समय है। इसके बाद, संभोग दक्षता तेजी से बढ़ी। हालांकि, 7 घंटे से परे, संभोग दक्षता गणना इस तथ्य से प्रभावित होती है कि प्लेट पर माइटोटिक विकास होना शुरू हो जाता है। इस तरह से प्रारंभिक या देर से द्विगुणित की पहचान और चयन उन प्रयोगों के डिजाइन की अनुमति दे सकता है जिनका उद्देश्य अगुणित के बीच तेजी से या विलंबित संभोग विकसित करना है। सटीक समय जिस पर संभोग दक्षता चरम पर होती है, प्रत्येक तनाव के लिए परिवर्तनशील होती है। उदाहरण के लिए, विकास कैनेटीक्स का उपयोग करके, हमने प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया कि एससीएएम तनाव अन्य एस सेरेविसिया उपभेदों (जैसे एसके 1) की तुलना में कम वृद्धि दर प्रदर्शित करता है, और यह संभवतः संभोग की गतिशीलता को भी प्रभावित करता है।

Figure 1
चित्र 1: सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया का जीवन चक्र। सेरेविसिया में दो संभोग प्रकार हैं, ए और α, और अलैंगिक और यौन प्रजनन चरणदोनों को प्रदर्शित करता है। दो संभोग प्रकार, दूसरे की अनुपस्थिति में, माइटोटिक रूप से विभाजित होते हैं। हालांकि, जब वे एक-दूसरे के आसपास के क्षेत्र में मौजूद होते हैं, तो वे माइटोटिक रूप से विभाजित करना बंद कर देते हैं, और सेलुलर और परमाणु सामग्री एक द्विगुणित बनाने के लिए फ्यूज हो जाती है। द्विगुणित कोशिका आगे माइटोटिक रूप से विभाजित कर सकती है। हालांकि, प्रतिकूल परिस्थितियों (भुखमरी) की उपस्थिति में, यह चार अगुणित युक्त बीजाणुओं का उत्पादन करने के लिए अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरता है। ये बीजाणु अनुकूल परिस्थितियों में अंकुरित होते हैं ताकि प्रत्येक प्रकार के दो अगुणित को छोड़ा जा सके, इस प्रकार जीवन चक्र पूरा हो सके। प्रभावकारिता जिसके साथ दो अगुणित ए और α साथी को संभोग दक्षता के रूप में जाना जाता है। इस संभोग दक्षता में कोई भी कमी संभोग के लिए एक पूर्व-युग्मक बाधा को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 

Figure 2
चित्र 2: संभोग दक्षता परख में शामिल चरण। (A) 1 सेमी x 1.5 सेमी का एक संभोग दक्षता ग्रिड, जिसे आगे 1 सेमी x 0.5 सेमी के बक्से में विभाजित किया गया है, को वाईपीडी प्लेट पर खींचा जाता है। (बी) अगुणित कोशिकाओं को चरम बक्से पर पैच किया जाता है। (C) 30 °C पर 24 घंटे के बाद अगुणित कोशिकाओं की वृद्धि। (डी) अगुणित पैच के एक तिहाई को टूथपिक का उपयोग करके हटा दिया जाता है, समान सेल संख्या (ओडी600 के आधार पर) में मिलाया जाता है, और केंद्र ग्रिड में पैच किया जाता है। (ई) 30 डिग्री सेल्सियस पर 7 घंटे के बाद केंद्र ग्रिड में पैच की गई कोशिकाओं की वृद्धि। इसमें नए द्विगुणित और अगुणित शामिल हैं जो जुड़े नहीं हैं। (एफ) केंद्र ग्रिड से स्क्रैप की गई कोशिकाओं के कमजोर पड़ने और चढ़ाना के बाद वाईपीडी प्लेट पर प्राप्त पृथक एकल कॉलोनियां। (जी) वाईपीडी प्लेट पर मौजूद द्विगुणित की संख्या की पहचान करने के लिए, कॉलोनियों को ट्रिप्टोफैन और ल्यूसीन की कमी वाली डबल ड्रॉप-आउट प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है। इस प्लेट पर केवल द्विगुणित बढ़ सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: खमीर उपभेदों की संभोग दक्षता। (A) एक YPD प्लेट पर SK1 और ScAM उपभेदों के दो अगुणित a और α की संभोग दक्षता। (बी) वाईपी प्लेटों पर एससीएएम स्ट्रेन के दो अगुणित ए और α की संभोग क्षमता जिसमें 2% गैलेक्टोज और ग्लिसरॉल / लैक्टेट प्लेटें होती हैं। (ग) ग्लूकोज वातावरण में एससीएएम तनाव में संभोग की गतिशीलता। परिणामों को 12 स्वतंत्र दोहराव से एसडी ± औसत के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

उपभेदों जीनोटाइप टिप्पणी संदर्भ
SK1AMa  ars314::TRP1, MATA, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2:: hisG, his3::hisG, trp1::hisG इस स्ट्रेन में टीआरपी 1 जीन होता है और इसलिए मीडिया में ट्रिप्टोफैन की अनुपस्थिति में बढ़ सकता है।
SK1AMα ars314::LEU2, MATalpha, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2:: hisG, his3::hisG, trp1::hisG इस तनाव में एलईयू 2 जीन है और इसलिए मीडिया में ल्यूसीन की अनुपस्थिति में बढ़ सकता है।
ScAMA ars314:: TRP1, MATA, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII ura3-52 इस स्ट्रेन में टीआरपी 1 जीन होता है और इसलिए मीडिया में ट्रिप्टोफैन की अनुपस्थिति में बढ़ सकता है। संदर्भ 28 में ScPJB644a से लिया गया
SCAMα ars314::URA3, MATalpha, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII, ura3-52 इस स्ट्रेन में यूआरए 3 जीन है और इसलिए मीडिया में यूरैसिल की अनुपस्थिति में बढ़ सकता है। संदर्भ 28 में ScPJB644 से व्युत्पन्न

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एस सेरेविसिया उपभेदों के जीनोटाइप।

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Discussion

संभोग मार्गों में शामिल जीन से संबंधित अध्ययन करने या संभोग व्यवहार पर बाहरी वातावरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एस सेरेविसिया में संभोग दक्षता का परिमाणीकरण आवश्यक है। पिछले दो दशकों में, एस सेरेविसिया 14,36,37,38 प्रजातिकरण से संबंधित प्रश्नों को संबोधित करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल भी बन गया है। दो संभोग प्रकारों की उपस्थिति और प्रयोगशाला वातावरण में आनुवंशिक हेरफेर और रखरखाव की आसानी ने इसे वास्तविक समय में प्रजनन बाधाओं के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त जीव बना दिया है। संभोग दक्षता का परिमाणीकरण आवश्यक है क्योंकि यह पूर्व-युग्मक प्रजनन बाधा का एक उपाय देता है। इसलिए, उच्च प्रजनन क्षमता के साथ एक सुविधाजनक प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।

उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, दो अलग-अलग उपभेदों की संभोग दक्षता जो पूरी तरह से अलग संभोग व्यवहार दिखाती है, को परिमाणित किया गया था। इसलिए, प्रोटोकॉल को किसी भी तनाव पर लागू किया जा सकता है, क्योंकि अधिकांश प्रयोगशाला खमीर उपभेदों में ऑक्सोट्रॉफी होती है जिसका उपयोग चयन के लिए किया जा सकताहै। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय कुछ महत्वपूर्ण विचार हैं। स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए प्रारंभिक वाईपीडी संस्कृतियों के लिए आवश्यक समय अवधि तनाव पर निर्भर है। धीमी गति से बढ़ने वाले तनाव को 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे इनक्यूबेशन से अधिक की आवश्यकता हो सकती है। मिश्रित किए जाने वाले अगुणित की मात्रा की गणना स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में ओडी माप के आधार पर की जाती है। साहित्य में रिपोर्ट किया गया मान 1 ओडी34 के लिए 107 कोशिकाओं / एमएल के क्रम में है; हालांकि, कोशिकाओं की संख्या बनाम ओडी के प्लॉट का उपयोग करके किसी विशेष तनाव के लिए इस मूल्य को चिह्नित करना बेहतर है। कोशिकाओं की समान संख्या के मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना ओडी मान और 1 ओडी में कोशिकाओं / एमएल की संख्या के आधार पर की जा सकती है, जो तनाव के लक्षण वर्णन से प्राप्त होती है। यह सुनिश्चित करना चाहिए कि अगुणित मिश्रण के बाद केंद्र ग्रिड में पैच की जा रही कोशिकाएं मोटे तौर पर एक मोनोलेयर बनाती हैं जो बहुत मोटी नहीं होती है। यह भी सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि मिश्रित होने वाली मात्रा लगभग 6-8 μL है। एक उच्च मात्रा से अगुणित पैच के साथ ओवरलैपिंग हो सकती है जो केंद्र ग्रिड के दोनों ओर हैं।

इस विधि का उपयोग खमीर के पारिस्थितिक आइसोलेट्स के बीच पूर्व-युग्मक प्रजनन बाधाओं का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, ऐसे मामलों के लिए, एचओ एंडोन्यूक्लिज़ जीन को पहले जीव के जीनोम से हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि एचओ एंडोन्यूक्लिज़ ले जाने वाले उपभेद इसकी संभोग-प्रकार स्विचिंग गतिविधि40 के कारण स्वचालित रूप से द्विगुणित बनाते हैं। स्पोरुलेटेड द्विगुणित से अलग किए गए अगुणित को पहले उल्लिखित विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके मैट लोकस में मौजूद अनुक्रम की पहचान करके एक या α के रूप में पहचाना जा सकता है। एचओ मार्कर को दो अगुणित संभोग प्रकारों के बीच अंतर करने के लिए मार्कर के रूप में दो अलग-अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यह विवरण विशेष अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले तनाव निर्माण पर निर्भर करता है।

इस विधि की सीमाओं में से एक यह है कि ऑक्सोट्रोफिक मार्करों के उपयोग के लिए कॉलोनियों को वाईपीडी प्लेट से ड्रॉप-आउट प्लेटों में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है। अगुणित और द्विगुणित कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए प्रतिदीप्ति मार्करों का उपयोग प्रयोगात्मक समय को कम करने में मदद कर सकता है। हालांकि, प्रतिदीप्ति मार्करों का उपयोग कोशिकाओं की विकास गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उत्पादन में एक अतिरिक्त लागत शामिल है, जो इस प्रकार, सेल की चयापचय और शारीरिक स्थिति को बदल सकतीहै। वैकल्पिक रूप से, दो अगुणित की पहचान करने के लिए ऑक्सोट्रोफिक मार्करों को एंटीबायोटिक मार्करों द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

संभोग दक्षता के लक्षण वर्णन के लिए उपयोग की जाने वाली पिछली विधियों में से कुछ 10: 1 16,21,24 के अनुपात में संभोग प्रकारों में से एक की अधिकता के उपयोग की रिपोर्ट करती हैं। अनुभव से, दो अगुणित के पक्षपाती अनुपात के उपयोग के परिणामस्वरूप अगुणित की माइटोटिक वृद्धि अधिक होती है। इसलिए, वर्तमान विधि दो अगुणित के 1: 1 मिश्रण का उपयोग करती है।

चूंकि इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उपभेदों में ऑक्सोट्रोफिक मार्करों को मैट लोकस के करीब डाला जाता है, अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान पुनर्संयोजन ऑक्सोट्रोफिक मार्कर और संभोग प्रकार के बीच संबंध को नहीं तोड़ता है। नतीजतन, एक विशेष अगुणित के ऑक्सोट्रॉफी और संभोग प्रकार में परिवर्तन नहीं होता है, भले ही उपभेदों को अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरने की अनुमति दी जाए। यह अनुकूलन और प्रजातिकरण43 पर एक चर के रूप में जीन प्रवाह के प्रभाव से संबंधित सवालों के जवाब देने की अनुमति देता है। इस प्रकार, कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल विभिन्न खमीर उपभेदों के बीच संभोग क्षमता को निर्धारित करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि प्रस्तुत करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास इस काम में कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं। लेखक सभी गैर-लाभकारी उपयोग के लिए एसके 1-व्युत्पन्न उपभेदों को साझा करने में प्रसन्न हैं।

Acknowledgments

इस कार्य को डीबीटी/वेलकम ट्रस्ट (इंडिया एलायंस) अनुदान (आईए/एस/19/2/504632) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो डीबीटी/वेलकम ट्रस्ट (इंडिया एलायंस) अनुदान (आईए/एस/19/2/504632) द्वारा समर्थित एक रिसर्च फेलो है। एएम को वैज्ञानिक और औद्योगिक अनुसंधान परिषद (सीएसआईआर), भारत सरकार द्वारा एक वरिष्ठ रिसर्च फेलो (09/087 (0873)/2017-ईएमआर-आई) के रूप में समर्थित किया गया है। लेखक चर्चा के लिए पाइके जयदेव भट को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Sigma Life Science A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology SRL 19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR HiMedia GRM1273
D-(+)-glucose Sigma Life Science G8270
Glass Petri plates HiMedia PW008  90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine Sigma Life Science A8094
L-Aspartic acid Sigma Life Science A7219
L-Histidine monochloride monohydrate Sigma Life Science H5659
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Life Science L8912
L-Lysine Aldrich 62840
L-Methionine Sigma Life Science M5308
L-Phenylalanine Sigma Life Science P5482
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tyrosine Sigma Life Science T8566
L-Valine Sigma Life Science V0513
Mating efficiency grid 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes Tarsons 500010
Peptone HiMedia RM001
Uracil Sigma Life Science U0750
Yeast Extract Powder HiMedia RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate BD Difco 233520

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References

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वापसी अंक 190 सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया संभोग दक्षता अगुणित द्विगुणित फेरोमोन शमू ए / α
<em>सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया</em> में अगुणित की संभोग क्षमता का निर्धारण
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Mahilkar, A., Nagendra, P., Saini,… More

Mahilkar, A., Nagendra, P., Saini, S. Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (190), e64596, doi:10.3791/64596 (2022).

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