Summary
I detta arbete beskrivs en robust metod för kvantifiering av parningseffektivitet i jästen Saccharomyces cerevisiae . Denna metod är särskilt användbar för kvantifiering av prezygotiska barriärer i specieringsstudier.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae är en allmänt använd modellorganism inom genetik, evolution och molekylärbiologi. Under de senaste åren har det också blivit en populär modellorganism för att studera problem relaterade till artbildning. Jästens livscykel involverar både asexuella och sexuella reproduktionsfaser. Lätt att utföra evolutionsexperiment och organismens korta generationstid möjliggör studier av utvecklingen av reproduktionsbarriärer. Effektiviteten med vilken de två parningstyperna (a och α) parar sig för att bilda a / α diploida kallas parningseffektivitet. Varje minskning av parningseffektiviteten mellan haploider indikerar en pre-zygotisk barriär. För att kvantifiera omfattningen av reproduktiv isolering mellan två haploider krävs därför en robust metod för att kvantifiera parningseffektiviteten. För detta ändamål presenteras ett enkelt och mycket reproducerbart protokoll här. Protokollet innefattar fyra huvudsteg, som inkluderar lappning av haploiderna på en YPD-platta, blandning av haploiderna i lika antal, utspädning och plätering för enskilda kolonier och slutligen beräkning av effektiviteten baserat på antalet kolonier på en bortfallsplatta. Auxotrofa markörer används för att tydligt skilja mellan haploider och diploider.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae, vanligen kallad spirande jäst, är en encellig eukaryot. Den har två parningstyper, en och α, och uppvisar både asexuella och sexuella reproduktionscykler. Parningstyperna a och α är haploider och kan dela sig mitotiskt i frånvaro av den andra parningstypen i den omgivande miljön, vilket representerar jästens asexuella cykel. När de två parningstyperna är i närheten, slutar de dela mitotiskt och smälter samman för att bilda en diploid cell. Den diploida jästen kan antingen dela mitotiskt när näringsämnen är närvarande eller genomgå meios under kvävehushållningsförhållandena i närvaro av en dålig kolkälla som inte kan jäsas, såsom acetat1. Detta resulterar i bildandet av sporer, som förblir vilande tills det finns gynnsamma tillväxtförhållanden. Livscykeln är avslutad när dessa sporer gror och de två haploida typerna släpps tillbaka till den haploida poolen 2,3 (figur 1).
Parningen av jästceller innefattar flera steg, såsom agglutination, bildandet av en parningsprojektion eller "shmoo", följt av cell- och kärnfusion 4,5. De två parningstyperna a och α producerar a-faktor respektive α-faktor för att initiera parning. Dessa faktorer är polypeptidferomoner som binder till receptorerna (Ste2 och Ste3) närvarande på cellytan av motsatt parningstyp5. Bindningen av feromonerna till receptorerna initierar feromonresponsvägen, den mitogenaktiverade proteinkinas (MAPK) signaltransduktionsvägen 6,7,8. Detta resulterar i arrestering av cellcykeln i G1-fasen, vilket leder till en metaboliskt aktiv stationär fas9. Cellerna slutar sedan dela mitotiskt, och proteinerna som krävs för parning syntetiseras. Eftersom de haploida cellerna inte kan röra sig mot varandra, riktas en parningsprojektion eller "shmoo" mot parningspartnern. När cellerna kommer i kontakt bryts cellväggen ned och det cytoplasmatiska innehållet smälter, vilket resulterar i parning för att bilda en diploid cell10,11. Parningseffektiviteten mellan haploider har använts som ett mått på artbildning i laboratorieutvecklade stammar, liksom mellan befintliga arter12.
Att vara en enkel eukaryot organism är jäst den valda modellen för ett stort antal forskningsfrågor associerade med komplexa eukaryota organismer. En sådan fråga är förknippad med artbildning och utvecklingen av reproduktionsbarriärer13,14. För sexuellt reproducerande organismer definieras en art av det biologiska artbegreppet (BSC) som föreslagits av Ernst Mayr15. Enligt detta koncept sägs två individer i en population tillhöra två olika arter om de inte kan korsas och är reproduktivt isolerade. Uppdelning av den sexuella reproduktionscykeln (som involverar fusion av gameter för att bilda en zygot, utvecklingen av zygoten till en avkomma och uppnåendet av sexuell mognad i avkomman) leder till reproduktiv isolering. Som visas i figur 1 är livscykeln för S. cerevisiae jämförbar med den sexuella reproduktionscykeln: a) sammansmältningen av de två parningstyperna a och α liknar fusionen av könsceller i sexuellt reproducerande organismer; b) Diploidens förmåga att genomgå mitotisk uppdelning motsvarar zygoten som utvecklas till avkomma; och c) den diploida som genomgår sporulering är jämförbar med processen för gametogenes14.
Pre-zygotisk isolering uppträder när assortativ parning observeras. Med lika möjligheter att para sig med två genetiskt olika a-typer parar sig en α typ företrädesvis med den ena över den andra eller vice versa14. När det gäller evolutionsexperiment där haploider har utvecklats i olika miljöer kan närvaron av en pre-parningsbarriär bestämmas genom att utföra en parningsanalys. En minskning av parningseffektiviteten jämfört med förfadern indikerar utvecklingen av en förparningsbarriär. Postzygotisk isolering kan uppstå på grund av diploidens oförmåga att genomgå effektiv mitotisk delning och / eller sporulering för att bilda haploida sporer14. Dessa kan kvantifieras genom att mäta tillväxthastigheten hos diploiderna respektive beräkna sporuleringseffektiviteten. För att studera utvecklingen av reproduktionsbarriärer krävs därför robusta metoder för att kvantifiera (a) parningseffektiviteten, (b) den mitotiska tillväxten av diploiden och (c) sporuleringseffektiviteten hos diploiden. I detta arbete rapporteras en robust metod för att kvantifiera parningseffektiviteten hos jäststammar.
I laboratorieexperiment kan ett av de sätt på vilka förekomsten av parning detekteras genom att använda auxotrofa markörer som kompletterar näringsbehovet. När de två parningstyperna är auxotrofa för två olika aminosyror kan endast den diploida cellen som bildas genom fusion av de två parningstyperna växa på ett medium som saknar båda aminosyrorna. Således är auxotrofa markörer användbara för att detektera parning både kvalitativt och kvantitativt. Ett kvalitativt test räcker för att identifiera parningstypen av en stam efter meios16. Kvantitativa tester är viktiga när man är intresserad av att identifiera en minskning av parningen medan man studerar generna som är involverade i parningsvägen17,18. Dessutom, med jäst som alltmer används i specieringsstudier, är en bekväm och reproducerbar parningsanalys nödvändig, eftersom kvantifieringen av parningseffektivitet är ett mått på den pre-zygotiska barriären.
Parningseffektiviteten mellan de två jästparningstyperna har tidigare kvantifierats16,19,20. De flesta av de tidigare använda metoderna är likartade i sin design med några variationer 16,21,22,23,24,25. Några av dem använder tidiga logfaskulturer, medan några andra använder mid-log-faskulturer av haploida stammar. Det finns variationer i förhållandena där de två parningstyperna blandas. Nästan alla protokoll använder ett nitrocellulosamembran. Suspensioner av båda parningstyperna som tas från tidigare odlade kulturer blandas och filtreras på ett nitrocellulosamembran placerat på en YPD-platta. I en av varianterna av protokollet lappas den haploida suspensionen direkt på en YPD-platta21. I experiment som behandlar generna som är involverade i feromonproduktionen av de två parningstyperna, tillsätts feromonerna externt medan suspensionerna av de två parningstyperna24 görs.
Efter inkubation i några timmar (vanligtvis cirka 5 timmar) efter blandning av haploiderna tvättas cellerna bort från membranet, späds ut och pläteras på selektiva medier. I en av de tidigare metoderna som rapporterades 1973 beräknades effektiviteten av zygotbildning eller parning genom att räkna antalet knoppade celler, unbudded celler och parning par under ett mikroskop med hjälp av en hemocytometer26. De flesta metoder som rapporteras senare använder emellertid auxotrofa markörer för att skilja haploider och diploider. Parningseffektivitet beräknas som procentandelen diploida celler i förhållande till antalet diploida och haploida celler i cellpoolen 16,21,23.
Trots ett antal rapporter som använder jäst som modellorganism för att studera artbildning, finns det inget standardiserat protokoll rapporterat i litteraturen förrän nu för att beräkna parningens effektivitet. Celler i logfasen kanske inte är idealiska för kvantifiering av parningseffektivitet. Under parning arresteras cellcykeln hos de två haploiderna, och följaktligen delar cellerna under parninginte 9. Eftersom cellcykeln också är känd för att vara på liknande sätt arresterad i celler i den stationära fas27, kan användning av sådana celler göra protokollet mer reproducerbart. Stationära fasceller kan blandas och läggas ut på YPD-plattor (dvs. en näringsrik miljö) för parning. De konventionella procedurerna kräver också ett nitrocellulosamembran och tvättning av cellerna, vilket gör processen besvärlig och utsatt för hanteringsfel. Dessutom kvantifierar de protokoll som hittills använts parningseffektiviteten i termer av en haploid. Men vid mätning av reproduktiv isolering kvantifieras parningseffektiviteten för en viss kombination av haploider snarare än en enda haploid.
För att ta itu med dessa problem rapporterar vi här en robust metod för kvantifiering av parningseffektivitet i jäst som är mycket reproducerbar och lätt att använda. Dessutom kan denna metod och de jäststammar som används här också användas i studier som undersöker effekten av genflöde på utvecklingen av parningsbarriärer.
Två olika stammar av S. cerevisiae användes i denna studie. En av stammarna härrör från SK1-bakgrunden; detta modifierades i vårt laboratorium genom att lägga till auxotrofa markörer nära MAT-locus. De resulterande genotyperna av haploiderna anges i tabell 128,29,30. I SK1-stammen hade en haploid TRP1-genen insatt nära MAT-locus, och den α haploiden hade LEU2-genen insatt nära MAT-locus. I ScAM-stammen infördes TRP1- och URA3-generna i a- respektive α haploiderna. Platsen för insättning var i ARS-regionen av kromosom III (Chr III: 197378..197609). För det protokoll som rapporteras här skulle auxotrofa markörer var som helst på genomet räcka. Att ha auxotrofa markörer nära MAT-lokus innebär dock att dessa stammar också kan användas för studier som undersöker effekten av genflöde på speciering31,32. Markörerna lades till nära MAT-platsen för att förhindra omblandning av markörerna på grund av rekombination. Därför kan detta protokoll användas för att kvantifiera parningseffektivitet i studier som involverar artbildning och även för att identifiera förändringen av parningseffektivitet när man studerar proteinerna som är involverade i parningsvägen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Protokollet innefattar i stort sett följande steg: (1) lappa haploiderna i parningseffektivitetsgallren på en YPD-platta, (2) blanda haploiderna i lika antal efter 24 timmars inkubation och ge de blandade haploiderna några timmar att para sig (7 timmar i denna studie), (3) plätering av de blandade cellerna på YPD för isolering av enskilda kolonier efter 7 timmar vid 30 °C, och slutligen, (4) bestämning av antalet diploider bildade med användning av auxotrofa markörer. Dessa steg diskuteras i detalj nedan (se även figur 2).
1. Patchning av haploider i parningseffektivitetsnäten
- Återuppliva haploiderna a och α från frysbestånden genom att strö på en YPD-agarplatta (2% agar, 2% dextros, 1% pepton, 0,5% jästextrakt) och låt dem växa i 48 timmar vid 30 ° C för att få isolerade enskilda kolonier.
- Inokulera enskilda kolonier från YPD-plattan i 5 ml YPD-medium (2 % dextros, 1 % pepton, 0,5 % jästextrakt) och inkubera vid 30 °C i 48 timmar med 250 rpm skakningar. Cellerna befinner sig i den stationära tillväxtfasen efter denna inkubationsperiod.
- Rita ett rutnät för parningseffektivitet på en ny YPD-platta. Rita rutnätet som en rektangel på 1 x 1,5 cm uppdelad i tre rutor så att var och en har måttet 1 cm x 0,5 cm, enligt figur 2A.
- Lapp 5 μL av YPD-kulturen hos de två parningstyperna på rektanglarna längst till vänster och längst till höger (figur 2B). Denna volym motsvarar ungefär 5 x 105 haploida celler som läggs ut i varje sektion. Inkubera plattorna i 24 timmar vid 30 °C.
OBS: Syftet med rutnätet är att göra experimentella åtgärder exakta (t.ex. antalet celler i experimentet). Rutnätets storlek är tillräckligt liten för att den är experimentellt lätthanterlig men tillräckligt stor för att den lätt kan manipuleras (som att lyfta celler från ett rutnät) och inte mottaglig för drift eller slumpmässiga händelser.
2. Blandning av haploider och parning
OBS: Efter 24 h (figur 2C) skrapas lika många celler av de två haploida typerna av de två gallren, blandas och läggs i mittrektangeln (figur 2D).
- För att blanda lika många celler, ta bort cirka 1/3 av plåstret som lades i ytterlådorna med en steril tandpetare och resuspendera i 20 μL vatten i en steril 1,5 ml injektionsflaska för var och en av haploiderna.
- Späd 5 μl av denna suspension i 2 ml vatten. Mät OD för denna utspädda suspension med en spektrofotometer vid 600 nm. Blanda lika många celler från de två stammarna, baserat på OD-värdet och antalet celler / ml i 1 OD för den specifika stammen. Beräkna den volym som krävs för att blandas och aspirera den från de återstående 15 μL av den enskilda haploida suspensionen.
Antalet celler lappade i mittrektangeln är sådant att cellerna bildar ett monolager. Med tanke på att jästcellen är en sfär med en radie av 2,58 μm33, skulle en rektangulär låda med 1 cm x 0,5 cm behöva cirka 1,7 x 106 celler för att bilda ett monolager. Försiktighet bör vidtas för att säkerställa att det inte finns någon fysisk beröring mellan cellerna lappade för parning och de två haploida cellnäten. Eftersom lika många av varje typ av haploida celler måste blandas, tillsätts 8,5 x 105 celler från varje stam. Cellantalet beräknas baserat på OD-mätningar, med tanke på att 1 OD vid 600 nm ungefär motsvarar 1 x 107 celler34. Till exempel, om OD600 av en haploid suspension är 0, 17 och den för den α haploiden är 0, 11, kan antalet celler i 5 μL av varje haploid suspension beräknas. För att säkerställa 8,5 x 105 celler av varje haploid typ blandas 1,25 μL av en haploid och 1,93 μL av de α haploida suspensionerna. - Tillsätt de nödvändiga volymerna av båda haploiderna i en färsk och steril 1,5 ml injektionsflaska och blanda väl med en pipett. Den slutliga volymen av denna suspension är i allmänhet cirka 6–8 μl. Patcha denna suspension i mittgallret. Inkubera plattan vid 30 °C i 7 timmar, så att haploiderna får tillräckligt med tid att para sig (figur 2E).
3. Plätering av blandade celler på YPD-agar
- Efter inkubationsperioden på 7 h, skrapa cellerna från mittrektangeln med en tandpetare eller en pipettspets och späd i 2 ml sterilt vatten. Sprid sedan cellsuspensionen på YPD-agar för att erhålla enstaka kolonier. För att bestämma den utspädningsfaktor som krävs för att erhålla enskilda kolonier, mät OD för det första röret i vilket de skrapade cellerna tillsätts. Specifika utspädningsfaktorer måste bestämmas för varje celltyp/cellstam som används.
OBS: Till exempel motsvarar en OD600 på 0,15 3 x 106 celler i en 2 ml suspension (med tanke på 1 OD = 1 x 107 celler / ml). För att erhålla några hundra kolonier på YPD-plattan späds cellsuspensionen seriellt vid 1:20 två gånger, och därefter används 100 μL av den slutliga utspädningen för spridning. - Efter plätering inkuberas YPD-plattorna vid 30 °C i 36–48 timmar tills det finns enstaka kolonier. Se till att några hundra enskilda kolonier erhålls från varje parningsexperiment för screening för att säkerställa att statistisk signifikans kan detekteras i data (figur 2F).
4. Screening för diploider med hjälp av auxotrofa markörer
- Bestäm vilken fraktion av de erhållna kolonierna som är diploida. För att identifiera de diploida kolonierna på plattan, överför de enskilda kolonierna genom att strö dem individuellt på en dubbel drop-out-platta (2% glukos, 0,66% kvävebas, 0,05% dubbel drop-out aminosyrablandning och 2% agar) som saknar aminosyrorna som stammarna är auxotrofa för, som visas i figur 2G. Inkubera plattorna vid 30 °C i 48 timmar.
OBS: Kolonierna kan också överföras till den dubbla drop-out-plattan med hjälp av replikplätering. I denna studie användes tryptofan och leucin (trp− leu−) bortfallsmedium vid kvantifiering av parningseffektiviteten hos SK1AM-stammarna, och tryptofan och uracil (trp− ura−) bortfallsmedium användes för ScAM-stammarna. Endast de diploida kolonierna växer på den dubbla drop-out-plattan eftersom de har båda auxotrofa markörerna: TRP1- och LEU2-gener i SK1AM-stammarna och TRP1- och URA3-gener i ScAM-stammarna. - Dessutom, strecka eller replika plattan kolonierna på enstaka bortfallsmedier (trp − eller leu − eller ura −) för att kvantifiera frekvensen av var och en av de två typerna av haploida i befolkningen.
- Beräkna parningseffektiviteten, η, enligt följande:
EQ (1)
där antalet parade haploider helt enkelt är lika med dubbelt så många diploider som identifierats på den dubbla bortfallsplattan (eftersom varje diploid berodde på parning av två haploider). Det totala antalet haploider är lika med summan av antalet streckade haploider plus dubbelt så många diploider streckade.
OBS: Till exempel, om endast 60 kolonier växer efter strimmor/replikplätering av 100 kolonier på ett dubbelt bortfallsmedium, kan parningseffektiviteten kvantifieras som 75% (eftersom 60 x 2 haploider parade sig för att bilda de 60 diploiderna och 40 haploider inte parade sig).
EQ (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantifiering av parningseffektiviteten hos de två parningstyperna
Protokollet som beskrivs här användes för att kvantifiera parningseffektiviteten mellan två jäststammar - mellan SK1AM a och SK1AM α och mellan ScAMa och ScAM α (figur 3A). I dessa experiment upprepades parningen mellan de två haploiderna minst 12 gånger. I var och en av upprepningarna av experimentet strimlades minst 100 kolonier på dubbla drop-out-medier. Protokollets robusthet möjliggjorde enkel differentiering av parningseffektiviteten mellan de två stammarna, SK1AM och ScAM. Medan SK1-stammarna parade sig med en mycket hög effektivitet, parade ScAM-stammarna med en relativt lägre effektivitet (figur 3A). Detta är kanske inte förvånande, eftersom ScAM-stammarna härstammar från hybridparning mellan S. cerevisiae och S. carlsbergensis-stammarna 35.
Förutom att skilja parningseffektiviteten mellan stammarna kan denna metod också användas för att kvantifiera skillnaderna i parningseffektiviteten hos stammarna i olika miljöer. Som visas i figur 3B minskade parningseffektiviteten hos ScAM-stammarna avsevärt när miljön inte innehöll glukos som primär kolkälla. Parning är en energiskt dyr process, och tillväxt på alternativa kolkällor minskar kvalitativt effektiviteten av parning.
Dynamik för parningseffektivitet
Metodens höga repeterbarhet gör det också möjligt att spåra dynamiken i parningseffektiviteten. När man fick para sig under olika tidsperioder (figur 3C) observerades ingen parning under de första 4-5 timmarna; De första diploiderna uppträdde först efter denna varaktighet. Förmodligen är detta den tid som behövs för att parningsprocessen ska slutföras i den givna miljön. Därefter ökade parningseffektiviteten snabbt. Men bortom 7 h påverkas beräkningar av parningseffektivitet av det faktum att mitotisk tillväxt börjar hända på plattan. Identifiering och urval av tidiga eller sena diploider på detta sätt kan möjliggöra design av experiment som syftar till att utveckla snabb eller fördröjd parning mellan haploider. Den exakta tidpunkten då parningseffektiviteten toppar varierar för varje stam. Till exempel, med hjälp av tillväxtkinetik, bestämde vi experimentellt att ScAM-stammen uppvisar en tillväxthastighet som är lägre än för andra S. cerevisiae-stammar (som SK1), och detta påverkar förmodligen också parningsdynamiken.
Figur 1: Livscykel för Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae har två parningstyper, a och α, och uppvisar både asexuella och sexuella reproduktionsfaser. De två parningstyperna, i frånvaro av den andra, delar sig mitotiskt. Men när de är närvarande i närheten av varandra slutar de dela mitotiskt, och cell- och kärninnehållet smälter för att bilda en diploid. Den diploida cellen kan ytterligare dela mitotiskt. Men i närvaro av ogynnsamma förhållanden (svält) genomgår den meios för att producera sporer innehållande fyra haploider. Dessa sporer spirer under gynnsamma förhållanden för att frigöra två haploider av varje slag och därmed slutföra livscykeln. Effekten med vilken de två haploiderna a och α parar sig kallas parningseffektiviteten. Varje minskning av denna parningseffektivitet indikerar en pre-zygotisk barriär mot parning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Steg som ingår i analysen av parningseffektivitet. (A) Ett galler för parningseffektivitet på 1 cm x 1,5 cm, som vidare är uppdelat i lådor med 1 cm x 0,5 cm vardera, ritas på en YPD-platta. (B) Haploida celler lappas på de extrema lådorna. C) Tillväxt av haploida celler efter 24 timmar vid 30 °C. (D) En tredjedel av de haploida fläckarna avlägsnas med en tandpetare, blandas i lika cellantal (baserat på OD600) och lappas i mittnätet. E) Tillväxten av de celler som lappats i mittgallret efter 7 timmar vid 30 °C. Detta innehåller de nya diploiderna som bildas och de haploider som inte har parat sig. (F) Isolerade enskilda kolonier erhållna på en YPD-platta efter utspädning och plätering av cellerna som skrapats från mittgallret. Denna platta inkuberades vid 30 °C i 36–48 timmar. (G) För att identifiera antalet diploider som finns på YPD-plattan överförs kolonierna till en dubbel drop-out-platta som saknar tryptofan och leucin. Endast diploider kan växa på denna platta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Parningseffektiviteten hos jäststammarna . (A) Parningseffektiviteten hos de två haploiderna a och α av SK1- och ScAM-stammarna på en YPD-platta. B) Parningseffektiviteten hos de två haploiderna a och α av ScAM-stammen på YP-plattor innehållande 2 % galaktos och på glycerol-/laktatplattor. (C) Parningsdynamiken i ScAM-stammen i en glukosmiljö. Resultaten visas som medelvärde ± SD från 12 oberoende upprepningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Stammar | Genotyp | Kommentar | Hänvisning |
| SK1AMen | ars314::TRP1, MATa, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Denna stam har TRP1-genen och kan därför växa i frånvaro av tryptofan i media. | |
| SK1AMα | ars314::LEU2, MATalpha, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Denna stam har LEU2-genen och kan därför växa i frånvaro av leucin i media. | |
| ScAMa | ars314::TRP1, MATa, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII ura3‐52 | Denna stam har TRP1-genen och kan därför växa i frånvaro av tryptofan i media. | Härledd från ScPJB644a i referens 28 |
| ScAMα | ars314::URA3, MATalpha, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII, ura3-52 | Denna stam har URA3-genen och kan därför växa i frånvaro av uracil i media. | Härledd från ScPJB644α i referens 28 |
Tabell 1: Genotyper av de S. cerevisiae-stammar som användes i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifieringen av parningseffektiviteten i S. cerevisiae är avgörande för att genomföra studier relaterade till generna som är involverade i parningsvägar eller studera påverkan av den yttre miljön på parningsbeteende. Under de senaste två decennierna har S. cerevisiae också blivit en populär modell för att ta itu med frågor relaterade till artbildning 14,36,37,38. Förekomsten av två parningstyper och lättheten av genetisk manipulation och underhåll i laboratoriemiljöer har gjort det till en lämplig organism för att studera utvecklingen av reproduktionsbarriärer i realtid. Kvantifieringen av parningseffektiviteten är avgörande eftersom den ger ett mått på den prezygotiska reproduktionsbarriären. Därför krävs ett bekvämt protokoll med hög reproducerbarhet.
Med hjälp av ovanstående protokoll kvantifierades parningseffektiviteten hos två olika stammar som visar helt olika parningsbeteende. Därför kan protokollet tillämpas på vilken stam som helst, eftersom de flesta laboratoriejäststammar bär auxotrofier som kan användas för urval39. Det finns dock några viktiga överväganden när du använder detta protokoll. Den tidsperiod som krävs för att de initiala YPD-kulturerna ska nå den stationära fasen är töjningsberoende. En långsamt växande stam kan behöva mer än 48 timmars inkubation vid 30 °C. Volymen av haploider som ska blandas beräknas baserat på OD-mätningar i en spektrofotometer. Det värde som rapporteras i litteraturen är i storleksordningen 107 celler/ml för 1 OD34; Det är dock bättre att karakterisera detta värde för en viss stam med hjälp av en plot av OD kontra antalet celler. Den volym som krävs för att säkerställa blandning av lika många celler kan beräknas baserat på OD-värdet och antalet celler / ml i 1 OD, som erhålls från karakteriseringen av stammen. Man bör se till att cellerna som lappas i mittnätet efter blandning av haploiderna ungefär bildar ett monolager som inte är särskilt tjockt. Man måste också se till att volymen som blandas är ungefär 6-8 μL. En högre volym kan leda till överlappning med de haploida fläckarna som finns på vardera sidan av mittnätet.
Denna metod kan också användas för att studera prezygotiska reproduktionsbarriärer mellan ekologiska isolat av jäst. I sådana fall måste emellertid HO-endonukleasgenen först avlägsnas från organismens genom, eftersom stammar som bär HO-endonukleas bildar diploider automatiskt på grund av dess kopplingsaktivitet av parningstyp40. De haploider som isolerats från den sporulerade diploiden kan identifieras som en eller α genom att identifiera sekvensen närvarande vid MAT-lokus med hjälp av de specifika primrar som nämnts tidigare41. HO-markören kan ersättas med två olika antibiotikaresistensgener som markörer för att skilja mellan de två haploida parningstyperna. Denna detalj beror på töjningskonstruktionen som används i den specifika studien.
En av begränsningarna med denna metod är att användningen av auxotrofa markörer kräver överföring av kolonierna från YPD-plattan till drop-out-plattorna. Användning av fluorescensmarkörer för att skilja mellan haploida och diploida celler kan bidra till att minska experimenttiden. Användningen av fluorescensmarkörer kan emellertid påverka cellernas tillväxtdynamik eftersom det finns en extra kostnad för att producera de fluorescerande proteinerna, vilket således kan förändra en cells metaboliska och fysiologiska tillstånd42. Alternativt kan de auxotrofa markörerna för att identifiera de två haploiderna ersättas med antibiotikamarkörer.
Några av de tidigare metoderna som används för karakterisering av parningseffektivitet rapporterar användningen av ett överskott av en av parningstyperna i förhållandet 10: 1 16,21,24. Av erfarenhet resulterar användningen av ett förspänt förhållande mellan de två haploiderna i mitotisk tillväxt av haploiden i överskott. Därför använder den nuvarande metoden en 1: 1-blandning av de två haploiderna.
Eftersom de auxotrofa markörerna i de stammar som används i denna studie sätts in nära MAT-locus , bryter rekombination under meios inte sambandet mellan den auxotrofa markören och parningstypen. Som ett resultat förändras inte auxotrofi och parningstypen för en viss haploid även om stammarna får genomgå meios. Detta gör det möjligt att svara på frågor relaterade till genflödets inverkan som en variabel på anpassning och artbildning43. Således presenterar detta protokoll totalt sett en enkel och robust metod för att kvantifiera parningseffektiviteten mellan olika jäststammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen i detta arbete. Författarna delar gärna med sig av SK1-härledda stammar för all ideell användning.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av ett DBT / Wellcome Trust (India Alliance) -bidrag (IA / S / 19/2 / 504632) till SS PN är en forskare som stöds av ett DBT / Wellcome Trust (India Alliance) bidrag (IA / S / 19/2 / 504632). AM stöds av Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indiens regering, som Senior Research Fellow (09/087 (0873) / 2017-EMR-I). Författarna tackar Paike Jayadeva Bhat för diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Powder regular grade for bacteriology | SRL | 19661 (0140186) | |
| Ammonium Sulphate, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glucose | Sigma Life Science | G8270 | |
| Glass Petri plates | HiMedia | PW008 | 90 mm x 15 mm dimension |
| L-Arginine | Sigma Life Science | A8094 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Life Science | A7219 | |
| L-Histidine monochloride monohydrate | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lysine | Aldrich | 62840 | |
| L-Methionine | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tyrosine | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-Valine | Sigma Life Science | V0513 | |
| Mating efficiency grid | 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate | ||
| Microcentrifuge tubes | Tarsons | 500010 | |
| Peptone | HiMedia | RM001 | |
| Uracil | Sigma Life Science | U0750 | |
| Yeast Extract Powder | HiMedia | RM027 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate | BD Difco | 233520 |
References
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: How yeast cells do it. Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).
- Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).
- Bardwell, L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).
- Reid, B. J., Hartwell, L. H. Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).
- Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production. Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).
- Bagnat, M., Simons, K. Cell surface polarization during yeast mating. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).
- Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).
- Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology. Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).
- Greig, D.
- Mayr, E. Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1999).
- Sprague, G. F.
- McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).
- Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones. Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).
- Maclean, C. J., Greig, D. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).
- Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations. Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).
- Leu, J. Y., Murray, A. W. Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast. Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).
- Kim, J., Hirsch, J. P. A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone. Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).
- Jin, M., et al. Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency. Science Signaling. 4 (186), (2011).
- Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D.
- McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination. Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S.
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
- Johnston, S. A., Hopper, J. E. Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).
- Mahilkar, A. Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , Indian Institute of Technology. Bombay, Mumbai. PhD thesis (2021).
- Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).
- Rice, W. R., Hostert, E. E. Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years. Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).
- White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. The past and future of experimental speciation. Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).
- Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).
- Domitrovic, T., et al. Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance. PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).
- Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G.
- Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast. Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).
- Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins. EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).
- Lee, H. Y., et al. Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species. Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).
- Pronk, J. T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).
- Madhani, H. D. From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, New York. (2007).
- Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow. Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).
