Summary
I dette arbeidet beskrives en robust metode for kvantifisering av parringseffektivitet i gjæren Saccharomyces cerevisiae . Denne metoden er spesielt nyttig for kvantifisering av pre-zygotiske barrierer i spesieringsstudier.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae er en mye brukt modellorganisme innen genetikk, evolusjon og molekylærbiologi. I de senere år har det også blitt en populær modellorganisme for å studere problemer knyttet til artsdannelse. Livssyklusen til gjær innebærer både aseksuelle og seksuelle reproduktive faser. Den enkle å utføre evolusjonseksperimenter og den korte generasjonstiden til organismen tillater studiet av utviklingen av reproduktive barrierer. Effektiviteten som de to parringstypene (a og α) parrer seg med for å danne a/α diploide blir referert til som parringseffektiviteten. Enhver reduksjon i parringseffektiviteten mellom haploider indikerer en pre-zygotisk barriere. For å kvantifisere omfanget av reproduktiv isolasjon mellom to haploider, er det derfor nødvendig med en robust metode for å kvantifisere parringseffektiviteten. For dette formål presenteres en enkel og svært reproduserbar protokoll her. Protokollen innebærer fire hovedtrinn, som inkluderer patching av haploider på en YPD-plate, blanding av haploider i like store mengder, fortynning og plating for enkeltkolonier, og til slutt beregning av effektiviteten basert på antall kolonier på en drop-out plate. Auxotrofe markører brukes for å tydelig skille mellom haploider og diploider.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae, ofte kalt spirende gjær, er en encellet eukaryote. Den har to parringstyper, a og α, og viser både aseksuelle og seksuelle reproduktive sykluser. A- og α-parringstypene er haploider og kan dele seg mitotisk i fravær av den andre parringstypen i omgivelsene, som representerer gjærens aseksuelle syklus. Når de to parringstypene er i umiddelbar nærhet, slutter de å dele seg mitotisk og smelter sammen for å danne en diploid celle. Den diploide gjæren kan enten dele seg mitotisk når næringsstoffer er til stede eller gjennomgå meiose under betingelsene for nitrogen sult i nærvær av en dårlig karbonkilde som ikke er gjærbar, slik som acetat1. Dette resulterer i dannelse av sporer, som forblir sovende til det er gunstige vekstforhold. Livssyklusen fullføres når disse sporene spirer og de to haploide typene slippes tilbake til det haploide bassenget 2,3 (figur 1).
Parring av gjærceller inkluderer flere trinn, for eksempel agglutinering, dannelsen av en parringsprojeksjon eller "shmoo", etterfulgt av celle- og kjernefysisk fusjon 4,5. De to parringstypene a og α produserer henholdsvis a-faktor og α-faktor for å initiere parring. Disse faktorene er polypeptidferomoner som binder seg til reseptorene (Ste2 og Ste3) som er tilstede på celleoverflaten av motsatt parringstype5. Bindingen av feromonene til reseptorene initierer feromonresponsveien, mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) signaltransduksjonsvei 6,7,8. Dette resulterer i arrestasjon av cellesyklusen i G1-fasen, noe som fører til en metabolsk aktiv stasjonær fase9. Cellene slutter deretter å dele seg mitotisk, og proteinene som kreves for parring syntetiseres. Siden de haploide cellene ikke kan bevege seg mot hverandre, er en parringsprojeksjon eller "shmoo" rettet mot parringspartneren. Når cellene kommer i kontakt, brytes celleveggen ned, og det cytoplasmatiske innholdet smelter sammen, noe som resulterer i parring for å danne en diploid celle10,11. Parringseffektiviteten mellom haploider har blitt brukt som et mål på artsdannelse i laboratorieutviklede stammer, så vel som mellom eksisterende arter12.
Å være en enkel eukaryot organisme, er gjær den valgte modellen for et stort antall forskningsspørsmål knyttet til komplekse eukaryote organismer. Et slikt spørsmål er knyttet til artsdannelse og utviklingen av reproduktive barrierer13,14. For seksuelt reproduserende organismer er en art definert av det biologiske artskonseptet (BSC) foreslått av Ernst Mayr15. Ifølge dette konseptet sies to individer av en populasjon å tilhøre to forskjellige arter hvis de ikke kan krysse seg og er reproduktivt isolert. Nedbrytning av den seksuelle reproduktive syklusen (som involverer fusjon av gameter for å danne en zygote, utviklingen av zygoten til et avkom, og oppnåelse av seksuell modenhet i avkom) fører til reproduktiv isolasjon. Som vist i figur 1 er livssyklusen til S. cerevisiae sammenlignbar med den seksuelle reproduksjonssyklusen: a) fusjonen av de to parringstypene a og α ligner fusjonen av kjønnsceller i seksuelt reproduserende organismer; b) diploidens evne til å gjennomgå mitotisk deling er ekvivalent med zygoten som utvikler seg til avkom; og c) den diploide som gjennomgår sporulering er sammenlignbar med prosessen med gametogenese14.
Pre-zygotisk isolasjon oppstår når assortativ parring observeres. Gitt lik mulighet til å pare seg med to genetisk forskjellige a-typer , parrer en α type seg fortrinnsvis med den ene over den andre eller omvendt14. I tilfelle av evolusjonseksperimenter der haploider har blitt utviklet i forskjellige miljøer, kan tilstedeværelsen av en pre-parring barriere bestemmes ved å utføre en parringsanalyse. En reduksjon i parringseffektiviteten sammenlignet med forfederen indikerer utviklingen av en pre-parring barriere. Postzygotisk isolasjon kan oppstå på grunn av diploidens manglende evne til å gjennomgå effektiv mitotisk deling og/eller sporulering for å danne haploide sporer14. Disse kan kvantifiseres ved henholdsvis å måle veksthastigheten til diploidene og beregne sporuleringseffektiviteten. Derfor, for å studere utviklingen av reproduktive barrierer, kreves robuste metoder for å kvantifisere (a) parringseffektiviteten, (b) den mitotiske veksten av diploiden, og (c) sporuleringseffektiviteten til diploid. I dette arbeidet rapporteres en robust metode for å kvantifisere parringseffektiviteten til gjærstammer.
I laboratorieforsøk er en av måtene som forekomsten av parring kan detekteres, ved å bruke auxotrofiske markører som utfyller ernæringsbehovene. Når de to parringstypene er auxotrofiske for to forskjellige aminosyrer, kan bare den diploide cellen dannet ved fusjon av de to parringstypene vokse på et medium mangelfull i begge aminosyrene. Dermed er auxotrofiske markører nyttige for å oppdage parring både kvalitativt og kvantitativt. En kvalitativ test vil være tilstrekkelig til å identifisere parringstypen av en stamme etter meiose16. Kvantitative tester er viktige når man er interessert i å identifisere en reduksjon i parring mens man studerer genene som er involvert i parringsveien17,18. I tillegg, med gjær som i økende grad brukes i spesieringsstudier, er det nødvendig med en praktisk og reproduserbar parringsanalyse, da kvantifiseringen av parringseffektiviteten er et mål på den pre-zygotiske barrieren.
Parringseffektiviteten mellom de to gjærparringstypene er kvantifisert tidligere16,19,20. De fleste av de tidligere brukte metodene er like i deres design med noen få variasjoner 16,21,22,23,24,25. Noen av dem bruker tidlige loggfasekulturer, mens noen få andre bruker midtloggfasekulturer av haploide stammer. Det er variasjoner i forholdene der de to parringstypene blandes. Nesten alle protokollene bruker en nitrocellulosemembran. Suspensjoner av begge parringstyper tatt fra tidligere dyrkede kulturer blandes og filtreres på en nitrocellulosemembran plassert på en YPD-plate. I en av variantene av protokollen er den haploide suspensjonen direkte lappet på en YPD-plate21. I eksperimenter som omhandler genene som er involvert i feromonproduksjonen av de to parringstypene, blir feromonene eksternt tilsatt mens suspensjonene av de to parringstypene24.
Etter inkubering i noen timer (vanligvis rundt 5 timer) etter blanding av haploider, vaskes cellene av fra membranen, fortynnes og belegges på selektive medier. I en av de tidligere metodene som ble rapportert i 1973, ble effektiviteten av zygotedannelse eller parring beregnet ved å telle antall budded celler, unbudded celler og parring par under et mikroskop ved hjelp av et hemocytometer26. Imidlertid bruker de fleste metoder rapportert senere auxotrofiske markører for å skille haploider og diploider. Parringseffektivitet beregnes som prosentandelen diploide celler i forhold til antall diploide og haploide celler i cellebassenget 16,21,23.
Til tross for en rekke rapporter som bruker gjær som modellorganisme for å studere artsdannelse, er det imidlertid ingen standardisert protokoll rapportert i litteraturen til nå for å beregne effektiviteten av parring. Celler i loggfasen er kanskje ikke ideelle for kvantifisering av parringseffektivitet. Under parring blir cellesyklusen til de to haploidene arrestert, og derfor deler cellene under parring ikke9. Siden cellesyklusen også er kjent for å bli arrestert på samme måte i celler i den stasjonære fase27, kan bruk av slike celler gjøre protokollen mer reproduserbar. Stasjonære faseceller kan blandes og legges ut på YPD-plater (dvs. et ernæringsrikt miljø) for parring. De konvensjonelle prosedyrene krever også en nitrocellulosemembran og vasking av cellene, noe som gjør prosessen tungvint og utsatt for håndteringsfeil. I tillegg kvantifiserer protokollene som hittil er brukt parringseffektiviteten i form av en haploid. Ved måling av reproduktiv isolasjon kvantifiseres imidlertid parringseffektiviteten for en bestemt kombinasjon av haploider i stedet for en enkelt haploid.
For å løse disse problemene, rapporterer vi her en robust metode for kvantifisering av parringseffektivitet i gjær som er svært reproduserbar og enkel å bruke. Videre kan denne metoden og gjærstammene som brukes her, også brukes i studier som undersøker effekten av genflyt på utviklingen av parringsbarrierer.
To forskjellige stammer av S. cerevisiae ble brukt i denne studien. En av stammene er avledet fra SK1-bakgrunnen; Dette ble modifisert i vårt laboratorium ved å legge til de auxotrofiske markørene nær MAT-lokuset. De resulterende genotypene av haploidene er gitt i tabell 128,29,30. I SK1-stammen hadde en haploid TRP1-genet satt inn nær MAT-lokuset, og den α haploide hadde LEU2-genet satt inn nær MAT-lokuset. I ScAM-stammen ble TRP1- og URA3-genene satt inn i henholdsvis a- og α-haploidene. Plasseringen av innsettingen var i ARS-regionen av kromosom III (Chr III: 197378..197609). For protokollen som er rapportert her, vil auxotrofe markører hvor som helst på genomet være tilstrekkelig. Å ha de auxotrofe markørene nær MAT-lokuset betyr imidlertid at disse stammene også kan brukes til studier som undersøker effekten av genstrøm på artsdannelse 31,32. Markørene ble lagt nær MAT-lokuset for å forhindre omstokking av markørene på grunn av rekombinasjon. Derfor kan denne protokollen brukes til å kvantifisere parringseffektivitet i studier som involverer spesiering og også for å identifisere endringen av parringseffektivitet når man studerer proteinene som er involvert i parringsveien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen innebærer i stor grad følgende trinn: (1) patching av haploidene i parringseffektivitetsgitterene på en YPD-plate, (2) blanding av haploidene i like mange etter 24 timers inkubasjon og gi de blandede haploidene noen timer til å parre seg (7 timer i denne studien), (3) plating av blandede celler på YPD for isolering av enkeltkolonier etter 7 timer ved 30 ° C, og til slutt, (4) bestemme antall diploider dannet ved hjelp av de auxotrofiske markørene. Disse trinnene er diskutert i detalj nedenfor (se også figur 2).
1. Lapping av haploider i parringseffektivitetsgitterene
- Gjenopplive haploidene a og α fra fryselagre ved å stripe på en YPD-agarplate (2% agar, 2% dekstrose, 1% pepton, 0,5% gjærekstrakt), og la dem vokse i 48 timer ved 30 ° C for å oppnå isolerte enkeltkolonier.
- Inokuler enkeltkolonier fra YPD-platen i 5 ml YPD-medium (2 % dekstrose, 1 % pepton, 0,5 % gjærekstrakt), og inkuber ved 30 °C i 48 timer med 250 rpm risting. Cellene er i den stasjonære vekstfasen etter denne inkubasjonsperioden.
- Tegn et parringseffektivitetsgitter på en ny YPD-plate. Tegn rutenettet som et rektangel på 1 cm x 1,5 cm delt inn i tre bokser, slik at hver har en dimensjon på 1 cm x 0,5 cm, som vist i figur 2A.
- Patch 5 μL av YPD-kulturen av de to parringstypene på venstre og høyre rektangler (figur 2B). Dette volumet tilsvarer omtrent 5 x 105 haploide celler lagt ut i hver seksjon. Inkuber platene i 24 timer ved 30 °C.
MERK: Formålet med rutenettet er å gjøre de eksperimentelle tiltakene presise (for eksempel antall celler i eksperimentet). Rutestørrelsen er liten nok til at den er eksperimentelt håndterbar, men stor nok til at den lett kan manipuleres (som å løfte celler fra et rutenett) og ikke utsatt for drift eller tilfeldige hendelser.
2. Blanding av haploider og parring
MERK: Etter 24 timer (figur 2C) skrapes like mange celler av de to haploide typene av de to rutene, blandes og legges i midtrektangelet (figur 2D).
- For å blande et likt antall celler, fjern ca. 1/3 av plasteret som ble lagt i de ytre boksene ved hjelp av en steril tannpirker, og resuspender i 20 μL vann i et sterilt 1,5 ml hetteglass for hver av haploidene.
- Fortynn 5 μL av denne suspensjonen i 2 ml vann. Mål OD for denne fortynnede suspensjonen ved hjelp av et spektrofotometer ved 600 nm. Bland like mange celler fra de to stammene, basert på OD-verdien og antall celler / ml i 1 OD for den aktuelle stammen. Beregn volumet som kreves for å bli blandet, og aspirer det fra de resterende 15 mikrol av den individuelle haploide suspensjonen.
MERK: Antall celler lappet i midtrektangelet er slik at cellene danner et monolag. Med tanke på at gjærcellen er en kule med en radius på 2,58 μm33, vil en rektangulær boks på 1 cm x 0,5 cm trenge omtrent 1,7 x 106 celler for å danne et monolag. Det må utvises forsiktighet for å sikre at det ikke er fysisk berøring mellom cellene som er lappet for parring og de to haploide cellegitterene. Siden like mange av hver type haploide celler må blandes, tilsettes 8,5 x 105 celler fra hver stamme. Celletallet beregnes basert på OD-målinger, med tanke på at 1 OD ved 600 nm er omtrent ekvivalent med 1 x 107 celler34. For eksempel, hvis OD600 av en haploid suspensjon er 0, 17 og den α haploid er 0, 11, kan antall celler i 5 μL av hver haploid suspensjon beregnes. For å sikre 8,5 x 105 celler av hver haploid type, blandes 1,25 μL av a haploid og 1,93 μL av de α haploide suspensjonene. - Tilsett nødvendig volum av begge haploidene i et friskt og sterilt 1,5 ml hetteglass, og bland godt med en pipette. Det endelige volumet av denne suspensjonen er vanligvis rundt 6–8 μL. denne fjæringen i midtgitteret. Inkuber platen ved 30 °C i 7 timer, slik at haploidene får tilstrekkelig tid til å pare seg (figur 2E).
3. Plating av blandede celler på YPD-agar
- Etter inkubasjonsperioden på 7 timer, skrap cellene fra senterrektangelet ved hjelp av en tannpirker eller en pipettespiss, og fortynn i 2 ml sterilt vann. Spre deretter cellesuspensjonen på YPD-agar for å oppnå enkeltkolonier. For å bestemme fortynningsfaktoren som er nødvendig for å oppnå enkeltkolonier, måles OD for det første røret som de skrapte cellene tilsettes. Spesifikke fortynningsfaktorer må bestemmes for hver celletype/stamme som brukes.
MERK: For eksempel tilsvarer en OD600 på 0,15 3 x 106 celler i en 2 ml suspensjon (vurderer 1 OD = 1 x 107 celler / ml). For å oppnå noen hundre kolonier på YPD-platen, blir cellesuspensjonen serielt fortynnet ved 1:20 to ganger, og deretter brukes 100 μL av den endelige fortynningen til spredning. - Etter plating, inkuber YPD-platene ved 30 °C i 36–48 timer til det er enkeltkolonier. Sørg for at man får noen hundre enkeltkolonier fra hvert parringsforsøk for screening for å sikre at statistisk signifikans kan påvises i dataene (figur 2F).
4. Screening for diploider ved hjelp av auxotrofiske markører
- Bestem hvilken brøkdel av koloniene som er oppnådd, er diploide. For å identifisere de diploide koloniene på platen, overfør de enkelte koloniene ved å streke dem individuelt på en dobbel drop-out-plate (2% glukose, 0,66% nitrogenbase, 0,05% dobbel drop-out aminosyreblanding og 2% agar) som mangler aminosyrene som stammene er auxotrofiske for, som vist i figur 2G. Inkuber platene ved 30 °C i 48 timer.
MERK: Koloniene kan også overføres til den doble drop-out-platen ved hjelp av replikaplating. I denne studien ble tryptofan og leucin (trp− leu−) drop-out medium brukt ved kvantifisering av parringseffektiviteten til SK1AM-stammene, og tryptofan og uracil (trp− ura−) drop-out medium ble brukt for ScAM-stammene. Bare de diploide koloniene vokser på den doble drop-out-platen, da de har begge de auxotrofe markørene: TRP1- og LEU2-gener i SK1AM-stammene og TRP1- og URA3-gener i ScAM-stammene. - I tillegg kan du streke eller replikaplate koloniene på enkeltmedier (trp− eller leu− eller ura−) for å kvantifisere frekvensen av hver av de to haploide typene i populasjonen.
- Beregn parringseffektiviteten, η, som følger:
EQ (1)
hvor antall haploider parret er ganske enkelt lik to ganger antall diploider identifisert på den doble drop-out-platen (siden hver diploid resulterte fra parring av to haploider). Det totale antall haploider er lik summen av antall haploider stripet pluss to ganger antall diploider stripet.
MERK: For eksempel, hvis bare 60 kolonier vokser etter streker / replikaplating 100 kolonier på et dobbelt frafallsmedium, kan parringseffektiviteten kvantifiseres som 75% (som 60 x 2 haploider parret for å danne de 60 diploidene, og 40 haploider ikke parret seg).
EQ (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantifisering av parringseffektiviteten til de to parringstypene
Protokollen beskrevet her ble brukt til å kvantifisere parringseffektiviteten mellom to gjærstammer - mellom SK1AM a og SK1AM α og mellom ScAMa og ScAMα (figur 3A). I disse forsøkene ble parringen mellom de to haploidene gjentatt minst 12 ganger. I hver av gjentakelsene av eksperimentet ble minst 100 kolonier streket på doble frafallsmedier. Den robuste protokollen muliggjorde enkel differensiering av parringseffektiviteten mellom de to stammene, SK1AM og ScAM. Mens SK1-stammene parret seg med svært høy effektivitet, parret ScAM-stammene seg med en relativt lavere effektivitet (figur 3A). Dette er kanskje ikke overraskende, da ScAM-stammene stammer fra hybridparring mellom S. cerevisiae og S. carlsbergensis-stammene 35.
I tillegg til å skille parringseffektiviteten mellom stammene, kan denne metoden også brukes til å kvantifisere forskjellene i parringseffektiviteten til stammene på tvers av forskjellige miljøer. Som vist i figur 3B, falt parringseffektiviteten til ScAM-stammene betydelig når miljøet ikke inneholdt glukose som en primær karbonkilde. Parring er en energisk kostbar prosess, og vekst på alternative karbonkilder reduserer kvalitativt effektiviteten av parring.
Dynamikk av parringseffektivitet
Den høye repeterbarheten av metoden gjør det også mulig å spore dynamikken i parringseffektiviteten. Når det fikk lov til å parre seg i forskjellige tidsperioder (figur 3C), ble det ikke observert parring de første 4-5 timene; De første diploidene dukket opp først etter denne varigheten. Antagelig er dette tiden som trengs for at parringsprosessen skal fullføres i det gitte miljøet. Deretter økte parringseffektiviteten raskt. Men utover 7 timer påvirkes parringseffektivitetsberegningene av det faktum at mitotisk vekst begynner å skje på platen. Identifisering og valg av tidlige eller sene diploider på denne måten kan tillate utforming av eksperimenter som tar sikte på å utvikle rask eller forsinket parring mellom haploider. Det nøyaktige tidspunktet hvor parringseffektiviteten topper seg, er variabel for hver belastning. For eksempel, ved hjelp av vekstkinetikk, bestemte vi eksperimentelt at ScAM-stammen utviser en veksthastighet lavere enn for andre S. cerevisiae-stammer (som SK1), og dette påvirker sannsynligvis også dynamikken i parring.
Figur 1: Livssyklusen til Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae har to parringstyper, a og α, og viser både aseksuelle og seksuelle reproduksjonsfaser. De to parringstypene, i fravær av den andre, deler seg mitotisk. Men når de er til stede i nærheten av hverandre, slutter de å dele seg mitotisk, og det cellulære og nukleære innholdet smelter sammen for å danne en diploid. Den diploide cellen kan videre dele seg mitotisk. Imidlertid, i nærvær av ugunstige forhold (sult), gjennomgår den meiose for å produsere sporer som inneholder fire haploider. Disse sporene spirer under gunstige forhold for å frigjøre to haploider av hver type, og dermed fullføre livssyklusen. Effekten som de to haploidene a og α kompis blir referert til som parringseffektiviteten. Enhver reduksjon i denne parringseffektiviteten indikerer en pre-zygotisk barriere for parring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinn involvert i parringseffektivitetsanalysen . (A) Et rutenett for parringseffektivitet på 1 cm x 1,5 cm, som videre er delt inn i esker på 1 cm x 0,5 cm hver, er tegnet på en YPD-plate. (B) Haploide celler er lappet på de ekstreme boksene. (C) Vekst av haploide celler etter 24 timer ved 30 °C. (D) En tredjedel av de haploide flekkene fjernes ved hjelp av en tannpirker, blandet i like cellenummer (basert på OD600), og lappet i sentergitteret. (E) Veksten av cellene lappet i sentergitteret etter 7 timer ved 30 °C. Dette inneholder de nye diploidene som dannes og haploidene som ikke har paret seg. (F) Isolerte enkeltkolonier oppnådd på en YPD-plate etter fortynning og plating av cellene skrapt fra sentergitteret. Denne platen ble inkubert ved 30 °C i 36-48 timer. (G) For å identifisere antall diploider som er tilstede på YPD-platen, overføres koloniene til en dobbel drop-out-plate som mangler tryptofan og leucin. Bare diploider kan vokse på denne platen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Parringseffektivitet av gjærstammene . (A) Parringseffektiviteten til de to haploidene a og α av SK1- og ScAM-stammene på en YPD-plate. (B) Parringseffektiviteten til de to haploidene a og α av ScAM-stammen på YP-plater som inneholder 2% galaktose og på glyserol / laktatplater. (C) Dynamikken i parring i ScAM-stammen i et glukosemiljø. Resultatene vises som gjennomsnitt ± SD fra 12 uavhengige repetisjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Stammer | Genotype | Kommentar | Referanse |
| SK1AMen | ars314::TRP1, MATa, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Denne stammen har TRP1-genet og kan dermed vokse i fravær av tryptofan i media. | |
| SK1AMα | ars314::LEU2, MATalpha, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Denne stammen har LEU2-genet og kan dermed vokse i fravær av leucin i media. | |
| ScAMen | ars314:: TRP1, MATa, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII ura3‐52 | Denne stammen har TRP1-genet og kan dermed vokse i fravær av tryptofan i media. | Avledet fra ScPJB644a i referanse 28 |
| ScAMα | ars314::URA3, MATalpha, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII, ura3‐52 | Denne stammen har URA3-genet og kan dermed vokse i fravær av uracil i media. | Avledet fra ScPJB644α i referanse 28 |
Tabell 1: Genotyper av S. cerevisiae-stammene brukt i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifiseringen av parringseffektiviteten i S. cerevisiae er avgjørende for å utføre studier relatert til gener som er involvert i parringsveier eller studere påvirkning av det ytre miljø på parringsadferd. I løpet av de siste to tiårene har S. cerevisiae også blitt en populær modell for å ta opp spørsmål knyttet til artsdannelse 14,36,37,38. Tilstedeværelsen av to parringstyper og den enkle genetiske manipulasjonen og vedlikeholdet i laboratoriemiljøer har gjort det til en passende organisme for å studere utviklingen av reproduktive barrierer i sanntid. Kvantifiseringen av parringseffektiviteten er viktig, da den gir et mål på den pre-zygotiske reproduktive barrieren. Derfor er det nødvendig med en praktisk protokoll med høy reproduserbarhet.
Ved hjelp av ovennevnte protokoll ble parringseffektiviteten til to forskjellige stammer som viser helt forskjellig parringsadferd kvantifisert. Derfor kan protokollen brukes på enhver stamme, da de fleste laboratoriegjærstammer bærer auxotrofier som kan brukes til valg39. Det er imidlertid noen viktige hensyn å ta når du bruker denne protokollen. Tidsvarigheten som kreves for at de første YPD-kulturene skal nå den stasjonære fasen, er belastningsavhengig. En saktevoksende stamme kan trenge mer enn 48 timers inkubasjon ved 30 °C. Volumet av haploider som skal blandes beregnes ut fra OD-målinger i et spektrofotometer. Verdien rapportert i litteraturen er i størrelsesorden 107 celler/ml for 1 OD34; Det er imidlertid bedre å karakterisere denne verdien for en bestemt stamme ved hjelp av et plott av OD versus antall celler. Volumet som kreves for å sikre blanding av like mange celler, kan beregnes basert på OD-verdien og antall celler / ml i 1 OD, som er oppnådd fra karakteriseringen av stammen. Man bør sørge for at cellene som lappes i sentergitteret etter å ha blandet haploidene omtrent danner et monolag som ikke er veldig tykt. Man må også sørge for at volumet som blandes er omtrent 6-8 μL. Et høyere volum kan føre til overlapping med haploide flekker som er på hver side av senterrutenettet.
Denne metoden kan også brukes til å studere pre-zygotiske reproduktive barrierer mellom økologiske isolater av gjær. For slike tilfeller må imidlertid HO-endonuklease-genet først fjernes fra organismens genom, da stammer som bærer HO-endonuklease danner diploider automatisk på grunn av sin parringstype bytteaktivitet40. Haploidene isolert fra sporulert diploid kan identifiseres som a eller α ved å identifisere sekvensen som er tilstede ved MAT-lokuset ved hjelp av de spesifikke primerne nevnt tidligere41. HO-markøren kan erstattes med to ulike antibiotikaresistensgener som markører for å skille mellom de to haploide parringstypene. Denne detaljen avhenger av belastningskonstruksjonen som brukes i den aktuelle studien.
En av begrensningene ved denne metoden er at bruk av auxotrofe markører krever overføring av koloniene fra YPD-platen til drop-out-platene. Bruk av fluorescensmarkører for å skille mellom haploide og diploide celler kan bidra til å redusere eksperimentell tid. Imidlertid kan bruken av fluorescensmarkører påvirke vekstdynamikken til cellene, da det er en ekstra kostnad involvert i å produsere fluorescerende proteiner, som dermed kan endre cellens metabolske og fysiologiske tilstand42. Alternativt kan de auxotrofiske markørene for å identifisere de to haploidene erstattes av antibiotikamarkører.
Noen av de tidligere metodene som brukes til karakterisering av parringseffektivitet, rapporterer bruken av et overskudd av en av parringstypene i forholdet 10: 1 16,21,24. Fra erfaring resulterer bruken av et partisk forhold mellom de to haploidene i mitotisk vekst av haploid i overskudd. Derfor bruker den nåværende metoden en 1: 1-blanding av de to haploidene.
Siden de auxotrofiske markørene i stammene som brukes i denne studien er satt inn nær MAT-lokuset, bryter ikke rekombinasjon under meiose sammenhengen mellom den auxotrofiske markøren og parringstypen. Som et resultat endres ikke auxotrofien og parringstypen til en bestemt haploid selv om stammene får gjennomgå meiose. Dette gjør det mulig å svare på spørsmål knyttet til virkningen av genflyt som en variabel på tilpasning og artsdannelse43. Dermed presenterer denne protokollen en enkel og robust metode for å kvantifisere parringseffektiviteten mellom forskjellige gjærstammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser i dette arbeidet. Forfatterne er glade for å dele SK1-avledede stammer for all ideell bruk.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av et DBT / Wellcome Trust (India Alliance) tilskudd (IA / S / 19/2 / 504632) til SS PN er en forsker støttet av et DBT / Wellcome Trust (India Alliance) stipend (IA / S / 19/2 / 504632). AM støttes av Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Indias regjering, som seniorforsker (09/087 (0873) / 2017-EMR-I). Forfatterne takker Paike Jayadeva Bhat for diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Powder regular grade for bacteriology | SRL | 19661 (0140186) | |
| Ammonium Sulphate, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glucose | Sigma Life Science | G8270 | |
| Glass Petri plates | HiMedia | PW008 | 90 mm x 15 mm dimension |
| L-Arginine | Sigma Life Science | A8094 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Life Science | A7219 | |
| L-Histidine monochloride monohydrate | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lysine | Aldrich | 62840 | |
| L-Methionine | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tyrosine | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-Valine | Sigma Life Science | V0513 | |
| Mating efficiency grid | 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate | ||
| Microcentrifuge tubes | Tarsons | 500010 | |
| Peptone | HiMedia | RM001 | |
| Uracil | Sigma Life Science | U0750 | |
| Yeast Extract Powder | HiMedia | RM027 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate | BD Difco | 233520 |
References
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: How yeast cells do it. Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).
- Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).
- Bardwell, L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).
- Reid, B. J., Hartwell, L. H. Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).
- Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production. Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).
- Bagnat, M., Simons, K. Cell surface polarization during yeast mating. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).
- Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).
- Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology. Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).
- Greig, D.
- Mayr, E. Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1999).
- Sprague, G. F.
- McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).
- Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones. Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).
- Maclean, C. J., Greig, D. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).
- Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations. Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).
- Leu, J. Y., Murray, A. W. Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast. Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).
- Kim, J., Hirsch, J. P. A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone. Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).
- Jin, M., et al. Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency. Science Signaling. 4 (186), (2011).
- Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D.
- McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination. Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S.
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
- Johnston, S. A., Hopper, J. E. Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).
- Mahilkar, A. Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , Indian Institute of Technology. Bombay, Mumbai. PhD thesis (2021).
- Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).
- Rice, W. R., Hostert, E. E. Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years. Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).
- White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. The past and future of experimental speciation. Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).
- Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).
- Domitrovic, T., et al. Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance. PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).
- Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G.
- Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast. Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).
- Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins. EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).
- Lee, H. Y., et al. Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species. Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).
- Pronk, J. T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).
- Madhani, H. D. From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, New York. (2007).
- Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow. Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).
