Summary
该协议描述了一种结合静态和动态方法的方法，以评估有机过氧酸在乳制品行业中根除生物膜的功效。这种方法也可用于测试新的生物或化学配方控制生物膜的有效性。
Abstract
乳制品行业中生物膜的存在是一个主要问题，因为它们对加工厂中经常使用的大多数原位清洗（CIP）程序具有很高的抵抗力，因此可能导致生产不安全和改变的乳制品。因此，为乳品行业开发新的生物膜控制策略势在必行。该协议旨在评估有机过氧酸（过氧乙酸，过丙酸和过乳酸以及基于过氧乙酸的商业消毒剂）使用静态和动态方法的组合根除乳制品生物膜的功效。使用最小生物膜根除浓度（MBEC）测定（一种静态高通量筛选方法）对所有生物膜或混合生物膜中最强的产生生物膜的细菌进行测试。与推荐浓度的消毒剂接触时间为5分钟，成功消除了单个和混合生物膜。目前正在进行研究，以使用疾病控制中心（CDC）生物膜反应器来证实这些观察结果，这是一种模拟 原位 条件的动态方法。这种类型的生物反应器可以使用不锈钢表面，该表面构成了大多数工业设备和表面。反应器的初步结果似乎证实了有机过氧酸对生物膜的功效。本研究中描述的组合方法可用于开发和测试用于控制生物膜和根除微生物的新生物或化学制剂。
Introduction
乳制品行业是全球主要工业部门，包括在加拿大，那里有超过 10，500 个奶牛场，每年生产近 9000 万升牛奶1。尽管乳制品行业（包括加工厂）有严格的卫生要求，但牛奶是微生物的重要培养基，因此，乳制品可能含有微生物，包括腐败或病原微生物。这些病原体可引起各种疾病;例如，沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特菌可分别引起胃肠炎和脑膜炎2。腐败微生物可以通过产生气体、细胞外酶或酸来影响乳制品的质量和感官特性3.牛奶的外观和颜色也可能改变，例如通过假单胞菌spp.4。
其中一些微生物可以在不同的表面上形成生物膜，包括不锈钢。这种生物膜使微生物能够在设备表面持续存在和繁殖，从而污染乳制品5。生物膜也存在问题，因为它们能够阻碍传热并加速设备的腐蚀，导致设备过早更换，从而导致经济损失6。
原位清洗（CIP）程序使食品工业能够控制微生物的生长。这些程序涉及依次使用氢氧化钠、硝酸，有时还包括含有次氯酸和过氧乙酸7，8 的消毒剂。次氯酸虽然对微生物非常有效，但它也会与天然有机物发生反应，导致有毒副产物的形成9。过氧乙酸不产生有害副产物10;然而，它在食品工业中对生物膜的有效性变化很大10，11。最近，已经研究了其他过氧酸，包括过丙酸和过乳酸的抗菌活性，它们似乎是控制生物膜中微生物生长的良好替代品12，13。
因此，本研究旨在评估有机过氧酸（过氧乙酸、过丙酸和过乳酸以及基于过氧乙酸的消毒剂）根除乳品生物膜的功效，该方法结合了最小生物膜根除浓度 （MBEC） 测定、静态高通量筛选方法和美国疾病控制中心 （CDC） 生物膜反应器（一种模拟原 位 的动态方法 条件。MBEC测定在协议中以下称为“生物膜微量滴定板”。这里介绍的协议和代表性结果证明了有机过氧酸的功效及其在控制乳制品行业中微生物生物膜的潜在应用。
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Protocol
本文所载的工作需要一个生物安全2级实验室，并已获得拉瓦尔大学机构生物安全委员会的批准（项目编号119689）。
注意：图1中的流程 图 总结了结合静态和动态方法的方法，该方法用于评估有机过氧酸根除生物膜的功效。
1. 材料准备
- 微生物分离物
- 使用前15分钟打开生物安全柜（BSC），并用70%（v / v）酒精溶液清洁。
- BSC 无菌后，放置一瓶待测试的微生物分离物（本研究中为偶氮假单 胞菌或 短单胞 菌囊泡）、接种环、装有 10 mL 无菌胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 的 15 mL 管和涡旋混合器。在放入平衡计分卡之前，用酒精对所有材料进行消毒。
- 涡旋微生物分离物小瓶以使培养物均质化。
- 无菌地将 20 μL 微生物分离物转移到 15 mL 管中包含的 10 mL 无菌 TSB 中，并在 30 °C 下以 160 rpm 搅拌孵育 16-24 小时。
注意： 水泡芽孢杆菌 必须按照处理病原微生物所需的指南在密闭 2 级实验室中使用。处理人员必须经过适当的培训，并且必须戴安全眼镜，手套和外套。
- 消毒剂
- 要制备有机过氧酸溶液 （60 mL），将 24 mL 过氧化氢和 36 mL 酸（乙酸、丙酸或乳酸）加入 250 mL 锥形瓶中。然后，加入预定义体积的 10 M 硫酸（过氧乙酸为 655 μL，过丙酸为 635 μL，过乳酸为 715 μL）。轻轻摇动烧瓶进行混合，然后将烧瓶放入化学罩内设置的30°C水浴中。将烧瓶孵育2天，每天早上温和混合。
注意：商用过氧乙酸消毒剂（见 材料表）由制造商直接提供。
注意：消毒剂必须在化学罩下使用。在实验期间必须戴安全眼镜和手套。有关消毒剂的更多信息，请参阅相应的材料安全数据表。 - 按如下所述对过氧化氢进行滴定。
- 将一个空的300 mL烧杯放在分析天平上（参见 材料表）并去皮。将大约 0.23 克消毒剂装入烧杯中，并注意添加的确切重量。在烧杯中加入100g冷的1N硫酸溶液，在烧杯中加入磁力搅拌棒，并将其放在搅拌板上。
- 让溶液搅拌直至完全均质。然后，向烧杯中加入三滴铁指示剂溶液（H2O中的0.1wt%），并用0.1N硫酸铈溶液滴定，直到溶液从鲑鱼粉红色变为浅蓝色。注意添加的硫酸铈溶液的体积。
- 使用以下公式计算过氧化氢的百分比：
等式 （1）
其中 S 是添加的硫酸铈溶液的体积，N 是硫酸铈溶液的正态性 （0.1 N），W 是样品的重量 （~0.2300 g），0.017 = （1 mol H 2 O 2/2 mol Ce） × （34.0147 g H 2 O 2 /1 mol H 2 O）2× （1 L/1，000 mL）
- 按如下所述对有机过氧酸进行滴定。
- 将 20 mL 的 7.5% （w/v） 碘化钾溶液加入烧杯中。用0.1N硫代硫酸钠溶液缓慢滴定，直到溶液的蓝色开始变成浅棕色/橙色。
- 向烧杯中加入 2 mL 淀粉溶液（H2O 中的 1 wt%），并用 0.1 N 硫代硫酸钠溶液滴定，直到溶液从黑色变为橙色。注意使用的硫代硫酸钠溶液的体积。
- 使用以下公式计算有机过氧酸的百分比：
等式 （2）
其中T是使用的硫代硫酸钠溶液的体积，N是硫代硫酸钠溶液的正常性（0.1 N），W是样品的重量（~0.2300g），0.038 = （1 mol CH 3 COOOH/1 mol I 2） × （1 mol I 2/2 mol S2 O 3） × （76.06 g/1 mol CH3COOOH） × （1 L/1，000 mL）
注意：重复步骤1.2.2和步骤1.2.3，再用两个样品执行每个测试一式三份。
- 要制备有机过氧酸溶液 （60 mL），将 24 mL 过氧化氢和 36 mL 酸（乙酸、丙酸或乳酸）加入 250 mL 锥形瓶中。然后，加入预定义体积的 10 M 硫酸（过氧乙酸为 655 μL，过丙酸为 635 μL，过乳酸为 715 μL）。轻轻摇动烧瓶进行混合，然后将烧瓶放入化学罩内设置的30°C水浴中。将烧瓶孵育2天，每天早上温和混合。
等式 （1）
等式 （2）2. 形成单一和混合生物膜
- 生物膜微量滴定板
- 涡旋含有细菌培养物的试管（20μL菌株+ 10mLTSB培养基，在步骤1.1.4中制备）。在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上进行连续稀释和铺板，以确定过夜培养物的细菌细胞计数（cfu）。然后，将 100 μL 培养物无菌转移到 10 mL 无菌 TSB 培养基中（终浓度约为 2 x 107 cfu/mL）。
注意：对于使用生物反应器的测定，将体积为 100 μL 的微生物分离物转移到 100 mL 无菌 TSB 中。 - 涡旋管。对于每种细菌，使用多通道移液器将稀释的细菌培养物一式三份转移到生物膜微量滴定板（每孔 150 μL）中。将 150 μL TSB 培养基加载到三个新孔中作为对照。将生物膜微量滴定板（参见 材料表）在30°C下孵育24小时而不搅拌。
注意：对于混合生物膜测定，每种悬浮液加入 75 μL，总体积为 150 μL。生物膜微量滴定板在其盖子上包含钉子，在其上形成生物膜。
- 涡旋含有细菌培养物的试管（20μL菌株+ 10mLTSB培养基，在步骤1.1.4中制备）。在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上进行连续稀释和铺板，以确定过夜培养物的细菌细胞计数（cfu）。然后，将 100 μL 培养物无菌转移到 10 mL 无菌 TSB 培养基中（终浓度约为 2 x 107 cfu/mL）。
- 生物反应器
- 按照制造商的说明清洁和风干生物反应器的部件（参见 材料表），然后按照如下所述继续制备反应器。
- 首先，将扁平刀片放置在 1 L 玻璃烧杯（生物反应器）内，该烧杯通过磁棒连接到其支架上，并通过安装在生物反应器盖内侧的塑料条将设置保持在直立位置。
- 使用螺丝刀将不锈钢试样或滑块（见 材料表）放在聚丙烯棒上，然后将它们插入盖子上的孔中，而无需将其定位销放在凹口中，以使蒸汽在灭菌过程中逸出。
- 用铝箔覆盖所有生物反应器通风口，并用铝箔包裹其余设备，即管子 L/S 18 （ID = 7.9 mm） 和 L/S 16 （ID = 3.1 mm）、玻璃流断裂、容器盖、螺丝刀、镊子和 0.2 μm 过滤器。
注意： 将硅管（见 材料表）插入位于介质容器盖内表面的倒钩中。 - 高压灭菌生物反应器，在121°C下干循环20分钟。
- 以间歇模式（第一步）在生物反应器中进行生物膜形成。
- 在BSC中，将管L/S 18的一端连接到生物反应器的出口，并保持另一端用铝箔包裹以保持无菌。
- 从生物反应器盖上取下一个试样或载玻片支架，并将其放入无菌 50 mL 管中。然后，使用 50 mL 血清移液管将 340 mL 的 300 mg/L TSB 培养基填充到生物反应器的烧杯中，通过棒占据的孔。
- 使用 5 mL 移液管通过之前使用的相同孔口，用 1 mL 细菌溶液（~108 cfu/mL 偶 氮甲酸疟原虫）接种生物反应器中的培养基，然后将棒放回其原始位置。将已放置在盖孔中的杆定位，使销钉适合其各自的凹口。
- 将0.2μm细菌空气吹扫过滤器放置在直径最小的管末端，该过滤器位于生物反应器的盖子上。另一根相同直径的管子仍然用金属螺帽或紧密关闭的硅胶塞永久堵塞。
- 将生物反应器放在设置在30°C的加热板上24小时，并以130rpm搅拌。
注意：对于多物种生物膜的形成，使用等体积的不同细菌培养物以获得1mL的总接种物体积。
- 在生物反应器中以连续流动模式（第二步）形成生物膜。
- 将含有18 L无菌蒸馏水的大瓶放入BSC中，并加入2 L 1，000 mg / L TSB培养基以获得100 mg / L的终浓度。
- 用无菌盖盖住容器，两个管子连接到该盖子。第一个是固定在盖子内表面的硅胶管，用于泵送介质。第二根管（L/S 16）连接到外部端口，以允许液体流向生物反应器。将0.2μm过滤器放入培养基容器盖上的第二个管中。
- 将第二根管连接到蠕动泵，并将另一端连接到玻璃流断路，然后将其插入生物反应器盖上的较大管中。
- 使用另一个 20 L 大瓶收集生物反应器的流出物。将连接到生物反应器出口出水口的管端连接到废物容器的盖子上。将0.2μm过滤器插入该容器盖上的管中。
- 以 11.3 mL/min 的流速启动蠕动泵，并使系统运行 24 小时。
注意：生物反应器中生物膜形成过程中使用的培养基或牛奶的流速（11.3mL / min）通过将340mL（对应于反应器内液体的体积）除以30分钟的停留时间来确定。
- 回收细菌生物膜。
- 关闭蠕动泵，停止搅拌和加热生物反应器。
- 小心地从生物反应器中取出每根棒，并在 40 mL PBS 中冲洗试样或载玻片 3 次以消除浮游细菌。之后，使用适当的螺丝刀将试样或玻片释放到含有 40 mL PBS 的无菌 50 mL 锥形管中。涡旋管30秒，将它们转移到放置在超声仪浴中的架子上，并以40 kHz的速度对管子进行超声处理30秒（这需要110 W的功率）。重复此操作 3 次。
- 将 40 mL 生物膜悬浮液收集在无菌 50 mL 锥形管中，然后用 2 mL 无菌 PBS 溶液冲洗试样或载玻片。回收这种漂洗液并将其添加到已经收集的生物膜悬浮液中。
- 枚举生物膜中的活细菌：使用获得的生物膜悬浮液，进行 10 倍连续稀释，然后将 100 μL 的 10-5 和 10-6 稀释液一式三份接种在 TSA 上。将板在30°C孵育24小时。计算琼脂平板上存在的菌落数，并根据ASTM E2562-1714使用以下公式计算试样和载玻片上的细菌密度（活无柄细菌）：
等式 （3）
其中 X 是菌落形成单位（CFU）的数量， B 是铺板的体积（0.1mL）， V 是生物膜悬浮的体积（储备溶液）， A 是被生物膜覆盖的试样或载玻片的表面， D 是稀释因子。
- 按照制造商的说明清洁和风干生物反应器的部件（参见 材料表），然后按照如下所述继续制备反应器。
等式 （3）3. 有机过氧酸根除生物膜功效的定量评价
- 生物膜微量滴定板
- 将 200 μL 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 加入到 96 孔微孔板的三个孔中。
- 将生物膜微孔板的盖子（带有在钉子上形成的生物膜）转移到含有PBS的96孔微孔板上10秒，以洗涤生物膜并消除浮游细菌。
- 准备所需浓度的消毒剂（例如，25 ppm、50 ppm、500 ppm、1，000 ppm、5，000 ppm、10，000 ppm 和 25，000 ppm）。
注意：所有稀释液均使用无菌蒸馏水无菌进行。 - 将 200 μL 每种浓度的消毒剂加入新的 96 孔微量滴定板的孔中，一式三份。将生物膜微量滴定板的盖子转移到包含消毒剂的96孔微量滴定板上，并在室温下孵育板所需的暴露时间。
- 将 200 μL Dey-Engley 中和肉汤添加到新的 96 孔微量滴定板的孔中。将生物膜微量滴定板的盖子转移到含有中和肉汤的96孔微量滴定板上。用封口膜密封微量滴定板，并将其以40kHz置于浴超声仪中30分钟。
- 30分钟后，从超声仪中取出微量滴定板并去除封口膜。将 100 μL 从包含超声处理后分离的生物膜的 96 孔板的第一列转移到新的 96 孔微量滴定板的第一排。
- 将 180 μL 无菌 1x PBS 加入新的 96 孔微孔板（在步骤 3.1.6 中制备）的孔中，第一行除外。将 20 μL 生物膜溶液从第一行转移到含有 180 μL 1x PBS 的第二行孔中（第 2 行，稀释度：10−1）。然后，将第二行中所含的 20 μL 液体转移到下一行中含有 180 μL 1x PBS（第 3 行，稀释度：10−2）的孔中。重复相同的步骤以获得10-5和10-7之间的稀释度。
- 在TSA上接种100μL稀释液，并根据每种细菌生长所需的参数孵育板。
- 孵育后，计数cfus并使用以下公式计算每个PEG的log 10密度和每个消毒剂浓度下的log10减少：
等式 （4）
其中 X 是点中计数的菌落形成单位， B 是铺板体积（0.01mL）， V 是孔体积（0.20mL）， A 是钉表面积（46.63mm2）， D 是稀释度。
等式 （5） - 在独立的日子重复每个实验 3 次。
注意：“消除生物膜的消毒剂的最低浓度”或MBEC对应于没有细菌生长的最低消毒剂浓度。
- 生物反应器
注意：遵循ASTM标准E2871-1915 的程序对 偶氮假单胞菌 PFlA1进行此测试。- 首先在生物反应器的试样上形成生物膜，如步骤2.2所述。然后，取下固定试样的杆，并在含有 30 mL PBS 的锥形管内冲洗。
- 使用螺丝刀将每张试样放入无菌 50 mL 锥形管中，然后加入 4 mL 适当的有机过氧酸溶液或 PBS 用于对照。孵育 5 分钟，然后加入 36 mL Dey-Engley 中和肉汤。涡旋30秒，然后使用超声仪浴以40 kHz超声处理30秒。重复该过程3x以获得生物膜悬浮液。
- 同样，冲洗所有其他棒并从试样中回收生物膜。在TSA培养基上连续稀释生物膜悬浮液和板0.1 mL。将板在30°C孵育24小时。
- 孵育后，计数cfus，然后计算每个试样的生物膜密度（方程6），来自同一棒的每组三个试样的平均对数密度（LD），包括处理和对照（方程7），以及消毒剂的对数减少（方程8）使用以下公式：
等式 （6）
其中 X 是计数的菌落形成单位/试样的平均值， B 是铺板的体积（0.1mL）， V 是消毒剂或PBS加中和剂的体积（40mL）， D 是稀释液。
等式 （7）
等式 （8）
等式 （4）
等式 （5）
等式 （6）
等式 （7）
等式 （8）4. 有机过氧酸根除生物膜功效的定性评价
注意：用消毒剂处理后（步骤3.1.1至步骤3.1.5），制备静态方法中在生物膜微量滴定板的钉子上形成的偶 氮假单胞菌 生物膜，并通过扫描电子和共聚焦显微镜观察进行分析。
- 扫描电子显微镜
- 将 200 μL 1x PBS 加入 96 孔微孔板的三个孔中。将盖子从生物膜微量滴定板（步骤3.1.5）转移到含有PBS的96孔微孔板上，并在室温下放置10秒以消除Dey-Engley中和肉汤。
- 使用无菌的针鼻钳从生物膜微量滴定板上取下钉子。将每个钉子放入罩下的空小瓶中，并向每个小瓶中加入初级固定剂（0.1M 二甲胂酸钠缓冲液pH 7.5中的5%戊二醛）。盖上每个小瓶并在4°C下孵育24小时。
- 孵育后，用移液管倒出固定剂，并将所有液体废物丢弃在适当的容器中。取下每个小瓶的盖子，并将它们放在罩子中风干72小时。
- 通过将环氧树脂（见材料表）涂在每根短管的平坦上表面，将样品安装在铝短管上（见材料表）。然后，用镊子小心地将钉子固定在存根上。
- 用 EMS950x + 350s 金溅射（参见 材料表）在 2 x 10−1 bar 氩气压力和 20 mA 电流下金属化样品 4 分钟。通过用银漆将钉子的侧面涂在未暴露于金的侧面来进行适当的接地（参见 材料表）。
- 使用SEM控制用户界面版本6.28在扫描电子显微镜上获取图像（参见 材料表）。本研究中使用的加速电压为15 kV，放大倍数分别为300倍和2，000倍。
- 共聚焦显微镜
- 将 200 μL 1x PBS 加入 96 孔微量滴定板的三个孔中。将盖子从生物膜微孔板转移到含有PBS的96孔板中，并放置10秒以消除Dey-Engley中和肉汤。
- 通过将 3 μL 绿色荧光染料和 3 μL 红色荧光染料（参见 材料表）加入 1 mL 无菌水中来制备荧光染料溶液。
- 将 200 μL 染色溶液加入 96 孔微量滴定板的一个孔中。将盖子从生物膜微量滴定板转移到含有染色溶液的96孔板中。用铝箔覆盖生物膜微量滴定板，并在室温下孵育样品20-30分钟。
- 将 200 μL 灭菌水加入 96 孔微孔板的孔中。然后，将盖子从生物膜微孔板转移到含有水的96孔微孔板上，并放置直到观察。
- 使用共聚焦激光扫描显微镜（参见 材料表）和63x / 1.40油DIC物镜可视化在钉子上形成的生物膜。使用相关软件获取图像（参见 材料表）。用于绿色和红色荧光染料的荧光激发波长分别为482 nm和490 nm。
注意：为获得最佳效果，请将钉子切开并放入60毫米培养皿中，然后用无菌水填充培养皿。
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Representative Results
SEM分析显示生物膜微孔板钉上存在由偶氮假单胞菌PFl1A产生的生物膜（图2A）。可以观察到三维生物膜结构。P. azotoformans PFl1A先前被确定为使用96孔微量滴定板12的强大生物膜生产者（A570>1.5）。
此外，使用生物反应器在不锈钢载玻片上形成的偶氮福曼斯PFl1A生物膜似乎非常致密，并显示出具有三维结构的成熟生物膜的形态特征（图2B）。此外，该分离株在动态系统中产生的生物膜的细菌计数结果显示，TSB培养基和无菌脱脂牛奶中的细胞密度分别对应于8.74 log CFU/cm 2和7.86 log CFU/cm 2（图2C）。
此外，用双歧杆菌分离物获得的图3所示结果表明，某些因素可以对生物反应器中的生物膜形成产生重要影响。通过改变一些参数，例如生物反应器内的搅拌速度、培养基流速、培养基营养浓度和连续模式步骤的持续时间，可以增强细胞附着，并且可以观察到更密集的生物膜。例如，将营养浓度从100 mg / L增加到900 mg / L（条件A与条件F相比）导致生物膜的细菌计数从6.11 log CFU / cm 2增加到8.71 log CFU/ cm 2。此外，当流速降低到6.0mL / min（在条件C中）时，观察到生物膜的显着生长，导致与该分离物的生长速率一致的更长的停留时间。
对生物膜微量滴定板或生物反应器消毒前和消毒后处理上形成的生物膜的显微镜观察与活细胞计数相辅相成。 图4 显示，在乳制品厂通常使用的消毒剂的接触时间（5分钟）和浓度（有机过氧酸为500ppm，过氧化氢为100，000ppm）下，没有一个生物膜含有可检测的活细胞。这些结果通过显微镜证实（图5）。 图5A 显示了未经处理的MBEC生物膜（对照）的三维结构，而处理过的MBEC生物膜（使用过氧化氢，过氧乙酸，过乳酸，过丙酸和商业消毒剂制剂）失去其三维构象，如SEM测定。然而，尽管用消毒剂处理生物膜，但仍然存在明显的生物膜结构，特别是过氧化氢。然而，使用活/死技术，在这种情况下，具有荧光活性染色的共聚焦显微镜（CM）证实，在消毒剂处理后，剩余的生物膜结构基本上没有生命（图5B）。
图1：代表静态和动态组合方法的流程图，用于评估有机过氧酸根除生物膜的有效性。 请点击此处查看此图的大图。
图2： 偶氮假单胞菌 PFl1A对生物膜形成的分析。 （A）在生物膜微量滴定板的钉子上形成的偶 氮假单胞菌PFl1A 生物膜的扫描电子显微照片（300x和2，000x）。该图经许可从 Goetz 等人 12 修改（版权所有 2022 美国微生物学会。保留所有权利。比例尺 = 50 μm （300x）， 100 μm （2，000x）。（B）扫描电子显微照片（2，000x）（1）含有在生物反应器中生长的偶 氮假单胞菌PFl1A 生物膜的不锈钢载玻片和（2）无生物膜载玻片（阴性对照）。比例尺 = 10 μm。该图经许可修改自Niboucha et al.16 。（三）在TSB培养基和无菌脱脂牛奶中的生物反应器中形成的偶 氮假单胞菌 PFl1A生物膜的细菌密度，并通过从不锈钢载玻片中超声去除后确定。数据以标准偏差±平均值表示（n = 3）。显著差异 （p < 0.05） 基于学生的 t 检验。该图经许可修改自Niboucha et al.16 。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用生物反应器在不同搅拌、流速、连续模式时间和培养基 （TSB） 条件下开发的囊 泡短单胞菌 生物膜的细菌密度。 条件 A：130 rpm 搅拌速度，11.8 mL/min 流速，在 100 mg/L TSB 培养基中连续 24 小时模式（根据 ASTM 国际协议 E2562-1714 关于 铜绿假单胞菌形成生物膜）;条件 B：60 rpm 搅拌速度，11.8 mL/min 流速，在 100 mg/L TSB 培养基中连续 24 小时;条件 C：60 rpm 搅拌速度，6.0 mL/min 流速，在 100 mg/L TSB 培养基中连续 24 小时;条件 D：60 rpm 搅拌速度，6.0 mL/min 流速，在 100 mg/L TSB 培养基中连续模式 48 小时;条件E：60 rpm搅拌速度，6.0 mL / min流速，在300 mg / L TSB介质中连续模式48小时;条件F：60 rpm 搅拌速度，6.0 mL/min 流速，在 900 mg/L TSB 培养基中连续模式 48 小时;条件 G：60 rpm 搅拌速度，6.0 mL/min 流速，2.7 g/L TSB 中的 24 小时间歇模式和 900 mg/L TSB 培养基中的 48 小时连续模式。数据以标准偏差±平均值表示（n = 3）。显著差异（不同的字母， p < 0.05）基于单因素方差分析和Tukey的多重比较检验。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：用过氧化氢、过乳酸、过丙酸、过氧乙酸或商业消毒剂处理前后和之后偶 氮假单胞 菌 PFl1A 生物膜中的活细胞计数。 每个点代表每个分离株在三个独立日获得的三次重复计数的平均值。数据以标准偏差±平均值表示（n = 3）。该图经许可从 Goetz 等人 12 修改（版权所有 2022 美国微生物学会。保留所有权利。 请点击此处查看此图的大图。
图5：生物膜结构和活力的显微镜观察。 （A）扫描偶氮假单胞菌PFl1A生物膜的电子显微照片（300x和2，000x）在用过氧化氢，过氧乙酸，过乳酸，过丙酸和商业消毒剂处理之前（对照）和之后在其最低生物膜根除浓度（MBEC）下形成在生物膜微量滴定板的钉子上。比例尺 = 10 μm。该图经许可从 Goetz 等人 12 修改（版权所有 2022 美国微生物学会。保留所有权利。（B） 在用过氧乙酸 （500 ppm） 处理之前（左）和之后（右）使用生物膜微孔板钉上的荧光细胞活力染色形成的生物膜的活力，通过共聚焦激光扫描显微镜（63x/1.40 油差分干涉对比物镜）可视化。活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色。比例尺 = 20 μm。该图经许可修改 Goetz 等人 12（版权所有 2022 美国微生物学会。保留所有权利。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
MBEC测定（生物膜微孔板测定）是第一种被ASTM17认可为标准生物膜根除测试的方法。我们的研究和其他研究表明，使用该测定时有两个关键步骤：超声处理步骤（时间和功率）和消毒剂处理时间18。斯图尔特和帕克还提出了可能影响测定结果的其他参数，例如微生物种类，生物膜年龄，表面积/体积比等。19. 最后，重要的是要注意，微孔板盖上的钉子周围生物膜的形成可能是异质的，并且会根据所使用的细菌而变化。
MBEC方法可以与各种类型的消毒剂一起使用。显微镜技术的使用，例如SEM和共聚焦显微镜，对于研究生物膜的三维结构和活力状态（荧光细胞活力染色试剂盒，见材料表）是互补的，并且对于研究消毒前和消毒后处理后的三维结构和活力状态（荧光细胞活力染色试剂盒，见 材料表）是互补的，分别12。由于执行的便利性和速度，细菌形成生物膜的能力主要用微量滴定板进行研究。然而，在大多数情况下，使用这种没有剪切力的封闭系统是有局限性的。因此，强烈建议使用动态生物膜形成方法（例如CDC生物反应器）来确认使用生物膜微孔板测定进行的观察。
根据ASTM标准化方法14，15和已发表的研究20，21，生物反应器广泛用于生长生物膜和评估消毒剂的功效。该装置模拟生物膜形成的某些环境条件，例如在高剪切力、特定和可再生营养素以及表面材料方面。在这项研究中，使用该动态系统在不锈钢载玻片上获得了可重现的成熟偶氮假单胞菌PFlA1菌株生物膜。这里介绍的方案基于使用铜绿假单胞菌的ASTM标准方案。然而，这种标准化的生物膜方法不能适用于所有微生物，即使它们已被证明是使用其他技术的强大生物膜生产者。 B. vesicularis就是这种情况，必须对其进行方案优化以达到更高的生物膜密度。
先前的研究表明，一些操作条件（或参数）在生物膜发育过程中至关重要，必须适应测试的每个细菌22，23，24。例如，必须根据偏好和浓度25调整每种细菌的营养需求。此外，已经表明，在生物反应器中的连续养分供应条件下，生物膜比在分批模式下生长时更厚，并且具有更显着的生物量，这被认为是营养有限的环境26。另一个重要方面是停留时间，它由流速控制，应进行调整以使其比细菌倍增时间短。此外，必须针对每种细菌调节流体的温度和剪切混合，以提供最佳的生长条件27。挡板运动产生的高剪切应力促进了生物膜的发展，并在控制其结构和厚度方面发挥作用28。但是，如果搅拌速度增加太多，则会导致生物膜表面的侵蚀或脱落，从而导致细菌密度降低29，30。
生物反应器的使用有一些局限性，例如除了使用大量流体作为营养培养基外，它还昂贵且耗时。尽管如此，它仍然是形成和研究生物膜的一种高度可重复和可重复的方法。生物反应器的使用还允许同时使用由不同材料制成的多个优惠券。生物反应器设计用于监测生物膜生长过程中的实验条件，例如温度、搅拌速度和流速，并允许回收均匀且具有代表性的生物膜以供后续分析。总体而言，静态和动态方法对于体 外 研究消毒剂对从食品和环境部门分离的生物膜的功效是互补的。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了魁北克生物工业研究与创新联盟（CRIBIQ）（2016-049-C22），Agropur，Groupe Sani Marc和加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（RDCPJ516460-17）的支持。我们感谢Teresa Paniconi对手稿的批判性审查。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
| 316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| 96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
| Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
| Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
| AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
| Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
| Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
| Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
| EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
| Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
| Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
| Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
| FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at - 20 °C |
| Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
| Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
| Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
| Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
| Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
| Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
| Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
| Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
| Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
| Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
| Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
| Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
| Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
| Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
| Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
| Vortex | Cole Parmer | UZ-04724-00 | |
| Water bath | VWR | 89202-970 | |
| Zen software | Zeiss |
References
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