Summary
이 프로토콜은 낙농 산업에서 생물막을 박멸하기 위한 유기 퍼옥시산의 효능을 평가하기 위해 정적 및 동적 방법을 결합한 접근 방식을 설명합니다. 이 접근법은 또한 생물막을 제어하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형의 효과를 시험하기 위해 사용될 수 있다.
Abstract
낙농 산업에서 생물막의 존재는 가공 공장에서 자주 사용되는 대부분의 CIP(clean-in-place) 절차에 대한 높은 내성으로 인해 안전하지 않고 변경된 유제품의 생산으로 이어질 수 있기 때문에 주요 관심사입니다. 따라서 낙농 산업을 위한 새로운 생물막 제어 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜은 정적 및 동적 방법의 조합을 사용하여 유제품 생물막을 박멸하기 위한 유기 과록시산(과초산, 과프로피온산 및 과락트산 및 상업용 과초산 기반 소독제)의 효능을 평가하는 것을 목표로 합니다. 모든 소독제는 정적 고처리량 스크리닝 방법인 최소 생물막 박멸 농도(MBEC) 분석을 사용하여 단일 또는 혼합 생물막에서 가장 강력한 생물막 생성 박테리아에 대해 테스트되었습니다. 권장 농도의 소독제와 5분의 접촉 시간으로 단일 및 혼합 생물막을 모두 성공적으로 박멸했습니다. 현장 조건을 모방하는 동적 방법인 질병 통제 센터(CDC) 생물막 반응기를 사용하여 이러한 관찰을 확인하기 위한 연구가 현재 진행 중입니다. 이러한 유형의 생물 반응기는 대부분의 산업 장비 및 표면을 구성하는 스테인리스 스틸 표면을 사용할 수 있습니다. 반응기의 예비 결과는 생물막에 대한 유기 퍼옥시산의 효능을 확인하는 것으로 보입니다. 이 연구에서 설명된 결합된 접근 방식은 생물막을 제어하고 미생물을 박멸하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형을 개발하고 테스트하는 데 사용될 수 있습니다.
Introduction
낙농 산업은 캐나다를 포함하여 전 세계적으로 주요 산업 부문으로, 10,500개 이상의 낙농장에서 매년 약 9,000만 hL의 우유를 생산하고 있습니다1. 가공 공장을 포함하여 낙농 산업에서 부과되는 엄격한 위생 요구 사항에도 불구하고 우유는 미생물을 위한 훌륭한 배양 배지를 구성하므로 유제품에는 부패 또는 병원성 미생물을 포함한 미생물이 포함될 가능성이 높습니다. 이 병원체는 다양한 질병을 일으킬 수 있습니다. 예를 들어, 살모넬라균 과 리스테리아 모노사이토제네스는 각각 위장염과 수막염을 유발할 수 있다2. 부패 미생물은 가스, 세포외 효소 또는 산을 생성하여 유제품의 품질과 관능적 특성에 영향을 미칠 수 있다3. 우유의 모양과 색상은 예를 들어 Pseudomonas spp.4에 의해 변경될 수도 있습니다.
이러한 미생물 중 일부는 스테인리스 스틸을 포함하여 다양한 표면에 생물막을 형성할 수 있습니다. 이러한 생물막은 장비 표면의 미생물의 지속성 및 증식을 가능하게 하여 유제품의 오염을 가능하게 한다5. 생물막은 또한 열 전달을 방해하고 장비의 부식을 가속화하여 장비의 조기 교체로 이어져 경제적 손실을 초래하기 때문에 문제가 된다6.
CIP(Clean-in-Place) 절차를 통해 식품 산업은 미생물의 성장을 제어할 수 있습니다. 이러한 절차에는 수산화 나트륨, 질산 및 때로는 하이포아염소산 및과 아세트산 7,8을 함유 한 살균제의 순차적 사용이 포함됩니다. 하이포아염소산은 미생물에 대해 매우 효과적이지만 천연 유기물과도 반응하여 독성 부산물을 형성합니다9. 과초산은 유해한 부산물을 생성하지 않는다10; 그러나 식품 산업에서 생물막에 대한 효과는 매우 다양합니다10,11. 최근에, 퍼프로피온산 및 퍼락트산을 포함한 다른 퍼옥시산이 항균 활성에 대해 연구되었으며, 이들은 생물막에서 미생물 성장을 조절하기 위한 좋은 대안으로 보인다12,13.
따라서 본 연구는 최소 생물막 박멸 농도(MBEC) 분석법, 정적 고처리량 스크리닝 방법, 질병통제센터(CDC) 생물막 반응기, in situ를 모방한 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 유제품 생물막 박멸을 위한 유기 과록시산(과초산, 과프로피온산, 과락트산 및 과초산 기반 소독제)의 효능을 평가하는 것을 목표로 했습니다 여건. MBEC 분석은 이후 프로토콜에서 "생물막 마이크로타이터 플레이트"로 지칭된다. 여기에 제시된 프로토콜과 대표적인 결과는 유기 퍼옥시산의 효능과 낙농 산업에서 미생물 생물막을 제어하기 위한 잠재적 응용을 보여줍니다.
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Protocol
이 기사에 포함 된 작업에는 생물 안전 레벨 2 실험실이 필요하며 Université Laval 기관 생물 안전위원회에서 이전에 승인 (프로젝트 번호 119689)했습니다.
참고: 그림 1 의 순서도는 생물막 박멸을 위한 유기 퍼옥시산의 효능을 평가하는 데 사용된 정적 및 동적 접근 방식을 결합한 방법론의 요약을 나타냅니다.
1. 재료 준비
- 미생물 분리
- 사용하기 15분 전에 생물 안전 작업대(BSC)를 켜고 70%(v/v) 알코올 용액으로 세척하십시오.
- BSC가 멸균되면 테스트할 미생물 분리물 바이알(이 연구에서는 Pseudomonas azotoformans 또는 Brevundimonas vesicularis ), 접종 루프, 10mL의 멸균 트립신 대두 액체(TSB)로 채워진 15mL 튜브 및 볼텍스 믹서. BSC에 배치하기 전에 모든 재료를 알코올로 소독하십시오.
- 배양물을 균질화하기 위해 분리된 미생물 바이알을 소용돌이.
- 미생물 분리물 20μL를 15mL 튜브에 들어 있는 멸균 TSB 10mL로 무균적으로 옮기고 160rpm에서 교반하면서 30°C에서 16-24시간 동안 배양합니다.
주의: B. vesicularis는 병원성 유기체를 취급하는 데 필요한 지침에 따라 격리 레벨 2 실험실에서 사용해야 합니다. 핸들러는 적절한 교육을 받아야 하며 보안경, 장갑 및 코트를 착용해야 합니다.
- 소독 제
- 유기 퍼옥시산 용액(60mL)을 준비하기 위해 24mL의 과산화수소와 36mL의 산(아세트산, 프로피온산 또는 젖산)을 250mL 삼각 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 미리 정의된 부피 10M 황산(과아세트산의 경우 655μL, 과프로피온산의 경우 635μL, 과젖산의 경우 715μL)을 추가합니다. 플라스크를 부드럽게 흔들어 혼합하고, 플라스크를 케미컬 후드 내부에 설치된 30°C 수조에 넣는다. 플라스크를 2일 동안 배양하고 매일 아침 부드럽게 혼합합니다.
알림: 상업용 과초산 기반 소독제( 재료 표 참조)는 제조업체에서 직접 제공했습니다.
주의 : 소독제는 화학 후드 아래에서 사용해야 합니다. 실험 기간 동안 보안경과 장갑을 착용해야 합니다. 소독제에 대한 자세한 내용은 해당 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오. - 아래에 설명된 대로 과산화수소의 적정을 수행합니다.
- 빈 300mL 비커를 분석 저울( 재료 표 참조)에 놓고 저울의 무게를 측정합니다. 약 0.23g의 소독제를 비커에 넣고 정확한 무게를 기록하십시오. 차가운 1N 황산 용액 100g을 비커에 넣고 마그네틱 교반 막대를 비커에 넣고 교반 플레이트에 놓습니다.
- 용액이 완전히 균질화될 때까지 저어줍니다. 그런 다음 페로인 지시약 용액(H2O중 0.1wt%)을 비커에 3방울 떨어뜨리고 용액이 연어 분홍색에서 밝은 파란색으로 변할 때까지 0.1N 황산세륨 용액으로 적정합니다. 첨가된 황산세륨 용액의 부피에 유의하십시오.
- 다음 공식을 사용하여 과산화수소의 백분율을 계산하십시오.
식 (1)
여기서 S는 첨가된 황산세륨 용액의 부피이고, N은 황산세륨 용액의 정규성(0.1N), W는 시료의 중량(~0.2300g), 0.017 = (1mol H2O 2/2mol Ce) ×(34.0147g H2O2/1molH2O)2×(1L/1,000mL)
- 아래에 설명된 대로 유기 퍼옥시산의 적정을 수행합니다.
- 7.5%(w/v) 요오드화칼륨 용액 20mL를 비커에 넣습니다. 용액의 파란색이 옅은 갈색/주황색으로 변하기 시작할 때까지 0.1N 티오황산나트륨 용액으로 천천히 적정합니다.
- 전분 용액 2mL(H2O중 1wt%)를 비커에 넣고 용액이 검은색에서 주황색으로 변할 때까지 0.1N 티오황산나트륨 용액으로 적정합니다. 사용된 티오황산나트륨 용액의 부피에 유의하십시오.
- 다음 공식을 사용하여 유기 peroxyacid의 백분율을 계산하십시오.
식 (2)
여기서 T는 사용된 티오황산나트륨 용액의 부피이고, N은 티오황산나트륨 용액(0.1N)의 정규성이고, W는 시료의 중량(~0.2300g)이며, 0.038 = (1몰 CH3COOOH/1몰 I2) ×(1몰I2/2몰S2O3) ×(76.06g/1몰 CH3COOOH) ×(1L/1,000mL)
알림: 1.2.2 단계와 1.2.3 단계를 두 개 더 반복하십시오.amples를 사용하여 각 테스트를 세 번 수행합니다.
- 유기 퍼옥시산 용액(60mL)을 준비하기 위해 24mL의 과산화수소와 36mL의 산(아세트산, 프로피온산 또는 젖산)을 250mL 삼각 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 미리 정의된 부피 10M 황산(과아세트산의 경우 655μL, 과프로피온산의 경우 635μL, 과젖산의 경우 715μL)을 추가합니다. 플라스크를 부드럽게 흔들어 혼합하고, 플라스크를 케미컬 후드 내부에 설치된 30°C 수조에 넣는다. 플라스크를 2일 동안 배양하고 매일 아침 부드럽게 혼합합니다.
식 (1)
식 (2)2. 단일 및 혼합 생물막의 형성
- 생물막 마이크로타이터 플레이트
- 박테리아 배양물(균주 20 μL + TSB 배지 10 mL, 단계 1.1.4에서 제조)이 들어있는 튜브를 와동시킨다. 트립신 대두 한천(TSA)에 대한 연속 희석 및 플레이팅을 수행하여 하룻밤 배양의 박테리아 세포 수(cfu)를 결정합니다. 그런 다음 배양물 100μL를 멸균 TSB 배지 10mL에 무균적으로 옮깁니다(최종 농도 약 2 x 107 cfu/mL).
참고: 바이오리액터를 사용한 분석을 위해 100μL의 부피의 미생물 분리물을 100mL의 멸균 TSB로 옮깁니다. - 튜브를 소용돌이. 각 박테리아에 대해 희석된 박테리아 배양물을 멀티채널 피펫을 사용하여 생물막 마이크로타이터 플레이트(웰당 150μL)에 3회 옮깁니다. 150μL의 TSB 배지를 3개의 새 웰에 로드하여 대조군으로 사용합니다. 생물막 마이크로타이터 플레이트( 재료 표 참조)를 교반 없이 30°C에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.
참고: 혼합 생물막 분석의 경우 각 현탁액 75μL를 추가하여 총 부피 150μL를 만듭니다. 생물막 미세 역가 플레이트에는 생물막이 형성되는 뚜껑에 못이 있습니다.
- 박테리아 배양물(균주 20 μL + TSB 배지 10 mL, 단계 1.1.4에서 제조)이 들어있는 튜브를 와동시킨다. 트립신 대두 한천(TSA)에 대한 연속 희석 및 플레이팅을 수행하여 하룻밤 배양의 박테리아 세포 수(cfu)를 결정합니다. 그런 다음 배양물 100μL를 멸균 TSB 배지 10mL에 무균적으로 옮깁니다(최종 농도 약 2 x 107 cfu/mL).
- 생물 반응기
- 제조업체의 지침에 따라 생물 반응기의 부품( 재료 표 참조)을 세척 및 자연 건조하고 아래에 설명된 대로 반응기 준비를 진행합니다.
- 먼저, 마그네틱 바에 의해 홀더에 부착된 1L 유리 비커(바이오리액터) 내부에 플랫 블레이드를 놓고 바이오리액터 뚜껑 안쪽에 부착된 플라스틱 바를 사용하여 설정을 똑바로 유지합니다.
- 드라이버를 사용하여 스테인리스 스틸 쿠폰 또는 슬라이드( 재료 표 참조)를 폴리프로필렌 막대에 놓고 정렬 핀을 노치에 넣지 않고 뚜껑의 구멍에 삽입하여 멸균 중에 증기가 빠져나갈 수 있도록 합니다.
- 모든 바이오리액터 통풍구를 알루미늄 호일로 덮고 나머지 장비, 즉 튜빙 L/S 18(ID = 7.9mm) 및 L/S 16(ID = 3.1mm), 유리 흐름 차단기, 용기 캡, 드라이버, 집게 및 0.2μm 필터를 알루미늄 호일로 감쌉니다.
알림: 실리콘 튜브( 재료 표 참조)를 중간 용기 캡의 내부 표면에 있는 미늘에 삽입합니다. - 121°C에서 20분 동안 건조 사이클로 설정된 바이오리액터를 오토클레이브합니다.
- 배치 모드에서 생물막 형성을 생물막 형성을 수행합니다(첫 번째 단계).
- BSC에서 튜브 L/S 18의 한쪽 끝을 생물반응기의 출구 스파우트에 연결하고 다른 쪽 끝을 알루미늄 호일로 싸서 무균 상태를 유지합니다.
- 바이오리액터 뚜껑에서 쿠폰 또는 슬라이드 홀더 1개를 제거하고 멸균된 50mL 튜브에 넣습니다. 그 후, 50mL 혈청학적 피펫을 사용하여 막대가 차지한 구멍을 통해 생물반응기의 비커에 300mg/L TSB 배지 340mL를 채웁니다.
- 이전에 사용한 것과 동일한 오리피스를 통해 5mL 피펫을 사용하여 1mL의 박테리아 용액(~108cfu /mL의 P. azotoformans)으로 생물반응기의 배양 배지를 접종한 다음 막대를 원래 위치로 되돌립니다. 핀이 각각의 노치에 맞도록 뚜껑 구멍에 이미 배치된 막대를 배치합니다.
- 0.2μm 박테리아 공기 퍼지 필터를 바이오리액터 뚜껑에 있는 가장 작은 직경의 튜브 끝에 놓습니다. 동일한 직경의 다른 튜브는 금속 나사 캡 또는 단단히 닫히는 실리콘 플러그로 영구적으로 막힌 상태로 유지됩니다.
- 30°C로 설정된 가열판 위에 생물반응기를 24시간 동안 놓고 130 rpm으로 교반한다.
참고: 다종 생물막 형성의 경우 동일한 부피의 다른 박테리아 배양을 사용하여 접종물을 위한 총 부피 1mL를 얻습니다.
- 연속 흐름 모드에서 생물막 형성을 생물막 형성을 수행합니다(두 번째 단계).
- BSC에 멸균 증류수 18L가 포함된 카보이를 넣고 1,000mg/L TSB 배양액 2L를 첨가하여 최종 농도 100mg/L를 얻습니다.
- 두 개의 튜브가 연결된 멸균 캡으로 용기를 덮으십시오. 첫 번째는 캡의 내부면에 고정 된 실리콘 튜브이며 매체를 펌핑하는 데 사용됩니다. 두 번째 튜브(L/S 16)는 액체가 바이오리액터로 흐를 수 있도록 외부 포트에 연결됩니다. 0.2μm 필터를 배지 용기 뚜껑의 두 번째 튜브에 넣습니다.
- 이 두 번째 튜브를 연동 펌프에 연결하고 다른 쪽 끝을 유리 흐름 차단기에 조인한 다음 바이오리액터 뚜껑의 더 큰 튜브에 삽입합니다.
- 또 다른 20L 카보이를 사용하여 바이오리액터에서 폐수를 수집합니다. 생물 반응기 배출구에 연결된 튜브의 끝을 폐기물 용기의 캡에 부착합니다. 이 용기의 뚜껑에 있는 튜브에 0.2μm 필터를 삽입합니다.
- 11.3mL/분의 유속으로 연동 펌프를 시작하고 시스템을 24시간 동안 작동 상태로 둡니다.
참고: 생물반응기에서 생물막 형성 중에 사용된 배양액 또는 우유의 유속(11.3mL/분)은 340mL(반응기 내 액체의 부피에 해당)를 30분의 체류 시간으로 나누어 결정했습니다.
- 박테리아 생물막을 회수합니다.
- 연동 펌프를 끄고 바이오리액터의 교반 및 가열을 중지합니다.
- 바이오리액터로부터 각 로드를 조심스럽게 제거하고, 플랑크톤 박테리아를 제거하기 위해 40 mL의 PBS에서 쿠폰 또는 슬라이드를 3배 헹굽니다. 그런 다음 적절한 드라이버를 사용하여 40mL의 PBS가 들어 있는 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 쿠폰 또는 슬라이드를 놓습니다. 튜브를 30초 동안 소용돌이치고, 초음파 처리기 욕조에 놓인 랙으로 옮기고, 튜브를 40kHz에서 30초 동안 초음파 처리합니다(110W의 전력이 필요함). 이 작업을 3회 반복합니다.
- 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 40mL 생물막 현탁액을 수집한 다음 쿠폰 또는 슬라이드를 2mL의 멸균 PBS 용액으로 헹굽니다. 이 헹굼 액체를 회수하여 이미 수집 된 생물막 현탁액에 첨가하십시오.
- 생물막에서 생존 가능한 박테리아 열거: 얻은 생물막 현탁액으로 10배 연속 희석을 수행한 다음 TSA에서 10-5 및 10-6 희석액 100μL를 세 번 플레이트합니다. 플레이트를 30°C에서 24시간 동안 인큐베이션합니다. 한천 플레이트에 존재하는 콜로니의 수를 세고, 다음 공식을 사용하여 ASTM E2562-1714에 따라 쿠폰 및 슬라이드 상의 박테리아 밀도(생존 가능한 고착 박테리아)를 계산합니다.
식 (3)
여기서 X 는 콜로니 형성 단위(CFU)의 수, B 는 도금된 부피(0.1mL), V 는 생물막이 현탁되는 부피(원액), A 는 생물막으로 덮인 쿠폰 또는 슬라이드의 표면, D 는 희석 계수입니다.
- 제조업체의 지침에 따라 생물 반응기의 부품( 재료 표 참조)을 세척 및 자연 건조하고 아래에 설명된 대로 반응기 준비를 진행합니다.
식 (3)3. 생물막 박멸을 위한 유기 과록시산의 효능에 대한 정량적 평가
- 생물막 마이크로타이터 플레이트
- 200μL의 인산염 완충 식염수(1x PBS)를 96웰 마이크로플레이트의 3개 웰에 추가합니다.
- 생물막을 세척하고 플랑크톤 박테리아를 제거하기 위해 못 위에 형성된 생물막이 있는 생물막 마이크로플레이트의 뚜껑을 PBS가 들어 있는 96웰 마이크로플레이트로 10초 동안 옮깁니다.
- 필요한 농도(예: 활성 물질 25ppm, 50ppm, 500ppm, 1,000ppm, 5,000ppm, 10,000ppm 및 25,000ppm)로 소독제를 준비합니다.
알림: 모든 희석액은 멸균 증류수를 사용하여 무균 상태로 만들어집니다. - 각 농도의 소독제 200μL를 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 세 번 추가합니다. 생물막 마이크로타이터 플레이트의 뚜껑을 소독제가 들어 있는 이 96웰 마이크로타이터 플레이트로 옮기고 원하는 노출 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.
- 200μL의 Dey-Engley 중화 브로스를 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 추가합니다. 생물막 마이크로타이터 플레이트의 뚜껑을 중화 브로스가 들어있는 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 옮긴다. 마이크로타이터 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 30분 동안 40kHz의 수조 초음파 처리기에 넣습니다.
- 30분 후, 초음파 처리기로부터 마이크로타이터 플레이트를 제거하고 파라필름을 제거한다. 초음파 처리 후 분리된 생물막이 포함된 96웰 플레이트의 첫 번째 컬럼에서 100μL를 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트의 첫 번째 행으로 옮깁니다.
- 첫 번째 행을 제외하고 180μL의 멸균 96웰 마이크로플레이트(단계 3.1.6에서 준비됨)의 웰에 추가합니다. 생물막 용액 20 μL를 첫 번째 행에서 1x PBS 180 μL가 들어 있는 두 번째 행의 웰로 옮깁니다(행 2, 희석: 10-1). 그런 다음 두 번째 줄에 포함된 액체 20μL를 1x PBS 180μL가 들어 있는 다음 줄의 웰로 옮깁니다(행 3, 희석: 10-2). 동일한 절차를 반복하여 10-5와 10-7 사이의 희석액을 얻습니다.
- 희석액 100 μL를 TSA에 접종하고 각 박테리아의 성장에 필요한 매개 변수에 따라 플레이트를 배양합니다.
- 배양 후 cfus를 계산하고 다음 방정식을 사용하여 각 페그에 대한 로그10 밀도와 각 소독제 농도에서 로그10 감소를 계산합니다.
식 (4)
여기서 X는 스팟에서 계수된 콜로니 형성 단위이고, B는 도말된 부피(0.01mL), V는 웰 부피(0.20mL), A는 페그 표면적(46.63mm2), D는 희석액입니다.
식 (5) - 독립적인 날에 각 실험을 3회 반복합니다.
참고: "생물막을 박멸하는 소독제의 최소 농도"(MBEC)는 박테리아 성장을 나타내지 않는 가장 낮은 소독제 농도에 해당합니다.
- 생물 반응기
알림: ASTM 표준 E2871-1915 의 절차에 따라 P. azotoformans PFlA1로 이 테스트를 수행합니다.- 단계 2.2에 설명된 바와 같이 바이오리액터의 쿠폰 상에 바이오필름을 형성하는 것으로 시작한다. 그런 다음 쿠폰을 고정하는 막대를 제거하고 PBS 30mL가 들어 있는 원추형 튜브 안에서 헹굽니다.
- 드라이버를 사용하여 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 각 쿠폰을 떨어뜨린 다음 대조군에 적절한 유기 퍼옥시산 용액 또는 PBS 4mL를 추가합니다. 5분 동안 배양한 다음 Dey-Engley 중화액 36mL를 추가합니다. 30초 동안 소용돌이친 다음 초음파 처리기 수조를 사용하여 30초 동안 40kHz에서 초음파 처리합니다. 이 과정을 3x 반복하여 생물막 현탁액을 얻습니다.
- 마찬가지로 다른 모든 막대를 헹구고 쿠폰에서 생물막을 회수하십시오. 생물막 현탁액을 연속적으로 희석하고 TSA 배지에서 0.1mL를 플레이트합니다. 플레이트를 30°C에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.
- 인큐베이션 후, cfus를 계수한 후, 다음 방정식을 사용하여 각 쿠폰에 대한 생물막 밀도(식 6), 처리 및 대조군(식 7), 및 소독제에 대한 로그 감소(식 8)를 포함하는 동일한 로드로부터의 3개의 쿠폰 각각의 세트에 대한 평균 로그 밀도(LD)를 계산한다.
식 (6)
여기서 X 는 계수/쿠폰된 집락 형성 단위의 평균이고, B 는 도말된 부피(0.1mL), V 는 소독제 또는 PBS와 중화제의 부피(40mL), D 는 희석입니다.
식 (7)
식 (8)
식 (4)
식 (5)
식 (6)
식 (7)
식 (8)4. 생물막 박멸을 위한 유기 퍼옥시산의 효능에 대한 정성적 평가
참고: 소독제로 처리한 후(단계 3.1.1 내지 단계 3.1.5), 정적 방법으로 생물막 마이크로타이터 플레이트의 못에 형성된 P. 아조토포르만스 생물막을 제조하고 주사 전자 및 공초점 현미경 관찰에 의해 분석하였다.
- 주사전자현미경(SEM)
- 200μL의 1x PBS를 96웰 마이크로플레이트의 3개 웰에 추가합니다. 뚜껑을 생물막 마이크로타이터 플레이트(단계 3.1.5)로부터 PBS를 함유하는 96-웰 마이크로플레이트로 옮기고, 이를 실온에서 10초 동안 방치하여 데이-엥글리 중화 브로스를 제거하였다.
- 멸균된 니들 노즈 플라이어를 사용하여 생물막 마이크로타이터 플레이트에서 못을 제거합니다. 각 못을 후드 아래의 빈 바이알에 넣고 각 바이알에 1차 고정액(0.1M Na 카코딜레이트 완충액 pH 7.5에 5% 글루타르알데히드)을 추가합니다. 각 바이알의 뚜껑을 덮고 4°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 배양 후 피펫으로 고정액을 디캔팅하고 모든 액체 폐기물을 적절한 용기에 버립니다. 각 바이알의 캡을 제거하고 후드에 넣어 72시간 동안 자연 건조시킵니다.
- 각 스텁의 평평한 윗면에 에폭시 수지(재료 표 참조)를 적용하여 알루미늄 스텁(재료 표 참조)에 샘플을 장착합니다. 그런 다음 집게로 못을 스텁에 조심스럽게 부착하십시오.
- EMS950x + 350s 금 스퍼터(재료 표 참조)로 2 x 10-1bar 아르곤 압력 및 20mA 전류에서 4분 동안 샘플을 금속화합니다. 금에 노출되지 않은 못의 측면을 은색 페인트로 칠하여 적절한 접지를 수행합니다(재료 표 참조).
- SEM control 사용자 인터페이스 버전 6.28을 사용하여 주사 전자 현미경에서 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조). 본 연구에 사용된 가속전압은 15kV였고, 배율은 300x와 2,000x였다.
- 컨포칼 현미경
- 200μL의 1x PBS를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 3개 웰에 추가합니다. 뚜껑을 생물막 마이크로플레이트로부터 PBS를 함유하는 96-웰 플레이트로 옮기고, 이를 10초 동안 방치하여 데이-엥글리 중화 브로스를 제거한다.
- 멸균수 3mL에 녹색 형광 염색 3μL와 적색 형광 염색( 재료 표 참조) 1μL를 추가하여 형광 얼룩 용액을 준비합니다.
- 200 μL의 염색 용액을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 한 웰에 넣는다. 뚜껑을 생물막 마이크로타이터 플레이트에서 염색 용액이 들어 있는 96웰 플레이트로 옮깁니다. 생물막 마이크로타이터 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 20-30분 동안 샘플을 배양합니다.
- 200μL의 멸균수를 96웰 마이크로플레이트의 웰에 추가합니다. 이어서, 바이오필름 마이크로플레이트로부터 물을 함유하는 96-웰 마이크로플레이트로 뚜껑을 옮기고, 관찰될 때까지 그대로 둔다.
- 63x/1.40 오일 DIC 대물렌즈가 있는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경( 재료 표 참조)을 사용하여 못에 형성된 생물막을 시각화합니다. 관련 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조). 녹색 및 적색 형광 염색에 사용된 형광 여기 파장은 각각 482nm와 490nm였다.
알림: 최상의 결과를 얻으려면 못을 잘라 60mm 페트리 접시에 넣고 접시에 멸균수를 채웁니다.
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Representative Results
SEM 분석은 생물막 마이크로플레이트 못 상에서 P. azotoformans PFl1A에 의해 생성된 생물막의 존재를 보여줍니다(그림 2A). 3차원 생물막 구조를 관찰할 수 있습니다. P. 아조토포르만스 PFl1A는 이전에 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 강력한 생물막 생산자(A570 > 1.5)로 확인되었다12.
또한, 생물반응기를 이용하여 스테인리스 스틸 슬라이드 상에 형성된 P. azotoformans PFl1A 생물막은 매우 치밀한 것으로 나타났으며, 3차원 구조를 갖는 성숙한 생물막의 형태학적 특성을 나타내었다(도 2B). 또한, 동적 시스템에서 이 분리주에 의해 개발된 생물막의 박테리아 계수 결과는 TSB 배양 배지 및 멸균 탈지유에서 각각 8.74 log CFU/cm2 및 7.86 log CFU/cm2에 해당하는 상당한 세포 밀도를 보여주었습니다(그림 2C).
또한, B. vesicularis 분리물로 얻은 그림 3에 표시된 결과는 특정 요인이 생물 반응기에서 생물막 형성에 중요한 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다. 바이오리액터 내의 교반 속도, 배지 유속, 배지 영양소 농도 및 연속 모드 단계의 지속 시간과 같은 일부 파라미터를 변화시킴으로써, 세포 부착이 향상될 수 있고, 더 조밀한 바이오필름이 관찰될 수 있다. 예를 들어, 영양소 농도를 100mg/L에서 900mg/L로 증가시키면(조건 F와 비교하여 조건 A) 생물막의 박테리아 수가 6.11 log CFU/cm2에서 8.71 log CFU/cm2로 증가했습니다. 또한, 유속이 6.0mL/분으로 감소했을 때(조건 C에서) 생물막의 상당한 성장이 관찰되었으며, 그 결과 이 분리주의 성장 속도와 일치하는 더 긴 체류 시간이 발생했습니다.
생물막 마이크로타이터 플레이트 또는 생물반응기 소독제 처리 전후에 형성된 생물막의 현미경 관찰은 생존 세포 수를 보완했습니다. 그림 4 는 낙농 공장에 일반적으로 적용되는 소독제의 접촉 시간(5분) 및 농도(유기 과록산의 경우 500ppm, 과산화수소의 경우 100,000ppm)에서 검출 가능한 생존 세포를 생물막에 포함하지 않았음을 보여줍니다. 이러한 결과는 현미경으로 확인되었습니다(그림 5). 도 5A 는 처리되지 않은 MBEC 생물막(대조군)의 3차원 구조를 보여주며, 처리된 MBEC 생물막(과산화수소, 과초산, 과락트산, 과프로피온산 및 상업용 소독제 제제 포함)은 SEM에 의해 결정된 바와 같이 3차원 형태를 잃는다. 그러나, 생물막은 소독제로 처리되었지만, 특히 과산화수소와 함께 명백한 생물막 구조가 남아있었습니다. 그럼에도 불구하고, 형광 생존 가능성 염색을 통한 생/사멸 기술(이 경우 컨포칼 현미경(CM))을 사용하여 소독제 처리 후 나머지 생물막 구조가 주로 생명이 없는 것을 확인했습니다(그림 5B).
그림 1: 생물막 박멸을 위한 유기 과록산의 효과를 평가하기 위한 결합된 정적 및 동적 접근 방식을 나타내는 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 슈도모나스 아조토포르만스 PFl1A에 의한 생물막 형성 분석. (A) 생물막 미세역가 플레이트의 못 상에 형성된 P. 아조토포르만스 PFl1A 생물막의 주사전자현미경 사진(300x 및 2,000x). 이 수치는 Goetz et al.12 의 허가를 받아 수정되었습니다(Copyright 2022 American Society for Microbiology. 판권 소유.). 스케일 바 = 50 μm (300x), 100 μm (2,000x). (b) (1) 생물반응기에서 성장한 P. 아조토포르만스 PFl1A 생물막을 함유하는 스테인리스강 슬라이드 및 (2) 생물막이 없는 슬라이드(음성 대조군)의 주사전자현미경 사진(2,000x). 스케일 바 = 10 μm. 이 수치는 Niboucha et al.16 의 허가를 받아 수정되었습니다. (씨) P. azotoformans PFl1A 생물막의 박테리아 밀도는 TSB 배양 배지 및 멸균 탈지유에서 생물반응기에서 형성되고 스테인리스 스틸 슬라이드에서 초음파에 의해 제거된 후 결정됩니다. 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표시됩니다. 유의한 차이(p < 0.05)는 스튜던트 t-검정을 기반으로 합니다. 이 수치는 Niboucha et al.16 의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 교반, 유속, 연속 모드에서의 시간 및 배양 배지(TSB)의 다양한 조건에서 바이오리액터를 사용하여 개발된 Brevundimonas vesicularis 생물막의 박테리아 밀도. 조건 A: 100 mg/L TSB 배지에서 교반 속도 130 rpm, 유속 11.8 mL/min, 24시간 연속 모드 (녹농균에 의한 생물막 형성을 위한 ASTM 국제 프로토콜 E2562-1714에 따름); 조건 B: 교반 속도 60rpm, 유속 11.8mL/분, 100mg/L TSB 배지에서 24시간 연속 모드; 조건 C: 교반 속도 60 rpm, 유속 6.0 mL/분, 100 mg/L TSB 배지에서 24시간 연속 모드; 조건 D: 교반 속도 60 rpm, 유속 6.0 mL/분, 100 mg/L TSB 배지에서 48시간 연속 모드; 조건 E: 교반 속도 60 rpm, 유속 6.0 mL/분, 300 mg/L TSB 배지에서 48시간 연속 모드; 조건 F: 60 rpm 교반 속도, 6.0 mL/min 유속, 900 mg/L TSB 배지에서 48시간 연속 모드; 조건 G: 교반 속도 60rpm, 유속 6.0mL/분, 2.7g/L TSB에서 24시간 배치 모드 및 900mg/L TSB 배지에서 48시간 연속 모드. 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표시됩니다. 유의한 차이(다른 문자, p < 0.05)는 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 검정을 기반으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 과산화수소, 과락트산, 과프로피온산, 과아세트산 또는 상업용 소독제로 처리하기 전과 후의 슈도모나스 아조토포르만스 PFl1A 생물막의 생존 세포 수. 각 점은 각 분리주에 대해 독립적인 3일 동안 얻은 삼중 카운트의 평균을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표시됩니다. 이 수치는 Goetz et al.12 의 허가를 받아 수정되었습니다(Copyright 2022 American Society for Microbiology. 판권 소유.). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 생물막 구조 및 생존력의 현미경 관찰. (A) 과산화수소, 과초산, 퍼락트산, 퍼프로피온산 및 상업용 소독제로 처리하기 전(대조군) 및 처리 후 생물막 마이크로타이터 플레이트의 못에 형성된 슈도모나스 아조토포르만스 PFl1A 생물막의 주사 전자 현미경 사진(300x 및 2,000x) 최소 생물막 박멸 농도(MBEC). 스케일 바 = 10 μm. 이 수치는 Goetz et al.12 의 허가를 받아 수정되었습니다(Copyright 2022 American Society for Microbiology. 판권 소유.). (B) 과아세트산(500ppm)으로 처리하기 전(왼쪽)과 후(오른쪽)의 생물막 마이크로플레이트 페그에서 형광 세포 생존율 염색을 사용하여 P. azotoformans PFl1A에 의해 형성된 생물막의 생존율, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(63x/1.40 오일 미분 간섭 대비 대물렌즈). 생존 세포는 녹색으로 염색되고 죽은 세포는 빨간색으로 염색됩니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 수치는 Goetz et al.12 의 허가를 받아 수정되었습니다(Copyright 2022 American Society for Microbiology. 판권 소유.). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
MBEC 분석법(biofilm microplate assay)은 ASTM17에 의해 표준 생물막 박멸 시험법으로 인정된 최초의 방법이었다. 우리의 연구와 다른 사람들은이 분석을 사용할 때 두 가지 중요한 단계가 있음을 보여주었습니다 : 초음파 처리 단계 (시간 및 전력)와 소독제 처리 시간18. Stewart와 Parker는 또한 미생물 종, 생물막 나이, 표면적/부피 비율 등과 같은 분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 다른 매개변수를 제안했습니다. 19. 마지막으로, 마이크로플레이트 뚜껑의 못 주위에 생물막의 형성은 이질적일 수 있으며 사용된 박테리아에 따라 달라질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
MBEC 방법은 잠재적으로 다양한 유형의 소독제와 함께 사용될 수 있습니다. SEM 및 컨포칼 현미경과 같은 현미경 기술의 사용은 상호 보완적이며 생물막의 3차원 구조 및 생존 상태(형광 세포 생존 가능성 염색 키트, 재료 표 참조)를 연구하는 데 매우 유용하다(형광 세포 생존도 염색 키트, 재료 표 참조)는 각각 소독제 처리 전후에 처리된다12. 생물막을 형성하는 박테리아의 능력은 실행의 용이성과 속도 때문에 주로 마이크로타이터 플레이트로 연구되었습니다. 그러나 대부분의 상황에서 볼 수 있듯이 전단력이 없는 이 폐쇄 시스템의 사용에는 한계가 있습니다. 따라서 CDC 생물 반응기와 같은 동적 생물막 형성 방법을 사용하여 생물막 마이크로플레이트 분석을 사용하여 관찰한 내용을 확인하는 것이 좋습니다.
ASTM 표준화 방법14,15 및 발표된 연구20,21에 따르면 생물막은 생물막을 성장시키고 소독제의 효능을 평가하는 데 광범위하게 사용됩니다. 이 장치는 높은 전단력, 특정 및 재생 가능한 영양소 및 표면 재료와 같은 생물막 형성의 특정 환경 조건을 모방합니다. 이 연구에서는 이 동적 시스템을 사용하여 스테인리스 스틸 슬라이드에서 재현 가능한 성숙 P. azotoformans PFlA1 균주 생물막을 얻었습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 사용하는 ASTM 표준 프로토콜을 기반으로 합니다. 그러나 이 표준화된 생물막 방법은 다른 기술을 사용하여 강력한 생물막 생산자로 밝혀진 경우에도 모든 미생물에 적용할 수 없습니다. 이것은 B. vesicularis의 경우로, 더 높은 생물막 밀도에 도달하기 위해 프로토콜을 최적화해야 했습니다.
이전 연구에서는 일부 작동 조건(또는 매개변수)이 생물막 발달 과정에서 중요하며 테스트된 박테리아 22,23,24 각각에 대해 조정되어야 함을 입증했습니다. 예를 들어, 영양소 요구량은 선호도 및 농도25 측면에서 각 박테리아에 대해 조정되어야 한다. 더욱이, 생물막은 영양분 제한 환경으로 간주되는 배치 모드에서 성장할 때보다 생물반응기 내의 연속적인 영양 공급 조건 하에서 더 두껍고 더 중요한 바이오매스를 갖는 것으로 나타났다26. 또 다른 중요한 측면은 체류 시간이며, 이는 유속에 의해 제어되며 박테리아 배가 시간보다 짧아지도록 조정되어야 합니다. 또한, 유체의 온도 및 전단 혼합은 최적의 성장 조건을 제공하기 위해 각 박테리아에 대해 조정되어야 한다27. 배플의 움직임에 의해 생성된 높은 전단 응력은 생물막 발달을 촉진하고 생물막의 구조와 두께를 조절하는 역할을 한다(28). 그러나 교반 속도를 너무 많이 높이면 생물막 표면이 침식되거나 벗겨져 박테리아 밀도가 감소할 수 있습니다(29,30).
생물 반응기의 사용은 영양 배지로서 많은 양의 유체를 사용하는 것 이외에 비용과 시간이 많이 소요되는 것과 같은 몇 가지 한계를 갖는다. 그럼에도 불구하고 생물막을 형성하고 연구하기 위한 매우 반복 가능하고 재현 가능한 방법으로 남아 있습니다. 생물 반응기를 사용하면 서로 다른 재료로 만들어진 여러 쿠폰을 동시에 사용할 수 있습니다. 바이오리액터는 온도, 교반 속도 및 유속과 같은 생물막 성장 중 실험 조건을 모니터링하도록 설계되었으며 후속 분석을 위해 균질하고 대표적인 생물막을 회수할 수 있습니다. 전반적으로, 정적 및 동적 방법은 식품 및 환경 부문에서 분리된 생물막에 대한 소독제의 효능을 시험관 내에서 연구하는 데 보완적입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc 및 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) (RDCPJ516460-17)의 지원을 받았습니다. 원고에 대한 비판적 검토에 대해 Teresa Paniconi에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
| 316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| 96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
| Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
| Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
| AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
| Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
| Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
| Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
| EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
| Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
| Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
| Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
| FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at - 20 °C |
| Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
| Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
| Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
| Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
| Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
| Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
| Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
| Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
| Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
| Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
| Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
| Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
| Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
| Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
| Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
| Vortex | Cole Parmer | UZ-04724-00 | |
| Water bath | VWR | 89202-970 | |
| Zen software | Zeiss |
References
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