Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utvärdering av effekten av organiska peroxisyror för att utrota mejeribiofilmer med hjälp av en metod som kombinerar statiska och dynamiska metoder

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64619
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Département des Sciences des Aliments, Institut sur la Nutrition et les Aliments Fonctionnels, Université Laval
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt som kombinerar statiska och dynamiska metoder för att utvärdera effekten av organiska peroxisyror för att utrota biofilmer i mejeriindustrin. Detta tillvägagångssätt kan också användas för att testa effektiviteten hos nya biologiska eller kemiska formuleringar för kontroll av biofilmer.

Abstract

Förekomsten av biofilmer inom mejeriindustrin är mycket oroande, eftersom de kan leda till produktion av osäkra och förändrade mejeriprodukter på grund av deras höga motståndskraft mot de flesta CIP-förfaranden som ofta används i bearbetningsanläggningar. Därför är det absolut nödvändigt att utveckla nya biofilmkontrollstrategier för mejeriindustrin. Detta protokoll syftar till att utvärdera effekten av organiska peroxisyror (perättiksyra, perpropionsyra och perlaktiska syror och ett kommersiellt perättiksyrabaserat desinfektionsmedel) för att utrota mejeribiofilmer med en kombination av statiska och dynamiska metoder. Alla desinfektionsmedel testades på de starkaste biofilmproducerande bakterierna i antingen en enda eller en blandad biofilm med hjälp av MBEC-analysen (minimum biofilm eradication concentration), en statisk screeningmetod med hög kapacitet. En kontakttid på 5 minuter med desinfektionsmedlen vid rekommenderade koncentrationer utrotade framgångsrikt både den enskilda och blandade biofilmen. Studier pågår för närvarande för att bekräfta dessa observationer med hjälp av Center for Disease Control (CDC) biofilmreaktor, en dynamisk metod för att efterlikna in situ-förhållanden . Denna typ av bioreaktor möjliggör användning av en rostfri yta, som utgör de flesta industriella utrustningar och ytor. De preliminära resultaten från reaktorn verkar bekräfta effekten av organiska peroxisyror mot biofilmer. Det kombinerade tillvägagångssättet som beskrivs i denna studie kan användas för att utveckla och testa nya biologiska eller kemiska formuleringar för att kontrollera biofilmer och utrota mikroorganismer.

Introduction

Mejeriindustrin är en stor industrisektor över hela världen, inklusive i Kanada, där det finns mer än 10 500 mjölkgårdar som producerar nästan 90 miljoner hL mjölk varje år1. Trots de strikta hygienkraven inom mejeriindustrin, inklusive i bearbetningsanläggningar, utgör mjölk ett utmärkt odlingsmedium för mikroorganismer, och därför kommer mejeriprodukter sannolikt att innehålla mikroorganismer, inklusive förstörelse eller patogena mikroorganismer. Dessa patogener kan orsaka olika sjukdomar; till exempel kan Salmonella sp. och Listeria monocytogenes orsaka gastroenterit respektivemeningit 2. Nedbrytningsmikroorganismer kan påverka kvaliteten och organoleptiska egenskaper hos mejeriprodukter genom att producera gaser, extracellulära enzymer eller syror3. Mjölkens utseende och färg kan också ändras, t.ex. genom Pseudomonas spp.4.

Några av dessa mikroorganismer kan bilda biofilmer på olika ytor, inklusive rostfritt stål. Sådana biofilmer möjliggör persistens och multiplikation av mikroorganismer på utrustningens yta och därmed kontaminering av mejeriprodukterna5. Biofilmer är också problematiska på grund av deras förmåga att hindra värmeöverföring och påskynda korrosion av utrustningen, vilket leder till för tidigt utbyte av utrustningen och därmed till ekonomiska förluster6.

Clean-in-place (CIP) -procedurer gör det möjligt för livsmedelsindustrin att kontrollera tillväxten av mikroorganismer. Dessa förfaranden innefattar sekventiell användning av natriumhydroxid, salpetersyra och ibland desinfektionsmedel innehållande hypoklorsyra och perättiksyra 7,8. Även om hypoklorsyra är mycket effektiv mot mikroorganismer, reagerar den också med naturligt organiskt material, vilket orsakar bildandet av giftiga biprodukter9. Perättiksyra genererar inte skadliga biprodukter10; Dess effektivitet mot biofilmer i livsmedelsindustrin är dock mycket varierande10,11. Nyligen har andra peroxisyror, inklusive perpropionsyra och perlaktiska syror, studerats för sin antimikrobiella aktivitet, och de verkar vara ett bra alternativ för kontroll av mikrobiell tillväxt i biofilmer12,13.

Därför syftade denna studie till att utvärdera effekten av organiska peroxisyror (perättiksyra, perpropionsyra och permjölksyra och ett perättiksyrabaserat desinfektionsmedel) för att utrota mejeribiofilmer med hjälp av ett tillvägagångssätt som kombinerar MBEC-analysen (minimum biofilm eradication concentration), en statisk screeningmetod med hög genomströmning och Center for Disease Control (CDC) biofilmreaktor, en dynamisk metod som efterliknar in situ Villkor. MBEC-analysen kallas nedan "biofilmmikrotiterplattor" i protokollet. Protokollet som presenteras här och de representativa resultaten visar effekten av organiska peroxisyror och deras potentiella tillämpning för att kontrollera mikrobiella biofilmer i mejeriindustrin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Arbetet i denna artikel kräver ett biosäkerhetsnivå 2-laboratorium och godkändes tidigare (projektnummer 119689) av Université Lavals institutionella biosäkerhetskommitté.

OBS: Flödesschemat i figur 1 representerar en sammanfattning av den metod som kombinerar statiska och dynamiska metoder som användes för att utvärdera effekten av organiska peroxisyror för att utrota biofilmer.

1. Beredning av material

  1. Mikrobiella isolat
    1. Slå på det biologiska säkerhetsskåpet (BSC) 15 minuter före användning och rengör det med en 70% (v / v) alkohollösning.
    2. När BSC är steril, placera en injektionsflaska med det mikrobiella isolatet som ska testas (Pseudomonas azotoformans eller Brevundimonas vesicularis i denna studie), en inokuleringsslinga, ett 15 ml rör fyllt med 10 ml steril tryptisk sojabuljong (TSB) och en virvelblandare. Innan du placerar i BSC, desinficera alla material med alkohol.
    3. Virvel injektionsflaskan med mikrobiellt isolat för att homogenisera kulturen.
    4. Överför aseptiskt 20 μL av det mikrobiella isolatet till 10 ml sterilt TSB i ett 15 ml rör och inkubera det vid 30 °C i 16–24 timmar under omrörning vid 160 rpm.
      VARNING: B. vesicularis måste användas i ett inneslutningslaboratorium på nivå 2 i enlighet med de riktlinjer som krävs för hantering av patogena organismer. Föraren måste vara ordentligt utbildad och måste bära skyddsglasögon, handskar och en kappa.
  2. Desinfektionsmedel
    1. För att bereda den organiska peroxisyralösningen (60 ml), tillsätt 24 ml väteperoxid och 36 ml syra (ättiksyra, propionsyra eller mjölksyra) i en 250 ml Erlenmeyerkolv. Tillsätt sedan en fördefinierad volym på 10 M svavelsyra (655 μL för perättiksyra, 635 μL för perpropionsyra eller 715 μL för permjölksyra). Skaka kolven försiktigt för att blanda och placera kolven i ett 30 °C vattenbad som är uppsatt inuti den kemiska huven. Inkubera kolven i 2 dagar, med försiktig blandning varje morgon.
      OBS: Det kommersiella perättiksyrabaserade desinfektionsmedlet (se materialförteckning) tillhandahölls direkt av tillverkaren.
      VARNING: Desinfektionsmedlen måste användas under en kemisk huva. Skyddsglasögon och handskar måste bäras under hela experimentet. För mer information om desinfektionsmedlen, se respektive säkerhetsdatablad.
    2. Utför titrering av väteperoxid enligt beskrivningen nedan.
      1. Placera en tom 300 ml bägare på en analysvåg (se Materialförteckning) och tarera skalan. Väg upp ca 0,23 g desinfektionsmedel i bägaren och notera den exakta vikten som tillförts. Tillsätt 100 g kall 1 N svavelsyralösning i bägaren, tillsätt en magnetisk omrörningsstång i bägaren och lägg den på en omrörningsplatta.
      2. Låt lösningen röra tills fullständig homogenisering. Tillsätt sedan tre droppar av en ferroinindikatorlösning (0,1 vikt% iH2O) i bägaren och titrera med 0,1 N ceriumsulfatlösning tills lösningen ändras från en laxrosa färg till en ljusblå färg. Observera volymen ceriumsulfatlösning tillsatt.
      3. Beräkna procentandelen väteperoxid med följande formel:
        Equation 1 Ekv. (1)
        där S är volymen tillsatt ceriumsulfatlösning, N är normaliteten hos ceriumsulfatlösningen (0,1 N), W är provets vikt (~ 0,2300 g) och 0,017 = (1 mol H2O2/2 mol Ce) × (34,0147 g H2O2/1 mol H2O)2 × (1 l/1 000 ml)
    3. Utför titrering av de organiska peroxisyrorna enligt beskrivningen nedan.
      1. Tillsätt 20 ml 7,5% (w/v) kaliumjodidlösning i en bägare. Titrera långsamt med 0,1 N natriumtiosulfatlösning tills lösningens blå färg börjar bli ljusbrun/orange.
      2. Tillsätt 2 ml stärkelselösning (1 viktprocent iH2O) till bägaren och titrera med 0,1 N natriumtiosulfatlösning tills lösningen ändras från svart till orange. Notera volymen natriumtiosulfatlösning som används.
      3. Beräkna procentandelen organisk peroxisyra med följande formel:
        Equation 2 Ekv. (2)
        där T är volymen natriumtiosulfatlösning som används, N är normaliteten hos natriumtiosulfatlösningen (0,1 N), W är provets vikt (~ 0,2300 g) och 0,038 = (1 mol CH3COOOH/1 molI2) × (1 mol I 2/2 mol S2O3) × (76,06 g / 1 mol CH3COOOH) × (1 l / 1 000 ml)
        Upprepa steg 1.2.2 och steg 1.2.3 med ytterligare två provexemplar för att utföra varje provning i tre exemplar.

2. Bildning av enkla och blandade biofilmer

  1. Biofilm mikrotiterplattor
    1. Virvla röret som innehåller bakteriekulturen (20 μL av stammen + 10 ml TSB-medium, beredd i steg 1.1.4). Utför serieutspädning och plätering på tryptisk sojaagar (TSA) för att bestämma bakteriecellantalet (cfu) för nattkulturen. Överför sedan aseptiskt 100 μl av kulturen till 10 ml sterilt TSB-medium (för en slutlig koncentration på ca 2 x 107 cfu/ml).
      OBS: För analysen med bioreaktorn överförs en volym på 100 μL av det mikrobiella isolatet till 100 ml steril TSB.
    2. Virvla röret. För varje bakterie, överför den utspädda bakteriekulturen till biofilmmikrotiterplattan (150 μl per brunn) i tre exemplar med hjälp av en flerkanalig pipett. Ladda 150 μL TSB-medium i tre nya brunnar för att fungera som kontroller. Inkubera mikrotiterplattan för biofilm (se Materialförteckning) vid 30 °C i 24 timmar utan omrörning.
      Anmärkning: För tester med blandad biofilm tillsätts 75 μl av varje suspension för en total volym på 150 μl. Biofilmmikrotiterplattan innehåller pinnar i locken, på vilka biofilmerna bildas.
  2. Bioreaktor
    1. Rengör och lufttorka bioreaktorns delar (se materialförteckning) enligt tillverkarens anvisningar och fortsätt att förbereda reaktorn enligt beskrivningen nedan.
      1. Placera först det plana bladet inuti 1 L glasbägare (bioreaktor), som är fäst vid hållaren med en magnetstång, och håll installationen i upprätt läge med hjälp av plaststången fäst på insidan av bioreaktorlocket.
      2. Placera kupongerna eller diabilderna i rostfritt stål (se Materialförteckning) på sina polypropenstänger med skruvmejseln och sätt in dem i hålen i locket, utan att placera deras justeringsstift i skårorna, så att ånga kan komma ut under sterilisering.
      3. Täck alla bioreaktorventiler med aluminiumfolie och linda in resten av utrustningen, nämligen slangen L/S 18 (ID = 7,9 mm) och L/S 16 (ID = 3,1 mm), glasflödesbrottet, behållarlocken, skruvmejslarna, pincetten och 0,2 μm-filtren med aluminiumfolie.
        OBS: Sätt in kiselröret (se materialförteckning) i hullingen på insidan av behållarlocket.
      4. Autoklavera bioreaktorn inställd i en torr cykel vid 121 °C i 20 minuter.
    2. Utför biofilmbildning i bioreaktorn i batchläge (första steget).
      1. I en BSC, anslut ena änden av slangen L / S 18 till bioreaktorns utloppspip och håll den andra änden insvept i aluminiumfolie för att bevara steriliteten.
      2. Ta bort en kupong eller glidhållare från bioreaktorlocket och placera den i ett sterilt 50 ml rör. Fyll sedan bioreaktorns bägare med 340 ml 300 mg / L TSB-medium genom hålet som upptogs av stången med en 50 ml serologisk pipett.
      3. Inokulera odlingsmediet i bioreaktorn med 1 ml bakterielösning (~108 cfu/ml P. azotoformans) med en 5 ml pipett genom samma öppning som tidigare använts och sätt sedan tillbaka staven i sitt ursprungliga läge. Placera stavarna som redan är placerade i lockhålen så att stiften passar in i sina respektive skåror.
      4. Placera ett 0,2 μm bakteriellt luftreningsfilter i slutet av röret med den minsta diametern, som ligger på bioreaktorns lock. Det andra röret med samma diameter förblir permanent anslutet med ett metallskruvlock eller en silikonplugg som stängs tätt.
      5. Placera bioreaktorn i 24 timmar över värmeplattan inställd på 30 °C och rör om vid 130 rpm.
        OBS: För biofilmbildning av flera arter, använd en lika stor volym av de olika bakteriekulturerna för att erhålla en total volym på 1 ml för inokulatet.
    3. Utför biofilmbildning i bioreaktorn i kontinuerligt flödesläge (andra steget).
      1. Placera en carboy innehållande 18 L sterilt destillerat vatten i BSC och tillsätt 2 L 1,000 mg/L TSB odlingsmedium för att erhålla en slutlig koncentration på 100 mg/L.
      2. Täck behållaren med sitt sterila lock, till vilket två rör är anslutna. Den första är ett silikonrör fixerat på lockets inre yta och används för att pumpa mediet. Det andra röret (L/S 16) är anslutet till den externa porten så att vätskan kan strömma mot bioreaktorn. Placera ett 0,2 μm filter i det andra röret på locket på mediumbehållaren.
      3. Anslut detta andra rör till den peristaltiska pumpen och anslut den andra änden till glasflödesbrottet, som sedan sätts in i det större röret på bioreaktorlocket.
      4. Använd ytterligare en 20 L carboy för att samla upp utflödet från bioreaktorn. Fäst änden av röret som är anslutet till bioreaktorns utloppspip på locket på avfallsbehållaren. Sätt i ett 0,2 μm filter i röret som finns på locket på denna behållare.
      5. Starta peristaltisk pump med en flödeshastighet på 11,3 ml/min och låt systemet vara igång i 24 timmar.
        OBS: Flödeshastigheten (11,3 ml / min) för odlingsmediet eller mjölken som användes under biofilmbildning i bioreaktorn bestämdes genom att dividera 340 ml (vilket motsvarar vätskans volym i reaktorn) med uppehållstiden på 30 min.
    4. Återställ bakteriebiofilmen.
      1. Stäng av den peristaltiska pumpen och sluta röra och värma bioreaktorn.
      2. Ta försiktigt bort varje stav från bioreaktorn och skölj kupongerna eller glidbanorna 3x i 40 ml PBS för att eliminera planktonbakterier. Släpp sedan kupongerna eller glasen i sterila 50 ml koniska rör innehållande 40 ml PBS med en lämplig skruvmejsel. Vortex rören för 30 s, överföra dem på ett rack placerat i en sonicator bad, och sonikera rören vid 40 kHz för 30 s (vilket kräver 110 W effekt). Upprepa denna operation 3x.
      3. Samla upp 40 ml biofilmsuspensioner i sterila 50 ml koniska rör och skölj sedan kupongerna eller objektglasen med 2 ml steril PBS-lösning. Återvinn denna sköljvätska och tillsätt den till den redan uppsamlade biofilmsuspensionen.
    5. Räkna upp de livskraftiga bakterierna i biofilmen: Med den erhållna biofilmsuspensionen utför du 10-faldiga seriella utspädningar och plattar sedan 100 μL av 10-5 och 10-6 utspädningarna på TSA i tre exemplar. Inkubera plattorna vid 30 °C i 24 timmar. Räkna antalet kolonier som finns på agarplattorna och beräkna bakterietätheten på kupongerna och objektglasen (livskraftiga sittande bakterier) enligt ASTM E2562-1714 med följande formel:
      Equation 3 Ekv. (3)
      där X är antalet kolonibildande enheter (CFU), B är den pläterade volymen (0,1 ml), V är den volym i vilken biofilmen är suspenderad (stamlösningen), A är ytan på kupongen eller glaset som täcks av biofilmen och D är utspädningsfaktorn.

3. Kvantitativ utvärdering av effekten av organiska peroxisyror för att utrota biofilmer

  1. Biofilm mikrotiterplattor
    1. Tillsätt 200 μL fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) i tre brunnar i en 96-brunns mikroplatta.
    2. Överför locket på biofilmmikroplattan, med biofilmer som har bildats på pinnarna, till 96-brunnsmikroplattan som innehåller PBS i 10 s för att tvätta biofilmerna och eliminera planktonbakterier.
    3. Bered desinfektionsmedlen i erforderliga koncentrationer (t.ex. 25 ppm, 50 ppm, 500 ppm, 1 000 ppm, 5 000 ppm, 10 000 ppm och 25 000 ppm aktiv substans).
      OBS: Alla spädningar görs aseptiskt med sterilt destillerat vatten.
    4. Tillsätt 200 μL av varje koncentration av desinfektionsmedel i brunnarna på en ny 96-brunns mikrotiterplatta i tre exemplar. Överför locket på biofilmmikrotiterplattan till denna 96-brunns mikrotiterplatta som innehåller desinfektionsmedlen och inkubera plattan vid rumstemperatur under önskad exponeringstid.
    5. Tillsätt 200 μL Dey-Engley-neutraliserande buljong till brunnarna på en ny 96-brunns mikrotiterplatta. Överför locket på biofilmmikrotiterplattan på 96-brunnsmikrotiterplattan som innehåller den neutraliserande buljongen. Försegla mikrotiterplattan med parafilm och placera den i badljudsondon vid 40 kHz i 30 minuter.
    6. Efter 30 minuter, ta bort mikrotiterplattan från ljudfilmen och ta bort parafilmen. Överför 100 μL från den första kolonnen på 96-brunnsplattan som innehåller biofilmerna som lossnat efter ultraljudsbehandling till den första raden av en ny 96-brunns mikrotiterplatta.
    7. Tillsätt 180 μL steril 1x PBS till brunnarna på den nya 96-brunnsmikroplattan (beredd i steg 3.1.6), förutom den första raden. Överför 20 μL biofilmlösning från första raden till brunnarna i andra raden innehållande 180 μL 1x PBS (rad 2, spädning: 10−1). Överför sedan 20 μL av vätskan i den andra raden till brunnarna i nästa rad innehållande 180 μL 1x PBS (rad 3, utspädning: 10−2). Upprepa samma procedur för att erhålla utspädningar mellan 10-5 och 10-7.
    8. Inokulera 100 μL av spädningarna på TSA och inkubera plattorna enligt de parametrar som krävs för tillväxt av varje bakterie.
    9. Efter inkubation räknar du cfus och beräknar log 10-densiteten för varje peg och log10-reduktionen vid varje desinfektionsmedelskoncentration med följande ekvationer:
      Equation 4 Ekv. (4)
      där X är de kolonibildande enheterna räknade på platsen, B är volymen pläterad (0,01 ml), V är brunnsvolymen (0,20 ml), A är pinnytan (46,63 mm2) och D är utspädningen.
      Equation 5 Ekv. (5)
    10. Upprepa varje experiment 3x på oberoende dagar.
      OBS: Den "minsta koncentrationen av desinfektionsmedel som utrotar biofilmen", eller MBEC, motsvarar den lägsta desinfektionsmedelskoncentrationen som inte visar någon bakterietillväxt.
  2. Bioreaktor
    OBS: Proceduren för ASTM-standarden E2871-1915 följs för att utföra detta test med P. azotoformans PFlA1.
    1. Börja med att bilda biofilmerna på kupongerna i bioreaktorn, som beskrivs i steg 2.2. Ta sedan bort stången som håller kupongerna och skölj den inuti ett koniskt rör som innehåller 30 ml PBS.
    2. Släpp varje kupong i ett sterilt 50 ml koniskt rör med en skruvmejsel och tillsätt sedan 4 ml lämplig organisk peroxisyralösning eller PBS för kontrollen. Inkubera i 5 minuter och tillsätt sedan 36 ml Dey-Engley-neutraliserande buljong. Vortex för 30 s, och sedan sonicate på 40 kHz för 30 s med hjälp av en sonicator bad. Upprepa processen 3x för att erhålla biofilmsuspensionen.
    3. Skölj på samma sätt alla andra stavar och återställ biofilmerna från kupongerna. Utför seriella utspädningar av biofilmsuspensionen och plattan 0,1 ml på TSA-medium. Inkubera plattorna vid 30 °C i 24 timmar.
    4. Efter inkubationen räknar du cfus och beräknar sedan biofilmdensiteten för varje kupong (Ekv. 6), den genomsnittliga logaritmiska densiteten (LD) för varje uppsättning av tre kuponger från samma stav, inklusive behandling och kontroll (Ekv. 7) och logreduktionen för desinfektionsmedlet (Ekv. 8) med hjälp av följande ekvationer:
      Equation 6 Ekv. (6)
      där X är medelvärdet av de kolonibildande enheterna räknade/kupong, B är den pläterade volymen (0,1 ml), V är volymen desinfektionsmedel eller PBS plus neutralisator (40 ml) och D är utspädningen.
      Equation 7 Ekv. (7)
      Equation 8 Ekv. (8)

4. Kvalitativ utvärdering av effekten av organiska peroxisyror för att utrota biofilmer

OBS: Efter att ha behandlats med desinfektionsmedlen (steg 3.1.1 till steg 3.1.5) framställdes och analyserades P. azotoformans biofilmer som bildades på pinnarna på biofilmmikrotiterplattan i den statiska metoden genom observation på skanningselektron- och konfokalmikroskop.

  1. Svepelektronmikroskopi (SEM)
    1. Tillsätt 200 μL 1x PBS till tre brunnar i en 96-brunns mikroplatta. Överför locket från biofilmmikrotiterplattan (steg 3.1.5) till mikroplattan med 96 brunnar som innehåller PBS och låt det stå i rumstemperatur i 10 sekunder för att eliminera Dey-Engleys neutraliserande buljong.
    2. Ta bort pinnarna från biofilmens mikrotiterplatta med en steriliserad nåltång. Placera varje pinne i en tom injektionsflaska under huven och tillsätt primärt fixeringsmedel (5 % glutaraldehyd i 0,1 M Na-cakodylatbuffert pH 7,5) till varje injektionsflaska. Kapsylera varje injektionsflaska och inkubera dem vid 4 °C i 24 timmar.
    3. Efter inkubation, dekantera fixeringsmedlet med en pipett och kassera allt flytande avfall i en lämplig behållare. Ta bort locken på varje injektionsflaska och placera dem i en huva för att lufttorka i 72 timmar.
    4. Montera proverna på aluminiumstubbar (se Materialförteckning) genom att applicera epoxiharts (se Materialförteckning) på den plana övre ytan på varje stubbe. Fäst sedan försiktigt pinnarna på stubbarna med pincett.
    5. Metallisera proverna med en EMS950x + 350s guldsputter (se materialtabell) i 4 minuter vid 2 x 10-1 bar argontryck och 20 mA ström. Utför lämplig jordning genom att måla sidan av pinnen oexponerad för guldet med silverfärg (se Materialförteckning).
    6. Hämta bilder på ett svepelektronmikroskop med SEM-kontrollens användargränssnitt version 6.28 (se Materialförteckning). Accelerationsspänningen som användes i denna studie var 15 kV och förstoringarna var 300x och 2000x.
  2. Konfokal mikroskopi
    1. Tillsätt 200 μL 1x PBS till tre brunnar på en 96-brunns mikrotiterplatta. Överför locket från biofilmmikroplattan till 96-brunnsplattan som innehåller PBS och låt det stå i 10 s för att eliminera Dey-Engley-neutraliserande buljongen.
    2. Bered lösningar av fluorescerande fläckar genom att tillsätta 3 μL grön fluorescerande fläck och 3 μL röd fluorescerande fläck (se materialtabell) till 1 ml sterilt vatten.
    3. Tillsätt 200 μL färgningslösning i en brunn på en 96-brunns mikrotiterplatta. Överför locket från biofilmmikrotiterplattan till 96-brunnsplattan som innehåller färgningslösningen. Täck biofilmmikrotiterplattan med aluminiumfolie och inkubera provet i 20-30 minuter vid rumstemperatur.
    4. Tillsätt 200 μL steriliserat vatten i brunnarna på en 96-brunns mikroplatta. Överför sedan locket från biofilmmikroplattan till mikroplattan med 96 brunnar som innehåller vattnet och låt det stå tills observation.
    5. Visualisera biofilmerna som bildas på pinnarna med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop (se materialtabell) med ett 63x/1,40 olje-DIC-objektiv. Hämta bilderna med tillhörande programvara (se Materialförteckning). De fluorescensexcitationsvåglängder som användes för de gröna och röda fluorescerande fläckarna var 482 nm respektive 490 nm.
      OBS: För bästa resultat, klipp och placera pinnen i en 60 mm petriskål och fyll skålen med sterilt vatten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SEM-analysen visar närvaron av biofilmer producerade av P. azotoformans PFl1A på biofilmens mikroplattpinnar (figur 2A). En tredimensionell biofilmstruktur kan observeras. P. azotoformans PFl1A identifierades tidigare som en stark biofilmproducent (A570 > 1,5) med 96-brunns mikrotiterplattor12.

Dessutom verkade P. azotoformans PFl1A-biofilmen som bildades på ett rostfritt stålglas med användning av bioreaktorn vara mycket tät och uppvisade de morfologiska egenskaperna hos en mogen biofilm med en tredimensionell struktur (figur 2B). Dessutom visade resultaten av bakterieräkningen av de biofilmer som utvecklats av detta isolat i det dynamiska systemet signifikanta celldensiteter motsvarande 8,74 log CFU/cm2 och 7,86 log CFU/cm2 i TSB-odlingsmedium respektive steril skummjölk (figur 2C).

Dessutom visade resultaten i figur 3 som erhållits med B. vesicularis-isolatet att vissa faktorer kan ha ett viktigt inflytande på biofilmbildningen i bioreaktorn. Genom att variera några av parametrarna, såsom omrörningshastigheten i bioreaktorn, medelflödeshastigheten, medelnäringskoncentrationen och varaktigheten av det kontinuerliga lägessteget, kan cellbindningen förbättras och tätare biofilmer kan observeras. Till exempel resulterade en ökning av näringskoncentrationen från 100 mg / L till 900 mg / L (tillstånd A jämfört med tillstånd F) i en ökning av bakterieantalet av biofilmerna från 6,11 log CFU / cm 2 till 8,71 log CFU / cm2. Vidare observerades signifikant tillväxt av biofilmer när flödeshastigheten reducerades till 6,0 ml/min (vid tillstånd C), vilket resulterade i en längre uppehållstid som överensstämde med tillväxthastigheten för detta isolat.

De mikroskopiska observationerna av biofilmerna som bildades på biofilmmikrotiterplattorna eller bioreaktorns för- och efterdesinfektionsbehandling kompletterade de livskraftiga celltalen. Figur 4 visar att ingen av biofilmerna innehöll detekterbara viabla celler vid kontakttiden (5 min) och koncentrationerna (500 ppm med organiska peroxisyror och 100 000 ppm med väteperoxid) av desinfektionsmedel som vanligtvis används i mejerianläggningar. Dessa resultat bekräftades genom mikroskopi (figur 5). Figur 5A visar den tredimensionella strukturen hos en obehandlad MBEC-biofilm (kontroll), medan behandlade MBEC-biofilmer (med väteperoxid, perättiksyra, permjölksyra, perpropionsyra och ett kommersiellt desinfektionsmedel) förlorar sin tredimensionella konformation, som bestäms av SEM. Även om biofilmerna behandlades med desinfektionsmedel kvarstod dock en uppenbar biofilmstruktur, särskilt med väteperoxid. Användningen av en levande / död teknik, i detta fall konfokalmikroskopi (CM) med fluorescerande viabilitetsfärgning, bekräftade dock att den återstående biofilmstrukturen huvudsakligen var livlös efter en desinfektionsbehandling (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: Flödesschema som representerar en kombinerad statisk och dynamisk metod för att utvärdera effektiviteten av organiska peroxisyror för att utrota biofilmer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Analys av biofilmbildning av Pseudomonas azotoformans PFl1A. (A) Svepelektronmikrografer (300x och 2 000x) av P. azotoformans PFl1A-biofilm bildad på pinnar av biofilmmikrotiterplattan. Denna siffra har modifierats från Goetz et al.12 med tillstånd (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Alla rättigheter förbehållna.). Skalstänger = 50 μm (300x), 100 μm (2,000x). (B) Svepelektronmikrografer (2 000x) av (1) ett glas av rostfritt stål innehållande en P. azotoformans PFl1A-biofilm odlad i bioreaktorn och (2) ett biofilmfritt glas (negativ kontroll). Skalstång = 10 μm. Denna siffra har modifierats från Niboucha et al.16 med tillstånd. (C) Bakteriell densitet av P. azotoformans PFl1A biofilmer bildas i bioreaktorn i TSB odlingsmedium och steril skummjölk och bestäms efter avlägsnande genom ultraljud från rostfria stålrutschbanor. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 3). Signifikant skillnad (p < 0,05) baseras på Students t-test. Denna siffra har modifierats från Niboucha et al.16 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Bakterietäthet hos biofilmer av Brevundimonas vesicularis som utvecklats med användning av bioreaktorn under varierande omrörningsförhållanden, flödeshastigheter, tid i kontinuerligt läge och odlingsmedia (TSB). Villkor A: 130 rpm omrörningshastighet, 11,8 ml / min flödeshastighet, 24 timmars kontinuerligt läge i 100 mg / L TSB-medium (i enlighet med ASTM International Protocol E2562-1714 för bildning av biofilmer av Pseudomonas aeruginosa). Villkor B: 60 rpm omrörningshastighet, 11,8 ml / min flödeshastighet, 24 timmars kontinuerligt läge i 100 mg / L TSB-medium; Villkor C: 60 rpm omrörningshastighet, 6,0 ml / min flödeshastighet, 24 h kontinuerligt läge i 100 mg / L TSB-medium; Villkor D: 60 rpm omrörningshastighet, 6,0 ml / min flödeshastighet, 48 h kontinuerligt läge i 100 mg / L TSB-medium; Villkor E: 60 rpm omrörningshastighet, 6,0 ml / min flödeshastighet, 48 h kontinuerligt läge i 300 mg / L TSB-medium; Villkor F: 60 rpm omrörningshastighet, 6,0 ml / min flödeshastighet, 48 h kontinuerligt läge i 900 mg / L TSB-medium; Villkor G: 60 rpm omrörningshastighet, 6,0 ml / min flödeshastighet, 24 timmars batchläge i 2,7 g / L TSB och 48 h kontinuerligt läge i 900 mg / L TSB-medium. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 3). Signifikanta skillnader (olika bokstäver, p < 0,05) baseras på enkelriktad ANOVA och Tukeys multipeljämförelsetest. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Viabelt celltal i biofilmer av Pseudomonas azotoformans PFl1A före och efter behandling med väteperoxid, permjölksyra, perpropionsyra, perättiksyra eller kommersiellt desinfektionsmedel. Varje punkt representerar medelvärdet av tre av de tre av varandra följande dagarna för varje isolat. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 3). Denna siffra har modifierats från Goetz et al.12 med tillstånd (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Alla rättigheter förbehållna.). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Mikroskopisk observation av biofilmens struktur och livskraft. (A) Svepelektronmikrografer (300x och 2,000x) av en Pseudomonas azotoformans PFl1A-biofilm som bildas på pinnarna på biofilmmikrotiterplattan före (kontroll) och efter behandling med väteperoxid, perättiksyra, permjölksyra, perpropionsyra och kommersiellt desinfektionsmedel vid deras lägsta koncentrationer för utrotning av biofilm (MBEC). Skalstång = 10 μm. Denna siffra har modifierats från Goetz et al.12 med tillstånd (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Alla rättigheter förbehållna.). (B) Viabiliteten hos en biofilm bildad av P. azotoformans PFl1A med användning av fluorescerande cellviabilitet färgning på biofilmmikroplattpinnen före (vänster) och efter (höger) behandling med perättiksyra (500 ppm), visualiserad genom konfokal laserskanningsmikroskopi (63x/1,40 oljedifferentialinterferenskontrastmål). De livskraftiga cellerna färgas gröna och de döda cellerna färgas röda. Skalstång = 20 μm. Denna siffra har modifierats Goetz et al.12 med tillstånd (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Alla rättigheter förbehållna.). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MBEC-analysen (biofilm microplate assay) var den första metoden som erkändes som ett standardtest för utrotning av biofilm av ASTM17. Vår studie och andra har visat att det finns två kritiska steg när du använder denna analys: ultraljudsbehandlingssteget (tid och kraft) och desinfektionsmedelsbehandlingstiden18. Stewart och Parker föreslog också andra parametrar som kan påverka resultatet av analysen, såsom mikrobiella arter, biofilmålder, ytarea / volymförhållande etc. 19. Slutligen är det viktigt att notera att bildandet av biofilmer runt pinnarna på mikroplattlocken kan vara heterogent och variera beroende på vilka bakterier som används.

MBEC-metoden kan potentiellt användas med olika typer av desinfektionsmedel. Användningen av mikroskopitekniker, såsom SEM och konfokalmikroskopi, är komplementära och extremt användbara för att studera de tredimensionella strukturerna och viabilitetsstatusen (fluorescerande cellviabilitetsfärgningssatser, se materialförteckning) för biofilm före respektive efter desinfektionsbehandling12. Bakteriers förmåga att bilda biofilmer har huvudsakligen studerats med mikrotiterplattor på grund av enkel och snabb körning. Användningen av detta slutna system utan skjuvkrafter, som observerats i de flesta situationer, har dock begränsningar. Därför rekommenderas starkt användning av en dynamisk biofilmbildningsmetod, såsom CDC-bioreaktorn, för att bekräfta observationerna gjorda med hjälp av biofilmmikroplattanalysen.

Enligt ASTM:s standardiserade metod14,15 och publicerade studier20,21 används bioreaktorn i stor utsträckning för att odla biofilmer och för att utvärdera effekten av desinfektionsmedel. Denna anordning efterliknar vissa miljöförhållanden för biofilmbildning, såsom när det gäller hög skjuvkraft, specifika och förnybara näringsämnen och ytmaterial. I denna studie erhölls reproducerbara mogna biofilmer av P. azotoformans PFlA1-stam på glas av rostfritt stål med användning av detta dynamiska system. Protokollet som presenteras här baserades på ASTM-standardprotokollet med Pseudomonas aeruginosa. Denna standardiserade biofilmmetod kan dock inte tillämpas på alla mikroorganismer, även om de har visat sig vara starka biofilmproducenter som använder andra tekniker. Detta var fallet för B. vesicularis, för vilken protokollet måste optimeras för att nå en högre biofilmdensitet.

Tidigare studier har visat att vissa driftsförhållanden (eller parametrar) är avgörande i processen för biofilmutveckling och måste anpassas för var och en av de testade bakterierna22,23,24. Till exempel måste näringsbehovet justeras för varje bakterie när det gäller preferens och koncentration25. Dessutom har det visats att biofilmerna är tjockare och har mer betydande biomassa under kontinuerliga näringstillförselförhållanden i bioreaktorn än när de odlas i satsläge, vilket anses vara en näringsbegränsad miljö26. En annan viktig aspekt är uppehållstiden, som styrs av flödeshastigheten och bör justeras för att den ska bli kortare än bakteriefördubblingstiden. Dessutom måste temperaturen och skjuvblandningen av vätskan justeras för varje bakterie för att ge optimala tillväxtförhållanden27. Den höga skjuvspänningen som skapas av baffelns rörelse främjar biofilmutveckling och spelar en roll för att kontrollera dess struktur och tjocklek28. Men om omrörningshastigheten ökas för mycket kan det orsaka erosion eller sloughing av biofilmens yta, vilket leder till minskad bakterietäthet29,30.

Användningen av en bioreaktor har vissa begränsningar, till exempel att det är dyrt och tidskrävande förutom att använda en stor volym vätskor som näringsmedium. Ändå är det fortfarande en mycket repeterbar och reproducerbar metod för att bilda och studera biofilmer. Användningen av en bioreaktor möjliggör också samtidig användning av flera kuponger gjorda av olika material. Bioreaktorn är utformad för att övervaka experimentella förhållanden under biofilmtillväxt, såsom temperatur, omrörningshastighet och flödeshastighet, och det möjliggör återvinning av homogena och representativa biofilmer för efterföljande analys. Sammantaget kompletterar statiska och dynamiska metoder för att in vitro studera desinfektionsmedels effektivitet mot biofilmer isolerade från livsmedels- och miljösektorerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc och Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17). Vi tackar Teresa Paniconi för den kritiska granskningen av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm filters  Corning 09-754-28 diameter: 50 mm, PTFE- Membrane
316 stainless-steel disc coupon Biosurface Technologies Corporation RD128-316
316 stainless-steel slide coupon Biosurface Technologies Corporation CBR 2128-316
96-microtiter plate Corning 07-200-89 cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate 
Acetic acid Sigma Aldrich 27225 store at RT
Aluminium stubs Electron Microscopy Science 75830-10 32x5mm
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% Electron Microscopy Sciences 16220 store at -20 °C
AB204-S/FACT Analytical balance Mettler Toledo AB204-S
Bacterial Vent Filter (0.45 µm) Biosurface Technologies Corporation BST 02915
BioDestroy Groupe Sani Marc 09-10215 commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT
Carboy LDPE 20 L Cole Parmer 06031-52
CDC biofilm reactor Biosurface Technologies Corporation CRB 90 bioreactor
Cerium (IV) sulphate Thermo Scientific 35650-K2 store at RT
Confocal laser scanning microscope  LSM 700 Zeiss LSM 700
Dey-Engley neutralizing broth Millipore D3435-500G store at 4 °C
EMS950x + 350s gold sputter  Electron Microscopy Sciences
Epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14121 with BDMA
Ethyl alcohol 95%, USP Greenfield global P016EA95 store at RT
Ferroin indicator solution Sigma Aldrich 318922-100ML store at RT
Filling/venting cap Cole Parmer RK-06258-00
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316 fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at - 20 °C
Glass flow break Biosurface Technologies Corporation FB 50
Gold with silver paint  Electron Microscopy Sciences 12684-15
Heating plate set Biosurface Technologies Corporation 110V Stir Plate
Hex screwdriver Biosurface Technologies Corporation CBR 5497
Hydrogen peroxide Sigma 216763 store at 4 °C
Inoculating loops VWR 12000-812 sterile, 10 µl
Lactic acid Laboratoire MAT LU-0200 store at RT
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head Cole Parmer 77200-60
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base Innovotech 19111 Biofilm microtiter plate
Oxford agar base Thermo Scientific OXCM0856B store at 4 °C
Plastic coupon holder Biosurface Technologies Corporation CBR 2203
Plastic slide holder rod Biosurface Technologies Corporation CBR 2203-GL
Potassium iodide Fisher Chemical P410-500 store at RT
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) Wiha 26015
Propionic acid Laboratoire MAT PF-0221 store at RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance Cole Parmer  UZ-11976-3
Scanning electron microscope JSM-6360LV model JEOL JSM-6360LV SEM and user control interface
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.205 (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Screw cap tube, 50 mL Sarstedt 62.547.205 (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences  12300 store at -20 °C
Sodium thiosulfate Thermo Scientific AC124270010 store at RT
Sonication bath Fisher 15-336-122 5,7 L
Starch solution Anachemia AC8615 store at RT
Sulfuric acid Sigma Aldrich 258105-500ML store at RT
Tryptic soy agar BD Bacto DF0369-17-6 store at RT
Tryptic soy broth BD Bacto DF0370-17-3 store at RT
Tubing Masterflex L/S 16 25' Cole Parmer MFX0642416
Tubing Masterflex L/S 18 25' Cole Parmer MFX0642418
Tygon SPT-3350 silicon tubing  Saint-Gobain ABW18NSF IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.
Vortex Cole Parmer UZ-04724-00
Water bath  VWR 89202-970
Zen software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canada's dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre. , Available from: https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance (2017).
  2. Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications. Foodborne Pathogens and Disease. 2 (2), 115-129 (2005).
  3. Fondation de technologie laitière du Québec. Science et technologie du lait. 3rd edn. , Les Presses de l'Université Laval. Quebec. (2018).
  4. Evanowski, R., et al. Short communication: Pseudomonas azotoformans causes gray discoloration in HTST fluid milk. Journal of dairy science. 100, 7906-7909 (2017).
  5. Bower, C. K., McGuire, J., Daeschel, M. A. The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces. Trends in Food Science & Technology. 7 (5), 152-157 (1996).
  6. Gupta, S., Anand, S. Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers. International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).
  7. Marchand, S., et al. Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).
  8. Silva, H. O., et al. Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk. Frontiers in Microbiology. 9, 2934 (2018).
  9. Sedlak, D. L., von Gunten, U. Chemistry. The chlorine dilemma. Science. 331 (6013), 42-43 (2011).
  10. vander Veen, S., Abee, T. Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).
  11. Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. L. Resistance to benzalkonium chloride, peracetic acid and nisin during formation of mature biofilms by Listeria monocytogenes. Food Microbiology. 28 (3), 418-425 (2011).
  12. Goetz, C., Larouche, J., Velez Aristizabal, M., Niboucha, N., Jean, J. Efficacy of organic peroxyacids for eliminating biofilm preformed by microorganisms isolated from dairy processing plants. Applied and Environmental Microbiology. 88 (4), 0188921 (2022).
  13. Vimont, A., Fliss, I., Jean, J. Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact surfaces. Food and Environmental Virology. 7 (1), 49-57 (2015).
  14. ASTM International. ASTM E2562-17. Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2562-17.html (2017).
  15. ASTM International. ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2871-19.html (2019).
  16. Niboucha, N., et al. Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor. Frontiers in Microbiology. 13, 892181 (2022).
  17. ASTM International. ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2799-17.html (2022).
  18. Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).
  19. Stewart, P. S., Parker, A. E. Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020 (2019).
  20. Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context. International Dairy Journal. 126, 105264 (2022).
  21. Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).
  22. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).
  23. Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application. Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).
  24. Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies. Pathogens. 10 (9), 1212 (2021).
  25. Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm. Food Microbiology. 92, 103592 (2020).
  26. Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness. Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885 (2020).
  27. Goeres, D. M., et al. Design and Fabrication of Biofilm Reactors. Recent Trends in Biofilm Science and Technology. Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L. , Academic Press. Cambridge, MA. 71-88 (2020).
  28. Fjeld, C. S., Schüller, R. B. Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses. Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).
  29. Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).
  30. Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow. Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).

Tags

Biologi nummer 190
Utvärdering av effekten av organiska peroxisyror för att utrota mejeribiofilmer med hjälp av en metod som kombinerar statiska och dynamiska metoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goetz, C., Niboucha, N., Jubinville, … More

Goetz, C., Niboucha, N., Jubinville, E., Jean, J. Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods. J. Vis. Exp. (190), e64619, doi:10.3791/64619 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter