Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

دراسة التفاعلات بين إنزيمات هيستون المعدلة وعوامل النسخ في الجسم الحي عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) هو تقنية تصوير للكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول FRET لدراسة ارتباط الإنزيمات المعدلة للهيستون بعوامل النسخ التي تجندها إلى المروجين المستهدفين للتنظيم اللاجيني للتعبير الجيني في الأنسجة النباتية.

Abstract

يتأثر التنظيم اللاجيني للتعبير الجيني عادة بإنزيمات تعديل الهستون (HMEs) التي تولد علامات هيستون غير متجانسة أو euchromatic لقمع النسخ أو التنشيط ، على التوالي. يتم تجنيد HMEs إلى الكروماتين المستهدف بواسطة عوامل النسخ (TFs). وبالتالي ، فإن اكتشاف وتوصيف التفاعلات المباشرة بين HMEs و TFs أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها وخصوصيتها بشكل أفضل. ستكون هذه الدراسات أكثر أهمية من الناحية البيولوجية إذا أجريت في الجسم الحي داخل الأنسجة الحية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لتصور التفاعلات في أوراق النبات بين هيستون ديوبيكوتيناز النبات وعامل نسخ النبات باستخدام نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ، والذي يسمح باكتشاف المجمعات بين جزيئات البروتين التي تقع في حدود <10 نانومتر من بعضها البعض. يتم تقديم نوعين مختلفين من تقنية FRET: SE-FRET (الانبعاث الحساس) و AB-FRET (تبييض المستقبل) ، حيث يتم نقل الطاقة بشكل غير إشعاعي من المتبرع إلى المستقبل أو تنبعث إشعاعيا من قبل المتبرع عند التبييض الضوئي للمقبل. يمكن تكييف كل من نهج SE-FRET و AB-FRET بسهولة لاكتشاف التفاعلات الأخرى بين البروتينات الأخرى في النبات.

Introduction

تلعب deubiquitinases هيستون النبات دورا مهما في التحكم في التعبير الجيني عن طريق التعديل اللاحق للترجمة للهستونات ، وتحديدا عن طريق محو علامات monoubiquitylationالخاصة بها 1. حتى الآن ، يعد OTLD1 أحد نباتات هيستون ديوبيكوتيناز القليلة الوحيدة التي تتميز على المستوى الجزيئي في Arabidopsis 2,3. يزيل OTLD1 مجموعات monoubiquitin من جزيئات هيستون H2B ، وبالتالي تعزيز إزالة أو إضافة أستلة euchromatic وتعديلات المثيلة لهستونات H3 في الكروماتين الجيني المستهدف 4,5. علاوة على ذلك ، يتفاعل OTLD1 مع إنزيم آخر معدل للكروماتين ، وهو هيستون ليسين ديميثيلاز KDM1C ، للتأثير على قمع النسخ للجينات المستهدفة 6,7.

تفتقر معظم الإنزيمات المعدلة للهيستون إلى قدرات ربط الحمض النووي ، وبالتالي لا يمكنها التعرف على الجينات المستهدفة مباشرة. أحد الاحتمالات هو أنها تتعاون مع بروتينات عامل النسخ المرتبط بالحمض النووي الذي يربط هذه الإنزيمات ويوجهها إلى أهداف الكروماتين الخاصة بها. على وجه التحديد ، في النباتات ، من المعروف أن العديد من الإنزيمات الرئيسية المعدلة للهيستون (أي هيستون ميثيل ترانسفيراز8،9 ، هيستون أسيتيل ترانسفيراز 10 ، هيستون ديميثيلاز11 ، ومعقدات بوليكومب القمعية12،13،14) يتم تجنيدها بواسطة عوامل النسخ. تماشيا مع هذه الفكرة ، تم مؤخرا اقتراح آلية واحدة ممكنة لتوظيف OTLD1 للمروجين المستهدفين والتي تستند إلى تفاعلات محددة بين البروتين والبروتين في OTLD1 مع عامل النسخ LSH1015.

ينتمي LSH10 إلى عائلة من بروتينات نبات ALOG (Arabidopsis LSH1 و Oryza G1) التي تعمل كمنظم تنموي مركزي16،17،18،19،20،21،22. حقيقة أن أعضاء عائلة بروتين ALOG تحتوي على زخارف ربط الحمض النووي 23 وتظهر القدرات على تنظيم النسخ22 ، والتوطين النووي19 ، و homodimerization24 تقدم مزيدا من الدعم لفكرة أن هذه البروتينات ، بما في ذلك LSH10 ، قد تعمل كعوامل نسخ محددة أثناء التنظيم اللاجيني للنسخ. إحدى التقنيات التجريبية الرئيسية المستخدمة لتوصيف تفاعل LSH10-OTLD1 في الجسم الحي هي نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)15.

FRET هي تقنية تصوير للكشف المباشر عن التفاعلات القريبة المدى بين البروتينات داخل <10 نانومتر من بعضها البعض25 داخل الخلايا الحية. هناك نوعان رئيسيان من الاختلافات في نهج FRET26: الانبعاثات الحساسة (SE-FRET) (الشكل 1A) وتبييض المستقبل (AB-FRET) (الشكل 1B). في SE-FRET ، البروتينات المتفاعلة - أحدها موسوم بفلوروكروم مانح (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر ، GFP) والآخر مع فلوروكروم متقبل (على سبيل المثال ، بروتين فلوري أحمر أحادي ، mRFP27,28) - ينقل طاقة الحالة المثارة بشكل غير إشعاعي من المتبرع إلى المستقبل. نظرا لعدم انبعاث أي فوتونات أثناء هذا النقل ، يتم إنتاج إشارة فلورية لها طيف انبعاث إشعاعي مشابه للطيف المستقبل. في AB-FRET ، يتم الكشف عن تفاعلات البروتين وقياسها كميا بناء على الانبعاث الإشعاعي المرتفع للمتبرع عندما يتم تعطيل المستقبل بشكل دائم عن طريق التبييض الضوئي ، وبالتالي لا يمكنه تلقي الطاقة غير الإشعاعية المنقولة من المتبرع (الشكل 1). الأهم من ذلك ، أن الموقع تحت الخلوي لمضان FRET يدل على توطين البروتينات المتفاعلة في الخلية.

إن القدرة على نشر FRET في الأنسجة الحية وتحديد التوطين تحت الخلوي للبروتينات المتفاعلة في وقت واحد مع اكتشاف هذا التفاعل في حد ذاته ، يجعل FRET التقنية المفضلة للدراسات والتوصيف الأولي لتفاعلات البروتين والبروتين في الجسم الحي. تعد منهجية التصوير الفلوري المماثلة في الجسم الحي ، تكملة التألق ثنائي الجزيئات (BiFC) 29،30،31،32 ، نهجا بديلا جيدا ، على الرغم من أنه ، على عكس FRET ، قد ينتج BiFC إيجابيات خاطئة بسبب التجميع التلقائي لمراسلي BiFC الفلوري الذاتي 33 ، والقياس الكمي لبياناته أقل دقة.

تشارك هذه المقالة التجربة الناجحة في تنفيذ كل من تقنيات SE-FRET و AB-FRET وتقدم بروتوكولا لنشرها للتحقيق في التفاعلات بين OTLD1 و LSH10 في الخلايا النباتية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استخدام نيكوتيانا بينثاميانا أو سلالة Agrobacterium tumefaciens EHA105 أو GV3101 في هذه الدراسة.

1. بناء ناقلات الحنق

  1. حدد علامات الفلورسنت لزوج FRET المتبرع / المتقبل.
    1. استخدم EGFP من pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (انظر جدول المواد) لتوليد ناقل المانح.
    2. استخدم mRFP من pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (انظر جدول المواد) لإنشاء متجه المستقبل.
  2. قم بإنشاء بنيات FRET للمانح / المتقبل باستخدام تقنية استنساخ إعادة التركيب الخاصة بالموقع34 ، مثل نظام استنساخ إعادة التركيبGateway 35.
    1. تضخيم تسلسل الترميز للبروتينات ذات الأهمية36 (أي Arabidopsis OTLD1 و LSH10)15.
      ملاحظة: من الجيد أيضا استخدام عنصر تحكم سلبي يمثل تجانسا لأحد البروتينات المتفاعلة ولكن لا يتوقع أن يظهر تفاعلا. تستخدم دراسة تفاعل OTLD1-LSH10 تجانسا ل LSH10 ، LSH4 ، لا يتعرف على OTLD1. يتم تضخيم OTLD1 و LSH10 و LSH4 cDNAs بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المدرجة في الجدول 1.
    2. استنساخ OTLD1 و LSH10 و LSH4 في متجه الدخول pDONR207 بواسطة تقنية استنساخ إعادة التركيب الخاصة بالموقع 34.
    3. استخدم بوابة LR Clonase II (انظر جدول المواد) لنقل LSH10 و LSH4 من pDONR207 إلى متجه الوجهة الثنائية pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 لإنشاء بنيات المانحين الثنائية p35S::LSH10-GFP (البناء المختبر) و p35S::LSH4-GFP (التحكم السلبي).
    4. استخدم نفس الإنزيم المتاح تجاريا (الخطوة 1.2.3) لنقل OTLD1 من pDONR207 إلى متجه الوجهة الثنائية pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 لإنشاء بناء المستقبل الثنائي p35S:: OTLD1-mRFP (بناء تم اختباره).
    5. PCR-تضخيم36 mRFP من pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 باستخدام البادئات المدرجة في الجدول 1 ، واستنساخها بواسطة تقنية استنساخ إعادة التركيب إلى pDONR207 ، ثم استخدم LR Clonase II لنقل mRFP إلى pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 لتوليد بناء الاندماج الثنائي p35S::mRFP-GFP (التحكم الإيجابي).
  3. إجراء تحويل البنيات المانحة والمتقبلة إلى Agrobacterium.
    1. أضف 1 ميكروغرام من كل بلازميد من الخطوات 1.2.3-1.2.5 إلى 100 ميكرولتر من مزرعة الخلايا المختصة من سلالة Agrobacterium tumefaciens EHA105 أو GV3101 ، المحضرة باستخدام البروتوكولات القياسية 37 أو التي تم الحصول عليها تجاريا ، واحتضانها عند37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. أضف 1 مل من وسط LB (1٪ تريبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، و 1٪ كلوريد الصوديوم ؛ انظر جدول المواد) إلى خليط الخلية المختص وحرك عند 200 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. أعد تعليق الخلايا في 0.1 مل من وسط LB عن طريق السحب ونشرها على أجار LB المكمل بالمضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال ، 0.01٪ سبكتينومايسين و 0.005٪ ريفامبيسين ؛ انظر جدول المواد). تنمو عند 28 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
    4. اختر المستعمرات الفردية وقم بتلقيح كل منها على حدة في 1 مل من مرق LB المكمل بالمضادات الحيوية المناسبة.
    5. تنمو الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ونقل 0.2 مل من المزرعة إلى أنبوب جديد. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    6. استخراج الحمض النووي البلازميد عن طريق بروتوكول قياسي لعزل البلازميدات من خلايا Agrobacterium 38 وإعادة تعليق الحمض النووي المستخرج في30 ميكرولتر من الماء. لتحديد المستعمرات التي تؤوي البلازميدات المرغوبة ، استخدم 2 ميكرولتر من مستحضر الحمض النووي كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل مع البادئات الخاصة بالجينات المدرجة في الجدول 1. امزج 0.7 مل من المزرعة المحددة مع 0.3 مل من الجلسرين وخزنها في -80 درجة مئوية.

2. التسلل الزراعي

  1. تنمو نباتات نيكوتيانا بينثاميانا .
    ملاحظة: طوال التجربة بأكملها ، يجب أن تكون جميع النباتات صحية.
    1. زرع وتنمو بذور N. benthamiana في وعاء يحتوي على تربة رطبة بكثافة عالية.
    2. احتفظ بالبذور المزروعة في غرفة نمو عند 23 درجة مئوية مع 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الدورة المظلمة بكثافة ضوء 150-170 ميكرومول / م2ثانية حتى يصل قطر euphyll إلى 0.5 سم.
    3. انقل الشتلات إلى أواني أكبر واسمح لها بالنمو في نفس الغرفة بنفس المعلمات.
      ملاحظة: تكون النباتات جاهزة للتسلل الزراعي عندما يبلغ قطر أكبر أوراقها 5-7 سم ، عادة في غضون 4-5 أسابيع. في النباتات الصغيرة جدا ، ستكون آثار التسلل الزراعي شديدة جدا بالنسبة لتحليل FRET.
  2. تحضير الخلايا البكتيرية للتسلل الزراعي.
    1. تنمو كل مستعمرة من مستعمرات Agrobacterium التي تحتوي على تركيبات FRET طوال الليل في 5 مل من وسط LB المكمل بالمضادات الحيوية المناسبة (الخطوة 1.3.3) و 150 ميكرومتر من الأسيتوسيرينجون عند 28 درجة مئوية (انظر جدول المواد).
    2. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 3000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للتسلل الزراعي (10 mM MgCl2 ، 10 mM MES pH 5.6 ، 150 μM acetosyringone) إلى OD600 = 0.5.
    4. اجمع الخلايا المعاد تعليقها بنسبة 1: 1 v / v بين الخلايا التي تحتوي على التركيبات المناسبة (الخطوة 2.2.5).
    5. بالنسبة للتسلل الزراعي مزدوج البناء ، امزج حصص ثقافتين ، وبالنسبة للتسلل الزراعي أحادي البناء ، امزج حصص نفس الثقافة:
      1. البروتينات المختبرة: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (البكتيريا التي تؤوي تركيبات p35S::OTLD1-mRFP و p35S::LSH10-GFP).
      2. التحكم السلبي: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (البكتيريا التي تؤوي p35S :: OTLD1-mRFP و p35S :: LSH4-GFP بنيات).
      3. التحكم السلبي: LSH10-GFP + mRFP مجاني (البكتيريا التي تؤوي p35S::LSH10-GFP و pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. التحكم الإيجابي: mRFP-GFP (البكتيريا التي تؤوي p35S :: mRFP-GFP بناء).
    6. احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 0.5-1 ساعة.
  3. أداء التسلل الزراعي.
    1. قم بتحميل الثقافة البكتيرية في حقنة عديمة الإبر سعة 1 مل.
    2. اضغط برفق ولكن بحزم على فوهة المحقنة على الجانب المحوري من أوراق N. benthamiana الموسعة بالكامل أثناء إمساك الورقة بإصبع قفاز على الجانب المحوري.
    3. تسلل ما يصل إلى أربع نقاط على ورقة ، وثلاث أوراق لكل نبات ، واثنين أو ثلاثة نباتات لكل ثقافة بكتيرية. تغيير القفازات بين العينات لمنع التلوث المتبادل.
    4. الحفاظ على النباتات الزراعية المتسللة في نفس غرفة النمو في ظل نفس الظروف ، كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 ، لمدة 24 ساعة إلى 36 ساعة. لا تحتفظ بالنباتات الزراعية المتسللة لمدة تزيد عن 36 ساعة ، لأن هذا سيقلل من إشارة التألق.

3. المجهر متحد البؤر

  1. إعداد شرائح المجهر للتصور مضان.
    1. بعد 24-36 ساعة من التسلل ، استخدم شفرة حلاقة لقطع كل ورقة زراعية إلى قطع صغيرة (2 مم × 4 مم) بين الأوردة.
    2. ضع قطع الأوراق على شريحة زجاجية بحيث يكون سطح الورقة المحوري متجها لأعلى. ضع قطرة ماء على قطع الأوراق وقم بتغطيتها بزجاج الغطاء. اضغط قليلا على زجاج الغطاء لإزالة فقاعات الهواء.
    3. قم بتشغيل المجهر والليزر (انظر جدول المواد). ضع الشريحة في حامل مرحلة المجهر للتصوير تحت معلمات FRET المحددة (الخطوتان 3.2 و 3.3).
    4. ابدأ عمليات الرصد باستخدام عدسة موضوعية 10x لتحديد الخلايا التي تظهر إشارات GFP و mRFP ، ثم استخدم عدسة موضوعية 40x للملاحظات التفصيلية اللاحقة.
      ملاحظة: الأهم من ذلك ، عادة ما يتم إجراء SE-FRET و AB-FRET على نفس عينة الأنسجة ، مما يسمح باستخدام نفس إعدادات القناة (الخطوة 3.2) باستثناء قناة FRET ، التي يتم تشغيلها / إيقاف تشغيلها لملاحظات SE-FRET و AB-FRET ، على التوالي (الخطوتان 3.2.2.3 و 3.3.1).
  2. قم بإعداد المعلمات ل SE-FRET (الشكل 1 أ).
    1. افتح أداة الاكتساب متعدد الأبعاد (MDA).
    2. إنشاء مجموعة من ثلاث قنوات متحدة البؤر في نفس مجال الرؤية (الشكل التكميلي 1).
      1. اضبط القناة المانحة (قناة GFP) لإثارة وانبعاث الفلوروكروم المانح باستخدام ليزر الإثارة 405 نانومتر ومرشح الانبعاث 400-597 نانومتر.
      2. اضبط قناة المستقبل (قناة mRFP) لإثارة وانبعاث الفلوروكروم المستقبلي باستخدام ليزر الإثارة 561 نانومتر ومرشح الانبعاث 400-597 نانومتر.
        ملاحظة: تم ضبط مرشح الانبعاث ل mRFP على 400-597 نانومتر لفصل إشارة mRFP عن إشارة FRET عند 597-617 نانومتر (الخطوة 3.2.2.3) وبالتالي تقليل انبعاث mRFP المستقل عن FRET.
      3. اضبط قناة FRET لإثارة المتبرع وانبعاث الفلوروكرومات المتقبلة باستخدام ليزر الإثارة 405 نانومتر ومرشح الانبعاث 597-617 نانومتر.
    3. اضبط شدة إثارة المتبرع عند الحد الأدنى لمراقبة FRET مع تجنب التبييض الضوئي ، مما يقلل من كفاءة SE-FRET.
      ملاحظة: يتم اختيار شدة الإثارة هذه تجريبيا قبل إجراء إجراء FRET لتجنب التبييض الضوئي. يختلف حسب سمك الورقة وعمرها والوقت بعد الإفراط في التعبير.
    4. قم بإثارة المتبرع وابحث عن الخلايا التي تحتوي على إشارة التألق المتوقعة للمتقبل.
    5. حدد المنطقة التي تحتوي على إشارة التألق محل الاهتمام.
    6. احصل على تسلسل صور SE-FRET بالضغط على زر Snap .
      1. صورة 10-15 خلية تعبر عن بنية mRFP-GFP (التحكم الإيجابي) أولا ؛ اضبط معلمات التركيز والتكبير / التصغير والكسب الذكي للتركيز على مجال الاهتمام المراد التقاطه (الشكل التكميلي 2).
      2. باستخدام نفس الإعدادات ، قم بتصوير 10-15 خلية ، كل منها يعبر عن OTLD1-mRFP أو mRFP المجاني أو LSH10-GFP أو LSH4-GFP بشكل منفصل.
        ملاحظة: يتم الحصول على هذه الصور بواسطة المكون الإضافي "PixFRET" الخاص ب ImageJ (انظر جدول المواد) ، والذي تم استخدامه لتحليل بيانات FRET (الخطوة 3.4.1) لتحديد قيم التسييل الطيفي (SBT) للمقبلين والمانحين ؛ يتم استخدام هذه الصور من قبل البرنامج لإنشاء صور SE-FRET ل OTLD1-mRFP + LSH10-GFP و OTLD1-mRFP + LSH4-GFP و LSH10-GFP + أزواج بروتين mRFP المجانية (الخطوة 3.2.6.3).
      3. أيضا ، باستخدام نفس الإعدادات ، صورة 10-15 خلية تعبر عن OTLD1-mRFP + LSH10-GFP و OTLD1-mRFP + LSH4-GFP و LSH10-GFP + أزواج بروتين mRFP مجانية.
  3. قم بإعداد معلمات AB-FRET (الشكل 1B).
    1. استخدم معلمات قناة المتبرع والمستقبل المحددة ل SE-FRET (الخطوة 3.2.2) ولكن قم بإيقاف تشغيل قناة FRET.
    2. اضبط معلمات التبييض الضوئي للمتقبل (mRFP) (الشكل التكميلي 3).
      1. تأكد من أن التبييض يبدأ بعد خمس صور. السماح ب 200 تكرار لكل منطقة مبيض. حافظ على كثافة الليزر بنسبة 100٪ عند 561 نانومتر.
      2. الحفاظ على مدة التبييض من 45 ثانية. تأكد من سرعة مسح ضوئي تبلغ 512 × 512 بكسل عند 400 هرتز.
    3. ارسم منطقة الخلية المراد تبييضها ؛ على سبيل المثال ، بالنسبة للتفاعلات النووية ، يتم رسم المناطق ذات الاهتمام حول كامل مساحة نواة الخلية39.
    4. قم بتنشيط التبييض بالضغط على زر بدء التجربة ؛ سيؤدي تنشيط هذه الوظيفة إلى إجراء التبييض الضوئي والحصول على تسلسل صورة AB-FRET.
  4. تحليل بيانات FRET.
    1. لتحليل بيانات SE-FRET ، استخدم المكون الإضافي "PixFRET" لبرنامج ImageJ لإنشاء صور مصححة لكفاءة SE-FRET بعد طرح SBT40 (الخطوة 3.2.6.2).
    2. لتحليل بيانات AB-FRET ، احسب ٪ AB-FRET كنسبة مئوية للزيادة في انبعاث GFP بعد التبييض الضوئي mRFP باستخدام الصيغة التالية41: ٪ AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] × 100 ، حيث GFPpost هو انبعاث GFP بعد التبييض الضوئي mRFP ، و GFPpre هو انبعاث GFP قبل التبييض الضوئي mRFP.
    3. عند مراجعة صور FRET ، انتبه إلى التوطين تحت الخلوي لإشارة FRET.
      ملاحظة: في كثير من الحالات ، يمكن تحديد هذه المقصورات الخلوية (على سبيل المثال ، النواة ، البلاستيدات الخضراء ، ER ، إلخ) بسهولة ، وكميزة إضافية لتقنية FRET ، توفر أدلة مهمة على الوظيفة البيولوجية للبروتينات المتفاعلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 2 النتائج النموذجية لتجربة SE-FRET ، حيث تم تسجيل نوى الخلية في وقت واحد في ثلاث قنوات (أي GFP المانحة ، و mRFP المتقبل ، و SE-FRET). تم استخدام هذه البيانات لإنشاء صور لكفاءة SE-FRET مشفرة في مقياس ألوان زائفة. على هذا المقياس ، يتوافق الانتقال من الأزرق إلى الأحمر مع زيادة في كفاءة FRET ، وهو مقياس لقرب البروتين والبروتين من 0٪ إلى 100٪. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تسجيل إشارة SE-FRET في نواة الخلية ، وكانت شدتها بعد التعبير المشترك ل LSH10 و OTLD1 مماثلة لتلك التي لوحظت بعد التعبير عن mRFP-GFP (أي التحكم الإيجابي). لم يلاحظ أي SE-FRET في الضوابط السلبية (أي التعبير المشترك ل OTLD1-mRFP و LSH4-GFP أو mRFP المجاني و LSH10-GFP).

تم قياس تفاعلات LSH10-OTLD1 باستخدام AB-FRET. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تسجيل مضان GFP المانح في نواة الخلية قبل وبعد التبييض الضوئي ل mRFP المتقبل كسلسلة زمنية للتبييض الضوئي لقياسات مضان المتبرع والمستقبل (الشكل التكميلي 4). تم تقديم صور نوى الخلية المسجلة بلون زائف لتحديد التغير في مضان GFP. يوضح الشكل 3 أن التعبير المشترك LSH10-GFP / OTLD1-mRFP أدى إلى زيادة مضان مانح GFP بعد أن تم تبييض متقبل mRFP ضوئيا وفقد قدرته على التألق. لوحظت زيادة مماثلة في مضان المانحين في التحكم الإيجابي mRFP-GFP ولكن ليس في الضوابط السلبية للتعبير المشترك LSH4-GFP / OTLD1-mRFP أو LSH10-GFP / mRFP ، في حين تم تعطيل مضان المستقبل في جميع تجارب التبييض الضوئي. يوضح الشكل 4 التحليل الكمي لبيانات AB-FRET ، مما يدل على الزيادة ذات الدلالة الإحصائية في مضان المانحين (٪ AB-FRET) بنسبة 13٪ تقريبا بعد التعبير المشترك LSH10 و OTLD1. أنتجت السيطرة الإيجابية mRFP-GFP ٪ AB-FRET بنسبة 30٪ تقريبا ، في حين أن الضوابط السلبية لم تنتج أي ٪ AB-FRET. أظهرت كل من صور SE-FRET و AB-FRET إشارة FRET في نواة الخلية ، بما يتفق مع التوطين تحت الخلوي المتوقع لمجمعات الإنزيم المعدلة لعامل النسخ وكذلك للطبيعة النووية لبروتينات GFP / mRFP34 (الشكل 2 والشكل 3).

باختصار ، تظهر البيانات التمثيلية أنه يمكن استخدام بروتوكول FRET هذا لإظهار وتحديد التفاعلات بين الإنزيمات المعدلة للهيستون وعوامل النسخ وتحديد توطينها تحت الخلوي في الخلايا النباتية الحية.

Figure 1
الشكل 1: ملخص تخطيطي لتقنيات SE-FRET و AB-FRET . (أ) المبدأ الأساسي ل SE-FRET. تم تمييز أحد البروتينات المختبرة ب GFP ، والذي يعمل كفلوروكروم مانح ، والآخر مع mRFP ، الذي يعمل كفلوروكروم متقبل. جزيء المتبرع متحمس ، ويتم تسجيل انبعاث المستقبل. إذا تفاعلت البروتينات المختبرة مع بعضها البعض بحيث يتم وضعها في نطاق 10 نانومتر من بعضها البعض ، يتم نقل الطاقة من المتبرع المتحمس بشكل غير إشعاعي إلى المستقبل ، والذي يصبح بعد ذلك متحمسا وينبعث منه مضان في قناة انبعاث FRET. في حالة عدم حدوث تفاعل ، لا يتم نقل أي طاقة من المتبرع إلى المستقبل ، ولا يتم الكشف عن أي انبعاث من قبل المتقبل. (ب) المبدأ الأساسي ل AB-FRET. يتم تمييز البروتينات المختبرة كما هو موضح في (A) ل SE-FRET. جزيء المتبرع متحمس ، وإذا حدث التفاعل بين البروتينات المختبرة ، فإن المتبرع يثير المتقبل بطريقة غير إشعاعية ، مما يؤدي إلى الحنق. بعد ذلك ، يتم تعطيل المتقبل بشكل دائم عن طريق التبييض الضوئي ، وبالتالي يفقد قدرته على قبول الطاقة غير الإشعاعية من المتبرع وإصدار مضان FRET في قناة انبعاث FRET ؛ من ناحية أخرى ، يزداد التألق المنبعث من المتبرع لأن المتبرع يفقد طاقة أقل عن طريق النقل غير الإشعاعي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: التفاعل النوعي ل LSH10 مع OTLD1 في أوراق N. benthamiana المكتشفة بواسطة SE-FRET. يتم عرض الصور من ثلاث قنوات كشف (المتبرع ، والمستقبل ، و SE-FRET) لمجموعات البروتين المشار إليها. تم حساب صور كفاءة SE-FRET عن طريق طرح النزف الطيفي (SBT) وتظهر بألوان زائفة ، مع اللونين الأحمر والأزرق للدلالة على أعلى وأدنى إشارة ، على التوالي. (أ) إشارة كفاءة عالية SE-FRET ناتجة عن التحكم الإيجابي mRFP-GFP. (ب) إشارة كفاءة SE-FRET الإيجابية الناتجة عن بروتينات LSH10-GFP و OTLD1-mRFP المتفاعلة. (ج) لم ينتج التعبير المشترك لبروتين التحكم السلبي LSH4-GFP و OTLD1-mRFP أي إشارة كفاءة SE-FRET. (د) لم ينتج التعبير المشترك لبروتين mRFP الخالي من التحكم السلبي و LSH10-GFP أي إشارة كفاءة SE-FRET. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التفاعل النوعي ل LSH10 مع OTLD1 في أوراق N. benthamiana المكتشفة بواسطة AB-FRET. يتم عرض الصور من قناتين للكشف (المتبرع والمستلم) قبل وبعد التبييض الضوئي لمجموعات البروتين المشار إليها. تشير الدائرة إلى المنطقة المبيضة ضوئيا. يتم عرض AB-FRET ، الذي يتم تصوره على أنه زيادة في مضان GFP بعد التبييض الضوئي mRFP ، باستخدام لون زائف مع اللونين الأحمر والأزرق ، مما يدل على أعلى وأدنى إشارة ، على التوالي. (أ) زيادة في مضان مانحي GFP الناتج عن التحكم الإيجابي mRFP-GFP. (ب) زيادة في مضان مانحي GFP الناتج عن بروتينات LSH10-GFP و OTLD1-mRFP المتفاعلة. (ج) أنتج التعبير المشترك لبروتين التحكم السلبي LSH4-GFP و OTLD1-mRFP تغييرات طفيفة في مضان مانحي GFP. (د) أنتج التعبير المشترك لبروتين mRFP الخالي من التحكم السلبي و LSH10-GFP تغييرات ضئيلة في مضان مانح GFP. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تقدير كمي ل AB-FRET. تظهر النسبة المئوية للزيادة في مضان مانح GFP بعد التبييض الضوئي mRFP (٪ AB-FRET) لمجموعات البروتين المشار إليها. تمثل أشرطة الخطأ متوسط n = 13 خلية لكل قياس. حدد اختبار t ثنائي الطرف أن الاختلافات بين القيم المتوسطة ذات دلالة إحصائية لقيم p * p < 0.05 و ** p < 0.01 و ***p < 0.001 ؛ P≥ 0.05 ليست ذات دلالة إحصائية (ns). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اسم التمهيدي التسلسل (5ʹ إلى 3ʹ) قصد
OTLD1 مهاجم ggggacaagtttgtacaaaaagcaagcaatgactcggattttggttcaaag تضخيم OTLD1 من cDNA
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagaaagctgggtgttccgtggctttgcctggtctgcgtc تضخيم OTLD1 من cDNA
LSH10 مهاجم ggggacaagtttgtacaaaaagcaggctcaatgtcctccaagagaaagagg تضخيم LSH10 من cDNA
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgtcaacagagactaaagaaac تضخيم LSH10 من cDNA
LSH4 مهاجم ggggacaagtttgtacaaaaagcaagcaatggatcatatcatcggctttatg تضخيم LSH4 من cDNA
LSH4 آر في ggggaccactttgtacaagaaagctgggttagtagggctacttgaaatcgcc تضخيم LSH4 من cDNA
مررفب مهاجم ggggacaagtttgtacaaaaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt تضخيم mRFP من pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttggagatctgcggccgcgg تضخيم mRFP من pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc تأكيد التسلسلات في pDONR207 عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل الحمض النووي
أتل2 GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC تأكيد التسلسلات في pDONR207 عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل الحمض النووي
AttB1 مهاجم Ggggacaagtttgtac aaaaagcaggct تأكيد التسلسلات في متجهات الوجهة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل الحمض النووي
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt تأكيد التسلسلات في متجهات الوجهة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل الحمض النووي
35S المروج مهاجم ctatccttcgcaagacccttc تأكيد التسلسلات في متجهات الوجهة بواسطة PCR

الجدول 1: بادئات للاستنساخ وتأكيد التسلسلات المستنسخة في pDONOR207 ومتجهات الوجهة. Fw ، الاشعال إلى الأمام. Rv ، الاشعال العكسية.

الشكل التكميلي 1: تحديد معلمات القنوات البؤرية. (أ) لقطة شاشة لإعداد معلمة الإثارة والانبعاث للقناة المانحة (GFP). (ب) لقطة شاشة لإعداد معلمة الإثارة والانبعاث لقناة المستقبل (mRFP). (ج) لقطة شاشة لإعداد معلمة الإثارة والانبعاث لقناة FRET. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تعديل المعلمات للحصول على صور SE-FRET للعينة محل الاهتمام. ( A) لقطة شاشة لإعداد معلمة منطقة المسح الضوئي (أي حجم الصورة وسرعة المسح الضوئي واتجاهها ومتوسطها). (ب) لقطة شاشة لإعداد معلمة قناة GFP (أي الليزر والثقب والكسب الرئيسي والكسب الرقمي). (ج) لقطة شاشة لإعداد معلمة قناة mRFP (أي الليزر والثقب والكسب الرئيسي والكسب الرقمي). (د) لقطة شاشة لإعداد معلمة قناة FRET (أي الليزر ، والثقب ، والكسب الرئيسي ، والكسب الرقمي). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: تحديد معلمات التبييض الضوئي المتقبل. ( A) لقطة شاشة لإعداد معلمة منطقة المسح الضوئي (أي حجم الصورة وسرعة المسح الضوئي واتجاهها ومتوسطها). (ب) لقطة شاشة للسلسلة الزمنية وإعداد معلمة تبييض الوقت. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: السلاسل الزمنية لقياسات مضان المتبرع والمتقبل أثناء AP-FRET. تم تحديد حركية مضان المتقبل (mRFP) والمانحة (GFP) للعينات المشار إليها قبل وأثناء وبعد فترة التبييض الضوئي. (أ) التحكم الإيجابي في mRFP-GFP. (ب) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (ج) التحكم السلبي LSH4-GFP + OTLD1-mRFP. (د) LSH10-GFP سلبي + تحكم مجاني في mRFP. تشير الخطوط الصفراء إلى الفترة الزمنية للتبييض الضوئي. ترسم المنحنيات البيضاء قياسات حركية التألق. في كل لوحة ، تظهر الصور العلوية والسفلية حركية مضان المتقبل (mRFP) والمانحة (GFP) ، على التوالي. لاحظ أنه ، بطبيعة الحال ، غالبا ما ينخفض مضان GFP بمرور الوقت لأن الليزر يقوم تدريجيا بتبييض GFP نفسه. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول FRET هذا بسيط وسهل التكاثر. كما يتطلب الحد الأدنى من الاستثمار في التوريد ويستخدم المعدات القياسية للعديد من المختبرات الحديثة. على وجه التحديد ، هناك خمس ميزات تقنية رئيسية تميز تنوع هذا الإجراء. أولا ، يتم إنشاء بنيات FRET باستخدام إعادة التركيب الخاصة بالموقع ، وهو نهج استنساخ سهل الاستخدام ، وينتج نتائج دقيقة ، ويوفر الوقت مقارنة بالاستنساخ التقليدي القائم على إنزيم التقييد. ثانيا ، نباتات N. benthamiana سهلة النمو ، وتنتج كميات كبيرة نسبيا من الأنسجة ومتوفرة في معظم المختبرات. ثالثا ، يؤدي الارتشاح الزراعي إلى تعبير عابر عن التركيبات المسلمة ، وبالتالي يولد البيانات في غضون فترة زمنية قصيرة نسبيا (أي 24-36 ساعة) مقارنة بالأشهر المطلوبة لإنتاج النباتات المحورة وراثيا. رابعا ، تسمح القدرة على تقديم مجموعات مختلفة من التركيبات ذات الأهمية عن طريق التسلل الزراعي المشترك باختبار التفاعلات بين أي بروتينات. أخيرا ، يمكن إجراء كل من SE-FRET و AB-FRET بالتتابع على نفس عينة الأنسجة فقط عن طريق تشغيل / إيقاف تشغيل أحد إعدادات قناة الليزر. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام توصيلالقصف الدقيق 42 كنهج بديل لبناء التسليم في الأنسجة النباتية بدلا من التسلل الزراعي. في هذه الحالة ، فإن استخدام النواقل الثنائية المطلوبة للتسلل الزراعي غير ضروري.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في اختيار زوج الفلوروكروم المانح والمتقبل بشكل صحيح لتحسين كفاءة FRET. يجب مراعاة العوامل الثلاثة التالية: (1) يحتاج طيف انبعاثات المانحين إلى تداخل طيف امتصاص المستقبل إلى أقصى حد لزيادة كمية الطاقة المنقولة إلى أقصى حد ؛ (2) يجب أن تكون أطياف انبعاث الجهة المانحة والمتقبلة مختلفة بما يكفي لتمييزها عن بعضها البعض وتقليل SBT للإشارة المكتشفة بواسطة الفحص المجهري ؛ (3) يجب أن يكون لدى المتقبل الحد الأدنى من الإثارة المباشرة عند الحد الأقصى لامتصاص المتبرع لتقليل إثارة المتقبل أثناء إثارة المتبرع. أزواج FRET الشائعة للمانحين / المتقبلين المستخدمة هي بروتينات الفلورسنت السماوية / الصفراء والخضراء / الحمراء (أي CFP / YFP و GFP / mRFP ، على التوالي). يستخدم هذا البروتوكول زوج GFP / mRFP لأنه مناسب لتصوير الخلايا الحية ، وعلى عكس أزواج FRET السماوية / الصفراء ، يظهر سمية ضوئية منخفضة وتبييضا ضوئيا منخفضا43. بشكل ملائم ، يعمل الانصهار الانتقالي بين زوج FRET (أي mRFP-GFP) كعنصر تحكم إيجابي مثالي في FRET.

خطوة حاسمة أخرى هي اختيار الضوابط السلبية المناسبة. على سبيل المثال ، في حالة تفاعل LSH10-OTLD1 ، يجب أن يتضمن تحليل FRET دائما التعبير عن OTLD1 وحده ، LSH10 وحده ، والتعبير المشترك ل OTLD1 و LSH10 مع البروتينات التي لا يتوقع التفاعل معها (أي LSH4 و mRFP الحر ، على التوالي). فيما يتعلق باختيار الضوابط السلبية ، يمكن لتجارب FRET اتباع الإرشادات الخاصة بأفضل الممارسات لاستخدام تقنية BiFC44 ، وهي نهج آخر قائم على التصوير الفلوري تم تكييفه للكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا النباتية الحية29،30،31،32.

أخيرا ، هناك عامل يؤثر على تجربة FRET شائع في جميع التجارب في الأنسجة النباتية الحية ، وهو مستمد من الظروف الفسيولوجية المختلفة للنبات ، بشكل عام ، والخلايا المتحولة المتسللة إلى الزراعة ، على وجه الخصوص ، حتى عند الحفاظ عليها في ظل ظروف نمو التحكم. يمكن أن يساهم هذا التباين الفسيولوجي في تباين معين لبيانات FRET بين التجارب الفردية والنباتات وحتى الأوراق. وبالتالي ، من المهم استخدام نباتين على الأقل وثلاث أوراق لكل نبات لكل تجربة واختيار أوراق ناضجة وموسعة بالكامل للتسلل الزراعي ، لأنها تنتج صورا أفضل.

كما هو الحال مع جميع المنهجيات التجريبية ، فإن FRET لها قيودها الفنية والقائمة على الاستخدام. أحد هذه العوامل المحددة هو طبيعة علامة الفلورسنت الذاتي وموقعها داخل البروتين محل الاهتمام (على سبيل المثال ، في نهاية الأمينية أو الكربوكسيل) ، والتي قد تتداخل مع الخصائص البيولوجية لهذا البروتين ، مثل نمطه الأصلي للتوطين تحت الخلوي أو القدرة على التعرف على تفاعلاته الطبيعية. قبل وضع العلامات ، يجب تحليل كل بروتين مهم ، إلى أقصى حد ممكن ، لخصائصه الهيكلية التي قد تتعرض للخطر بسبب وضع العلامات. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، يجب تحديد معلمات وضع العلامات تجريبيا بناء على الأنشطة المعروفة للبروتين محل الاهتمام. ومن القيود الرئيسية الأخرى التطور التقني النسبي ل FRET ، والذي يتطلب استخدام الفحص المجهري متحد البؤر مع الأجهزة والبرامج المناسبة. على عكس العديد من طرق تفاعل البروتين الأخرى ، مثل نظام الخميرة ثنائي الهجين (Y2H) 45،46،47 ، فإن FRET غير مناسب لتحديد تفاعلات البروتين عن طريق فحص مكتبات التعبير ، وخاصة الشاشات عالية الإنتاجية 48. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن معظم المقايسات التي يتم إجراؤها في الجسم الحي ، فإن FRET ليس نظاما نقيا كيميائيا حيويا ، وبالتالي ، فإنه لا يكتشف المشاركة المحتملة لعوامل خلوية أخرى غير معروفة في التفاعل.

تكمن أهمية FRET فيما يتعلق بالمقايسات الأخرى لتفاعلات البروتين في اكتشافه للتفاعلات قصيرة المدى ، مما يقلل من فرص النتائج الإيجابية الكاذبة ، وقابلية التطبيق للنشر في الجسم الحي في مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة والكائنات الحية (بما في ذلك النباتات) ، والكشف عن التوطين تحت الخلوي للبروتينات المتفاعلة. تم العثور على العديد من خصائص FRET هذه في مناهج أخرى في الجسم الحي ، مثل سبليت لوسيفيراز49،50 أو BiFC29،30،31،32،33 ، من بينها BiFC ربما يكون الأكثر استخداما. اختبار تفاعل آخر يستخدم على نطاق واسع هو Y2H45،46،47 ؛ ومع ذلك ، خارج أبحاث بيولوجيا الخميرة ، يستخدم هذا الفحص نظاما تجريبيا غير متجانس ، عرضة للإيجابيات الخاطئة ، وتتطلب نتائجه تأكيدا بتقنية أخرى. الاختلاف المفاهيمي ل Y2H هو مقايسة انقسام يوبيكويتين وهي أكثر ملاءمة للكشف عن التفاعلات بين البروتينات الغشائية51,52 والتي تظهر قيودا بالنسبة إلى FRET التي تشبه Y2H. أخيرا ، يمكن الكشف عن تفاعلات البروتين عن طريق الترسيب المناعي المشترك (co-IP) ، والذي ينطبق على الكشف في بيئة معقدة من مستخلصات الخلايا وكذلك في التفاعلات المختبرية المحددة بدقة53،54،55 ؛ في تجربتنا ، يعد co-IP مفيدا للغاية كطريقة بديلة ومستقلة لتأكيد البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام النهج القائمة على التألق في الجسم الحي.

في حين تم تطوير بروتوكول FRET المحدد هذا لدراسة التفاعلات بين عوامل نسخ النبات والإنزيمات المعدلة للهيستون ، يمكن استخدامه لاكتشاف وتوصيف التفاعلات بين العديد من الفئات الأخرى من البروتينات inplanta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم دعم العمل في مختبر V.C. بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (R35GM144059 و R01GM50224) و NSF (MCB1913165 و IOS1758046) و BARD (IS-5276-20) إلى V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

علم الأحياء ، العدد 188 ، إنزيمات تعديل الهستون (HMEs) ، عوامل النسخ (TFs) ، تفاعلات البروتين والبروتين ، FRET
دراسة التفاعلات بين إنزيمات هيستون المعدلة وعوامل النسخ <em>في الجسم الحي</em> عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter