Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Abstract

Gen ekspresyonunun epigenetik regülasyonu, transkripsiyonel baskı veya aktivasyon için sırasıyla heterokromatik veya ekromatik histon işaretleri üreten histon modifiye edici enzimlerden (HME'ler) sıklıkla etkilenir. HME'ler, transkripsiyon faktörleri (TF'ler) tarafından hedef kromatinlerine alınır. Bu nedenle, HME'ler ve TF'ler arasındaki doğrudan etkileşimleri tespit etmek ve karakterize etmek, işlevlerini ve özgüllüklerini daha iyi anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu çalışmalar, canlı dokular içinde in vivo olarak gerçekleştirilirse biyolojik olarak daha alakalı olacaktır. Burada, bir bitki histon deubikitinaz ile bir bitki transkripsiyon faktörü arasındaki etkileşimleri, birbirinden <10 nm uzaklıktaki protein molekülleri arasındaki komplekslerin tespit edilmesini sağlayan floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak görselleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. FRET tekniğinin iki varyasyonu sunulmaktadır: SE-FRET (duyarlılaştırılmış emisyon) ve AB-FRET (alıcı ağartma), burada enerji donörden alıcıya radyal olmayan bir şekilde aktarılır veya alıcının fotobeyazlatılması üzerine donör tarafından ışınımsal olarak yayılır. Hem SE-FRET hem de AB-FRET yaklaşımları, muzdaki diğer proteinler arasındaki diğer etkileşimleri keşfetmek için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

Bitki histon deubikitinazları, histonların post-translasyonel modifikasyonuyla, özellikle monoubikitilasyon işaretlerini silerek gen ekspresyonunu kontrol etmede önemli bir rol oynar1. Şimdiye kadar, OTLD1, Arabidopsis 2,3'te moleküler düzeyde karakterize edilen birkaç bitki histon deubikitinazından biridir. OTLD1, monoubikitin gruplarını H2B histon moleküllerinden uzaklaştırır, böylece hedef gen kromatin 4,5'teki H3 histonlarının ekromatik asetilasyon ve metilasyon modifikasyonlarının çıkarılmasını veya eklenmesini teşvik eder. Ayrıca, OTLD1, hedef genlerin transkripsiyonel baskılanmasını etkilemek için başka bir kromatin modifiye edici enzim olan histon lizin demetilaz KDM1C ile etkileşime girer 6,7.

Çoğu histon modifiye edici enzim DNA bağlanma yeteneklerinden yoksundur ve bu nedenle hedef genlerini doğrudan tanıyamazlar. Bir olasılık, bu enzimleri bağlayan ve onları kromatin hedeflerine yönlendiren DNA bağlayıcı transkripsiyon faktörü proteinleriyle işbirliği yapmalarıdır. Spesifik olarak, bitkilerde, birkaç ana histon modifiye edici enzimin (yani, histon metiltransferazlar8,9, histon asetiltransferazlar 10, histon demetilatazlar 11 ve Polycomb baskılayıcı kompleksleri12,13,14) transkripsiyon faktörleri tarafından işe alındığı bilinmektedir. Bu fikirle tutarlı olarak, son zamanlarda, OTLD1'in hedef promotörlere işe alınması için OTLD1'in bir transkripsiyon faktörü LSH1015 ile spesifik protein-protein etkileşimlerine dayanan olası bir mekanizma önerilmiştir.

LSH10, merkezi gelişimsel düzenleyiciler 16,17,18,19,20,21,22 olarak işlev gören bitki ALOG (Arabidopsis LSH1 ve Oryza G1) proteinlerinin bir ailesine aittir. ALOG protein ailesinin üyelerinin DNA bağlayıcı motifler23 içermesi ve transkripsiyonel düzenleme22, nükleer lokalizasyon 19 ve homodimerizasyon24 kapasitelerini sergilemesi,LSH10 da dahil olmak üzere bu proteinlerin transkripsiyonun epigenetik düzenlenmesi sırasında spesifik transkripsiyon faktörleri olarak hareket edebileceği fikrine daha fazla destek vermektedir. LSH10-OTLD1 etkileşimini in vivo olarak karakterize etmek için kullanılan ana deneysel tekniklerden biri floresan rezonans enerji transferidir (FRET)15.

FRET, canlı hücrelerin içinde birbirlerinden25 <10 nm içindeki proteinler arasındaki yakın mesafeli etkileşimleri doğrudan tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. FRET yaklaşım26'nın iki ana varyasyonu vardır: duyarlılaştırılmış emisyon (SE-FRET) (Şekil 1A) ve alıcı beyazlatma (AB-FRET) (Şekil 1B). SE-FRET'te, biri donör florokrom (örneğin, yeşil floresan proteini, GFP) ve diğeri alıcı florokrom (örneğin, monomerik kırmızı floresan protein, mRFP27,28) ile etiketlenmiş olan etkileşimli proteinler, uyarılmış durum enerjisini radyal olmayan bir şekilde donörden alıcıya aktarır. Bu aktarım sırasında hiçbir foton yayılmadığından, alıcınınkine benzer bir ışınımsal emisyon spektrumuna sahip bir floresan sinyali üretilir. AB-FRET'te, protein etkileşimleri, alıcı fotobeyazlatma ile kalıcı olarak inaktive edildiğinde ve bu nedenle donörden aktarılan ışınımsal olmayan enerjiyi alamadığında donörün yüksek radyasyon emisyonuna dayanarak tespit edilir ve ölçülür (Şekil 1). Önemli olarak, FRET floresansının hücre altı konumu, hücredeki etkileşimli proteinlerin lokalizasyonunun göstergesidir.

FRET'yi canlı dokulara yerleştirme ve etkileşen proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu belirleme yeteneği, bu etkileşimi kendi başına tespit etmekle aynı anda FRET'yi çalışmalar ve protein-protein etkileşimlerinin in vivo olarak ilk karakterizasyonu için tercih edilen teknik haline getirmektedir. Karşılaştırılabilir bir in vivo floresan görüntüleme metodolojisi olan bimoleküler floresan tamamlama (BiFC)29,30,31,32, iyi bir alternatif yaklaşımdır, ancak FRET'in aksine, BiFC, otofloresan BiFC muhabirlerinin spontan montajı nedeniyle yanlış pozitifler üretebilir 33 ve verilerinin nicelleştirilmesi daha az hassastır.

Bu makale, hem SE-FRET hem de AB-FRET tekniklerinin uygulanmasındaki başarılı deneyimi paylaşmakta ve bitki hücrelerinde OTLD1 ve LSH10 arasındaki etkileşimleri araştırmak için konuşlandırılmaları için bir protokol sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens suşu EHA105 veya GV3101 kullanılmıştır.

1. FRET vektör yapısı

  1. Donör/alıcı FRET çifti için floresan etiketleri seçin.
    1. Donör vektörünü oluşturmak için pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 15,28'den EGFP kullanın (bkz.
    2. Alıcı vektörü oluşturmak için pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1'den mRFP kullanın (bkz.
  2. Ağ Geçidi rekombinasyon klonlama sistemi35 gibi bölgeye özgü bir rekombinasyon klonlama tekniği34 kullanarak donör/alıcı FRET yapılarını oluşturun.
    1. İlgilenilen proteinlerin kodlama dizilerini yükseltin36 (yani, Arabidopsis OTLD1 ve LSH10)15.
      NOT: Etkileşen proteinlerden birinin homologunu temsil eden, ancak etkileşim göstermesi beklenmeyen negatif bir kontrol kullanmak da iyi bir fikirdir; OTLD1-LSH10 etkileşim çalışması, OTLD1'i tanımayan LSH10, LSH4'ün bir homologunu kullanır. OTLD1, LSH10 ve LSH4 cDNA'ları, Tablo 1'de listelenen primerler kullanılarak PCR ile güçlendirilir.
    2. OTLD1, LSH10 ve LSH4'ü, bölgeye özgü rekombinasyon klonlama tekniği34 ile pDONR207 giriş vektörüne klonlayın.
    3. LSH10 ve LSH4'ü pDONR207'den pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 ikili hedef vektörüne aktarmak için Ağ Geçidi LR Clonase II'yi (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak p35S::LSH10-GFP (test edilmiş yapı) ve p35S::LSH4-GFP (negatif kontrol) ikili donör yapılarını oluşturun.
    4. OTLD1'i pDONR207'den pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 ikili hedef vektörüne aktarmak için piyasada bulunan aynı enzimi (adım 1.2.3) kullanarak p35S::OTLD1-mRFP (test edilmiş yapı) ikili alıcı yapısını oluşturun.
    5. Tablo 1'de listelenen primerleri kullanarak pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1'den36 mRFP'yi PCR-amplify edin, rekombinasyon klonlama tekniği ile pDONR207'ye klonlayın ve ardından ikili füzyon yapısı p35S::mRFP-GFP'yi (pozitif kontrol) oluşturmak için mRFP'yi pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1'e aktarmak için LR Clonase II'yi kullanın.
  3. Donör ve alıcı yapılarının Agrobacterium'a dönüşümünü gerçekleştirin.
    1. Standart protokoller 37 kullanılarak hazırlanan veya ticari olarak elde edilen Agrobacterium tumefaciens suşu EHA105 veya GV3101'in yetkin hücrelerinin kültürünün 1.2.3-1.2.5 ila 100 μL adımlarından her plazmidin 1 μG'sini ekleyin ve 5 dakika boyunca37 ° C'de inkübe edin.
    2. Yetkili hücre karışımına 1 mL LB ortamı (% 1 tripton,% 0.5 maya ekstraktı ve% 1 NaCl; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 1.5 saat boyunca 200 rpm ve 28 ° C'de çalkalayın. Hücreleri, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleme yoluyla toplayın.
    3. Pipetleme yoluyla hücreleri 0.1 mL LB ortamında yeniden askıya alın ve uygun antibiyotiklerle desteklenmiş LB agarına yayın (örneğin,% 0.01 spektinomisin ve% 0.005 rifampisin; bakınız Malzeme Tablosu). 2 gün boyunca 28 ° C'de büyüyün.
    4. Bireysel kolonileri seçin ve her birini ayrı ayrı uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 1 mL LB suyuna aşılayın.
    5. Hücreleri 24 saat boyunca 28 ° C'de büyütün ve kültürün 0.2 mL'sini yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 30 s için 10.000 × g'da santrifüjleme yoluyla toplayın.
    6. Plazmid DNA'sını, plazmidleri Agrobacterium hücrelerinden izole etmek için standart bir protokolle ekstrakte edin 38 ve ekstrakte edilen DNA'yı30 μL suda yeniden askıya alın. İstenilen plazmidleri barındıran kolonileri tanımlamak için, DNA preparatının 2 μL'sini, Tablo 1'de listelenen gen-spesifik primerlerle PCR için bir şablon olarak kullanın. Tanımlanan kültürün 0.7 mL'sini 0.3 mL gliserol ile karıştırın ve -80 ° C'de saklayın.

2. Tarımsal sızma

  1. Nicotiana benthamiana bitkilerini yetiştirin.
    NOT: Tüm deney boyunca, tüm bitkiler sağlıklı olmalıdır.
    1. N. benthamiana tohumlarını yüksek yoğunlukta ıslak toprak içeren bir tencereye ekin ve yetiştirin.
    2. Ekilenleri, öfilin çapı 0,5 cm'ye ulaşana kadar 16 saat ışık ve 8 saat karanlık döngü ile 150-170 μmol / m2 s ışık yoğunluğu ile23° C'de ayarlanmış bir büyüme odasında tutun.
    3. Fideleri daha büyük saksılara aktarın ve aynı odada aynı parametrelerle büyümelerine izin verin.
      NOT: Bitkiler, en büyük yaprakları 5-7 cm çapında, genellikle 4-5 hafta içinde agroinfiltrasyona hazırdır. Çok genç olan daha küçük bitkilerde, agroinfiltrasyonun etkileri FRET analizi için çok şiddetli olacaktır.
  2. Agroinfiltrasyon için bakteri hücreleri hazırlayın.
    1. FRET yapılarını içeren her bir Agrobacterium kolonisini, uygun antibiyotiklerle (adım 1.3.3) ve 28 ° C'de 150 μM asetosirringon ile desteklenmiş 5 mL LB ortamında bir gecede büyütün (bkz.
    2. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüj yapın.
    3. Agroinfiltrasyon tamponundaki hücreleri (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM asetosirringon) OD600 = 0.5'e kadar yeniden askıya alın.
    4. Yeniden askıya alınan hücreleri, uygun yapıları barındıran hücreler arasında 1: 1 v / v oranında birleştirin (adım 2.2.5).
    5. Çift yapılı tarımsal sızmalar için, iki kültürün alikotlarını karıştırın ve tek yapılı tarımsal sızmalar için aynı kültürün alikotlarını karıştırın:
      1. Test edilen proteinler: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (p35S::OTLD1-mRFP ve p35S::LSH10-GFP yapılarını barındıran bakteriler).
      2. Negatif kontrol: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (p35S::OTLD1-mRFP ve p35S::LSH4-GFP yapılarını barındıran bakteriler).
      3. Negatif kontrol: LSH10-GFP + serbest mRFP (p35S::LSH10-GFP ve pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 yapılarını barındıran bakteriler).
      4. Pozitif kontrol: mRFP-GFP (p35S::mRFP-GFP yapısını barındıran bakteriler).
    6. Hücreleri 0.5-1 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
  3. Agroinfiltrasyon gerçekleştirin.
    1. Bakteri kültürünü 1 mL'lik iğnesiz bir şırıngaya yükleyin.
    2. Şırınganın nozulunu tamamen genişlemiş N. benthamiana yapraklarının abeksenel tarafına nazikçe ama sıkıca bastırırken, yaprağı adaksiyal tarafta eldivenli bir parmakla tutun.
    3. Bir yaprak üzerinde dört noktaya kadar sızın, bitki başına üç yaprak, her bakteri kültürü için iki veya üç bitki yapın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında eldiven değiştirin.
    4. Agrosızmış bitkileri, adım 2.1.2'de açıklandığı gibi, aynı büyüme odasında, 24 saat ila 36 saat boyunca aynı koşullar altında tutun. Agrosızmış bitkileri 36 saatten daha uzun süre tutmayın, çünkü bu floresan sinyalini azaltacaktır.

3. Konfokal mikroskopi

  1. Floresan görselleştirme için mikroskop slaytları hazırlayın.
    1. İnfiltrasyonun 24-36 saatinden sonra, her agroinfiltre edilmiş yaprağı damarlar arasında küçük parçalara (2 mm x 4 mm) kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.
    2. Yaprak parçalarını, abeksenel yaprak yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine yerleştirin. Yaprak parçalarına bir damla su koyun ve kapak camıyla örtün. Hava kabarcıklarını gidermek için kapak camına hafifçe dokunun.
    3. Mikroskop ve lazeri açın (bkz. Slaytı, belirli FRET parametreleri altında görüntüleme için mikroskop sahne tutucusuna yerleştirin (adım 3.2 ve 3.3).
    4. Hem GFP hem de mRFP sinyallerini sergileyen hücreleri tanımlamak için 10x objektif lens kullanarak gözlemlere başlayın ve ardından sonraki ayrıntılı gözlemler için 40x objektif lens kullanın.
      NOT: Önemli olarak, SE-FRET ve AB-FRET genellikle aynı doku örneği üzerinde gerçekleştirilir ve sırasıyla SE-FRET ve AB-FRET gözlemleri için açılıp kapatılan FRET kanalı hariç (adım 3.2) aynı kanal ayarlarının (adım 3.2) kullanılmasına izin verir (adım 3.2.3 ve 3.3.1).
  2. SE-FRET parametrelerini ayarlayın (Şekil 1A).
    1. Çok Boyutlu Alma (MDA) aracını açın.
    2. Aynı görüş alanında üç konfokal kanaldan oluşan bir küme oluşturun (Ek Şekil 1).
      1. 405 nm uyarma lazeri ve 400-597 nm emisyon filtresi ile donör florokromun uyarılması ve emisyonu için donör kanalını (GFP kanalı) ayarlayın.
      2. 561 nm uyarma lazeri ve 400-597 nm emisyon filtresi ile alıcı florokromun uyarılması ve emisyonu için alıcı kanalı (mRFP kanalı) ayarlayın.
        NOT: mRFP emisyon filtresi, mRFP sinyalini FRET sinyalinden 597-617 nm'de (adım 3.2.2.3) ayırmak ve böylece FRET'den bağımsız mRFP emisyonunu azaltmak için 400-597 nm olarak ayarlanmıştır.
      3. 405 nm uyarma lazeri ve 597-617 nm emisyon filtresi ile vericinin uyarılması ve alıcı florokromların emisyonu için FRET kanalını ayarlayın.
    3. Fotobeyazlatmayı önlerken FRET'yi gözlemlemek için donör uyarma yoğunluğunu minimum seviyeye ayarlayın ve SE-FRET verimliliğini azaltın.
      NOT: Bu uyarma yoğunluğu, fotobeyazlatmayı önlemek için FRET prosedürü uygulanmadan önce deneysel olarak seçilir. Yaprak kalınlığına, yaşına ve aşırı ekspresyondan sonraki zamana bağlı olarak değişir.
    4. Donörü uyarın ve alıcının beklenen floresan sinyalini içeren hücreleri tarayın.
    5. İlgilenilen floresan sinyalini içeren bölgeyi seçin.
    6. Tutturma düğmesine basarak bir SE-FRET görüntü dizisi edinin.
      1. Önce mRFP-GFP yapısını (pozitif kontrol) ifade eden görüntü 10-15 hücre; odaklanım, yakınlaştırma ve akıllı kazanç parametrelerini yakalanacak ilgi alanına odaklanacak şekilde ayarlayın (Ek Şekil 2).
      2. Aynı ayarları kullanarak, her biri OTLD1-mRFP, serbest mRFP, LSH10-GFP veya LSH4-GFP'yi ayrı ayrı ifade eden 10-15 hücreyi görüntüleyin.
        NOT: Bu görüntüler, alıcılar ve bağışçılar için spektral kanama (SBT) değerlerini belirlemek üzere FRET veri analizleri (adım 3.4.1) için kullanılan ImageJ'nin "PixFRET" eklentisi (bkz. Malzeme Tablosu) tarafından edinilir; Bu görüntüler yazılım tarafından OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP ve LSH10-GFP + serbest mRFP protein çiftleri için SE-FRET görüntüleri oluşturmak için kullanılır (adım 3.2.6.3).
      3. Ayrıca, aynı ayarları kullanarak, OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP ve LSH10-GFP + serbest mRFP protein çiftlerini birlikte ifade eden görüntü 10-15 hücre.
  3. AB-FRET için parametreleri ayarlayın (Şekil 1B).
    1. SE-FRET için ayarlanan donör ve alıcı kanal parametrelerini kullanın (adım 3.2.2) ancak FRET kanalını kapatın.
    2. Alıcının fotobeyazlatılması için parametreleri ayarlayın (mRFP) (Ek Şekil 3).
      1. Beyazlatmanın beş görüntüden sonra başladığından emin olun. Her alan ağartıcısı için 200 yinelemeye izin verin. % 100 lazer yoğunluğunu 561 nm'de tutun.
      2. Beyazlatma süresini 45 sn tutun. 400 Hz'de 512 x 512 piksel tarama hızı sağlayın.
    3. Ağartılacak hücrenin bölgesini çizin; Örneğin, nükleer etkileşimler için, ilgilenilen bölgeler hücre çekirdeğinin tüm alanı etrafında çizilir39.
    4. Denemeyi başlat düğmesine basarak ağartmayı etkinleştirin; Bu fonksiyonun etkinleştirilmesi fotobeyazlatmayı gerçekleştirecek ve AB-FRET görüntü dizisini elde edecektir.
  4. FRET verilerini analiz edin.
    1. SE-FRET verilerini analiz etmek için, SBT40'ı çıkardıktan sonra SE-FRET verimliliğinin düzeltilmiş görüntülerini oluşturmak üzere ImageJ yazılımı için "PixFRET" eklentisini kullanın (adım 3.2.6.2).
    2. AB-FRET verilerini analiz etmek için, aşağıdaki formülü41 kullanarak mRFP fotobeyazlatma işleminden sonra GFP emisyonundaki yüzde artış olarak %AB-FRET hesaplayın: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, burada GFPpost, mRFP fotobeyazlatmadan sonra GFP emisyonudur ve GFPpre, mRFP fotobeyazlatmadan önce GFP emisyonudur.
    3. FRET görüntülerini incelerken, FRET sinyalinin hücre altı lokalizasyonuna dikkat edin.
      NOT: Birçok durumda, bu hücresel bölmeler (örneğin, çekirdek, kloroplastlar, ER, vb.) kolayca tanımlanabilir ve FRET tekniğinin ek bir yararı olarak, etkileşime giren proteinlerin biyolojik işlevine önemli ipuçları sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2 , hücre çekirdeğinin aynı anda üç kanala (yani, donör GFP, alıcı mRFP ve SE-FRET) kaydedildiği bir SE-FRET deneyinin tipik sonuçlarını göstermektedir. Bu veriler, sahte renk ölçeğinde kodlanmış SE-FRET verimliliğinin görüntülerini oluşturmak için kullanıldı. Bu ölçekte, maviden kırmızıya geçiş, FRET verimliliğinde bir artışa, protein-protein yakınlığının% 0 ila% 100 arasında bir ölçüsüne karşılık gelir. Bu temsili deneyde, SE-FRET sinyali hücre çekirdeğine kaydedildi ve LSH10 ve OTLD1'in birlikte ekspresyonunu takiben yoğunluğu, mRFP-GFP'nin ekspresyonundan sonra gözlemlenenle karşılaştırılabilir (yani, pozitif kontrol). Negatif kontrollerde SE-FRET gözlenmedi (yani, OTLD1-mRFP ve LSH4-GFP'nin birlikte ekspresyonu veya serbest mRFP ve LSH10-GFP).

LSH10-OTLD1 etkileşimleri AB-FRET kullanılarak ölçüldü. Bu amaçla, alıcı mRFP'nin fotobeyazlatmasından önce ve sonra donör GFP floresansı, donör ve alıcı floresan ölçümlerinin fotobeyazlatma zaman serileri olarak hücre çekirdeğine kaydedildi (Ek Şekil 4). Kaydedilen hücre çekirdeğinin görüntüleri, GFP floresansındaki değişimi ölçmek için sahte renkte sunuldu. Şekil 3 , LSH10-GFP / OTLD1-mRFP koekspresyonunun, mRFP alıcısı fotobeyazlatıldıktan ve floresan yeteneğini kaybettikten sonra GFP donör floresansının artmasına neden olduğunu göstermektedir. Donör floresansında benzer bir artış mRFP-GFP pozitif kontrolünde gözlendi, ancak LSH4-GFP / OTLD1-mRFP veya LSH10-GFP / mRFP koekspresyonunun negatif kontrollerinde gözlenmedi, oysa alıcı floresan tüm fotobeyazlatma deneylerinde inaktive edildi. Şekil 4 , AB-FRET verilerinin kantitatif analizini göstererek, LSH10 ve OTLD1'i birlikte eksprese ettikten sonra donör floresansında (%AB-FRET) yaklaşık% 13'lük istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğunu göstermektedir. Pozitif mRFP-GFP kontrolü yaklaşık %30 AB-FRET üretirken, negatif kontroller %AB-FRET üretmedi. Hem SE-FRET hem de AB-FRET görüntüleri, transkripsiyon faktörü-histon modifiye edici enzim kompleksleri ve GFP / mRFP proteinlerinin nükleositoplazmik doğası için beklenen hücre altı lokalizasyonu ile tutarlı olarak hücre çekirdeğindeki FRET sinyalini göstermiştir34 (Şekil 2 ve Şekil 3).

Özetle, temsili veriler, bu FRET protokolünün, histon modifiye edici enzimler ile transkripsiyon faktörleri arasındaki etkileşimleri göstermek ve ölçmek ve canlı bitki hücrelerinde hücre altı lokalizasyonlarını belirlemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Figure 1
Resim 1: SE-FRET ve AB-FRET tekniklerinin şematik özeti . (A) SE-FRET'in temel prensibi. Test edilen proteinlerden biri, donör florokrom görevi gören GFP ile, diğeri ise alıcı florokrom görevi gören mRFP ile etiketlenir. Donör molekül uyarılır ve alıcı emisyon kaydedilir. Test edilen proteinler, birbirlerinden 10 nm uzakta konumlandırılacak şekilde birbirleriyle etkileşime girerlerse, uyarılmış donörden gelen enerji, radyasyon olmadan alıcıya aktarılır, bu da daha sonra uyarılır ve FRET emisyon kanalında floresan yayar. Herhangi bir etkileşim gerçekleşmezse, donörden alıcıya enerji aktarılmaz ve alıcı tarafından FRET emisyonu tespit edilmez. (B) AB-FRET'in temel ilkesi. Test edilen proteinler, SE-FRET için (A) bölümünde açıklandığı gibi etiketlenmiştir. Donör molekül uyarılır ve test edilen proteinler arasındaki etkileşim meydana gelirse, donör alıcıyı ışınımsal olmayan bir şekilde uyarır ve FRET'ye neden olur. Daha sonra, alıcı fotobeyazlatma ile kalıcı olarak inaktive edilir, böylece donörden ışınımsal olmayan enerjiyi kabul etme ve FRET emisyon kanalında FRET floresansını yayma yeteneğini kaybeder; Donör tarafından yayılan floresan ise artar, çünkü donör ışınımsal olmayan transferle daha az enerji kaybeder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: SE-FRET tarafından tespit edilen N. benthamiana yapraklarında LSH10'un OTLD1 ile spesifik etkileşimi. Belirtilen protein kombinasyonları için üç tespit kanalından (donör, alıcı ve SE-FRET) görüntüler gösterilmiştir. SE-FRET verimlilik görüntüleri, spektral kanamanın (SBT) çıkarılmasıyla hesaplandı ve sırasıyla en yüksek ve en düşük sinyali gösteren kırmızı ve mavi renklerle sahte renkte gösterildi. (A) mRFP-GFP pozitif kontrolü tarafından üretilen yüksek SE-FRET verimlilik sinyali. (B) Etkileşen LSH10-GFP ve OTLD1-mRFP proteinleri tarafından üretilen pozitif SE-FRET verimlilik sinyali. (C) Negatif kontrol proteini LSH4-GFP ve OTLD1-mRFP'nin birlikte ekspresyonu, SE-FRET verimlilik sinyali üretmedi. (D) Negatif kontrolsüz mRFP proteini ve LSH10-GFP'nin birlikte ekspresyonu, SE-FRET verimlilik sinyali üretmedi. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: AB-FRET tarafından tespit edilen N. benthamiana yapraklarında LSH10'un OTLD1 ile spesifik etkileşimi. Fotobeyazlatmadan önce ve sonra iki algılama kanalından (donör ve alıcı) alınan görüntüler, belirtilen protein kombinasyonları için gösterilmiştir. Daire, fotobeyazlatılan bölgeyi gösterir. mRFP fotobeyazlatma işleminden sonra GFP floresansında bir artış olarak görselleştirilen AB-FRET, sırasıyla en yüksek ve en düşük sinyali gösteren kırmızı ve mavi renklerle sahte renk kullanılarak görüntülenir. (A) mRFP-GFP pozitif kontrolü tarafından üretilen GFP donör floresansında bir artış. (B) Etkileşen LSH10-GFP ve OTLD1-mRFP proteinleri tarafından üretilen GFP donör floresansında bir artış. (C) Negatif kontrol proteini LSH4-GFP ve OTLD1-mRFP'nin birlikte ekspresyonu, GFP donör floresansında ihmal edilebilir değişiklikler üretti. (D) Negatif kontrolsüz mRFP proteini ve LSH10-GFP'nin birlikte ekspresyonu, GFP donör floresansında ihmal edilebilir değişiklikler üretti. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Resim 4: AB-FRET'in Nicelleştirilmesi. Belirtilen protein kombinasyonları için mRFP fotobeyazlatma sonrası GFP donör floresansındaki yüzde artış (%AB-FRET) gösterilmiştir. Hata çubukları, her ölçüm için n = 13 hücre ortalamasını temsil eder. İki kuyruklu t-testi, ortalama değerler arasındaki farklılıkların p-değerleri için istatistiksel olarak anlamlı olduğunu belirledi *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001; p≥ 0.05 istatistiksel olarak anlamlı değildir (ns). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Astar adı Sıra (5ʹ - 3ʹ) Amaç
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag OTLD1'i cDNA'dan yükseltin
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttccgtggctttgcctttgcgtc OTLD1'i cDNA'dan yükseltin
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgtcctctccaagagaaagagg LSH10'u cDNA'dan yükseltin
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac LSH10'u cDNA'dan yükseltin
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg LSH4'ü cDNA'dan yükseltin
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc LSH4'ü cDNA'dan yükseltin
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt mRFP'yi pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1'den yükseltin
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggttggagatctgcggccgcgg mRFP'yi pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1'den yükseltin
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc pDONR207'deki dizileri PCR ve DNA dizilimi ile onaylayın
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac pDONR207'deki dizileri PCR ve DNA dizilimi ile onaylayın
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Hedef vektörlerdeki dizileri PCR ve DNA dizilimi ile onaylayın
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Hedef vektörlerdeki dizileri PCR ve DNA dizilimi ile onaylayın
35S Promoter Fw ctatccttcgcaagacccttc Hedef vektörlerdeki dizileri PCR ile onaylayın

Tablo 1: pDONOR207'deki klonlanmış dizileri ve hedef vektörleri klonlamak ve onaylamak için astarlar. Fw, ileri astarlar; Rv, ters primerler.

Ek Şekil 1: Konfokal kanallar için parametrelerin ayarlanması. (A) Donör kanalı (GFP) için uyarma ve emisyon parametresi kurulumu için ekran görüntüsü. (B) Alıcı kanal (mRFP) için uyarma ve emisyon parametresi kurulumu için ekran görüntüsü. (C) FRET kanalı için uyarma ve emisyon parametresi kurulumu için ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: İlgilenilen numunenin SE-FRET görüntülerinin elde edilmesi için parametrelerin ayarlanması. (A) Tarama alanı parametre ayarı için ekran görüntüsü (yani, görüntü boyutu, tarama hızı, yönü ve ortalaması). (B) GFP kanal parametresi kurulumu için ekran görüntüsü (yani, lazer, iğne deliği, ana kazanç ve dijital kazanç). (C) mRFP kanal parametresi kurulumu için ekran görüntüsü (yani, lazer, iğne deliği, ana kazanç ve dijital kazanç). (D) FRET kanalı parametre kurulumu için ekran görüntüsü (yani, lazer, iğne deliği, ana kazanç ve dijital kazanç). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Alıcı fotobeyazlatma için parametrelerin ayarlanması. (A) Tarama alanı parametre ayarı için ekran görüntüsü (yani, görüntü boyutu, tarama hızı, yönü ve ortalaması). (B) Zaman serisi ve zaman ağartma parametresi kurulumu için ekran görüntüsü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: AP-FRET sırasında donör ve alıcı floresan ölçümlerinin zaman serisi. Fotobeyazlatma periyodu öncesinde, sırasında ve sonrasında belirtilen numuneler için alıcı (mRFP) ve donör (GFP) floresansının kinetiği belirlendi. (A) Pozitif mRFP-GFP kontrolü. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Negatif LSH4-GFP + OTLD1-mRFP kontrolü. (D) Negatif LSH10-GFP + Serbest mRFP kontrolü. Sarı çizgiler fotobeyazlatma süresini gösterir. Beyaz eğriler, floresan kinetiğinin ölçümlerini çizer. Her panelde, üst ve alt görüntüler sırasıyla alıcı (mRFP) ve donör (GFP) floresansının kinetiğini gösterir. Doğal olarak, GFP floresansının zamanla azaldığını unutmayın, çünkü lazer GFP'nin kendisini yavaş yavaş fotobeyazlatır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu FRET protokolü basit ve yeniden üretilmesi kolaydır; aynı zamanda minimum tedarik yatırımı gerektirir ve birçok modern laboratuvar için standart ekipman kullanır. Spesifik olarak, beş ana teknik özellik bu prosedürün çok yönlülüğünü ayırt eder. İlk olarak, FRET yapıları, kullanımı kolay, doğru sonuçlar üreten ve geleneksel kısıtlama enzimi tabanlı klonlamaya kıyasla zamandan tasarruf sağlayan bir klonlama yaklaşımı olan bölgeye özgü rekombinasyon kullanılarak oluşturulur. İkincisi, N. benthamiana bitkilerinin büyümesi kolaydır, nispeten büyük miktarlarda doku üretir ve çoğu laboratuvarda bulunur. Üçüncüsü, agroinfiltrasyon, teslim edilen yapıların geçici ifadesiyle sonuçlanır ve bu nedenle, transgenik bitkiler üretmek için gereken aylara kıyasla nispeten kısa bir süre içinde (yani, 24-36 saat) veri üretir. Dördüncüsü, ko-agroinfiltrasyon yoluyla ilgilenilen yapıların farklı kombinasyonlarını sunma yeteneği, herhangi bir protein arasındaki etkileşimlerin test edilmesine izin verir. Son olarak, hem SE-FRET hem de AB-FRET aynı doku örneği üzerinde sadece lazer kanal ayarlarından birini açıp kapatarak sırayla gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, mikrobombardıman dağıtımı42'nin , agroinfiltrasyon yerine bitki dokularına yapı dağıtımı için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılabileceği belirtilmelidir; Bu durumda, agroinfiltrasyon için gerekli ikili vektörlerin kullanımı gereksizdir.

Bu protokolün kritik bir adımı, FRET verimliliğini optimize etmek için donör ve alıcı florokrom çiftini doğru seçmektir. Aşağıdaki üç faktör göz önünde bulundurulmalıdır: (1) aktarılan enerji miktarını en üst düzeye çıkarmak için donör emisyon spektrumunun alıcı absorpsiyon spektrumuyla maksimum düzeyde örtüşmesi gerekir; (2) Donörün ve alıcının emisyon spektrumları, birbirlerinden ayırt edilebilecek ve mikroskopi ile tespit edilen sinyalin SBT'sini en aza indirecek kadar farklı olmalıdır; (3) Alıcı, donörün uyarılması sırasında alıcının uyarılmasını en aza indirmek için donörün absorbans maksimumunda minimum doğrudan uyarılmaya sahip olmalıdır. Kullanılan yaygın donör / alıcı FRET çiftleri camgöbeği / sarı ve yeşil / kırmızı floresan proteinlerdir (yani, sırasıyla CFP / YFP ve GFP / mRFP). Bu protokol GFP / mRFP çiftini kullanır, çünkü canlı hücre görüntüleme için uygundur ve camgöbeği / sarı FRET çiftlerinin aksine, düşük fototoksisite ve düşük fotobeyazlatma43 sergiler. Uygun bir şekilde, FRET çifti arasındaki translasyonel füzyon (yani, mRFP-GFP) ideal bir FRET pozitif kontrolü görevi görür.

Bir diğer kritik adım, uygun negatif kontrollerin seçilmesidir. Örneğin, LSH10-OTLD1 etkileşimi durumunda, FRET analizi her zaman tek başına OTLD1'in, tek başına LSH10'un ekspresyonunu ve OTLD1 ve LSH10'un etkileşimin beklenmediği proteinlerle (yani, sırasıyla LSH4 ve serbest mRFP) birlikte ekspresyonunu içermelidir. Negatif kontrollerin seçimi açısından, FRET deneyleri, canlı bitki hücrelerinde protein etkileşimlerinin tespiti için uyarlanmış başka bir floresan görüntüleme tabanlı yaklaşım olan BiFC tekniği44'ün kullanımı için en iyi uygulamalara ilişkin yönergeleri izleyebilir 29,30,31,32.

Son olarak, FRET deneylerini etkileyen bir faktör, canlı bitki dokularındaki tüm deneylerde ortaktır ve genel olarak bitkinin değişen fizyolojik koşullarından ve özellikle de kontrollü büyüme koşulları altında tutulsa bile, agrosızmış dönüştürülmüş hücrelerden kaynaklanmaktadır. Bu fizyolojik değişkenlik, bireysel deneyler, bitkiler ve hatta yapraklar arasındaki FRET verilerinin belirli bir değişkenliğine katkıda bulunabilir. Bu nedenle, her deney için bitki başına en az iki bitki ve üç yaprak kullanmak ve daha iyi görüntüler elde ettikleri için agroinfiltrasyon için olgun, tamamen genişletilmiş yaprakları seçmek önemlidir.

Tüm deneysel metodolojilerde olduğu gibi, FRET'in teknik ve kullanıma dayalı sınırlamaları vardır. Böyle bir sınırlayıcı faktör, otofloresan etiketinin doğası ve ilgilenilen protein içindeki (örneğin, amino veya karboksil terminustaki) konumudur ve bu proteinin biyolojik özelliklerine, örneğin doğal hücre altı lokalizasyon paterni veya doğal interaktörlerini tanıma yeteneği gibi müdahale edebilir. Etiketlemeden önce, ilgilenilen her protein, etiketleme ile tehlikeye girebilecek yapısal özellikleri açısından mümkün olduğunca analiz edilmelidir. Bununla birlikte, birçok durumda, etiketleme parametreleri, ilgilenilen proteinin bilinen aktivitelerine dayanarak ampirik olarak belirlenmelidir. Bir diğer önemli sınırlama, uygun donanım ve yazılımla konfokal mikroskopi kullanmayı gerektiren FRET'in göreceli teknik karmaşıklığıdır. Maya iki hibrid sistem (Y2H)45,46,47 gibi diğer birçok protein etkileşim yönteminin aksine, FRET ekspresyon kütüphanelerini, özellikle de yüksek verimli ekranları48 tarayarak protein etkileşimlerini tanımlamak için uygun değildir. Ek olarak, in vivo olarak yapılan çoğu tahlil gibi, FRET biyokimyasal olarak saf bir sistem değildir ve bu nedenle, etkileşimdeki diğer bilinmeyen hücresel faktörlerin potansiyel katılımını tespit etmez.

FRET'nin diğer protein etkileşimleri tahlillerine göre önemi, kısa mesafeli etkileşimlerin tespiti, yanlış pozitif sonuç alma şansını azaltması, çeşitli hücrelerde, dokularda ve organizmalarda (bitkiler dahil) in vivo olarak konuşlandırılabilirliğinde ve etkileşime giren proteinlerin hücre altı lokalizasyonunun tespitinde yatmaktadır. FRET'nin bu özelliklerinin çoğu, BiFC'nin belki de en yaygın olarak kullanıldığı bölünmüş lusiferaz 49,50 veya BiFC29,30,31,32,33 gibi diğer in vivo yaklaşımlarda bulunur. Yaygın olarak kullanılan bir diğer etkileşim testi Y2H45,46,47; Bununla birlikte, maya biyolojisi araştırmasının dışında, bu tahlil yanlış pozitiflere eğilimli heterolog bir deney sistemi kullanır ve bulguları başka bir teknikle doğrulanmayı gerektirir. Y2H'nin kavramsal bir varyasyonu, membran proteinleri51,52 arasındaki etkileşimleri tespit etmek için daha uygun olan ve Y2H'ye benzer FRET'ye göre sınırlamalar sergileyen bir bölünme-ubikitin testidir. Son olarak, protein etkileşimleri, hücre ekstraktlarının karmaşık bir ortamında ve kesin olarak tanımlanmış in vitro reaksiyonlarda53,54,55; Deneyimlerimize göre, co-IP, floresan tabanlı in vivo yaklaşımlar kullanılarak elde edilen verileri doğrulamak için alternatif ve bağımsız bir yöntem olarak en yararlı olanıdır.

Bu spesifik FRET protokolü, bitki transkripsiyon faktörleri ve histon modifiye edici enzimler arasındaki etkileşimleri incelemek için geliştirilmiş olsa da, inplanta'nın diğer birçok protein sınıfı arasındaki etkileşimleri keşfetmek ve karakterize etmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.

Acknowledgments

V.C.'nin laboratuvarındaki çalışmalar, NIH (R35GM144059 ve R01GM50224), NSF (MCB1913165 ve IOS1758046) ve BARD'dan (IS-5276-20) V.C.'ye verilen hibelerle desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Biyoloji Sayı 188 Histon modifiye edici enzimler (HME'ler) transkripsiyon faktörleri (TF'ler) protein-protein etkileşimleri FRET
Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki <em>Etkileşimlerin in vivo</em> Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter