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Biology

Studio delle interazioni tra enzimi modificanti gli istoni e fattori di trascrizione in vivo mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) è una tecnica di imaging per rilevare le interazioni proteiche nelle cellule viventi. Qui viene presentato un protocollo FRET per studiare l'associazione di enzimi modificanti gli istoni con fattori di trascrizione che li reclutano nei promotori bersaglio per la regolazione epigenetica dell'espressione genica nei tessuti vegetali.

Abstract

La regolazione epigenetica dell'espressione genica è comunemente influenzata dagli enzimi modificanti gli istoni (HME) che generano segni istonici eterocromatici o eucromatici rispettivamente per la repressione o l'attivazione trascrizionale. Gli HME vengono reclutati nella loro cromatina target dai fattori di trascrizione (TF). Pertanto, rilevare e caratterizzare le interazioni dirette tra HME e TF è fondamentale per comprendere meglio la loro funzione e specificità. Questi studi sarebbero biologicamente più rilevanti se eseguiti in vivo all'interno di tessuti viventi. Qui, viene descritto un protocollo per visualizzare le interazioni nelle foglie delle piante tra una deubiquitinasi istonica vegetale e un fattore di trascrizione vegetale utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET), che consente la rilevazione di complessi tra molecole proteiche che si trovano entro <10 nm l'una dall'altra. Vengono presentate due varianti della tecnica FRET: SE-FRET (emissione sensibilizzata) e AB-FRET (sbiancamento dell'accettore), in cui l'energia viene trasferita in modo non radiativo dal donatore all'accettore o emessa radiativamente dal donatore dopo il fotosbiancamento dell'accettore. Entrambi gli approcci SE-FRET e AB-FRET possono essere adattati facilmente per scoprire altre interazioni tra altre proteine nelle piante.

Introduction

Le deubiquitinasi istoniche vegetali svolgono un ruolo importante nel controllo dell'espressione genica mediante modificazione post-traduzionale degli istoni, in particolare cancellando i loro segni di monoubiquitilazione1. Finora, OTLD1 è una delle poche deubiquitinasi istoniche vegetali caratterizzate a livello molecolare in Arabidopsis 2,3. OTLD1 rimuove i gruppi monoubiquitina dalle molecole istoniche H2B, promuovendo così la rimozione o l'aggiunta di acetilazione eucromatica e modificazioni di metilazione degli istoni H3 nel gene bersagliocromatina 4,5. Inoltre, OTLD1 interagisce con un altro enzima modificante la cromatina, l'istone lisina demetilasi KDM1C, per influenzare la soppressione trascrizionale dei geni bersaglio 6,7.

La maggior parte degli enzimi modificanti gli istoni non hanno capacità di legame al DNA e quindi non possono riconoscere direttamente i loro geni bersaglio. Una possibilità è che cooperino con le proteine del fattore di trascrizione leganti il DNA che legano questi enzimi e li dirigono verso i loro bersagli cromatinici. In particolare, nelle piante, diversi importanti enzimi modificanti gli istoni (cioè istone metiltransferasi8,9, istone acetiltransferasi 10, istone demetilasi 11 e complessi repressivi Polycomb12,13,14) sono noti per essere reclutati da fattori di trascrizione. Coerentemente con questa idea, recentemente, è stato proposto un possibile meccanismo per il reclutamento di OTLD1 nei promotori target che si basa su specifiche interazioni proteina-proteina di OTLD1 con un fattore di trascrizione LSH1015.

LSH10 appartiene ad una famiglia di proteine vegetali ALOG (Arabidopsis LSH1 e Oryza G1) che funzionano come regolatori centrali dello sviluppo 16,17,18,19,20,21,22. Il fatto che i membri della famiglia di proteine ALOG contengano motivi leganti il DNA23 e mostrino le capacità di regolazione trascrizionale 22, localizzazione nucleare19 e omodimerizzazione24 fornisce ulteriore supporto all'idea che queste proteine, incluso LSH10, possano agire come fattori di trascrizione specifici durante la regolazione epigenetica della trascrizione. Una delle principali tecniche sperimentali utilizzate per caratterizzare l'interazione LSH10-OTLD1 in vivo è il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)15.

FRET è una tecnica di imaging per rilevare direttamente interazioni a distanza ravvicinata tra proteine entro <10 nm l'una dall'altra25 all'interno di cellule viventi. Esistono due varianti principali dell'approccio FRET26: l'emissione sensibilizzata (SE-FRET) (Figura 1A) e lo sbiancamento accettore (AB-FRET) (Figura 1B). In SE-FRET, le proteine interagenti - una delle quali è marcata con un fluorocromo donatore (ad esempio, proteina fluorescente verde, GFP) e l'altra con un fluorocromo accettore (ad esempio, proteina fluorescente rossa monomerica, mRFP27,28) - trasferiscono in modo non radiativo l'energia dello stato eccitato dal donatore all'accettore. Poiché non vengono emessi fotoni durante questo trasferimento, viene prodotto un segnale fluorescente che ha uno spettro di emissione radiativa simile a quello dell'accettore. In AB-FRET, le interazioni proteiche sono rilevate e quantificate in base all'elevata emissione radiativa del donatore quando l'accettore è permanentemente inattivato dal fotosbiancamento e quindi non è in grado di ricevere l'energia non radiativa trasferita dal donatore (Figura 1). È importante sottolineare che la posizione subcellulare della fluorescenza FRET è indicativa della localizzazione delle proteine interagenti nella cellula.

La capacità di dispiegare FRET nei tessuti viventi e determinare la localizzazione subcellulare delle proteine interagenti simultaneamente con la rilevazione di questa interazione di per sé, rende FRET la tecnica di scelta per gli studi e la caratterizzazione iniziale delle interazioni proteina-proteina in vivo. Una metodologia di imaging a fluorescenza in vivo comparabile, la complementazione di fluorescenza bimolecolare (BiFC)29,30,31,32, è un buon approccio alternativo, anche se, a differenza di FRET, BiFC può produrre falsi positivi a causa dell'assemblaggio spontaneo dei reporter BiFC autofluorescenti 33 e la quantificazione dei suoi dati è meno precisa.

Questo articolo condivide l'esperienza di successo nell'implementazione di entrambe le tecniche SE-FRET e AB-FRET e presenta un protocollo per la loro distribuzione per studiare le interazioni tra OTLD1 e LSH10 nelle cellule vegetali.

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Protocol

Per il presente studio sono stati utilizzati Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens ceppo EHA105 o GV3101.

1. Costruzione vettoriale FRET

  1. Selezionare i tag fluorescenti per la coppia FRET donatore/accettore.
    1. Utilizzare EGFP da pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (vedere la tabella dei materiali) per generare il vettore donatore.
    2. Utilizzare mRFP da pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (vedere Tabella dei materiali) per generare il vettore accettore.
  2. Generare i costrutti FRET donatore/accettore utilizzando una tecnica di clonazione di ricombinazione specifica del sito34, come il sistema di clonazione di ricombinazione Gateway35.
    1. Amplificare le sequenze codificanti delle proteine di interesse36 (cioè Arabidopsis OTLD1 e LSH10)15.
      NOTA: È anche una buona idea utilizzare un controllo negativo che rappresenta un omologo di una delle proteine interagenti ma non ci si aspetta che mostri interazione; lo studio di interazione OTLD1-LSH10 impiega un omologo di LSH10, LSH4, che non riconosce OTLD1. I cDNA OTLD1, LSH10 e LSH4 sono amplificati mediante PCR utilizzando i primer elencati nella Tabella 1.
    2. Clonare OTLD1, LSH10 e LSH4 nel vettore di ingresso pDONR207 mediante la tecnica di clonazione di ricombinazione sito-specifica34.
    3. Utilizzare il Gateway LR Clonase II (vedere la Tabella dei Materiali) per trasferire LSH10 e LSH4 da pDONR207 nel vettore di destinazione binario pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 per generare i costrutti binari del donatore p35S::LSH10-GFP (costrutto testato) e p35S::LSH4-GFP (controllo negativo).
    4. Utilizzare lo stesso enzima disponibile in commercio (passo 1.2.3) per trasferire OTLD1 da pDONR207 nel vettore di destinazione binario pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 per generare il costrutto accettore binario p35S:: OTLD1-mRFP (costrutto testato).
    5. PCR-amplificare36 mRFP da pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 usando i primer elencati nella Tabella 1, clonarlo con la tecnica di clonazione di ricombinazione in pDONR207 e quindi utilizzare LR Clonase II per trasferire mRFP in pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 per generare il costrutto di fusione binaria p35S::mRFP-GFP (controllo positivo).
  3. Eseguire la trasformazione dei costrutti del donatore e dell'accettore in Agrobacterium.
    1. Aggiungere 1 μg di ciascun plasmide dalle fasi 1.2.3-1.2.5 a 100 μL della coltura di cellule competenti di Agrobacterium tumefaciens ceppo EHA105 o GV3101, preparato utilizzando i protocolli standard 37 o ottenuto commercialmente, e incubare a37 °C per 5 minuti.
    2. Aggiungere 1 mL di terreno LB (1% triptone, 0,5% estratto di lievito e 1% NaCl; vedi Tabella dei materiali) alla miscela cellulare competente e agitare a 200 rpm e 28 ° C per 1,5 h. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente.
    3. Risospendere le cellule in 0,1 mL di terreno LB mediante pipettaggio e distribuirle su agar LB integrato con gli antibiotici appropriati (ad esempio, 0,01% di spectinomicina e 0,005% di rifampicina; vedere Tabella dei materiali). Crescere a 28 °C per 2 giorni.
    4. Scegli le singole colonie e inocula ciascuna di esse separatamente in 1 ml di brodo LB integrato con gli antibiotici appropriati.
    5. Far crescere le cellule a 28 °C per 24 ore e trasferire 0,2 ml di coltura in una nuova provetta. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 10.000 × g per 30 s a temperatura ambiente.
    6. Estrarre il DNA plasmidico con un protocollo standard per isolare i plasmidi dalle cellule di Agrobacterium 38 e risospendere il DNA estratto in30 μL di acqua. Per identificare le colonie che ospitano i plasmidi desiderati, utilizzare 2 μL della preparazione del DNA come modello per la PCR con primer gene-specifici elencati nella Tabella 1. Mescolare 0,7 mL della coltura identificata con 0,3 mL di glicerolo e conservare a -80 °C.

2. Agroinfiltrazione

  1. Coltiva piante di Nicotiana benthamiana .
    NOTA: Durante l'intero esperimento, tutte le piante devono essere sane.
    1. Semina e coltiva i semi di N. benthamiana in un vaso contenente terreno umido ad alta densità.
    2. Conservare i semi piantati in una camera di crescita impostata a 23 °C con 16 h di luce e 8 ore di ciclo buio con intensità luminosa di 150-170 μmol/m2s fino a quando il diametro dell'eufilla raggiunge 0,5 cm.
    3. Trasferire le piantine in vasi più grandi e lasciarle crescere nella stessa camera con gli stessi parametri.
      NOTA: Le piante sono pronte per l'agroinfiltrazione quando le loro foglie più grandi hanno un diametro di 5-7 cm, di solito entro 4-5 settimane. Nelle piante più piccole che sono troppo giovani, gli effetti dell'agroinfiltrazione saranno troppo gravi per l'analisi FRET.
  2. Preparare le cellule batteriche per l'agroinfiltrazione.
    1. Coltivare ogni colonia di Agrobacterium contenente i costrutti FRET durante la notte in 5 ml di terreno LB integrato con gli antibiotici appropriati (fase 1.3.3) e 150 μM di acetosiringone a 28 °C (vedere Tabella dei materiali).
    2. Centrifugare le celle a 3.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Risospendere le cellule in tampone di agroinfiltrazione (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acetosiringone) a OD600 = 0,5.
    4. Combinare le celle risospese con un rapporto v/v 1:1 tra le celle che ospitano i costrutti appropriati (passo 2.2.5).
    5. Per le agroinfiltrazioni a doppio costrutto, mescolare le aliquote di due colture e, per le agroinfiltrazioni a costruzione singola, mescolare le aliquote della stessa coltura:
      1. Proteine testate: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (batteri che ospitano i costrutti p35S::OTLD1-mRFP e p35S::LSH10-GFP).
      2. Controllo negativo: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (batteri che ospitano i costrutti p35S::OTLD1-mRFP e p35S::LSH4-GFP).
      3. Controllo negativo: LSH10-GFP + mRFP libero (batteri che ospitano i costrutti p35S::LSH10-GFP e pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Controllo positivo: mRFP-GFP (batteri che ospitano il costrutto p35S::mRFP-GFP).
    6. Incubare le cellule a 28 °C per 0,5-1 ora.
  3. Eseguire l'agroinfiltrazione.
    1. Caricare la coltura batterica in una siringa senza ago da 1 ml.
    2. Premere delicatamente ma con decisione l'ugello della siringa contro il lato abassiale delle foglie di N. benthamiana completamente espanse tenendo la foglia con un dito guantato sul lato adassiale.
    3. Infiltrare fino a quattro punti su una foglia, tre foglie per pianta, due o tre piante per ogni coltura batterica. Cambiare i guanti tra i campioni per evitare contaminazioni incrociate.
    4. Mantenere le piante agroinfiltrate nella stessa camera di crescita nelle stesse condizioni, come descritto al punto 2.1.2, per 24-36 ore. Non tenere le piante agroinfiltrate per più di 36 ore, in quanto ciò ridurrebbe il segnale di fluorescenza.

3. Microscopia confocale

  1. Preparare vetrini da microscopio per la visualizzazione della fluorescenza.
    1. Dopo 24-36 h di infiltrazione, utilizzare una lametta per tagliare ogni foglia agroinfiltrata in piccoli pezzi (2 mm x 4 mm) tra le vene.
    2. Posizionare i pezzi di foglia su un vetrino con la superficie della foglia abassiale rivolta verso l'alto. Mettere una goccia d'acqua sui pezzi di foglie e coprirli con il vetro di copertura. Picchiettare leggermente il vetro di copertura per rimuovere le bolle d'aria.
    3. Accendere il microscopio e il laser (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il vetrino nel supporto del palco del microscopio per l'imaging sotto i parametri FRET specifici (passaggi 3.2 e 3.3).
    4. Iniziare le osservazioni utilizzando una lente obiettivo 10x per identificare le cellule che mostrano entrambi i segnali GFP e mRFP, quindi utilizzare una lente obiettivo 40x per le successive osservazioni dettagliate.
      NOTA: È importante sottolineare che SE-FRET e AB-FRET di solito vengono eseguiti sullo stesso campione di tessuto, consentendo l'uso delle stesse impostazioni del canale (fase 3.2) ad eccezione del canale FRET, che viene attivato / disattivato per le osservazioni SE-FRET e AB-FRET, rispettivamente (passaggi 3.2.2.3 e 3.3.1).
  2. Impostare i parametri per SE-FRET (Figura 1A).
    1. Aprire lo strumento MDA (Multi-Dimensional Acquisition).
    2. Stabilire un insieme di tre canali confocali nello stesso campo visivo (Figura supplementare 1).
      1. Impostare il canale donatore (il canale GFP) per l'eccitazione e l'emissione del fluorocromo donatore con il laser di eccitazione 405 nm e il filtro di emissione 400-597 nm.
      2. Impostare il canale accettore (il canale mRFP) per l'eccitazione e l'emissione del fluorocromo accettore con il laser di eccitazione 561 nm e il filtro di emissione 400-597 nm.
        NOTA: Il filtro di emissione per mRFP è stato impostato a 400-597 nm per separare il segnale mRFP dal segnale FRET a 597-617 nm (passo 3.2.2.3) e, quindi, ridurre l'emissione mRFP indipendente dal FRET.
      3. Impostare il canale FRET per l'eccitazione del donatore e l'emissione dei fluorocromi accettori con il laser di eccitazione da 405 nm e il filtro di emissione 597-617 nm.
    3. Impostare l'intensità di eccitazione del donatore a un livello minimo per osservare la FRET evitando il fotosbiancamento, riducendo l'efficienza SE-FRET.
      NOTA: Questa intensità di eccitazione viene selezionata sperimentalmente prima di eseguire la procedura FRET per evitare il fotosbiancamento. Varia a seconda dello spessore della foglia, dell'età e del tempo dopo la sovraespressione.
    4. Eccitare il donatore ed eseguire la scansione per le cellule contenenti il segnale di fluorescenza atteso dell'accettore.
    5. Selezionare la regione che contiene il segnale di fluorescenza di interesse.
    6. Acquisire una sequenza di immagini SE-FRET premendo il pulsante Snap .
      1. Immagine 10-15 celle che esprimono prima il costrutto mRFP-GFP (controllo positivo); regolare i parametri di messa a fuoco, zoom e guadagno intelligente per mettere a fuoco l'area di interesse da acquisire (Figura supplementare 2).
      2. Utilizzando le stesse impostazioni, visualizzare separatamente 10-15 celle, ognuna delle quali esprime OTLD1-mRFP, mRFP libero, LSH10-GFP o LSH4-GFP separatamente.
        NOTA: Queste immagini vengono acquisite dal plug-in "PixFRET" di ImageJ (vedi Tabella dei materiali), che è stato utilizzato per le analisi dei dati FRET (passo 3.4.1) per determinare i valori di bleed-through spettrale (SBT) per gli accettori e i donatori; queste immagini vengono utilizzate dal software per generare le immagini SE-FRET per le coppie di proteine OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP e LSH10-GFP + mRFP libere (passo 3.2.6.3).
      3. Inoltre, utilizzando le stesse impostazioni, immagine 10-15 cellule co-esprimendo coppie proteiche OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP e LSH10-GFP + mRFP libere.
  3. Impostare i parametri per AB-FRET (Figura 1B).
    1. Utilizzare i parametri del canale donatore e accettore impostati per SE-FRET (passaggio 3.2.2) ma spegnere il canale FRET.
    2. Impostare i parametri per il fotosbiancamento dell'accettore (mRFP) (Figura supplementare 3).
      1. Assicurati che lo sbiancamento inizi dopo cinque immagini. Consentire 200 iterazioni per ogni area candeggina. Mantenere l'intensità laser del 100% a 561 nm.
      2. Mantenere una durata di sbiancamento di 45 s. Garantire una velocità di scansione di 512 x 512 pixel a 400 Hz.
    3. Disegnare la regione della cella da sbiancare; Ad esempio, per le interazioni nucleari, le regioni di interesse sono disegnate attorno all'intera area del nucleo cellulare39.
    4. Attivare lo sbiancamento premendo il pulsante Avvia esperimento ; attivando questa funzione si eseguirà il photobleaching e si acquisirà la sequenza di immagini AB-FRET.
  4. Analizzare i dati FRET.
    1. Per analizzare i dati SE-FRET, utilizzare il plug-in "PixFRET" per il software ImageJ per generare immagini corrette dell'efficienza SE-FRET dopo aver sottratto SBT40 (passaggio 3.2.6.2).
    2. Per analizzare i dati AB-FRET, calcolare %AB-FRET come aumento percentuale delle emissioni di GFP dopo il fotosbiancamento mRFP utilizzando la seguente formula41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, dove GFPpost è l'emissione di GFP dopo il fotosbiancamento mRFP e GFPpre è l'emissione di GFP prima del fotosbiancamento mRFP.
    3. Quando si esaminano le immagini FRET, prestare attenzione alla localizzazione subcellulare del segnale FRET.
      NOTA: In molti casi, questi compartimenti cellulari (ad esempio, nucleo, cloroplasti, ER, ecc.) possono essere facilmente identificati e, come ulteriore vantaggio della tecnica FRET, forniscono importanti indizi sulla funzione biologica delle proteine interagenti.

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Representative Results

La Figura 2 illustra i risultati tipici di un esperimento SE-FRET, in cui i nuclei cellulari sono stati registrati simultaneamente in tre canali (cioè GFP del donatore, accettore mRFP e SE-FRET). Questi dati sono stati utilizzati per generare immagini di efficienza SE-FRET codificate in una scala pseudo-cromatica. Su questa scala, il passaggio dal blu al rosso corrisponde ad un aumento dell'efficienza FRET, una misura della vicinanza proteina-proteina dallo 0% al 100%. In questo esperimento rappresentativo, il segnale SE-FRET è stato registrato nel nucleo cellulare e la sua intensità dopo la coespressione di LSH10 e OTLD1 è stata paragonabile a quella osservata dopo l'espressione della mRFP-GFP (cioè controllo positivo). Nessun SE-FRET è stato osservato nei controlli negativi (cioè coespressione di OTLD1-mRFP e LSH4-GFP o mRFP libera e LSH10-GFP).

Le interazioni LSH10-OTLD1 sono state quantificate utilizzando AB-FRET. A tal fine, la fluorescenza GFP del donatore è stata registrata nel nucleo cellulare prima e dopo il fotosbiancamento dell'accettore mRFP come serie temporale di fotosbiancamento delle misurazioni della fluorescenza del donatore e dell'accettore (Figura supplementare 4). Le immagini dei nuclei cellulari registrati sono state presentate in pseudo-colore per quantificare il cambiamento nella fluorescenza GFP. La Figura 3 mostra che la coespressione LSH10-GFP/OTLD1-mRFP ha determinato un aumento della fluorescenza del donatore GFP dopo che l'accettore mRFP è stato fotosbiancato e ha perso la sua capacità di fluoresce. Un simile aumento della fluorescenza del donatore è stato osservato nel controllo positivo mRFP-GFP ma non nei controlli negativi della coespressione LSH4-GFP/OTLD1-mRFP o LSH10-GFP/mRFP, mentre la fluorescenza accettore è stata inattivata in tutti gli esperimenti di fotosbiancamento. La figura 4 mostra l'analisi quantitativa dei dati AB-FRET, dimostrando l'aumento statisticamente significativo della fluorescenza del donatore (%AB-FRET) di circa il 13% dopo aver coespresso LSH10 e OTLD1. Il controllo mRFP-GFP positivo ha prodotto %AB-FRET di circa il 30%, mentre i controlli negativi non hanno prodotto %AB-FRET. Entrambe le immagini SE-FRET e AB-FRET hanno mostrato il segnale FRET nel nucleo cellulare, coerente con la localizzazione subcellulare prevista per i complessi enzimatici modificanti il fattore di trascrizione e gli istoni e per la natura nucleocitoplasmatica delle proteine GFP/mRFP34 (Figura 2 e Figura 3).

In sintesi, i dati rappresentativi mostrano che questo protocollo FRET può essere utilizzato per dimostrare e quantificare le interazioni tra enzimi modificanti gli istoni e fattori di trascrizione e determinare la loro localizzazione subcellulare nelle cellule vegetali viventi.

Figure 1
Figura 1: Sintesi schematica delle tecniche SE-FRET e AB-FRET. (A) Il principio di base di SE-FRET. Una delle proteine testate è etichettata con GFP, che agisce come fluorocromo donatore, e l'altra con mRFP, che agisce come fluorocromo accettore. La molecola donatrice viene eccitata e viene registrata l'emissione accettore. Se le proteine testate interagiscono tra loro in modo tale da essere posizionate entro 10 nm l'una dall'altra, l'energia del donatore eccitato viene trasferita in modo non radiativo all'accettore, che quindi diventa eccitato ed emette fluorescenza nel canale di emissione FRET. Se non si verifica alcuna interazione, non viene trasferita energia dal donatore all'accettore e non viene rilevata alcuna emissione FRET da parte dell'accettore. (B) Il principio di base di AB-FRET. Le proteine testate sono etichettate come descritto in (A) per SE-FRET. La molecola donatrice è eccitata e se si verifica l'interazione tra le proteine testate, il donatore eccita l'accettore in modo non radiativo, con conseguente FRET. Quindi, l'accettore viene permanentemente inattivato dal fotosbiancamento, perdendo così la sua capacità di accettare energia non radiativa dal donatore ed emettere la fluorescenza FRET nel canale di emissione FRET; La fluorescenza emessa dal donatore, invece, è aumentata perché il donatore perde meno energia dal trasferimento non radiativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Interazione specifica di LSH10 con OTLD1 nelle foglie di N. benthamiana rilevata da SE-FRET. Le immagini provenienti da tre canali di rilevamento (donatore, accettore e SE-FRET) sono mostrate per le combinazioni proteiche indicate. Le immagini di efficienza SE-FRET sono state calcolate dalla sottrazione del bleed-through spettrale (SBT) e sono mostrate in pseudo-colore, con i colori rosso e blu che significano rispettivamente il segnale più alto e più basso. (A) Segnale ad alta efficienza SE-FRET prodotto dal controllo positivo mRFP-GFP. (B) Segnale positivo di efficienza SE-FRET prodotto dalle proteine LSH10-GFP e OTLD1-mRFP interagenti. (C) La coespressione della proteina di controllo negativo LSH4-GFP e OTLD1-mRFP non ha prodotto alcun segnale di efficienza SE-FRET. (D) La coespressione della proteina mRFP negativa priva di controllo e LSH10-GFP non ha prodotto alcun segnale di efficienza SE-FRET. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Interazione specifica di LSH10 con OTLD1 nelle foglie di N. benthamiana rilevate da AB-FRET. Le immagini provenienti da due canali di rilevamento (donatore e accettore) prima e dopo il fotosbiancamento sono mostrate per le combinazioni proteiche indicate. Il cerchio indica la regione fotosbiancata. AB-FRET, visualizzato come un aumento della fluorescenza GFP dopo il fotosbiancamento mRFP, viene visualizzato utilizzando pseudo-colore con i colori rosso e blu, che significano rispettivamente il segnale più alto e più basso. (A) Un aumento della fluorescenza del donatore GFP prodotta dal controllo positivo mRFP-GFP. (B) Un aumento della fluorescenza del donatore GFP prodotta dalle proteine LSH10-GFP e OTLD1-mRFP interagenti. (C) La coespressione della proteina di controllo negativo LSH4-GFP e OTLD1-mRFP ha prodotto cambiamenti trascurabili nella fluorescenza del donatore GFP. (D) La coespressione della proteina mRFP libera da controllo negativo e LSH10-GFP ha prodotto cambiamenti trascurabili nella fluorescenza del donatore GFP. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Una quantificazione di AB-FRET. L'aumento percentuale della fluorescenza del donatore GFP dopo sbiancamento fotografico mRFP (%AB-FRET) è mostrato per le combinazioni proteiche indicate. Le barre di errore rappresentano la media per n = 13 celle per ogni misurazione. Il test t a due code ha determinato che le differenze tra i valori medi sono statisticamente significative per i valori p *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001; p≥ 0,05 non sono statisticamente significativi (ns). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Nome del primer Sequenza (da 5 a 3) Scopo
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag Amplifica OTLD1 da cDNA
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttccgtggctttgcctctttgcgtc Amplifica OTLD1 da cDNA
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaagcaggctcaatgtcctccaagagaaagagg Amplifica LSH10 dal cDNA
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac Amplifica LSH10 dal cDNA
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg Amplifica LSH4 dal cDNA
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc Amplifica LSH4 dal cDNA
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt Amplifica mRFP da pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttggagatctgcggccgcgg Amplifica mRFP da pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc Confermare le sequenze in pDONR207 mediante PCR e sequenziamento del DNA
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac Confermare le sequenze in pDONR207 mediante PCR e sequenziamento del DNA
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Confermare sequenze nei vettori di destinazione mediante PCR e sequenziamento del DNA
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Confermare sequenze nei vettori di destinazione mediante PCR e sequenziamento del DNA
35S Promotore Fw ctatccttcgcaagacccttc Confermare le sequenze nei vettori di destinazione mediante PCR

Tabella 1: Primer per la clonazione e la conferma delle sequenze clonate in pDONOR207 e vettori di destinazione. Fw, primer in avanti; Rv, primer inversi.

Figura supplementare 1: Impostazione dei parametri per i canali confocali. (A) Screenshot per l'impostazione dei parametri di eccitazione ed emissione per il canale donatore (GFP). (B) Screenshot per l'impostazione dei parametri di eccitazione ed emissione per il canale accettore (mRFP). (C) Screenshot per l'impostazione dei parametri di eccitazione ed emissione per il canale FRET. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Regolazione dei parametri per l'acquisizione di immagini SE-FRET del campione di interesse. (A) Screenshot per l'impostazione del parametro dell'area di scansione (ad esempio, dimensioni dell'immagine, velocità di scansione, direzione e media). (B) Screenshot per l'impostazione dei parametri del canale GFP (ad esempio, laser, pinhole, master gain e guadagno digitale). (C) Screenshot per l'impostazione dei parametri del canale mRFP (ad esempio, laser, pinhole, master gain e guadagno digitale). (D) Screenshot per l'impostazione dei parametri del canale FRET (ad esempio, laser, stenopeico, guadagno master e guadagno digitale). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Impostazione dei parametri per il fotosbiancamento dell'accettore. (A) Screenshot per l'impostazione del parametro dell'area di scansione (ad esempio, dimensioni dell'immagine, velocità di scansione, direzione e media). (B) Screenshot per la serie temporale e l'impostazione dei parametri di sbiancamento temporale. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Serie temporale delle misurazioni della fluorescenza del donatore e dell'accettore durante AP-FRET. La cinetica della fluorescenza dell'accettore (mRFP) e del donatore (GFP) è stata determinata per i campioni indicati prima, durante e dopo il periodo di fotosbiancamento. (A) Controllo mRFP-GFP positivo. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Controllo LSH4-GFP + OTLD1-mRFP negativo. (D) LSH10-GFP negativo + controllo mRFP libero. Le linee gialle indicano il periodo di tempo di photobleaching. Le curve bianche tracciano le misure della cinetica di fluorescenza. In ciascun pannello, le immagini superiore e inferiore mostrano rispettivamente la cinetica della fluorescenza dell'accettore (mRFP) e del donatore (GFP). Si noti che, naturalmente, la fluorescenza GFP spesso diminuisce nel tempo perché il laser fotosbianca gradualmente la GFP stessa. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questo protocollo FRET è semplice e facile da riprodurre; Richiede anche un investimento minimo di fornitura e utilizza attrezzature standard per molti laboratori moderni. Nello specifico, cinque caratteristiche tecniche principali contraddistinguono la versatilità di questa procedura. In primo luogo, i costrutti FRET sono generati utilizzando la ricombinazione sito-specifica, un approccio di clonazione che è facile da usare, produce risultati accurati e consente di risparmiare tempo rispetto alla tradizionale clonazione basata su enzimi di restrizione. In secondo luogo, le piante di N. benthamiana sono semplici da coltivare, producono quantità relativamente grandi di tessuto e sono disponibili nella maggior parte dei laboratori. In terzo luogo, l'agroinfiltrazione si traduce in un'espressione transitoria dei costrutti consegnati e, quindi, genera dati in un periodo di tempo relativamente breve (cioè 24-36 ore) rispetto ai mesi necessari per produrre piante transgeniche. In quarto luogo, la capacità di fornire diverse combinazioni dei costrutti di interesse mediante co-agroinfiltrazione consente di testare le interazioni tra qualsiasi proteina. Infine, sia SE-FRET che AB-FRET possono essere eseguiti sequenzialmente sullo stesso campione di tessuto solo attivando/disattivando una delle impostazioni del canale laser. Va notato, tuttavia, che la consegna del microbombardamento42 può essere utilizzata come approccio alternativo per la consegna del costrutto nei tessuti vegetali anziché per l'agroinfiltrazione; In questo caso, l'uso di vettori binari richiesti per l'agroinfiltrazione non è necessario.

Un passo fondamentale di questo protocollo è selezionare correttamente la coppia fluorocromica donatore e accettore per ottimizzare l'efficienza FRET. I seguenti tre fattori dovrebbero essere considerati: (1) lo spettro di emissione del donatore deve sovrapporsi al massimo allo spettro di assorbimento dell'accettore per massimizzare la quantità di energia trasferita; (2) gli spettri di emissione del donatore e dell'accettore devono essere sufficientemente diversi per essere distinti l'uno dall'altro e per ridurre al minimo SBT del segnale rilevato al microscopio; (3) L'accettore deve avere un'eccitazione diretta minima al massimo di assorbanza del donatore per ridurre al minimo l'eccitazione dell'accettore durante l'eccitazione del donatore. Le coppie FRET donatore/accettore comuni utilizzate sono proteine fluorescenti ciano/giallo e verde/rosso (cioè CFP/YFP e GFP/mRFP, rispettivamente). Questo protocollo utilizza la coppia GFP/mRFP perché è adatto per l'imaging di cellule vive e, a differenza delle coppie CIANO/FRET giallo, presenta una bassa fototossicità e un basso photobleaching43. Convenientemente, la fusione traslazionale tra la coppia FRET (cioè mRFP-GFP) funge da controllo positivo FRET ideale.

Un altro passaggio critico è la selezione dei controlli negativi appropriati. Ad esempio, nel caso dell'interazione LSH10-OTLD1, l'analisi FRET deve sempre includere l'espressione di OTLD1 da solo, LSH10 da solo, e la coespressione di OTLD1 e LSH10 con proteine per le quali l'interazione non è prevista (cioè LSH4 e mRFP libero, rispettivamente). In termini di scelta dei controlli negativi, gli esperimenti FRET possono seguire le linee guida sulle migliori pratiche per l'uso della tecnica BiFC44, un altro approccio basato sull'imaging a fluorescenza adattato per la rilevazione di interazioni proteiche in cellule vegetali viventi 29,30,31,32.

Infine, un fattore che influenza la sperimentazione FRET è comune a tutti gli esperimenti su tessuti vegetali viventi, e deriva dalle diverse condizioni fisiologiche della pianta, in generale, e dalle cellule trasformate agroinfiltrate, in particolare, anche quando mantenute sotto controllo della crescita. Questa variabilità fisiologica può contribuire a una certa variabilità dei dati FRET tra singoli esperimenti, piante e persino foglie. Pertanto, è importante utilizzare almeno due piante e tre foglie per pianta per ogni esperimento e selezionare foglie mature e completamente espanse per l'agroinfiltrazione, poiché producono immagini migliori.

Come per tutte le metodologie sperimentali, FRET ha i suoi limiti tecnici e basati sull'utilizzo. Uno di questi fattori limitanti è la natura del tag autofluorescente e la sua posizione all'interno della proteina di interesse (ad esempio, al terminale amminico o carbossilico), che può interferire con le proprietà biologiche di questa proteina, come il suo modello nativo di localizzazione subcellulare o la capacità di riconoscere i suoi interattori naturali. Prima della marcatura, ogni proteina di interesse deve essere analizzata, per quanto possibile, per le sue caratteristiche strutturali che possono essere compromesse dalla marcatura. In molti casi, tuttavia, i parametri di marcatura devono essere determinati empiricamente in base alle attività note della proteina di interesse. Un'altra importante limitazione è la relativa sofisticazione tecnica della FRET, che richiede l'uso della microscopia confocale con l'hardware e il software appropriati. A differenza di molti altri metodi di interazione proteica, come il sistema a due ibridi di lievito (Y2H)45,46,47, FRET non è adatto per identificare le interazioni proteiche mediante lo screening delle librerie di espressione, in particolare gli screening ad alto rendimento 48. Inoltre, come la maggior parte dei test eseguiti in vivo, FRET non è un sistema biochimicamente puro e, quindi, non rileva il potenziale coinvolgimento di altri fattori cellulari sconosciuti nell'interazione.

Il significato della FRET rispetto ad altri saggi di interazioni proteiche risiede nella sua rilevazione di interazioni a breve distanza, riducendo le possibilità di risultati falsi positivi, l'applicabilità per il dispiegamento in vivo in una varietà di cellule, tessuti e organismi (comprese le piante) e il rilevamento della localizzazione subcellulare delle proteine interagenti. Molte di queste caratteristiche della FRET si trovano in altri approcci in vivo, come la split-luciferasi 49,50 o BiFC29,30,31,32,33, tra cui BiFC è forse il più comunemente usato. Un altro test di interazione ampiamente utilizzato è Y2H45,46,47; Tuttavia, al di fuori della ricerca sulla biologia del lievito, questo test utilizza un sistema sperimentale eterologo, incline a falsi positivi, e i suoi risultati richiedono la conferma con un'altra tecnica. Una variazione concettuale di Y2H è un test split-ubiquitina che è più adatto per rilevare interazioni tra le proteine di membrana51,52 e che presenta limitazioni rispetto alla FRET che è simile a Y2H. Infine, le interazioni proteiche possono essere rilevate mediante co-immunoprecipitazione (co-IP), che si applica alla rilevazione in un ambiente complesso di estratti cellulari e in reazioni in vitro precisamente definite53,54,55; nella nostra esperienza, il co-IP è molto utile come metodo alternativo e indipendente per confermare i dati ottenuti utilizzando gli approcci in vivo basati sulla fluorescenza.

Mentre questo specifico protocollo FRET è stato sviluppato per studiare le interazioni tra i fattori di trascrizione delle piante e gli enzimi modificanti gli istoni, può essere utilizzato per scoprire e caratterizzare le interazioni tra molte altre classi di proteine inplanta.

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Disclosures

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Acknowledgments

Il lavoro nel laboratorio di V.C. è supportato da sovvenzioni da NIH (R35GM144059 e R01GM50224), NSF (MCB1913165 e IOS1758046) e BARD (IS-5276-20) a V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

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Biologia Numero 188 Enzimi modificanti gli istoni (HME) fattori di trascrizione (TF) interazioni proteina-proteina FRET
Studio delle interazioni tra enzimi modificanti gli istoni e fattori di trascrizione <em>in vivo</em> mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

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