Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøgelse af interaktioner mellem histonmodificerende enzymer og transkriptionsfaktorer in vivo ved fluorescensresonansenergioverførsel

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

Fluorescensresonans energioverførsel (FRET) er en billeddannelsesteknik til påvisning af proteininteraktioner i levende celler. Her præsenteres en FRET-protokol for at studere sammenhængen mellem histonmodificerende enzymer med transkriptionsfaktorer, der rekrutterer dem til målpromotorerne til epigenetisk regulering af genekspression i plantevæv.

Abstract

Epigenetisk regulering af genekspression påvirkes almindeligvis af histonmodificerende enzymer (HME'er), der genererer heterokromatiske eller eukromatiske histonmærker til henholdsvis transkriptionel undertrykkelse eller aktivering. HME'er rekrutteres til deres målkromatin ved transkriptionsfaktorer (TF'er). Således er detektering og karakterisering af direkte interaktioner mellem HME'er og TF'er afgørende for at forstå deres funktion og specificitet bedre. Disse undersøgelser ville være mere biologisk relevante, hvis de blev udført in vivo inden for levende væv. Her beskrives en protokol til visualisering af interaktioner i planteblade mellem en plante histon deubiquitinase og en plantetranskriptionsfaktor ved hjælp af fluorescensresonansenergioverførsel (FRET), som muliggør påvisning af komplekser mellem proteinmolekyler, der er inden for <10 nm fra hinanden. To variationer af FRET-teknikken præsenteres: SE-FRET (sensibiliseret emission) og AB-FRET (acceptorblegning), hvor energien overføres ikke-strålingsagtigt fra donoren til acceptoren eller udsendes radiativt af donoren ved fotoblegning af acceptoren. Både SE-FRET og AB-FRET tilgange kan let tilpasses til at opdage andre interaktioner mellem andre proteiner i planta.

Introduction

Plantehistondeubiquitinaser spiller en vigtig rolle i at kontrollere genekspression ved posttranslationel modifikation af histoner, specifikt ved at slette deres monoubiquityleringsmærker1. Indtil videre er OTLD1 en af de eneste få plante histon deubiquitinaser karakteriseret på molekylært niveau i Arabidopsis 2,3. OTLD1 fjerner monoubiquitingrupper fra H2B-histonmolekylerne og fremmer derved fjernelse eller tilsætning af eukromatisk acetylering og methyleringsmodifikationer af H3-histoner i målgenetkromatin 4,5. Desuden interagerer OTLD1 med et andet kromatinmodificerende enzym, histonlysindemethylase KDM1C, for at påvirke transkriptionel undertrykkelse af målgenerne 6,7.

De fleste histonmodificerende enzymer mangler DNA-bindingsevner og kan derfor ikke genkende deres målgener direkte. En mulighed er, at de samarbejder med DNA-bindende transkriptionsfaktorproteiner, der binder disse enzymer og leder dem til deres kromatinmål. Specifikt i planter vides flere større histonmodificerende enzymer (dvs. histonmethyltransferaser8,9, histonacetyltransferaser 10, histondemethylaser 11 og polycomb-undertrykkende komplekser12,13,14) at blive rekrutteret af transkriptionsfaktorer. I overensstemmelse med denne idé blev der for nylig foreslået en mulig mekanisme til OTLD1-rekruttering til målpromotorerne, som er baseret på specifikke protein-protein-interaktioner af OTLD1 med en transkriptionsfaktor LSH1015.

LSH10 tilhører en familie af planten ALOG (Arabidopsis LSH1 og Oryza G1) proteiner, der fungerer som centrale udviklingsregulatorer 16,17,18,19,20,21,22. Det faktum, at medlemmerne af ALOG-proteinfamilien indeholder DNA-bindende motiver23 og udviser kapaciteten til transkriptionel regulering22, nuklear lokalisering19 og homodimerisering24, understøtter yderligere forestillingen om, at disse proteiner, herunder LSH10, kan fungere som specifikke transkriptionsfaktorer under epigenetisk regulering af transkription. En af de vigtigste eksperimentelle teknikker, der anvendes til at karakterisere LSH10-OTLD1-interaktionen in vivo, er fluorescensresonansenergioverførsel (FRET)15.

FRET er en billeddannelsesteknik til direkte påvisning af nærmiljøinteraktioner mellem proteiner inden for <10 nm fra hinanden25 inde i levende celler. Der er to hovedvariationer af FRET-metoden26: sensibiliseret emission (SE-FRET) (figur 1A) og acceptorblegning (AB-FRET) (figur 1B). I SE-FRET overfører de interagerende proteiner - hvoraf det ene er mærket med et donorfluorkrom (f.eks. Grønt fluorescerende protein, GFP) og det andet med et acceptorfluorkrom (f.eks. Monomært rødt fluorescerende protein, mRFP27,28) - ikke-strålingsenergi fra donoren til acceptoren. Fordi der ikke udsendes fotoner under denne overførsel, produceres et fluorescerende signal, der har et strålingsemissionsspektrum svarende til acceptorens. I AB-FRET detekteres og kvantificeres proteininteraktioner baseret på forhøjet strålingsemission af donoren, når acceptoren er permanent inaktiveret ved fotoblegning og dermed ikke er i stand til at modtage den ikke-strålingsenergi, der overføres fra donoren (figur 1). Det er vigtigt, at den subcellulære placering af FRET-fluorescensen er vejledende for lokaliseringen af de interagerende proteiner i cellen.

Evnen til at anvende FRET i levende væv og bestemme den subcellulære lokalisering af de interagerende proteiner samtidig med påvisning af denne interaktion i sig selv, gør FRET til den valgte teknik til undersøgelser og indledende karakterisering af protein-protein-interaktioner in vivo. En sammenlignelig in vivo fluorescensbilleddannelsesmetode, bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC)29,30,31,32, er en god alternativ tilgang, selvom BiFC i modsætning til FRET kan producere falske positiver på grund af spontan samling af de autofluorescerende BiFC-journalister 33, og kvantificeringen af dens data er mindre præcis.

Denne artikel deler den vellykkede erfaring med implementering af både SE-FRET og AB-FRET teknikker og præsenterer en protokol for deres implementering for at undersøge interaktionerne mellem OTLD1 og LSH10 i planteceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 eller GV3101 blev anvendt til denne undersøgelse.

1. FRET vektor konstruktion

  1. Vælg fluorescerende tags til donor / acceptor FRET-parret.
    1. Brug EGFP fra pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (se materialetabel) til at generere donorvektoren.
    2. Brug mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (se Materialetabel) til at generere acceptorvektoren.
  2. Generer donor/acceptor FRET-konstruktioner ved hjælp af en stedsspecifik rekombinationskloningsteknik34, f.eks. Gateway-rekombinationskloningssystemet35.
    1. Forstærk kodningssekvenserne af proteinerneaf interesse 36 (dvs. Arabidopsis OTLD1 og LSH10)15.
      BEMÆRK: Det er også en god ide at bruge en negativ kontrol, der repræsenterer en homolog af et af de interagerende proteiner, men forventes ikke at udvise interaktion; OTLD1-LSH10-interaktionsstudiet anvender en homolog af LSH10, LSH4, der ikke genkender OTLD1. OTLD1, LSH10 og LSH4 cDNA'er forstærkes af PCR ved hjælp af primere, der er anført i tabel 1.
    2. Klon OTLD1, LSH10 og LSH4 ind i indgangsvektoren pDONR207 ved hjælp af den stedsspecifikke rekombinationskloningsteknik34.
    3. Brug Gateway LR Clonase II (se Materialetabel) til at overføre LSH10 og LSH4 fra pDONR207 til den binære destinationsvektor pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 til at generere de binære donorkonstruktioner p35S::LSH10-GFP (testet konstruktion) og p35S::LSH4-GFP (negativ kontrol).
    4. Brug det samme kommercielt tilgængelige enzym (trin 1.2.3) til at overføre OTLD1 fra pDONR207 til den binære destinationsvektor pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 for at generere den binære acceptorkonstruktion p35S:: OTLD1-mRFP (testet konstruktion).
    5. PCR-forstærke36 mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 ved hjælp af primere, der er anført i tabel 1, klon det ved rekombinationskloningsteknikken til pDONR207, og brug derefter LR Clonase II til at overføre mRFP til pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 til at generere den binære fusionskonstruktion p35S::mRFP-GFP (positiv kontrol).
  3. Udfør transformation af donor- og acceptorkonstruktionerne til Agrobacterium.
    1. Der tilsættes 1 μg af hvert plasmid fra trin 1.2.3-1.2.5 til 100 μL af kulturen af kompetente celler af Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 eller GV3101, fremstillet ved hjælp af standardprotokoller 37 eller opnået kommercielt, og inkuberes ved37 °C i 5 min.
    2. Tilsæt 1 ml LB-medium (1% tryptone, 0,5% gærekstrakt og 1% NaCl; se materialetabel) til den kompetente celleblanding og omrør ved 200 o / min og 28 ° C i 1,5 timer. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 3.000 × g i 1 minut ved stuetemperatur.
    3. Resuspender cellerne i 0,1 ml LB-medium ved pipettering og spred dem på LB-agar suppleret med de relevante antibiotika (f.eks. 0,01% spectinomycin og 0,005% rifampicin; se Materialetabel). Voks ved 28 °C i 2 dage.
    4. Vælg individuelle kolonier og pod hver af dem separat i 1 ml LB bouillon suppleret med de relevante antibiotika.
    5. Cellerne vokser ved 28 °C i 24 timer, og 0,2 ml af kulturen overføres til et nyt rør. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 10.000 × g i 30 s ved stuetemperatur.
    6. Ekstrahers plasmid-DNA ved hjælp af en standardprotokol til isolering af plasmider fra Agrobacterium-celler 38 og resuspenderer det ekstraherede DNA i30 μL vand. For at identificere kolonierne, der huser de ønskede plasmider, skal du bruge 2 μL af DNA-præparatet som en skabelon til PCR med genspecifikke primere, der er anført i tabel 1. Der blandes 0,7 ml af den identificerede kultur med 0,3 ml glycerol og opbevares ved -80 °C.

2. Agroinfiltration

  1. Dyrk Nicotiana benthamiana planter.
    BEMÆRK: Gennem hele eksperimentet skal alle planter være sunde.
    1. Så og dyrk N. benthamiana frø i en gryde indeholdende våd jord med høj densitet.
    2. Opbevar de plantede frø i et vækstkammer indstillet til 23 °C med 16 timers lys og 8 timers mørk cyklus med 150-170 μmol/m2s lysintensitet, indtil euphyllens diameter når 0,5 cm.
    3. Overfør frøplanterne til større potter og lad dem vokse i samme kammer med de samme parametre.
      BEMÆRK: Planter er klar til agroinfiltration, når deres største blade er 5-7 cm i diameter, normalt inden for 4-5 uger. I mindre planter, der er for unge, vil virkningerne af agroinfiltration være for alvorlige til FRET-analysen.
  2. Forbered bakterieceller til agroinfiltration.
    1. Hver Agrobacterium-koloni, der indeholder FRET-konstruktionerne, vokser natten over i 5 ml LB-medium suppleret med de relevante antibiotika (trin 1.3.3) og 150 μM acetosyringon ved 28 °C (se materialetabel).
    2. Centrifuger cellerne ved 3.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Resuspender cellerne i agroinfiltrationsbuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acetosyringon) til OD600 = 0,5.
    4. Kombiner de resuspenderede celler i forholdet 1:1 v/v mellem celler med de relevante konstruktioner (trin 2.2.5).
    5. For de dobbeltkonstruerede agroinfiltrationer blandes aliquoterne fra to kulturer, og for enkeltkonstruktions agroinfiltrationer blandes aliquoterne fra den samme kultur:
      1. Testede proteiner: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bakterier, der huser p35S::OTLD1-mRFP og p35S::LSH10-GFP konstruktioner).
      2. Negativ kontrol: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bakterier, der huser p35S::OTLD1-mRFP og p35S::LSH4-GFP konstruktioner).
      3. Negativ kontrol: LSH10-GFP + fri mRFP (bakterier, der huser p35S:: LSH10-GFP og pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 konstruktioner).
      4. Positiv kontrol: mRFP-GFP (bakterier, der huser p35S::mRFP-GFP-konstruktionen).
    6. Cellerne inkuberes ved 28 °C i 0,5-1 time.
  3. Udfør agroinfiltration.
    1. Læg bakteriekulturen i en 1 ml nåleløs sprøjte.
    2. Tryk forsigtigt, men fast sprøjtens dyse mod den abaxiale side af de fuldt udvidede N. benthamiana-blade , mens du holder bladet med en behandsket finger på adaxialsiden.
    3. Infiltrer op til fire pletter på et blad, tre blade pr. Plante, to eller tre planter for hver bakteriekultur. Skift handsker mellem prøver for at forhindre krydskontaminering.
    4. Vedligehold de agroinfiltrerede planter i samme vækstkammer under de samme betingelser, som beskrevet i trin 2.1.2, i 24 timer til 36 timer. Opbevar ikke de agroinfiltrerede planter i mere end 36 timer, da dette vil reducere fluorescenssignalet.

3. Konfokal mikroskopi

  1. Forbered mikroskopdias til fluorescensvisualisering.
    1. Efter 24-36 timer af infiltrationen skal du bruge et barberblad til at skære hvert agroinfiltreret blad i små stykker (2 mm x 4 mm) mellem venerne.
    2. Placer bladstykkerne på et glasglas med den abaxiale bladoverflade opad. Læg en dråbe vand på bladstykkerne og dæk dem med dækglasset. Tryk let på dækglasset for at fjerne luftbobler.
    3. Tænd mikroskopet og laseren (se Materialetabel). Sliden anbringes i mikroskopets trinholder til billeddannelse under de specifikke FRET-parametre (trin 3.2 og 3.3).
    4. Begynd observationerne ved hjælp af et 10x objektivt objektiv for at identificere celler, der udviser både GFP- og mRFP-signalerne, og brug derefter et 40x objektivobjektiv til efterfølgende detaljerede observationer.
      BEMÆRK: Det er vigtigt, at SE-FRET og AB-FRET normalt udføres på den samme vævsprøve, hvilket tillader brug af de samme kanalindstillinger (trin 3.2) undtagen FRET-kanalen, som slås til/fra for henholdsvis SE-FRET- og AB-FRET-observationerne (trin 3.2.2.3 og 3.3.1).
  2. Indstil parametrene for SE-FRET (figur 1A).
    1. Åbn værktøjet Multi-Dimensional Acquisition (MDA).
    2. Opret et sæt af tre konfokale kanaler i samme synsfelt (supplerende figur 1).
      1. Indstil donorkanalen (GFP-kanalen) til excitation og emission af donorfluorokromen med 405 nm excitationslaser og 400-597 nm emissionsfilter.
      2. Indstil acceptorkanalen (mRFP-kanalen) til excitation og emission af acceptoren fluorkrom med 561 nm excitationslaser og 400-597 nm emissionsfilter.
        BEMÆRK: Emissionsfilteret for mRFP blev indstillet til 400-597 nm for at adskille mRFP-signalet fra FRET-signalet ved 597-617 nm (trin 3.2.2.3) og derfor reducere den FRET-uafhængige mRFP-emission.
      3. Indstil FRET-kanalen til excitation af donoren og emission af acceptorfluorkromerne med 405 nm excitationslaser og 597-617 nm emissionsfilter.
    3. Indstil donorens excitationsintensitet på et minimumsniveau for at observere FRET, samtidig med at fotoblegning undgås, hvilket reducerer SE-FRET-effektiviteten.
      BEMÆRK: Denne excitationsintensitet vælges eksperimentelt, før FRET-proceduren udføres for at undgå fotoblegning. Det varierer afhængigt af bladtykkelse, alder og tid efter overekspression.
    4. Ophidse donoren og scan efter celler, der indeholder acceptorens forventede fluorescenssignal.
    5. Vælg det område, der indeholder fluorescenssignalet af interesse.
    6. Få en SE-FRET-billedsekvens ved at trykke på Snap-knappen .
      1. Billede 10-15 celler, der udtrykker mRFP-GFP-konstruktionen (positiv kontrol) først; juster fokus-, zoom- og smart gain-parametrene for at fokusere på det interesseområde, der skal fanges (supplerende figur 2).
      2. Ved hjælp af de samme indstillinger skal du afbilde 10-15 celler, der hver udtrykker OTLD1-mRFP, fri mRFP, LSH10-GFP eller LSH4-GFP separat.
        BEMÆRK: Disse billeder er erhvervet af "PixFRET" plug-in af ImageJ (se Tabel over materialer), som blev brugt til FRET-dataanalyserne (trin 3.4.1) til at bestemme spektral blødningsværdier (SBT) for acceptorerne og donorerne; disse billeder bruges af softwaren til at generere SE-FRET-billederne til OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP og LSH10-GFP + frie mRFP-proteinpar (trin 3.2.6.3).
      3. Ved hjælp af de samme indstillinger udtrykker billede 10-15 celler også sammen OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP og LSH10-GFP + fri mRFP-proteinpar.
  3. Konfigurer parametre for AB-FRET (figur 1B).
    1. Brug parametrene for donor- og acceptorkanalen, der er indstillet til SE-FRET (trin 3.2.2), men sluk for FRET-kanalen.
    2. Indstil parametrene for fotobleaching af acceptoren (mRFP) (supplerende figur 3).
      1. Sørg for, at blegningen starter efter fem billeder. Tillad 200 gentagelser for hvert område blegemiddel. Hold 100% laserintensitet ved 561 nm.
      2. Oprethold en blegningsvarighed på 45 s. Sørg for en scanningshastighed på 512 x 512 pixels ved 400 Hz.
    3. Tegn det område af cellen, der skal bleges; For eksempel for nukleare interaktioner trækkes regioner af interesse omkring hele området af cellekernen39.
    4. Aktiver blegning ved at trykke på knappen Start eksperiment ; aktivering af denne funktion vil udføre fotobleaching og erhverve AB-FRET-billedsekvensen.
  4. Analyser FRET-dataene.
    1. Til analyse af SE-FRET-data skal du bruge plug-in'en "PixFRET" til ImageJ-softwaren til at generere korrigerede billeder af SE-FRET-effektiviteten efter at have trukket SBT40 fra (trin 3.2.6.2).
    2. For at analysere AB-FRET-dataene beregnes %AB-FRET som den procentvise stigning i GFP-emission efter mRFP-fotoblegning ved hjælp af følgende formel41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, hvor GFPpost er GFP-emission efter mRFP-fotoblegning, og GFPpre er GFP-emission før mRFP-fotoblegning.
    3. Når du gennemgår FRET-billederne, skal du være opmærksom på den subcellulære lokalisering af FRET-signalet.
      BEMÆRK: I mange tilfælde kan disse cellulære rum (f.eks. Kerne, kloroplaster, ER osv.) let identificeres og som en yderligere fordel ved FRET-teknikken give vigtige spor til den biologiske funktion af de interagerende proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 illustrerer de typiske resultater af et SE-FRET-eksperiment, hvor cellekernerne samtidig blev registreret i tre kanaler (dvs. donor GFP, acceptor mRFP og SE-FRET). Disse data blev brugt til at generere billeder af SE-FRET-effektivitet kodet i en pseudofarveskala. På denne skala svarer overgangen fra blå til rød til en stigning i FRET-effektivitet, et mål for protein-protein-nærhed fra 0% til 100%. I dette repræsentative eksperiment blev SE-FRET-signalet registreret i cellekernen, og dets intensitet efter coekspressionen af LSH10 og OTLD1 var sammenlignelig med den, der blev observeret efter ekspressionen af mRFP-GFP (dvs. positiv kontrol). Der blev ikke observeret SE-FRET i negative kontroller (dvs. coekspression af OTLD1-mRFP og LSH4-GFP eller fri mRFP og LSH10-GFP).

LSH10-OTLD1-interaktionerne blev kvantificeret ved hjælp af AB-FRET. Til dette formål blev donor-GFP-fluorescensen registreret i cellekernen før og efter fotobleaching af acceptoren mRFP som fotoblegningstidsserie for donor- og acceptorfluorescensmålinger (supplerende figur 4). Billederne af de optagede cellekerner blev præsenteret i pseudofarve for at kvantificere ændringen i GFP-fluorescens. Figur 3 viser, at LSH10-GFP/OTLD1-mRFP-coekspressionen resulterede i en øget GFP-donorfluorescens, efter at mRFP-acceptoren blev fotoblecheret og mistede sin evne til at fluorescere. En lignende stigning i donorfluorescensen blev observeret i mRFP-GFP-positiv kontrol, men ikke i de negative kontroller af LSH4-GFP/OTLD1-mRFP eller LSH10-GFP/mRFP-coekspression, mens acceptorfluorescensen blev inaktiveret i alle fotoblegningsforsøg. Figur 4 viser den kvantitative analyse af AB-FRET-dataene, der viser den statistisk signifikante stigning i donorfluorescensen (% AB-FRET) på ca. 13% efter coexpressing LSH10 og OTLD1. Den positive mRFP-GFP-kontrol producerede %AB-FRET på ca. 30%, mens de negative kontroller ikke producerede nogen% AB-FRET. Både SE-FRET- og AB-FRET-billeder viste FRET-signalet i cellekernen, i overensstemmelse med den subcellulære lokalisering, der forventes for transkriptionsfaktor-histonmodificerende enzymkomplekser såvel som for den nukleocytoplasmatiske natur af GFP / mRFP-proteinerne34 (figur 2 og figur 3).

Sammenfattende viser de repræsentative data, at denne FRET-protokol kan bruges til at demonstrere og kvantificere interaktioner mellem histonmodificerende enzymer og transkriptionsfaktorer og bestemme deres subcellulære lokalisering i levende planteceller.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over SE-FRET- og AB-FRET-teknikkerne. (A) Det grundlæggende princip for SE-FRET. Et af de testede proteiner er mærket med GFP, der fungerer som en donor fluorokrom, og den anden med mRFP, der fungerer som en acceptor fluorokrom. Donormolekylet er ophidset, og acceptoremissionen registreres. Hvis de testede proteiner interagerer med hinanden, således at de er placeret inden for 10 nm fra hinanden, overføres energien fra den exciterede donor ikke-radiativt til acceptoren, som derefter bliver ophidset og udsender fluorescens i FRET-emissionskanalen. Hvis der ikke forekommer interaktion, overføres der ingen energi fra donoren til acceptoren, og der opdages ingen FRET-emission fra acceptoren. (B) Det grundlæggende princip i AB-FRET. De testede proteiner er mærket som beskrevet i (A) for SE-FRET. Donormolekylet er ophidset, og hvis interaktionen mellem de testede proteiner forekommer, ophidser donoren acceptoren på en ikke-radiativ måde, hvilket resulterer i FRET. Derefter inaktiveres acceptoren permanent ved fotoblegning og mister derved sin evne til at acceptere ikke-strålingsenergi fra donoren og udsende FRET-fluorescensen i FRET-emissionskanalen; Den fluorescens, der udsendes af donoren, øges derimod, fordi donoren mister mindre energi ved den ikke-strålingsoverførsel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Specifik interaktion mellem LSH10 og OTLD1 i N. benthamiana blade detekteret af SE-FRET. Billeder fra tre detektionskanaler (donor, acceptor og SE-FRET) vises for de angivne proteinkombinationer. SE-FRET-effektivitetsbillederne blev beregnet ved subtraktion af spektral blødning (SBT) og vises i pseudofarve, hvor farverne rød og blå angiver henholdsvis det højeste og det laveste signal. (A) Højt SE-FRET-effektivitetssignal produceret af mRFP-GFP-positiv kontrol. (B) Positivt SE-FRET-effektivitetssignal produceret af de interagerende LSH10-GFP- og OTLD1-mRFP-proteiner. (C) Coekspression af det negative kontrolprotein LSH4-GFP og OTLD1-mRFP producerede intet SE-FRET-effektivitetssignal. (D) Coekspression af det negative kontrolfrie mRFP-protein og LSH10-GFP producerede intet SE-FRET-effektivitetssignal. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Specifik interaktion mellem LSH10 og OTLD1 i N. benthamiana blade påvist af AB-FRET. Billeder fra to detektionskanaler (donor og acceptor) før og efter fotoblegning vises for de angivne proteinkombinationer. Cirklen angiver det fotoblede område. AB-FRET, visualiseret som en stigning i GFP-fluorescens efter mRFP-fotoblegning, vises ved hjælp af pseudofarve med farverne rød og blå, hvilket betyder henholdsvis det højeste og laveste signal. (A) En stigning i GFP-donorfluorescensen produceret af mRFP-GFP-positiv kontrol. (B) En stigning i GFP-donorfluorescensen produceret af de interagerende LSH10-GFP- og OTLD1-mRFP-proteiner. (C) Coekspression af negativt kontrolprotein LSH4-GFP og OTLD1-mRFP medførte ubetydelige ændringer i GFP-donorfluorescensen. (D) Coekspression af det negative kontrolfrie mRFP-protein og LSH10-GFP medførte ubetydelige ændringer i GFP-donorfluorescensen. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: En kvantificering af AB-FRET. Den procentvise stigning i GFP-donorfluorescensen efter mRFP-fotoblegning (% AB-FRET) er vist for de angivne proteinkombinationer. Fejllinjer repræsenterer gennemsnittet for n = 13 celler for hver måling. Den tosidede t-test fastslog, at forskelle mellem middelværdier er statistisk signifikante for p-værdierne *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001; s≥ 0,05 er ikke statistisk signifikante (ns). Klik her for at se en større version af denne figur.

Grundnavn Sekvens (5ʹ til 3ʹ) Formål
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag Forstærk OTLD1 fra cDNA
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttccgtggctttgcgtc Forstærk OTLD1 fra cDNA
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgtcctctccaagagaaagagg Forstærk LSH10 fra cDNA
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac Forstærk LSH10 fra cDNA
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg Forstærk LSH4 fra cDNA
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc Forstærk LSH4 fra cDNA
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt Forstærk mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttggagatctgcggccgcgg Forstærk mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC Bekræft sekvenser i pDONR207 ved PCR- og DNA-sekventering
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac Bekræft sekvenser i pDONR207 ved PCR- og DNA-sekventering
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Bekræft sekvenser i destinationsvektorer ved PCR- og DNA-sekventering
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Bekræft sekvenser i destinationsvektorer ved PCR- og DNA-sekventering
35S Promotor Fw ctatccttcgcaagacccttc Bekræft sekvenser i destinationsvektorer med PCR

Tabel 1: Primere til kloning og bekræftelse af de klonede sekvenser i pDONOR207 og destinationsvektorer. Fw, fremadgående primere; Rv, omvendte primere.

Supplerende figur 1: Indstilling af parametre for konfokale kanaler. (A) Skærmbillede til opsætning af excitations- og emissionsparameter for donorkanalen (GFP). (B) Skærmbillede til excitations- og emissionsparameteropsætningen for acceptorkanalen (mRFP). (C) Skærmbillede til opsætning af excitations- og emissionsparameter for FRET-kanalen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Justering af parametre for erhvervelse af SE-FRET-billeder af stikprøven af interesse. (A) Skærmbillede til opsætning af scanningsområdeparameteren (dvs. billedstørrelse, scanningshastighed, retning og gennemsnit). (B) Skærmbillede til opsætning af GFP-kanalparameteren (dvs. laser, pinhole, master gain og digital gain). (C) Skærmbillede til opsætning af mRFP-kanalparameteren (dvs. laser, pinhole, master gain og digital gain). (D) Skærmbillede til opsætning af FRET-kanalparameteren (dvs. laser, pinhole, master gain og digital gain). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Indstilling af parametre for acceptorfotoblegning. (A) Skærmbillede til opsætning af scanningsområdeparameteren (dvs. billedstørrelse, scanningshastighed, retning og gennemsnit). (B) Skærmbillede til tidsserier og opsætning af tidsblegningsparameter. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Tidsserier for donor- og acceptorfluorescensmålinger under AP-FRET. Kinetikken af acceptoren (mRFP) og donorfluorescensen (GFP) blev bestemt for de angivne prøver før, under og efter fotoblegningsperioden. (A) Positiv mRFP-GFP-kontrol. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Negativ LSH4-GFP + OTLD1-mRFP-kontrol. (D) Negativ LSH10-GFP + Gratis mRFP-kontrol. Gule linjer angiver fotoblegningsperioden. Hvide kurver afbilder målingerne af fluorescenskinetikken. I hvert panel viser de øverste og nederste billeder kinetikken af henholdsvis acceptoren (mRFP) og donorfluorescensen (GFP). Bemærk, at GFP-fluorescensen naturligvis ofte falder over tid, fordi laseren gradvist fotobleger selve GFP'en. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne FRET-protokol er enkel og nem at gengive; Det kræver også minimal forsyningsinvestering og bruger standardudstyr til mange moderne laboratorier. Specifikt skelner fem vigtigste tekniske træk alsidigheden af denne procedure. For det første genereres FRET-konstruktionerne ved hjælp af stedspecifik rekombination, en kloningsmetode, der er nem at bruge, giver nøjagtige resultater og sparer tid sammenlignet med traditionel restriktionsenzymbaseret kloning. For det andet er N. benthamiana-planter enkle at dyrke, producerer relativt store mængder væv og er tilgængelige i de fleste laboratorier. For det tredje resulterer agroinfiltration i forbigående ekspression af de leverede konstruktioner og genererer således data inden for en relativt kort periode (dvs. 24-36 timer) sammenlignet med de måneder, der kræves for at producere transgene planter. For det fjerde tillader evnen til at levere forskellige kombinationer af de konstruktioner af interesse ved co-agroinfiltration test af interaktioner mellem proteiner. Endelig kan både SE-FRET og AB-FRET kun udføres sekventielt på den samme vævsprøve ved at tænde / slukke for en af laserkanalindstillingerne. Det skal dog bemærkes, at mikrobombardementslevering42 kan bruges som en alternativ tilgang til konstruktion af levering til plantevæv i stedet for agroinfiltration; I dette tilfælde er brugen af binære vektorer, der kræves til agroinfiltration, unødvendig.

Et kritisk trin i denne protokol er korrekt valg af donor- og acceptorfluorkrompar for at optimere FRET-effektiviteten. Følgende tre faktorer bør tages i betragtning: (1) donoremissionsspektret skal maksimalt overlappe acceptorabsorptionsspektret for at maksimere mængden af overført energi; 2) donorens og acceptorens emissionsspektre skal være tilstrækkeligt forskellige til at kunne skelnes fra hinanden og til at minimere SBT af det signal, der detekteres ved mikroskopi. (3) Acceptoren skal have minimal direkte excitation ved donorens absorbansmaksimum for at minimere excitation af acceptoren under excitation af donoren. Almindelige donor / acceptor FRET-par, der anvendes, er cyan / gule og grønne / røde fluorescerende proteiner (dvs. henholdsvis CFP / YFP og GFP / mRFP). Denne protokol anvender GFP / mRFP-parret, fordi det er egnet til levende cellebilleddannelse og i modsætning til cyan / gule FRET-par udviser lav fototoksicitet og lav fotoblegning43. Bekvemt fungerer den translationelle fusion mellem FRET-parret (dvs. mRFP-GFP) som en ideel FRET-positiv kontrol.

Et andet kritisk skridt er udvælgelsen af de relevante negative kontroller. For eksempel i tilfælde af LSH10-OTLD1-interaktionen skal FRET-analysen altid omfatte ekspressionen af OTLD1 alene, LSH10 alene og coekspression af OTLD1 og LSH10 med proteiner, for hvilke interaktionen ikke forventes (dvs. henholdsvis LSH4 og fri mRFP). Med hensyn til valget af negative kontroller kan FRET-eksperimenter følge retningslinjerne for bedste praksis for brug af BiFC-teknikken44, en anden fluorescensbilleddannelsesbaseret tilgang tilpasset til påvisning af proteininteraktioner i levende planteceller 29,30,31,32.

Endelig er en faktor, der påvirker FRET-eksperimentet, fælles for alle eksperimenter i levende plantevæv, og det stammer fra plantens varierende fysiologiske forhold generelt og de agroinfiltrerede transformerede celler, især, selv når de opretholdes under kontrollerede vækstbetingelser. Denne fysiologiske variabilitet kan bidrage til en vis variation af FRET-dataene mellem individuelle eksperimenter, planter og endda blade. Det er derfor vigtigt at bruge mindst to planter og tre blade pr. plante til hvert eksperiment og at vælge modne, fuldt udvidede blade til agroinfiltration, da de giver bedre billeder.

Som med alle eksperimentelle metoder har FRET sine tekniske og brugsbaserede begrænsninger. En sådan begrænsende faktor er arten af det autofluorescerende mærke og dets placering inden for det protein, der er af interesse (f.eks. ved amino- eller carboxylterminalen), som kan forstyrre dette proteins biologiske egenskaber, såsom dets oprindelige mønster af subcellulær lokalisering eller evnen til at genkende dets naturlige interactors. Før mærkning skal hvert protein af interesse analyseres i det omfang det er muligt for dets strukturelle egenskaber, der kan kompromitteres ved mærkning. I mange tilfælde skal mærkningsparametrene dog bestemmes empirisk baseret på de kendte aktiviteter af proteinet af interesse. En anden stor begrænsning er den relative tekniske raffinement af FRET, som kræver brug af konfokal mikroskopi med passende hardware og software. I modsætning til flere andre proteininteraktionsmetoder, såsom gær to-hybridsystemet (Y2H) 45,46,47, er FRET uegnet til at identificere proteininteraktioner ved at screene ekspressionsbiblioteker, især skærme med høj kapacitet 48. Hertil kommer, at FRET, som de fleste assays udført in vivo, ikke er et biokemisk rent system, og det registrerer således ikke den potentielle involvering af andre ukendte cellulære faktorer i interaktionen.

Betydningen af FRET med hensyn til andre assays af proteininteraktioner ligger i dens påvisning af kortdistanceinteraktioner, hvilket reducerer chancerne for falsk-positive resultater, anvendelighed til implementering in vivo i en række celler, væv og organismer (herunder planter) og påvisning af den subcellulære lokalisering af de interagerende proteiner. Mange af disse egenskaber ved FRET findes i andre in vivo-tilgange, såsom split-luciferase 49,50 eller BiFC29,30,31,32,33, blandt hvilke BiFC måske er den mest anvendte. Et andet meget anvendt interaktionsassay er Y2H45,46,47; Uden for gærbiologiforskning anvender dette assay imidlertid et heterologt eksperimentelt system, der er tilbøjeligt til falske positiver, og dets resultater kræver bekræftelse af en anden teknik. En konceptuel variation af Y2H er et split-ubiquitin-assay, som er bedre egnet til at detektere interaktioner mellem membranproteiner51,52, og som udviser begrænsninger i forhold til FRET, der ligner Y2H. Endelig kan proteininteraktioner detekteres ved co-immunoprecipitation (co-IP), som gælder for påvisning i et komplekst miljø af celleekstrakter såvel som i præcist definerede in vitro-reaktioner 53,54,55; Det er vores erfaring, at co-IP er mest nyttig som en alternativ og uafhængig metode til at bekræfte data opnået ved hjælp af de fluorescensbaserede in vivo-tilgange.

Mens denne specifikke FRET-protokol blev udviklet til at studere interaktionerne mellem plantetranskriptionsfaktorer og histonmodificerende enzymer, kan den bruges til at opdage og karakterisere interaktioner mellem mange andre klasser af proteiner inplanta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der blev ikke erklæret nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Arbejdet i V.C.'s laboratorium er støttet af tilskud fra NIH (R35GM144059 og R01GM50224), NSF (MCB1913165 og IOS1758046) og BARD (IS-5276-20) til V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Biologi udgave 188 histonmodificerende enzymer (HME'er) transkriptionsfaktorer (TF'er) protein-proteininteraktioner FRET
Undersøgelse af interaktioner mellem histonmodificerende enzymer og transkriptionsfaktorer <em>in vivo</em> ved fluorescensresonansenergioverførsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter