Summary
Die kontinuierliche arterielle Blutdruckmessung ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener hämodynamischer Parameter. Dieser Bericht demonstriert die Anwendung der kontinuierlichen arteriellen Blutdrucküberwachung in einem Großtiermodell des ischämischen Schlaganfalls zur Bestimmung der Pathophysiologie des Schlaganfalls, des Einflusses verschiedener hämodynamischer Faktoren und der Bewertung neuer Behandlungsansätze.
Abstract
Die Kontrolle des Blutdrucks, sowohl in Bezug auf die absoluten Werte als auch auf seine Variabilität, beeinflusst die Ergebnisse bei ischämischen Schlaganfallpatienten. Es bleibt jedoch schwierig, die Mechanismen zu identifizieren, die zu schlechten Ergebnissen führen, oder Maßnahmen zu bewerten, durch die diese Auswirkungen gemildert werden können, da menschliche Daten unerschwingliche Einschränkungen haben. In solchen Fällen können Tiermodelle verwendet werden, um strenge und reproduzierbare Bewertungen von Krankheiten durchzuführen. Hier berichten wir über die Verfeinerung eines zuvor beschriebenen Modells des ischämischen Schlaganfalls bei Kaninchen, das durch kontinuierliche Blutdruckaufzeichnung ergänzt wird, um die Auswirkungen der Modulation auf den Blutdruck zu bewerten. Unter Vollnarkose werden die Oberschenkelarterien durch chirurgische Schnitte freigelegt, um arterielle Schleusen beidseitig zu platzieren. Unter fluoroskopischer Visualisierung und Roadmap-Anleitung wird ein Mikrokatheter in eine Arterie des hinteren Kreislaufs des Gehirns vorgeschoben. Ein Angiogramm wird durch Injektion der kontralateralen Wirbelarterie durchgeführt, um den Verschluss der Zielarterie zu bestätigen. Wenn der okklusive Katheter für eine bestimmte Zeit in Position bleibt, wird der Blutdruck kontinuierlich aufgezeichnet, um eine enge Titration von Blutdruckmanipulationen zu ermöglichen, sei es mit mechanischen oder pharmakologischen Mitteln. Nach Ablauf des Okklusionsintervalls wird der Mikrokatheter entfernt und das Tier für eine vorgeschriebene Dauer der Reperfusion unter Vollnarkose gehalten. Für akute Untersuchungen wird das Tier dann eingeschläfert und enthauptet. Das Gehirn wird entnommen und aufbereitet, um das Infarktvolumen unter Lichtmikroskopie zu messen und mit verschiedenen histopathologischen Färbungen oder räumlichen transkriptomischen Analysen weiter zu beurteilen. Dieses Protokoll stellt ein reproduzierbares Modell dar, das für gründlichere präklinische Studien zu den Auswirkungen von Blutdruckparametern während eines ischämischen Schlaganfalls verwendet werden kann. Es ermöglicht auch eine effektive präklinische Evaluierung neuartiger neuroprotektiver Interventionen, die die Versorgung von Patienten mit ischämischem Schlaganfall verbessern könnten.
Introduction
Der ischämische Schlaganfall (IS) ist weltweit eine der Hauptursachen für Tod und langfristige Behinderungen, und es wird prognostiziert, dass seine Prävalenz mit zunehmendem Alter der Gesellschaft zunehmenwird 1. Während bei Akutinterventionen und Sekundärpräventionsstrategien erhebliche Fortschritte erzielt wurden, folgten ergänzende neuroprotektive Behandlungen nicht schnell 2,3,4,5,6,7. Weitere Forschung zur Pathobiologie des Schlaganfalls ist erforderlich, da die Mechanismen, durch die sich Therapien als wirksam erweisen können oder nicht, nur unzureichend verstanden sind. Dies ist vor allem auf die heterogene Natur der Schlaganfallpatientenpopulation zurückzuführen, von denen viele zahlreiche Komorbiditäten aufweisen, die die Analyse1 verwirren. Ein Grund für die Einschränkungen in der Forschung ist das Fehlen von Daten auf Gewebeebene - dem Goldstandard in der biomedizinischen Forschung - aufgrund der unerschwinglichen Morbidität der Entnahme von Gewebeproben aus dem menschlichen Zentralnervensystem. Insbesondere die Entnahme von Gefäßgewebe bei einem lebenden Menschen würde einen Schlaganfall verursachen, so dass Gefäßgewebe in der Regel nur bei der Autopsie gewonnen wird, was für die Allgemeinbevölkerung nicht repräsentativ ist und bei älteren Patienten mit Begleitdiagnosen zu einer fortgeschritteneren Erkrankung neigt.
In solchen Fällen, in denen nicht genügend menschliche Daten genutzt werden können, können Tiermodelle die Datenlücken schließen. Große Tiermodelle für Schlaganfälle sind begrenzt, da die meisten großen Tiere, die in der Forschung verwendet werden, Huftiere sind, die eine Rete mirabile haben, die einen direkten endovaskulären Zugang zu den Hirnarterien verhindert 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Kaninchen haben eine lange Geschichte der Verwendung für die Untersuchung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, einschließlich intrakranieller Pathologien 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Kaninchen stellen ein ideales Modell für zerebrovaskuläre Erkrankungen dar, da sie groß genug für eine endovaskuläre Katheterisierung sind und die rete mirabile fehlt, die bei anderen großen Säugetieren einen intrakraniellen Zugang ausschließt 9,15,16,17. Sie wurden bisher speziell für die Untersuchung des IS durch präzisen und gut kontrollierten Verschluss einer intrakraniellen Arterie mit einem Mikrokathetereingesetzt 18.
Die Kontrolle des Blutdrucks (BP), sowohl durch Modulation des absoluten Blutdrucks als auch der BP-Variabilität (BPV), des Grades, in dem der arterielle Blutdruck um einen mittleren Blutdruck schwankt, ist ein aufstrebendes potenzielles therapeutisches Ziel für IS-Patienten, nachdem Berichte über schlechtere Ergebnisse bei Patienten mit schlecht eingestelltem Blutdruck oder BPV 19,20,21,22 . Mechanistische Untersuchungen darüber, wie Veränderungen zu schlechten Ergebnissen bei IS-Patienten führen, fehlen. Dies ist zum Teil auf die Schwierigkeit zurückzuführen, Daten auf Gewebeebene zu erhalten und gut kontrollierte Analysen am Menschen durchzuführen. Um Interventionen zu testen, die den Blutdruck oder den Blutdruck modulieren, müssen Tiermodelle verwendet werden, um diese Einschränkungen zu überwinden. Dieser Bericht beschreibt die erfolgreiche Paarung eines zuvor validierten Kaninchenmodells der IS unter Verwendung eines kontrollierten Verschlusses der hinteren Hirnarterie in Verbindung mit einer kontinuierlichen intraarteriellen Messung von BP18. Die hier vorgestellte Methode verbessert die bisherigen Ansätze der Schlaganfall-Pathophysiologie, indem sie ein validiertes und reproduzierbares Schlaganfallmodell auf ein System anwendet, in dem eine präzise Messung und Kontrolle des Blutdrucks erreicht werden kann. In diesem verfeinerten Modell kann die Infarktlast mit einer postprozeduralen histopathologischen Färbung des entnommenen Gehirns beurteilt werden, die auch für verschiedene Färbungen und fortgeschrittenere Analysen wie die räumliche Transkriptomik zugänglich ist. Darüber hinaus kann auch die verschlossene Arteria posterior für die Morbiditätsanalyse nach Überlebensverfahren ausgewählt werden.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-Protokollnummer 21-09021 der University of Utah) genehmigt. Ausgewachsene neuseeländische weiße Kaninchen werden von kommerziellen Anbietern bezogen.
1. Tiererwerb
- Akklimatisieren Sie die Tiere nach der Ankunft für die erforderliche Dauer gemäß dem institutionellen Protokoll und halten Sie die Tiere sozial in einem Vivarium mit Standardfutter unter. Die Eingewöhnungszeit in unserer Einrichtung beträgt 2 Wochen.
2. Anästhesie und Überwachung
- Einleitung einer endotrachealen Vollnarkose mit intramuskulärer Injektion von Buprenorphin (0,03 mg/kg), gefolgt von ca. 30 min später mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (25-35 mg/kg) und Xylazin (3 mg/kg). Halten Sie die Anästhesie mit 1%-5% Isofluran in Sauerstoff aufrecht, das über einen Endotrachealtubus verabreicht wird. Verwenden Sie während der Induktion 100 %FiO 2 und titrieren Sie dann auf den niedrigsten FiO 2, der einen SpO2 von 100 % beibehält.
HINWEIS: Eine ununterbrochene Anästhesie ist notwendig, um Bewegungen des Tieres zu verhindern, so dass der Schlaganfall die einzige Störung des Schlaganduktionsprozesses ist. Dies verhindert auch Blutdruckspitzen, die durch Unruhe entstehen würden, die durch eine unzureichende Anästhesie entstehen könnte. Eine gleichmäßige Sauerstoffversorgung ist ebenfalls wichtig zu kontrollieren, um vergleichbare Schläge zu erzielen. Diese Maßnahmen sind alle in den nachfolgend beschriebenen repräsentativen Ergebnissen berücksichtigt. - Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie schädliche Reize auf den Zeh anwenden. Tragen Sie tierärztliche Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit vorzubeugen.
- Überwachen Sie die Sauerstoffsättigung mit einem Pulsoximeter, das am Ohr angebracht wird. Erhalten Sie einen intravenösen Zugang mit einem Angiokatheter in einer Ohrvene. Stellen Sie sicher, dass es mit einer Naht oder einem selbstklebenden transparenten Folienverband gesichert ist. Um den Vasospasmus zu mildern, geben Sie nach der Einleitung der Anästhesie 0,25 Zoll transdermales Nitroglycerin auf die Innenseite des Ohrs.
- Versorgen Sie die Wartungsflüssigkeiten mit normaler Kochsalzlösung in einer Geschwindigkeit von 1 cm³/kg/h. Platzieren Sie eine Ösophagustemperatursonde, um die Körpertemperatur zu überwachen. Halten Sie die Normothermie (33-37 °C) nach Bedarf mit wärmenden Decken aufrecht, die unter das Tier gelegt werden.
3. Chirurgische Vorbereitung
- Legen Sie das Kaninchen in Rückenlage auf einen fluoroskopietauglichen Operationstisch. Verlängern Sie den Kopf, um die Positionierung für nachfolgende angiographische Ansichten zu optimieren. Kaninchen haben außerordentlich empfindliche Arterien, die nach der Instrumentierung zu Vasospasmen neigen.
- Entfernen Sie das Fell aus beiden Leistenregionen mit einer elektrischen Haarschneidemaschine. Als nächstes tasten Sie die beidseitigen femoralarteriellen Impulse ab, um eine ausreichende Clearance durch beidseitiges Trimmen zu bestätigen. Bereiten Sie die Haut mit Chlorhexidin- und Alkoholpeelings vor und drapieren Sie die Haut dann auf die übliche sterile Weise.
- Verabreichung einer Lokalanästhesie durch subkutane Injektion von 2 ml 1%igem Lidocain in die beidseitigen Leistenregionen. Machen Sie einen 5 cm langen chirurgischen Schnitt mit einer Klinge mit der Nummer 10 an der Stelle, an der Lidocain injiziert wurde. Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das neurovaskuläre Bündel freizulegen (Abbildung 1A). Verlängern Sie bei Bedarf den Schnitt, um ein Arteriensegment freizulegen, das groß genug für den Zugang ist.
- Nach der Isolierung des neurovaskulären Bündels träufeln Sie einige Tropfen 1%iges Lidocain auf die Arterie, um einen Vasospasmus zu verhindern. Trennen Sie die Arterie vorsichtig mit einer Pinzette von der Vene und dem angrenzenden Nerv. Identifizieren Sie die Arterie anhand des charakteristischen Aussehens ihrer Muskelwand im Vergleich zu den dünnen Wänden der Vene. Die Arterie hat helleres Blut, während die Vene dunkleres Blut enthält.
4. Arterieller Zugang
- Nachdem die Arterie isoliert wurde, führen Sie die rechtwinklige Pinzette unter das Gefäß. Fassen Sie mit dem Instrument zwei Gefäßschlaufen und führen Sie sie vorsichtig unter der Arterie hindurch. Platzieren Sie jeweils einen am stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Ende des freiliegenden Gefäßes.
- Setzen Sie die Arterie einem sanften Zug aus, indem Sie an den Gefäßschlaufen ziehen. Untersuchen Sie zu diesem Zeitpunkt das Gefäß auf Restgewebe und entfernen Sie es mit einer sanften Dissektion (Abbildung 1B). Dies erhöht die Chancen auf einen erfolgreichen Zugriff.
- Verwenden Sie für den Zugang einen 22-G-Angiokatheter. Schieben Sie den Katheter selbst leicht über die innere Nadel, da diese oft im vollständigen Sitzen kleben bleibt und das Gerät bei Zugangsversuchen verschieben kann.
- Nachdem Sie das Gefäß präpariert und den Angiokatheter vorbereitet haben, träufeln Sie Lidocain erneut auf das Gefäß. Die Arterie weitet sich sichtbar, was die Chancen auf einen erfolgreichen Zugang und die Platzierung einer Schleuse mit der Seldinger-Technik erhöht.
- Üben Sie einen sanften Zug auf die stromabwärts gelegene Gefäßschlaufe aus, um die Arterie zu stauen, indem Sie den Abfluss reduzieren. Dadurch wird das Schiff auch für den Zugangsversuch stabilisiert. Schieben Sie die Nadel des Angiokatheters langsam in die Mitte des freiliegenden arteriellen Segments (Abbildung 1C). Wenn ein Blutblitz im Angiokatheter und in der Kammer an seinem Zentrum zu sehen ist, schieben Sie den Katheter über die Nadel in das arterielle Lumen.
- Wenn der Zugriffsversuch nicht erfolgreich ist, erreichen Sie die Hämostase, indem Sie die stromaufwärts gelegene Schiffsschleife anziehen. Spülen Sie den Angiokatheter mit Kochsalzlösung und setzen Sie ihn für weitere Versuche wieder auf die Einführnadel.
- Wenn der Angiokatheter erfolgreich im Gefäß bis zu seinem Hub platziert wurde, schieben Sie einen Cope-Mikrodraht durch das Angiokatheterlumen in die Aorta (Abbildung 1D). Entfernen Sie den Angiokatheter über dem Draht und ersetzen Sie ihn durch eine 5-French-Slim-Hydrophil-Hülle (Abbildung 1E).
- Bestätigen Sie den Rückfluss des arteriellen Blutes durch den Seitenarmschlauch, indem Sie das Dreiwegeventil öffnen. Spülen Sie den Mantel mit 0,9%iger Kochsalzlösung und verriegeln Sie das Ventil während des Spülvorgangs.
- Befestigen Sie die Scheidennabe mit einer zusätzlichen 3-0-Seidennaht an der angrenzenden Haut. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die kontralaterale Oberschenkelarterie. Um eine höhere Effizienz zu erzielen, können zwei Bediener gleichzeitig arbeiten, während sie sich auf jeweils eine Arterie konzentrieren.
5. Zervikocerebrale Angiographie und intrakranieller Zugang
- Führen Sie unter fluoroskopischer Visualisierung einen 4-French-Glide-Katheter über einen 0,035-Zoll-Gleitdraht vor, der durch die linke Femurhülle eingeführt wird. Positionieren Sie die Spitze des Gleitkatheters in der proximalen linken Wirbelarterie. Entfernen Sie den Draht und spülen Sie den Katheter mit heparinisierter 0,9%iger Kochsalzlösung.
- Führen Sie eine Angiographie von Hand durch, indem Sie die linke Wirbelarterie mit jodhaltigem Kontrastmittel unter geringer Vergrößerung injizieren, um den gesamten Kopf und Hals darzustellen (Abbildung 2A). Modulieren Sie die Injektion der Kontrastmittellösung, indem Sie mit einer Niederdruckinjektion beginnen, die sich steigert, um das gesamte Gefäßsystem sichtbar zu machen.
HINWEIS: Eine ausreichende Injektion zur Visualisierung des Rückflusses in der rechten Wirbelarterie ist erforderlich, da dieses angiographische Bild als Roadmap-Anleitung zur effizienten Auswahl der richtigen Wirbelarterie verwendet wird. Eine sanfte Injektion ist erforderlich, um Vasospasmus oder tiefere Verletzungen zu minimieren. Darüber hinaus kann eine übermäßige Kraft oder ein übermäßiges Volumen auch unter tiefer Betäubung vorübergehende Bewegungen des Tieres hervorrufen. - Für die Injektion des linken Wirbels injizieren Sie 50% Kontrastmittel, verdünnt in normaler Kochsalzlösung mit einem sanften Crescendo aus einer 3-cm³-Spritze. Die Injektion von 1-2 ml des verdünnten Kontrastmittels ist in der Regel ausreichend. Bestimmen Sie die angemessene Menge der Injektion, indem Sie den Rückfluss in der rechten Wirbelarterie in die rechte Schlüsselbeinarterie überprüfen. Beachten Sie bei dieser Injektion auch die hinteren zerebralen und oberen Kleinhirnarterien, von denen eine das Ziel für den Verschluss mit dem Mikrokatheter sein wird.
- Bereiten Sie einen 2,4-French-Flow-gerichteten Mikrokatheter mit einem 0,010-Zoll-Mikrodraht vor. Machen Sie eine C-Form an der Spitze des Mikrodrahtes. Schieben Sie den Mikrokatheter unter Anleitung der Roadmap in einem 4-French-Glide-Katheter durch die rechte Femurscheide und über den Draht in die rechte Wirbelarterie. Aufgrund der Neigung zu katheterinduzierten Vasospasmen sollten die Manipulationszeit des Geräts und die Anzahl der durchgeführten Katheterversuche minimiert werden.
- Schieben Sie den Mikrokatheter durch das zervikale Segment der rechten Wirbelarterie. Um die scharfe Kurve vom V2- zum V3-Segment am besten zu überstehen, schieben Sie den Mikrokatheter allein vor, während sich der Mikrodraht wieder proximal an seiner Spitze befindet. Das Führen mit dem Mikrodraht an dieser Stelle führt oft zu einer Selektion kleiner Seitenäste der Arteria vertebralis und kann die Ursache für einen erheblichen Vasospasmus sein.
- Nach der scharfen Kurve von V2 nach V3 gelangt der Mikrokatheter oft leicht in die proximale Arteria basilaris. Schieben Sie an dieser Stelle den Mikrodraht vor und wählen Sie die gewünschten hinteren zerebralen oder oberen Kleinhirnarterien aus. Mikrokatheterinjektionen werden aufgrund der fragilen Natur der intrakraniellen Arterien nicht empfohlen.
- Schieben Sie den Mikrokatheter über den Mikrodraht in die Zielarterie. Wählen Sie eine proximale Position, da sie aufgrund ihrer Winkelung am Ursprung in der Regel am sichersten im Seitenzahnbereich kommuniziert werden kann. Eine tiefere Position ist in der Arteria cerebellaris superior möglich (Abbildung 2B).
- Wiederholen Sie das Angiogramm, indem Sie den Katheter der linken Wirbelarterie mit hoher Vergrößerung über den Kopf injizieren, um den Verschluss der Zielarterie zu bestätigen (Abbildung 2B-C). Für eine optimale Bildgebung injizieren Sie den Kontrast mit voller Stärke in die 3-cm³-Spritze. In der Regel ist nicht mehr als 1 ml für eine ausreichende Trübung aller intrakraniellen Arterien erforderlich.
- Entfernen Sie den Mikrodraht vorsichtig aus dem Mikrokatheter unter fluoroskopischer Visualisierung, um eine stabile Position zu bestätigen. Setzen Sie einen Absperrhahn auf die Nabe des Mikrokatheters und schließen Sie den Absperrhahn, um Blutverlust durch retrograden Blutfluss zu verhindern. Entfernen Sie den linken Wirbelkatheter, um die linke Femurzugangsschleuse freizugeben.
- Während der anschließenden Okklusionsphase werden intermittierende Durchleuchtungsbilder aufgenommen, um eine stabile Position des okklusiven Mikrokatheters zu bestätigen. Ergebnisse von Verschlussperioden der Arteria cerebri posterior im Bereich von 60-240 min wurden bereits veröffentlicht18.
6. Blutdruckmessung und -modulation
- Während für den okklusiven intrakraniellen Mikrokatheter eine femorale Zugangsstelle verwendet wird, wird die kontralaterale Hülle für die Blutdruckmessung verwendet.
- Zeichnen Sie kontinuierliche arterielle Blutdruckwerte mit einem piezoresistiven 3-French-Gauge-Sensor auf, der durch eine Femurhülle geführt und vorgeschoben wird, bis sich die Sensorspitze in der unteren thorakalen Aorta befindet. Schließen Sie diesen Sensor an die Datenerfassungshardware an und visualisieren Sie die gemessenen Drücke mit der zugehörigen Software. Beobachten Sie den Blutdruck im Druckvisualisierungsfenster. Blutdruckaufzeichnungen können zur Visualisierung in der Statistiksoftware in eine Tabellenkalkulation exportiert werden.
- Wenn eine mechanische Manipulation des Blutdrucks mit einem Ballonkatheter gewünscht wird, schieben Sie alternativ einen 4 französischen 5-mm-Fogarty-Ballonkatheter durch die vorhandene Femurhülle. Positionieren Sie den Ballon in der Nebennierenaorta. Verwenden Sie das 0,025-Zoll-Innenlumen für die Druckverfolgung, um den Blutdruck stromaufwärts des Ballons kontinuierlich zu überwachen, und den 4-Zoll-Durchmesser des Ballons für eine zweite BP-Verfolgungsleitung, die an die Hülle angeschlossen wird, um den Blutdruck stromabwärts des Ballons kontinuierlich zu überwachen.
7. Euthanasie und Gewebeentnahme
- Entfernen Sie den okklusiven Mikrokatheter nach 3 h und setzen Sie dann die arterielle Blutdruckmessung und -modulation für den weiteren gewünschten Zeitraum fort. Eine Standard-Erholungszeit von 3 h wird zur Visualisierung eines abgeschlossenen Infarkts in der anschließenden Histologie verwendet.
- Stellen Sie nach Abschluss der vorgeschriebenen Okklusions- und Erholungszeiten sicher, dass sich das Tier in einer chirurgischen Anästhesieebene befindet, und führen Sie Euthanasie durch (Perfusionsfixierung mit phosphatgepufferter Lösung, gefolgt von Enthauptung nach Bestätigung des Fehlens von Herzaktivität). Alternativ können Sie eine Perfusionsfixierung durchführen, indem Sie Perfusat durch eine Femurscheide infundieren und dann eine Halsvene, die untere Hohlvene oder den rechten Vorhof durchschneiden.
HINWEIS: Für einige Post-Mortem-Analysen kann eine Perfusion vorzuziehen sein, da die Genexpression oder die Biomarkerwerte durch die Lösung beeinflusst werden können. Beide Techniken wurden von unserer Gruppe erfolgreich durchgeführt. - Bestätigen Sie bei akuten Eingriffen mit sofortiger Entnahme des Gehirns die Euthanasie und enthaupten Sie das Tier. Entfernen Sie das Schädeldach stückweise mit Rongeuren, beginnend am Hinterhauptkamm und anterior, bis das Gehirn intakt entnommen werden kann. Legen Sie das Gehirn in Formalin oder eine Lösung mit optimaler Schnitttemperatur und frieren Sie es je nach gewünschter Art der Gewebeanalyse schock ein.
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Representative Results
In den ersten Experimenten mit diesem Modell gelang es unserer Gruppe, bei 12 von 14 Tieren (85,7%) das gewünschte Ergebnis eines posterioren zerebralen oder oberen Kleinhirnarterienverschlusses zu erzielen. Für das Experiment wurden sieben Männchen und sieben Weibchen untersucht. Das durchschnittliche Gewicht der Tiere betrug 3,6 kg (± 0,46 kg). Bei den beiden Tieren, bei denen kein Erfolg eintrat, verhinderte ein tiefgreifender katheterinduzierter Vasospasmus einen sicheren Zugang zum intrakraniellen Kreislauf. Bei einem Kaninchen konnte ein intrakranieller Zugang aufgrund eines Verschlussvasospasmus nicht erreicht werden, und bei dem anderen Tier kam es während des Katheterisierungsversuchs zu einer intrakraniellen arteriellen Perforation, die wahrscheinlich auf den Versuch zurückzuführen war, den Mikrokatheter zu weit distal in der Arteria cerebri posterior zu positionieren.
Bei allen Tieren wurde das Gehirn erfolgreich entnommen und einer histopathologischen Analyse unterzogen, entweder mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) oder 2 % Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). In Übereinstimmung mit bereits veröffentlichten Ergebnissen des Okklusionsmodells traten größere Infarktvolumina mit längeren Okklusionsdauern auf, die von 60 bis 240 min erfolgreich durchgeführt wurden18. H&E-Färbungsbilder nach 90 min Okklusion mit 120 min Reperfusion sind in Abbildung 3 dargestellt.
Arterielle Blutdruckwerte unterhalb der Normotension (40-60 mmHg systolischer Blutdruck) wurden bei allen Tieren nach Narkoseeinleitung ohne Verwendung von Vasopressoren oder Aufblasen eines intraaortalen Ballons festgestellt. Das teilweise Aufblasen des Ballons hat einen sofortigen Anstieg des systolischen Blutdrucks gezeigt, wobei eine Beispiel-BP-Verfolgung in Abbildung 4 dargestellt ist. Diese Abbildung beinhaltet eine kurzzeitige Aufzeichnung, um sowohl die nahezu sofortige Veränderung nach dem Aufblasen des intraaortalen Ballons als auch die Veränderungen während jedes Herzzyklus zu visualisieren.
Abbildung 1: Zugang zur Arteria femoralis . (A) Chirurgische Freilegung des rechten femoralen neurovaskulären Bündels vor der stumpfen Dissektion. Weiße Pfeilspitzen zeigen die medialen und lateralen Ränder des zu disparierenden Bündels an. (B) Nach der Isolierung schwillt die Arterie an, wenn mit Lidocainlösung getropft wird und ein sanfter Zug auf die stromabwärts gelegene Gefäßschleife ausgeübt wird. Das Gefäß kann durch sanftes Präparieren von Gewebe (schwarzer Pfeil) von der Adventitia gereinigt werden. (C) Unter Aufrechterhaltung einer sanften Spannung auf das Gefäß wird ein 22-G-Angiokatheter in das Gefäß vorgeschoben. Nachdem das Blut im Angiokatheter (schwarzer Pfeil) und seiner Kammer aufblitzt, wird der Angiokatheter sanft in die Arterie vorgeschoben. (D) Wenn der Angiokatheter in der Arterie bis zu seiner Nabe vorgeschoben wird, wird ein Cope-Draht durch den Angiokatheter in die Arterie vorgeschoben. (E) Nach dem Entfernen des Angiokatheters über einen Cope-Mikrodraht wird eine Gefäßhülle (weiße Pfeilspitze) zusammen mit ihrem inneren Einführstift über den Draht geschoben. Die Schleuse tritt in die Arterie ein, deren Wand an der Arteriotomiestelle zu sehen ist (weißer Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Angiographische Aufnahmen. (A) Die gering vergrößerte Ansicht der digitalen Subtraktionsangiographie während der Injektion der proximalen linken Wirbelarterie (weißer Pfeil) zeigt die Füllung der Arteria basilaris (schwarzer Pfeil). Beachten Sie den Rückfluss zurück durch die rechte Arteria vertebralis in die Arteria subclavia, die als Fahrplan für die Katheterisierung verwendet werden kann. Schwarze Pfeilspitzen markieren den Verlauf der rechten oberen Hirnarterie, die für den Verschluss anvisiert wird. Weiße Pfeilspitzen kennzeichnen die hintere Kleinhirnarterie, die auch angegriffen werden kann. (B) Die fluoroskopische Aufnahme mit hoher Vergrößerung zeigt den Mikrokatheter in der rechten oberen Kleinhirnarterie aus einem rechten Wirbelzugang. Die weiße Pfeilspitze zeigt den röntgendichten Marker an der Mikrokatheterspitze. (C) Die digitale Subtraktionsangiographie mit hoher Vergrößerung während der Injektion der linken Wirbelarterie zeigt eine anhaltende Füllung der Arteria basilaris (schwarzer Pfeil), während der Mikrokatheter durch sie hindurchläuft. Jenseits der mittleren rechten oberen Kleinhirnarterie, wo die Spitze des Mikrokatheters durch die weiße Pfeilspitze angedeutet ist, ist keine Füllung festzustellen. Das schwarze Sternchen kennzeichnet das nicht durchblutete Gebiet stromabwärts des Verschlusses in der Arteria cerebellaris superior. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Pathologie-Bilder . (A) Foto eines intakten entnommenen Gehirns, das die Oberfläche des Gehirns von rechts zeigt. Man beachte das dunkle Erscheinungsbild des oberen Kleinhirns, das auf eine petechiale Blutung im akut infarktierten Gewebe hinweist. Weiße Pfeilspitzen markieren den Rand des Infarkts. (B) Langachsiges T2-gewichtetes Magnetresonanzbild des intakten Gehirns in Formalin. Man beachte das verstärkte Signal im rechten Kleinhirn (Sternchen), das mit dem Infarkt übereinstimmt und dessen Rand durch weiße Pfeilspitzen umrandet ist. (C) Hellfeldbilder von 1,5 mm dicken seriellen koronalen Schnitten nach Hämatoxylin und Eosin (H&E)-Färbung zeigen einen Infarkt im rechten Kleinhirn, dessen Rand durch schwarze Pfeilspitzen auf mehreren Schichten angezeigt wird. Diese Schnitte wurden aus Blöcken eines geernteten Kaninchenhirns geschnitten, das in der koronalen Ebene mit einer Schnittmatrix geschnitten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Blutdrucküberwachung. Blutdruckdruckmessung aus einem Fogarty-Ballonkatheter, der in der Nebennierenaorta positioniert ist. (A) Daten aus ca. 1 Stunde Blutdrucküberwachung zeigen arterielle Druckänderungen in Echtzeit mit Änderungen des Ballonaufblasens. (B) Die Kurzzeitverfolgung zeigt die Druckänderungen während des gesamten Herzzyklus. Darüber hinaus werden kleine, schnelle Veränderungen durch die respiratorische Variabilität festgestellt, die physiologisch normal ist. Nach dem Aufblasen des Ballons wird eine unmittelbare Beinahe-Verdoppelung des gemessenen Blutdrucks festgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Bei der Behandlung von IS wurden erhebliche Fortschritte erzielt, insbesondere angesichts der Fortschritte bei den Strategien für die Akutintervention und die Sekundärprävention. Es kann jedoch noch mehr getan werden, um die Versorgung von IS-Patienten zu verbessern. Begrenzte Fortschritte in anderen Aspekten der IS-Behandlung, insbesondere im Bereich der Neuroprotektion, resultieren wahrscheinlich aus den Einschränkungen des pathophysiologischen Verständnisses mechanistischer Prozesse auf Gewebe- und molekularer Ebene. Aussagekräftige Daten von Menschen sind unrealistisch und wahrscheinlich unmöglich zu erfassen. Unter solchen Umständen können Daten auf Gewebeebene aus Tiermodellen Wissenslücken schließen und sinnvolle Veränderungen bewirken.
Wie oben beschrieben, bieten Kaninchen eine optimale Kombination aus Größe, Physiologie und Anatomie für die Untersuchung zerebrovaskulärer Pathologien18. Ohne eine Rete mirabile gibt es keine strukturellen Barrieren zu den intrakraniellen Arterien. Darüber hinaus sind die intrakraniellen Gefäße groß genug, um endovaskuläre Geräte aufzunehmen, was in Nagetiermodellen nicht in ähnlicher Weise machbar ist. Daten aus den intrakraniellen Geweben können auf vielfältige Weise analysiert werden, sei es durch etablierte histopathologische und immunhistochemische Färbungen oder durch modernste Methoden wie endovaskuläre Biopsieproben, die mit Einzelzell-RNA-Sequenzierung analysiert werden, oder räumliche Transkriptomik von intaktem Gewebe 9,15,16,17,18. Dieses berichtete Protokoll verbessert frühere Berichte über das Kaninchenokklusionsmodell, da es mehrere hintere Zirkulationsarterien verwendet und den Schwerpunkt auf die praktischen Schritte zur Minderung von Vasospasmen oder arteriellen Verletzungen legt18. Dieses Protokoll ist auch eine Verbesserung gegenüber den bestehenden Berichten, da die praktikablen und reproduzierbaren Methoden zur kontinuierlichen Blutdrucküberwachung vorhanden sind.
Kaninchen bieten ein immenses Potenzial für Fortschritte im pathobiologischen Verständnis zerebrovaskulärer Erkrankungen, stellen aber auch technische Herausforderungen dar. Anekdotischen Berichten von Veterinärmedizinern zufolge haben Kaninchen den wohlverdienten Ruf, hämodynamisch instabil zu sein. Hypotonie während der Narkoseeinleitung ist unvermeidlich. Um die Auswirkungen zu mildern, ist eine sofortige Intubation nach der Sedierung erforderlich. Die effiziente Exposition und der unverzügliche Zugang einer Oberschenkelarterie ermöglichen eine frühzeitige hämodynamische Überwachung durch Blutdruckmessung. Dies muss jedoch mit akribischen Techniken ausgeglichen werden, um den Blutverlust während des Zugangs zu begrenzen. Die Begrenzung des Blutverlusts muss auch in allen Schritten des endovaskulären Eingriffs Priorität haben, was durch eine konzertierte Beobachtung beim Gerätewechsel und die Verwendung rotierender hämostatischer Ventile an allen Kathetern erreicht werden kann. Da sich das gesamte Protokoll über mehrere Stunden erstreckt, sind auch intravenöse Ersatzflüssigkeiten erforderlich, um Blutverlust und unempfindlichen Verlusten entgegenzuwirken. Schließlich sind die Kaninchenarterien äußerst empfindlich und anfällig für Vasospasmen, auf die mit topischem Nitroglycerin, wie oben beschrieben, vorbereitet werden kann. Eine minimale Instrumentierung kann den Vasospasmus begrenzen, und dies wird am besten durch eine konzertierte Planung erreicht, um die arterielle Exposition gegenüber mechanischen Stressoren zu minimieren. Lidocain, das auf die Arterie getropft wird, kann dieser Reaktion entgegenwirken, und Verapamil (1 mg/ml) kann in ähnlicher Weise auf das Gefäß getropft oder über einen Katheter in die Arterie infundiert werden. Schließlich kann eine Pause von einigen Minuten dazu führen, dass sich der Vasospasmus auflöst.
Trotz der Herausforderungen kann die Ähnlichkeit der Anatomie und Physiologie von Kaninchen mit dem Menschen bei der Modellierung menschlicher Krankheiten nützlich sein, und die Fähigkeit, diese Herausforderungen zu minimieren, macht sie für Experimente geeignet. In Verbindung mit modernster Sequenzierung und Bildgebung bieten Kaninchen eine bemerkenswerte Möglichkeit zur Untersuchung zerebrovaskulärer Erkrankungen. Insbesondere ermöglichen die oben beschriebenen Methoden die gut kontrollierte Untersuchung des IS und die Auswirkungen verschiedener hämodynamischer Parameter auf seine Pathophysiologie, Diagnose und Behandlung.
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Disclosures
MDA, GH und MAJ sind Berater für Certus Critical Care, Inc. MDA ist Berater für Johnson &; Johnson.
Acknowledgments
Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Center for Advancing Translational Sciences der National Institutes of Health unter den Award-Nummern UL1TR002538 und KL2TR002539 sowie durch den Transformational Grant 19TPA34910194 der American Heart Association unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk Suture | Ethicon | A184H | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B9275 | |
| Catheter | Terumo | CG415 | 4F glide catheter |
| Endovascular Pressure Sensor | Millar | SPR-524 | |
| Euthasol | Virbac | PVS111 | |
| Guidewire | Terumo | GR1804 | |
| Iohexol | ThermoFisher | 466651000 | Iodinated Contrast |
| Ketamine | Biorbyt | orb61131 | |
| LabChart Software | ADInstruments | ||
| Lidocaine | Spectrum | LI102 | |
| Microcatheter | Medtronic | EV3 105-5056 | Marathon Microcatheter |
| Microwire | Medtronic | EV3 103-0608 | Mirage Microwire |
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Rabbit Brain 2mm Coronal Cutting Matrix | Ted Pella | 15026 | |
| Saline | FisherScientific | 23-535435 | |
| Sheath | Merit Medical | PSI-5F-11 | |
| Xylazine | ThermoFisher | J61430.14 |
References
- the American Heart Association. Heart Disease and Stroke Statistics-2022 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 145 (8), 153 (2022).
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