缺血性脑卒中兔模型中血压的实时监测和调节

Summary

连续动脉血压记录可以研究各种血流动力学参数的影响。本报告展示了连续动脉血压监测在缺血性卒中大型动物模型中的应用，以确定卒中病理生理学、不同血流动力学因素的影响以及评估新的治疗方法。

Abstract

血压的控制，包括绝对值及其变异性，都会影响缺血性卒中患者的结局。然而，由于人类数据固有的令人望而却步的局限性，确定导致不良结果的机制或评估可以减轻这些影响的措施仍然具有挑战性。在这种情况下，动物模型可用于对疾病进行严格且可重复的评估。在这里，我们报告了先前描述的兔子缺血性中风模型的改进，该模型通过连续血压记录来增强，以评估调节对血压的影响。在全身麻醉下，股动脉通过手术切开以双侧放置动脉鞘暴露。在透视和路线图指导下，微导管进入大脑后循环的动脉。通过注射对侧椎动脉进行血管造影以确认目标动脉闭塞。在闭塞导管固定固定时间的情况下，连续记录血压，以便通过机械或药理学手段对血压操作进行严格滴定。在闭塞间隔结束时，取出微导管，并将动物在全身麻醉下维持规定的再灌注时间。对于急性研究，然后将动物安乐死并斩首。在光学显微镜下收获和处理大脑以测量梗死体积，并通过各种组织病理学染色或空间转录组学分析进一步评估。该协议提供了一个可重复的模型，可用于对缺血性中风期间血压参数的影响进行更彻底的临床前研究。它还有助于对可能改善缺血性中风患者护理的新型神经保护干预措施进行有效的临床前评估。

Introduction

缺血性中风（IS）是全球死亡和长期残疾的主要原因，预计随着社会^年龄的增长，其患病率将增加1。虽然在急性干预和二级预防策略方面取得了实质性进展，但辅助神经保护治疗并没有迅速跟进²，³，⁴，⁵，^6，7。需要进一步研究中风病理生物学，因为对治疗可能有效或可能无效的机制知之甚少。这主要是由于卒中患者群体的异质性，其中许多人有许多合并症，使分析¹感到困惑。研究局限性的一个驱动因素是缺乏组织水平的数据 - 生物医学研究的黄金标准 - 由于从人类中枢神经系统采样组织令人望而却步的发病率。具体来说，活人的血管组织采集会导致中风，因此血管组织通常只在尸检时获得，尸检在一般人群中的代表性不足，并且在伴随诊断的老年患者中偏向于更晚期的疾病。

在这种情况下，当无法利用足够的人类数据时，动物模型可以弥合数据差距。中风的大型动物模型是有限的，因为研究中使用的大多数大型动物都是有蹄类动物，具有阻止血管内直接进入脑动脉的有蹄类^动物8，9，^10，11，12，¹³，¹⁴，¹⁵，^16，17.兔子在心血管疾病的研究方面有着悠久的历史，包括颅内病变⁸，9，10，11，¹²，13，¹⁴，¹⁵，^16，17。兔子是脑血管疾病的理想模型，因为它们足够大，可以进行血管内导尿，并且缺乏阻止其他大型哺乳动物颅内通路的奇迹⁹，^15，16，17。它们以前已被专门用于通过用微导管精确且控制良好的颅内动脉闭塞来研究^IS18。

血压 （BP） 控制，无论是通过调节绝对血压还是血压变异性 （BPV），即动脉血压在平均血压附近波动的程度，是 IS 患者的新兴潜在治疗靶点，此前有报道称血压或 BPV 控制不佳的患者结局更差¹⁹，²⁰，^21，22.缺乏关于变化如何导致IS患者不良结局的机制研究。这部分是由于难以获得组织水平的数据并在人类中进行控制良好的分析。为了测试调节血压或BPV的干预措施，必须利用动物模型来克服这些限制。本报告描述了先前验证的 IS 兔模型的成功配对，该模型使用大脑后动脉的受控闭塞结合连续动脉内血压¹⁸ 测量。这里介绍的方法通过将经过验证和可重复的卒中模型应用于可以实现精确测量和控制血压的系统，改进了以前的中风病理生理学方法。在这个改进的模型中，可以通过收获的大脑的术后组织病理学染色来评估梗死负担，这也适用于各种染色和更高级的分析，如空间转录组学。此外，还可以选择闭塞的后循环动脉进行评估，以便在生存程序后进行发病率分析。

Protocol

该协议由机构动物护理和使用委员会（犹他大学IACUC协议编号21-09021）批准。成熟的新西兰白兔是从商业供应商那里获得的。

1. 动物获取

1. 根据机构协议，在抵达后，在规定的时间内适应动物，将动物社会地安置在具有标准食物的动物饲养室中。我们机构的适应期为2周。

2. 麻醉和监测

1. 肌内注射丁丙诺啡（0.03mg / kg）诱导全身气管内麻醉，然后在约30分钟后用氯胺酮（25-35mg / kg）和甲苯噻嗪（3mg / kg）肌内注射。用1%-5%异氟醚在通过气管插管给药的氧气中维持麻醉。在诱导过程中，使用 100% FiO 2，然后滴定至保持 100% SpO₂ 的最低 FiO₂。
   注意：不间断的麻醉对于防止动物运动是必要的，因此中风将是中风诱导过程的唯一中断。这还可以防止因麻醉不足引起的躁动而导致的血压峰值。一致的氧合对于控制实现可比的卒中也很重要。这些措施都包含在下面描述的代表性结果中。
2. 通过在脚趾上施加有害刺激来确认足够的麻醉深度。在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。
3. 通过放置在耳朵上的脉搏血氧仪监测血氧饱和度。使用耳静脉血管导管进行静脉通路。确保用缝合线或粘性透明薄膜敷料固定。为了减轻血管痉挛，在诱导麻醉后，将 0.25 英寸透皮硝酸甘油放在耳朵内侧。
4. 以 1 cc/kg/h 的速率提供生理盐水维持液。放置食管温度探头以监测体温。根据需要在动物下方放置保暖毯保持正常体温（33-37°C）。

3. 手术准备

1. 将兔子仰卧放在兼容荧光透视的手术台上。伸展头部，因为它优化了后续血管造影视图的定位。兔子的动脉非常敏感，仪器仪表后容易出现血管痉挛。
2. 使用电动剪从腹股沟区域去除皮毛。接下来，触诊双侧股动脉脉搏，通过双侧修剪来确认足够的间隙。用洗必泰和酒精磨砂膏准备皮肤，然后以通常的无菌方式覆盖皮肤。
3. 通过在双侧腹股沟区域皮下注射 2 mL 1% 利多卡因进行局部麻醉。在注射利多卡因的部位用10号刀片做一个5厘米的手术切口。使用钝性解剖暴露神经血管束（图1A）。如果需要，延长切口以充分暴露足够大的动脉段以进入。
4. 分离神经血管束后，在动脉滴几滴 1% 利多卡因以防止血管痉挛。使用镊子轻轻地将动脉与静脉和邻近神经分开。通过其肌肉壁的特征外观与静脉薄壁相比来识别动脉。动脉将有更亮的血液，而静脉将含有更深的血液。

4. 动脉通路

1. 动脉分离后，将直角镊子放在血管下方。用仪器抓住两个血管环，然后轻轻地将它们穿过动脉下方。在暴露容器的上游和下游各放置一个。
2. 通过拉动血管环使动脉受到轻微的牵引。此时，检查血管是否有任何残留组织，并通过轻轻解剖将其取出（图1B）。这增加了成功访问的机会。
3. 使用 22 G 血管导管进行通路。将导管本身稍微推进到内针上，因为完全就位时通常会粘住，并且在尝试进入时可能会使设备移位。
4. 解剖血管并准备血管导管后，再次将利多卡因滴注在血管上。动脉会明显扩张，这增加了使用Seldinger技术成功进入和放置鞘的机会。
5. 对下游血管环施加温和的牵引，通过减少流出来充血动脉。这也稳定了船只的进入尝试。缓慢地将血管导管的针头推进到暴露的动脉段的中间（图1C）。当在血管导管及其枢纽处的腔室中发现血迹时，将导管通过针头推进到动脉腔中。
6. 如果访问尝试不成功，则通过在上游血管环路上施加牵引来实现止血。用生理盐水冲洗血管导管，并用引入针更换血管导管以进行进一步尝试。
7. 当血管导管成功放置在血管中到其枢纽时，将 Cope 微丝穿过血管导管腔并进入主动脉（图 1D）。取下导线上的血管导管，并用5法式细亲水鞘代替（图1E）。
8. 通过打开三通阀确认动脉血通过侧臂管返回。用0.9%盐水冲洗护套，并在冲洗过程中锁定阀门关闭。
9. 用额外的 3-0 丝线将鞘轮固定在相邻的皮肤上。对股骨对侧动脉重复此过程。为了实现更高的效率，两名操作员可以同时工作，同时每人专注于一条动脉。

5.颈脑血管造影和颅内通路

1. 在透视下，将 4 法式滑行导管推进到插入左股骨鞘的 0.035 英寸滑丝上。将滑动导管的尖端定位在左椎动脉近端。取下导丝并用肝素化的0.9%盐水冲洗导管。
2. 在低放大倍率下用碘造影剂手动注射左椎动脉进行血管造影，以可视化整个头部和颈部（图2A）。通过从渐强的低压注射开始调节造影剂的注射，以可视化整个脉管系统。
   注意：需要足够的注射来可视化右椎动脉的反流，因为此血管造影图像将用于路线图指导，以有效地选择正确的椎动脉。需要轻柔注射以尽量减少血管痉挛或更严重的损伤。此外，即使在深度麻醉下，过度的力或体积也会诱发动物的瞬时运动。
3. 对于左椎体注射，用3cc注射器的温和渐强注射在生理盐水中稀释的50%造影剂。注入 1-2 cc 的稀释造影剂通常就足够了。通过检查右椎动脉反流并进入右锁骨下动脉来确定足够的注射量。在注射过程中，还要注意大脑后动脉和小脑上动脉，其中一条将是微导管闭塞的目标。
4. 准备带有 2.4 英寸微丝的 0.010 法式流导向微导管。在微丝的尖端做一个C形。在路线图指导下，将 4 法式滑动导管内的微导管推进，穿过右股骨鞘，越过导线进入右椎动脉。由于容易发生导管诱发的血管痉挛，应尽量减少器械操作时间和导管尝试次数。
5. 推进微导管通过右椎动脉的颈节段。为了最好地通过从 V2 到 V3 段的急转弯，当微丝回到其尖端近端时，单独推进微导管。此时使用微丝通常会导致椎动脉小侧支的选择，并且可能是大量血管痉挛的来源。
6. 在通过从V2到V3的急转后，微导管通常很容易通过近端基底动脉。此时，推进微丝并选择所需的大脑后动脉或小脑上动脉。鉴于颅内动脉的脆弱性质，不建议注射微导管。
7. 将微导管通过微丝推进到目标动脉中。选择一个近端位置，因为它在原点的角度通常最安全地在后部进行交流。在小脑上动脉中更深的位置是可行的（图2B）。
8. 通过在头部注射高倍率的左椎动脉导管来重复血管造影，以确认目标动脉的闭塞（图2B-C）。为了获得最佳成像，在3 cc注射器中注射全强度造影剂。通常，所有颅内动脉的充分混浊不需要超过 1 cc。
9. 在透视下轻轻地从微导管上取下微丝，以确认位置稳定。将旋塞阀放在微导管的轮毂上并关闭旋塞阀，以防止逆行血流失血。移除左椎导管，使左股骨通路鞘可用。
10. 在随后的闭塞期间，获取间歇性透视图像以确认闭塞微导管的稳定位置。60-240分钟的大脑后动脉闭塞期的结果已发表¹⁸。

6. 血压测量和调节

1. 当一个股骨通路部位用于闭塞性颅内微导管时，使用对侧鞘进行血压测量。
2. 使用 3 法式压阻式传感器记录连续动脉血压读数，该传感器通过股骨鞘放置并推进，直到传感器尖端位于胸主动脉下部。将此传感器连接到数据采集硬件，并使用其相关软件可视化测量的压力。在压力可视化窗口中观察血压。BP记录可以导出到电子表格中，以便在统计软件中进行可视化。
3. 或者，如果需要使用球囊导管对血压进行机械操作，则推进 4 法式 5 mm Fogarty 球囊导管通过可用的股骨鞘。将球囊放在肾下主动脉中。使用 0.025 英寸内腔进行压力示踪以连续监测球囊上游的血压，并使用气球的 4 法国直径将第二条血压示踪线连接到护套，以连续监测球囊下游的血压。

7. 安乐死和组织采集

1. 3小时后取出闭塞微导管，然后继续动脉血压测量和调节额外的所需时间。3 小时的标准恢复期用于在随后的组织学上可视化已完成的梗死。
2. 完成规定的闭塞和恢复时间后，确保动物处于麻醉的手术平面并进行安乐死（用磷酸盐缓冲溶液灌注固定，然后在确认没有心脏活动后斩首）。或者，通过股骨鞘输注灌注液，然后横断颈静脉、下腔静脉或右心房进行灌注固定。
   注意：对于某些尸检分析，灌注可能更可取，因为基因表达或生物标志物值可能会受到溶液的影响。这两种技术都由我们小组成功执行。
3. 在立即收获大脑的急性手术中，确认安乐死并将动物斩首。用 rongeurs 以零碎的方式去除颅骨，从枕脊开始并向前工作，直到大脑可以完整地收获。将大脑置于福尔马林或最佳切割温度溶液中并快速冷冻，具体取决于所需的组织分析类型。

Representative Results

在该模型的初始实验中，我们小组成功地在14只动物中的12只（85.7%）中实现了大脑后部或小脑上动脉闭塞的预期结果。在实验中，研究了七名男性和七名女性。平均动物体重为3.6公斤（±0.46公斤）。在未取得成功的两只动物中，深度导管诱导的血管痉挛阻止了安全进入颅内循环。在一只兔中，由于闭塞性血管痉挛而无法获得颅内通路，而在另一只动物中，在尝试导尿期间发生颅内动脉穿孔，这可能是由于试图将微导管放置在大脑后动脉中太远的地方。

在所有动物中，成功收获大脑并用苏木精和伊红（H&E）染色或2%三苯基氯化四唑（TTC）进行组织病理学分析。与先前发表的闭塞模型结果一致，梗死体积较大，闭塞持续时间较长，已成功从60分钟到240分钟¹⁸。 图3提供了90分钟闭塞和120分钟再灌注后的H&E染色图像。

在不使用血管加压药或主动脉内球囊充气的情况下诱导麻醉后，所有动物的基线动脉血压低于正常血压（40-60mmHg收缩压）。球囊部分充气显示收缩压立即升高， 图 4 提供了血压示踪样本。该图包括短时间的追踪，以可视化主动脉内球囊充气后的近瞬时变化以及整个心动周期的变化。

图1：股动脉通路 。 （A）钝化夹层前右股神经血管束的手术暴露。白色箭头表示要通过解剖暴露的束的内侧和侧缘。（B）隔离后，当滴注利多卡因溶液并轻轻牵引下游血管环时，动脉会充血。可以通过轻轻解剖外膜上的组织（黑色箭头）来清洁血管。（C）保持血管上的温和张力，将22G血管导管推进血管。在看到血管导管（黑色箭头）及其腔室中闪烁的血液后，血管导管被轻轻推进到动脉中。（D）随着血管导管在动脉中推进到其枢纽，Cope线通过血管导管推进到动脉中。（E）在Cope微丝上移除血管导管后，血管鞘（白色箭头）及其内部引入器通过导丝推进。可以看到鞘进入动脉，在动脉切开部位可以看到其壁（白色箭头）。 请点击此处查看此图的大图。

图2：血管造影图像。 （A）注射左椎近端动脉时数字减影血管造影的低放大倍率视图（白色箭头）显示基底动脉充满（黑色箭头）。注意回流从右椎动脉回流到锁骨下动脉，这可以用作指导导管插入的路线图。黑色箭头描绘了将作为闭塞目标的右上脑动脉的路线。白色箭头标识小脑后动脉，也可以作为目标。（B）高放大倍率点透视图像从右椎入路显示右小脑上动脉中的微导管。白色箭头表示微导管尖端的不透射线标记物。（C）注射左椎动脉期间的高放大倍率数字减影血管造影显示，当微导管穿过基底动脉时，基底动脉持续充盈（黑色箭头）。在中右小脑上动脉（微导管尖端由白色箭头指示）之外未发现填充物。黑色星号表示小脑上动脉闭塞下游的非灌注区域。 请点击此处查看此图的大图。

图3：病理学图像 。 （A）完整收获的大脑的照片，从动物的右侧显示大脑表面。注意小脑上部外观变暗，提示急性梗死组织中有瘀点出血。白色箭头划定梗死的边缘。（B）福尔马林中完整大脑的长轴T2加权磁共振图像。注意右小脑信号增加（星号），与梗死一致，梗死的边界由白色箭头划定。（C）苏木精和伊红（H&E）染色后1.5毫米厚的连续冠状切片的明场图像显示右小脑梗死，其边缘由多个切片上的黑色箭头指示。这些切片是从在冠状平面上切割的收获兔脑块上切成的，带有切割矩阵。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：血压监测。 位于肾下主动脉的 Fogarty 球囊导管的血压压力示踪。（A）来自大约1小时的血压监测数据表明，随着球囊充气的变化，动脉压的实时变化。（B）短期示踪显示整个心动周期的压力变化。此外，呼吸变异性可观察到微小而快速的变化，这在生理上是正常的。在气球充气后，测得的血压立即接近两倍。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

IS的管理取得了实质性进展，特别是考虑到急性干预和二级预防策略的进展。然而，可以做更多的工作来改善对IS患者的护理。IS治疗的其他方面进展有限，特别是在神经保护领域，可能是由于组织和分子水平上对机制过程的病理生理学理解的局限性。来自人类的有影响力的数据是不现实的，很可能不可能获得。在这种情况下，来自动物模型的组织水平数据可以弥合知识差距并影响有意义的变化。

如上所述，兔子为脑血管病理学的研究提供了大小、生理和解剖学的最佳组合¹⁸.由于缺乏奇迹，颅内动脉没有结构性障碍。此外，颅内血管足够大以容纳血管内装置，这在啮齿动物模型中同样不可行。来自颅内组织的数据可以通过多种方式进行分析，无论是通过已建立的组织病理学和免疫组织化学染色剂还是尖端方法，例如使用单细胞RNA测序分析的血管内活检样品或完整组织的空间转录组学9，^15，16，^17，18.鉴于兔子闭塞模型的应用，该报告方案改进了先前关于兔闭塞模型的报告，因为它应用了多条后循环动脉，并强调了减轻血管痉挛或动脉损伤的实际步骤¹⁸。该协议也是对现有报告的改进，给出了连续血压监测的可行和可重复的方法。

虽然兔子在脑血管疾病的病理生物学理解方面具有巨大的潜力，但它们也带来了技术挑战。根据兽医合作者的轶事报告，兔子因血流动力学不稳定而享有盛誉。麻醉诱导期间的低血压是不可避免的。为了减轻影响，镇静后需要立即插管。股动脉的有效暴露和及时进入允许通过血压测量进行早期血流动力学监测。然而，这必须与细致的技术相平衡，以限制访问过程中的失血。在血管内手术的所有步骤中，限制失血也必须是优先事项，这可以通过在设备更换期间的协同观察和在所有导管上使用旋转止血阀来实现。由于整个方案持续数小时，因此还需要补充静脉输液以抵消失血和不显性失血。最后，兔动脉非常敏感，容易发生血管痉挛，如上所述，可以用局部硝酸甘油来准备。最少的器械可以限制血管痉挛，这最好通过协调计划来实现，以尽量减少动脉暴露于机械应激源。滴注在动脉上的利多卡因可以抵消这种反应，维拉帕米（1mg/mL）也可以同样滴注在血管上或通过导管输注到动脉中。最后，暂停几分钟可以使血管痉挛消退。

尽管存在挑战，但兔子解剖学和生理学与人类的相似性可用于模拟人类疾病，并且最大限度地减少这些挑战的能力使它们适合实验。再加上尖端的测序和成像，兔子为研究脑血管疾病提供了绝佳的机会。特别是，上述方法可以很好地控制IS的研究以及各种血流动力学参数对其病理生理学，诊断和管理的影响。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-0 Silk Suture	Ethicon	A184H
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B9275
Catheter	Terumo	CG415	4F glide catheter
Endovascular Pressure Sensor	Millar	SPR-524
Euthasol	Virbac	PVS111
Guidewire	Terumo	GR1804
Iohexol	ThermoFisher	466651000	Iodinated Contrast
Ketamine	Biorbyt	orb61131
LabChart Software	ADInstruments
Lidocaine	Spectrum	LI102
Microcatheter	Medtronic	EV3 105-5056	Marathon Microcatheter
Microwire	Medtronic	EV3 103-0608	Mirage Microwire
PowerLab	ADInstruments
Rabbit Brain 2mm Coronal Cutting Matrix	Ted Pella	15026
Saline	FisherScientific	23-535435
Sheath	Merit Medical	PSI-5F-11
Xylazine	ThermoFisher	J61430.14