Summary
La registrazione continua della pressione arteriosa consente l'indagine degli impatti di vari parametri emodinamici. Questo rapporto dimostra l'applicazione del monitoraggio continuo della pressione arteriosa in un ampio modello animale di ictus ischemico per la determinazione della fisiopatologia dell'ictus, l'impatto di diversi fattori emodinamici e la valutazione di nuovi approcci terapeutici.
Abstract
Il controllo della pressione arteriosa, sia in termini di valori assoluti che di variabilità, influenza i risultati nei pazienti con ictus ischemico. Tuttavia, rimane difficile identificare i meccanismi che portano a risultati scadenti o valutare le misure con cui questi effetti possono essere mitigati a causa delle limitazioni proibitive inerenti ai dati umani. In questi casi, i modelli animali possono essere utilizzati per condurre valutazioni rigorose e riproducibili delle malattie. Qui riportiamo il perfezionamento di un modello precedentemente descritto di ictus ischemico nei conigli che è aumentato con la registrazione continua della pressione sanguigna per valutare gli impatti della modulazione sulla pressione sanguigna. In anestesia generale, le arterie femorali sono esposte attraverso tagli chirurgici per posizionare le guaine arteriose bilateralmente. Sotto la visualizzazione fluoroscopica e la guida della tabella di marcia, un microcatetere viene avanzato in un'arteria della circolazione posteriore del cervello. Un angiogramma viene eseguito iniettando l'arteria vertebrale controlaterale per confermare l'occlusione dell'arteria bersaglio. Con il catetere occlusivo che rimane in posizione per una durata fissa, la pressione sanguigna viene registrata continuamente per consentire una stretta titolazione delle manipolazioni della pressione sanguigna, sia attraverso mezzi meccanici che farmacologici. Al completamento dell'intervallo di occlusione, il microcatetere viene rimosso e l'animale viene mantenuto in anestesia generale per una durata prescritta di riperfusione. Per gli studi acuti, l'animale viene quindi eutanasia e decapitato. Il cervello viene raccolto ed elaborato per misurare il volume dell'infarto al microscopio ottico e ulteriormente valutato con varie colorazioni istopatologiche o analisi trascrittomica spaziale. Questo protocollo fornisce un modello riproducibile che può essere utilizzato per studi preclinici più approfonditi sugli effetti dei parametri della pressione sanguigna durante l'ictus ischemico. Facilita inoltre un'efficace valutazione preclinica di nuovi interventi neuroprotettivi che potrebbero migliorare la cura per i pazienti con ictus ischemico.
Introduction
L'ictus ischemico (IS) è una delle principali cause di morte e disabilità a lungo termine in tutto il mondo e si prevede che la sua prevalenza aumenterà con l'età della societàdi 1 anno. Mentre sono stati fatti progressi sostanziali negli interventi acuti e nelle strategie di prevenzione secondaria, i trattamenti neuroprotettivi aggiuntivi non hanno seguito il ritmo 2,3,4,5,6,7. Sono necessarie ulteriori ricerche sulla patobiologia dell'ictus perché i meccanismi attraverso i quali le terapie possono o non possono dimostrarsi efficaci sono poco conosciuti. Ciò è in gran parte dovuto alla natura eterogenea della popolazione di pazienti colpiti da ictus, molti dei quali hanno numerose comorbidità che confondono l'analisi1. Un fattore di limitazione nella ricerca è l'assenza di dati a livello tissutale - il gold standard nella ricerca biomedica - a causa della morbilità proibitiva del campionamento del tessuto dal sistema nervoso centrale umano. In particolare, la raccolta di tessuto vascolare in un essere umano vivente causerebbe un ictus, quindi il tessuto vascolare è in genere ottenuto solo all'autopsia, che è sottorappresentativa della popolazione generale e si inclina verso una malattia più avanzata nei pazienti anziani con diagnosi concomitanti.
In questi casi, quando non è possibile utilizzare dati umani sufficienti, i modelli animali possono colmare le lacune nei dati. I grandi modelli animali di ictus sono limitati poiché la maggior parte degli animali di grandi dimensioni utilizzati nella ricerca sono ungulati che hanno una rete mirabile che impedisce l'accesso endovascolare diretto alle arterie cerebrali 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . I conigli hanno una lunga storia di utilizzo per lo studio delle malattie cardiovascolari, comprese le patologie intracraniche 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. I conigli rappresentano un modello ideale per le malattie cerebrovascolari perché sono abbastanza grandi per il cateterismo endovascolare e mancano della rete mirabile che preclude l'accesso intracranico in altri grandi mammiferi 9,15,16,17. Sono stati precedentemente utilizzati specificamente per lo studio dell'IS attraverso l'occlusione precisa e ben controllata di un'arteria intracranica con un microcatetere18.
Il controllo della pressione arteriosa (BP), sia attraverso la modulazione della BP assoluta o la variabilità della BP (BPV), il grado in cui la pressione arteriosa fluttua intorno a una pressione arteriosa media, è un potenziale bersaglio terapeutico emergente per i pazienti con IS dopo segnalazioni di esiti peggiori in quelli con BP scarsamente controllata o BPV 19,20,21,22 . Manca un'indagine meccanicistica su come i cambiamenti portino a scarsi risultati nei pazienti con IS. Ciò è in parte dovuto alla difficoltà di ottenere dati a livello tissutale e di eseguire analisi ben controllate negli esseri umani. Per testare interventi che modulano BP o BPV, i modelli animali devono essere utilizzati per superare questi limiti. Questo rapporto descrive l'accoppiamento di successo di un modello di coniglio precedentemente validato di IS utilizzando l'occlusione controllata dell'arteria cerebrale posteriore in combinazione con la misurazione intra-arteriosa continua di BP18. Il metodo qui presentato migliora i precedenti approcci alla fisiopatologia dell'ictus applicando un modello di ictus convalidato e riproducibile a un sistema in cui è possibile ottenere una misurazione e un controllo precisi della BP. In questo modello raffinato, il carico di infarto può essere valutato con la colorazione istopatologica post-procedurale del cervello prelevato, che è anche suscettibile di varie colorazioni e analisi più avanzate come la trascrittomica spaziale. Inoltre, l'arteria di circolazione posteriore occlusa può anche essere scelta per essere valutata per l'analisi della morbilità seguendo le procedure di sopravvivenza.
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Protocol
Questo protocollo è approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (numero di protocollo IACUC dell'Università dello Utah 21-09021). I conigli bianchi maturi della Nuova Zelanda sono ottenuti da venditori commerciali.
1. Acquisizione di animali
- Acclimatare gli animali per la durata richiesta dopo l'arrivo secondo il protocollo istituzionale, ospitando socialmente gli animali in un vivaio con diete standard di chow. Il periodo di acclimatazione presso la nostra istituzione è di 2 settimane.
2. Anestesia e monitoraggio
- Indurre l'anestesia endotracheale generale con iniezione intramuscolare di buprenorfina (0,03 mg/kg) seguita circa 30 minuti dopo da un'iniezione intramuscolare di ketamina (25-35 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg). Mantenere l'anestesia con isoflurano all'1% -5% nell'ossigeno somministrato tramite un tubo endotracheale. Durante l'induzione, utilizzare il 100% di FiO 2, quindi titolare fino al FiO 2 più basso che mantiene un 100% SpO2.
NOTA: l'anestesia ininterrotta è necessaria per impedire il movimento dell'animale in modo che l'ictus sia l'unica interruzione del processo di induzione dell'ictus. Ciò previene anche i picchi di BP che deriverebbero dall'agitazione che potrebbe derivare da un'anestesia inadeguata. Anche l'ossigenazione costante è importante da controllare per ottenere colpi comparabili. Queste misure sono tutte contabilizzate nei risultati rappresentativi descritti di seguito. - Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia applicando stimoli nocivi alla punta. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Monitorare la saturazione di ossigeno con un pulsossimetro posizionato sull'orecchio. Ottenere l'accesso endovenoso con un angiocatetere in una vena auricolare. Assicurarsi che sia fissato con una sutura o una medicazione adesiva trasparente. Per mitigare il vasospasmo, posizionare 0,25 pollici di nitroglicerina transdermica all'interno dell'orecchio dopo l'induzione dell'anestesia.
- Fornire fluidi di mantenimento con soluzione salina normale ad una velocità di 1 cc/kg/h. Posizionare una sonda di temperatura esofagea per monitorare la temperatura corporea. Mantenere la normotermia (33-37 °C) secondo necessità con coperte riscaldanti poste sotto l'animale.
3. Preparazione chirurgica
- Posizionare il coniglio in posizione supina su un tavolo operatorio compatibile con la fluoroscopia. Estendi la testa in quanto ottimizza il posizionamento per le successive viste angiografiche. I conigli hanno arterie squisitamente sensibili inclini al vasospasmo dopo la strumentazione.
- Rimuovere la pelliccia da entrambe le regioni inguinali usando tagliatrici elettriche. Quindi, palpare gli impulsi arteriosi femorali bilaterali per confermare un'adeguata clearance tagliando bilateralmente. Preparare la pelle con scrub di clorexidina e alcool, quindi avvolgere la pelle nel solito modo sterile.
- Somministrare l'anestesia locale iniettando per via sottocutanea 2 ml di lidocaina all'1% nelle regioni inguinali bilaterali. Fare un'incisione chirurgica di 5 cm con una lama numero 10 nel sito in cui è stata iniettata la lidocaina. Utilizzare la dissezione smussata per esporre il fascio neurovascolare (Figura 1A). Se necessario, estendere l'incisione per esporre adeguatamente un segmento arterioso abbastanza grande per l'accesso.
- Dopo l'isolamento del fascio neurovascolare, gocciolare diverse gocce di lidocaina all'1% sull'arteria per prevenire il vasospasmo. Separare delicatamente l'arteria dalla vena e dal nervo adiacente usando una pinza. Identificare l'arteria dall'aspetto caratteristico della sua parete muscolare rispetto alle pareti sottili della vena. L'arteria avrà sangue più luminoso, mentre la vena conterrà sangue più scuro.
4. Accesso arterioso
- Dopo che l'arteria è stata isolata, passare la pinza ad angolo retto sotto la nave. Afferrare due anelli di vaso con lo strumento e passarli delicatamente sotto l'arteria. Situarne uno ciascuno alle estremità a monte e a valle del recipiente esposto.
- Sottoporre l'arteria a una leggera trazione tirando i cappi del vaso. A questo punto, ispezionare il vaso per eventuali tessuti residui e rimuoverlo delicatamente con una delicata dissezione (Figura 1B). Ciò aumenta le possibilità di accesso riuscito.
- Utilizzare un angiocatheter da 22 G per l'accesso. Avanzare leggermente il catetere stesso sopra l'ago interno poiché questo spesso si attacca quando è completamente seduto e può rimuovere il dispositivo durante i tentativi di accesso.
- Dopo aver sezionato il vaso e preparato l'angiocatere, gocciolare nuovamente la lidocaina sulla nave. L'arteria si dilaterà visibilmente, il che aumenta le possibilità di successo dell'accesso e del posizionamento di una guaina utilizzando la tecnica Seldinger.
- Applicare una trazione delicata al circuito del vaso a valle per ingoiare l'arteria riducendo il deflusso. Questo stabilizza anche la nave per il tentativo di accesso. Far avanzare lentamente l'ago dell'angiocatetere nel mezzo del segmento arterioso esposto (Figura 1C). Quando si vede un lampo di sangue nell'angiocatetere e nella camera al suo hub, far avanzare il catetere sopra l'ago nel lume arterioso.
- Se il tentativo di accesso non ha successo, ottenere l'emostasi applicando la trazione sul circuito a monte del vaso. Lavare l'angiocatheter con soluzione salina e sostituirlo sull'ago introduttore per ulteriori tentativi.
- Quando l'angiocatheter viene posizionato con successo nel recipiente fino al suo mozzo, far avanzare un microfilo di Cope attraverso il lume dell'angiocateter e nell'aorta (Figura 1D). Rimuovere l'angiocatetere sul filo e sostituirlo con una guaina idrofila sottile francese 5 (Figura 1E).
- Confermare il ritorno del sangue arterioso attraverso il tubo dell'arma laterale aprendo la valvola a tre vie. Lavare la guaina con soluzione salina allo 0,9% e bloccare la valvola chiusa durante il lavaggio.
- Fissare il mozzo della guaina alla pelle adiacente con un'ulteriore sutura di seta 3-0. Ripeti questo processo per l'arteria femorale controlaterale. Per ottenere maggiori efficienze, due operatori possono lavorare contemporaneamente concentrandosi su un'arteria ciascuno.
5. Angiografia cervicocerebrale e accesso intracranico
- Sotto la visualizzazione fluoroscopica, far avanzare un catetere a scorrimento francese 4 su un glidewire da 0,035 pollici inserito attraverso la guaina femorale sinistra. Posizionare la punta del catetere glide nell'arteria vertebrale sinistra prossimale. Rimuovere il filo e lavare il catetere con soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.
- Eseguire l'angiografia iniettando manualmente l'arteria vertebrale sinistra con contrasto iodato a basso ingrandimento per visualizzare l'intera testa e il collo (Figura 2A). Modulare l'iniezione della soluzione di contrasto iniziando con un'iniezione a bassa pressione che cresce per visualizzare l'intera vascolarizzazione.
NOTA: È necessaria un'iniezione sufficiente per visualizzare il reflusso lungo l'arteria vertebrale destra, poiché questa immagine angiografica verrà utilizzata come guida alla tabella di marcia per selezionare l'arteria vertebrale destra in modo efficiente. È necessaria un'iniezione delicata per ridurre al minimo il vasospasmo o lesioni più profonde. Inoltre, una forza o un volume eccessivi possono indurre movimenti transitori dall'animale anche in anestesia profonda. - Per l'iniezione vertebrale sinistra, iniettare il 50% di contrasto diluito in soluzione salina normale con un delicato crescendo da una siringa da 3 cc. L'iniezione di 1-2 cc del contrasto diluito è in genere sufficiente. Determinare la quantità adeguata di iniezione controllando il reflusso lungo l'arteria vertebrale destra e nell'arteria succlavia destra. Durante questa iniezione, notare anche le arterie cerebellari posteriori e superiori, una delle quali sarà il bersaglio da occludere con il microcatetere.
- Preparare un microcatetere a flusso diretto francese da 2,4 con un microfilo da 0,010 pollici. Crea una forma a C sulla punta del microfilo. Sotto la guida della tabella di marcia, far avanzare il microcatetere all'interno di un catetere a scorrimento francese 4 attraverso la guaina femorale destra e oltre il filo nell'arteria vertebrale destra. A causa della propensione al vasospasmo indotto da catetere, ridurre al minimo il tempo di manipolazione del dispositivo e il numero di tentativi di catetere eseguiti.
- Far avanzare il microcatetere attraverso il segmento cervicale dell'arteria vertebrale destra. Per superare al meglio la brusca virata dal segmento V2 a V3, far avanzare il microcatetere da solo mentre il microfilo è tornato prossimale alla sua punta. Condurre con il microfilo a questo punto causerà spesso la selezione di piccoli rami laterali dell'arteria vertebrale e può essere la fonte di vasospasmo sostanziale.
- Dopo aver superato la brusca virata da V2 a V3, il microcatetere passa spesso facilmente all'arteria basilare prossimale. A questo punto, far avanzare il microfilo e selezionare le arterie cerebrali posteriori o cerebellari superiori desiderate. Le iniezioni di microcatetere non sono consigliate data la natura fragile delle arterie intracraniche.
- Far avanzare il microcatetere sul microfilo nell'arteria bersaglio. Scegli una posizione prossimale in quanto è tipicamente più sicura nella parte posteriore comunicare a causa della sua angolazione alla sua origine. Una posizione più profonda è fattibile nell'arteria cerebellare superiore (Figura 2B).
- Ripetere l'angiogramma iniettando il catetere dell'arteria vertebrale sinistra con alto ingrandimento sopra la testa per confermare l'occlusione dell'arteria bersaglio (Figura 2B-C). Per un'imaging ottimale, iniettare il contrasto a piena forza nella siringa da 3 cc. Tipicamente, non sarà necessario più di 1 cc per un'adeguata opacizzazione di tutte le arterie intracraniche.
- Rimuovere delicatamente il microfilo dal microcatetere sotto visualizzazione fluoroscopica per confermare una posizione stabile. Posizionare un rubinetto sul mozzo del microcatetere e chiudere il rubinetto di arresto per evitare la perdita di sangue dal flusso sanguigno retrogrado. Rimuovere il catetere vertebrale sinistro per rendere disponibile la guaina di accesso femorale sinistra.
- Durante il successivo periodo di occlusione, acquisire immagini fluoroscopiche intermittenti per confermare una posizione stabile del microcatetere occlusivo. I risultati dei periodi di occlusione dell'arteria cerebrale posteriore compresi tra 60 e 240 minuti sono stati pubblicati in precedenza18.
6. Misurazione e modulazione della pressione sanguigna
- Mentre un sito di accesso femorale viene utilizzato per il microcatetere intracranico occlusivo, utilizzare la guaina controlaterale per la misurazione della pressione arteriosa.
- Registrare letture arteriose continue della pressione arteriosa con un sensore piezoresistivo di calibro francese 3, posizionato attraverso una guaina femorale e avanzato fino a quando la punta del sensore si trova nell'aorta toracica inferiore. Collegare questo sensore all'hardware di acquisizione dati e visualizzare le pressioni misurate con il software associato. Osservare BP nella finestra di visualizzazione della pressione. Le registrazioni BP possono essere esportate in un foglio di calcolo per la visualizzazione nel software di statistica.
- In alternativa, se si desidera una manipolazione meccanica della pressione arteriosa utilizzando un catetere a palloncino, far avanzare un catetere a palloncino Fogarty da 5 mm francese attraverso la guaina femorale disponibile. Posizionare il palloncino nell'aorta infrarenale. Utilizzare il lume interno da 0,025 pollici per il tracciamento della pressione per monitorare continuamente BP a monte del pallone e il diametro francese 4 del pallone per una seconda linea di tracciamento BP da collegare alla guaina per il monitoraggio continuo di BP a valle del pallone.
7. Eutanasia e raccolta di tessuti
- Rimuovere il microcatetere occlusivo dopo 3 ore, quindi continuare la misurazione e la modulazione della pressione arteriosa arteriosa per il periodo aggiuntivo desiderato. Un periodo di recupero standard di 3 ore viene utilizzato per la visualizzazione di un infarto completato sull'istologia successiva.
- Dopo aver completato i tempi di occlusione e recupero prescritti, assicurarsi che l'animale sia in un piano chirurgico di anestesia ed eseguire l'eutanasia (fissazione di perfusione con soluzione tampone fosfato, seguita da decapitazione dopo la conferma dell'assenza di attività cardiaca). In alternativa, eseguire la fissazione della perfusione infondendo il perfusato attraverso una guaina femorale e quindi transettando una vena giugulare, la vena cava inferiore o l'atrio destro.
NOTA: La perfusione può essere preferibile per alcune analisi postmortem poiché i valori di espressione genica o biomarcatori possono essere influenzati dalla soluzione. Entrambe le tecniche sono state eseguite con successo dal nostro gruppo. - Nelle procedure acute con raccolta immediata del cervello, confermare l'eutanasia e decapitare l'animale. Rimuovere il calvario in modo frammentario con i rongeur, iniziando dalla cresta occipitale e lavorando anteriormente fino a quando il cervello può essere raccolto intatto. Posizionare il cervello in formalina o soluzione di temperatura di taglio ottimale e congelamento flash, a seconda del tipo di analisi tissutale desiderata.
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Representative Results
Negli esperimenti iniziali con questo modello, il nostro gruppo ha raggiunto con successo il risultato desiderato di un'occlusione cerebrale posteriore o superiore dell'arteria cerebellare in 12 animali su 14 (85,7%). Per l'esperimento, sono stati studiati sette maschi e sette femmine. Il peso medio dell'animale era di 3,6 kg (± 0,46 kg). Nei due animali in cui non è stato raggiunto il successo, il vasospasmo indotto da catetere profondo ha precluso un accesso sicuro alla circolazione intracranica. In un coniglio, l'accesso intracranico non poteva essere ottenuto a causa del vasospasmo occlusivo, e nell'altro animale, la perforazione arteriosa intracranica si è verificata durante il tentativo di cateterismo, che era probabilmente dovuto al tentativo di posizionare il microcatetere troppo distalmente nell'arteria cerebrale posteriore.
In tutti gli animali, il cervello è stato raccolto con successo e sottoposto ad analisi istopatologica con colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) colorazione o cloruro di trifeniltetrazolio al 2% (TTC). In linea con i risultati precedentemente pubblicati del modello di occlusione, si sono verificati volumi di infarto maggiori con durate di occlusione più lunghe, che sono state eseguite con successo da 60 a 240 minuti18. Le immagini della colorazione H&E dopo 90 minuti di occlusione con 120 minuti di riperfusione sono fornite nella Figura 3.
La pressione arteriosa basale al di sotto della normotensione (pressione sistolica 40-60 mmHg) è stata osservata in tutti gli animali dopo induzione dell'anestesia senza uso di vasopressori o gonfiaggio di un palloncino intra-aortico. L'inflazione parziale del palloncino ha dimostrato un aumento immediato della pressione arteriosa sistolica, con un tracciato della pressione arteriosa del campione fornito nella Figura 4. Questa figura include il tracciamento di una breve durata per visualizzare sia il cambiamento quasi istantaneo dopo l'inflazione del palloncino intra-aortico, sia i cambiamenti durante ogni ciclo cardiaco.
Figura 1: Accesso all'arteria femorale. (A) Esposizione chirurgica del fascio neurovascolare femorale destro prima della dissezione smussata. Le punte di freccia bianche indicano i bordi mediale e laterale del fascio da esporre con la dissezione. (B) Dopo l'isolamento, l'arteria diventa gonfia quando gocciola con soluzione di lidocaina e applica una leggera trazione al circuito del vaso a valle. La nave può essere pulita con una delicata dissezione del tessuto (freccia nera) dall'avventizia. (C) Mantenendo una leggera tensione sul recipiente, un angiocatetere da 22 G viene fatto avanzare nel recipiente. Dopo aver visto il sangue lampeggiare nell'angiocatheter (freccia nera) e nella sua camera, l'angiocatheter viene delicatamente avanzato nell'arteria. (D) Con l'angiocatheter avanzato nell'arteria fino al suo mozzo, un filo di Cope viene fatto avanzare nell'arteria attraverso l'angiocatere. (E) Dopo aver rimosso l'angiocatheter su un microfilo di Cope, una guaina vascolare (punta di freccia bianca) viene avanzata insieme al suo introduttore interno sopra il filo. La guaina è vista entrare nell'arteria, la cui parete può essere vista nel sito dell'arteriotomia (freccia bianca). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini angiografiche. (A) La vista a basso ingrandimento dell'angiografia digitale a sottrazione durante l'iniezione dell'arteria vertebrale sinistra prossimale (freccia bianca) dimostra il riempimento dell'arteria basilare (freccia nera). Si noti il reflusso lungo l'arteria vertebrale destra nell'arteria succlavia, che può essere utilizzata come tabella di marcia per guidare il cateterismo. Le punte di freccia nere delineano il decorso dell'arteria cerebrale superiore destra che sarà presa di mira per l'occlusione. Le punte di freccia bianche identificano l'arteria cerebellare posteriore, che può anche essere presa di mira. (B) L'immagine fluoroscopica ad alto ingrandimento dimostra il microcatetere nell'arteria cerebellare superiore destra da un approccio vertebrale destro. La punta della freccia bianca indica il marcatore radiopaco sulla punta del microcatetere. (C) L'angiografia digitale a sottrazione ad alto ingrandimento durante l'iniezione dell'arteria vertebrale sinistra dimostra un riempimento persistente dell'arteria basilare (freccia nera) mentre il microcatetere la attraversa. Non si nota alcun riempimento oltre l'arteria cerebellare superiore di metà destra, dove la punta del microcatetere è indicata dalla punta della freccia bianca. L'asterisco nero identifica il territorio non perfuso a valle dell'occlusione nell'arteria cerebellare superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagini patologiche . (A) Fotografia del cervello raccolto intatto che mostra la superficie del cervello dalla destra dell'animale. Si noti l'aspetto oscurato del cervelletto superiore che indica un'emorragia petecchiale nel tessuto acutamente infartuato. Le punte di freccia bianche delimitano il margine dell'infarto. (B) Immagine di risonanza magnetica pesata in T2 ad asse lungo del cervello intatto in formalina. Si noti l'aumento del segnale nel cervelletto destro (asterisco), coerente con l'infarto, il cui bordo è delineato da punte di freccia bianche. (C) Le immagini in campo chiaro di sezioni coronali seriali spesse 1,5 mm dopo la colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) dimostrano infarto nel cervelletto destro, il cui margine è indicato da punte di freccia nere su più fette. Queste sezioni sono state tagliate da blocchi di un cervello di coniglio raccolto tagliato nel piano coronale con una matrice di taglio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Monitoraggio BP. Tracciamento della pressione BP da un catetere a palloncino Fogarty posizionato nell'aorta infrarenale. (A) I dati di circa 1 ora di monitoraggio della pressione arteriosa dimostrano variazioni della pressione arteriosa in tempo reale con variazioni del gonfiaggio del palloncino. (B) Il tracciamento a breve termine dimostra le variazioni di pressione durante il ciclo cardiaco. Inoltre, si notano piccoli e rapidi cambiamenti dalla variabilità respiratoria, che è fisiologicamente normale. Si nota un immediato quasi raddoppio della pressione arteriosa misurata in seguito all'inflazione del pallone. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Sono stati compiuti progressi sostanziali nella gestione dell'IS, in particolare considerando i progressi nelle strategie di intervento acuto e di prevenzione secondaria. Tuttavia, si può fare di più per migliorare l'assistenza ai pazienti IS. Progressi limitati in altri aspetti del trattamento dell'IS, in particolare nel campo della neuroprotezione, probabilmente derivano dai limiti nella comprensione fisiopatologica dei processi meccanicistici a livello tissutale e molecolare. I dati di impatto degli esseri umani sono irrealistici e probabilmente impossibili da acquisire. In tali circostanze, i dati a livello tissutale provenienti da modelli animali possono colmare le lacune nelle conoscenze e influenzare cambiamenti significativi.
Come descritto sopra, i conigli forniscono una combinazione ottimale di dimensioni, fisiologia e anatomia per lo studio delle patologie cerebrovascolari18. Mancando una rete mirabile, non ci sono barriere strutturali alle arterie intracraniche. Inoltre, i vasi intracranici sono abbastanza grandi da ospitare dispositivi endovascolari, il che non è altrettanto fattibile nei modelli di roditori. I dati provenienti dai tessuti intracranici possono essere analizzati in molteplici modi, sia attraverso colorazioni istopatologiche e immunoistochimiche consolidate che attraverso metodi all'avanguardia come campioni di biopsia endovascolare analizzati con sequenziamento di RNA unicellulare o trascrittomica spaziale di tessuti intatti 9,15,16,17,18. Questo protocollo riportato migliora i precedenti rapporti del modello di occlusione del coniglio data la sua applicazione di più arterie di circolazione posteriore e l'enfasi sui passi pratici per mitigare il vasospasmo o la lesione arteriosa18. Questo protocollo rappresenta anche un miglioramento rispetto alle relazioni esistenti, dati i metodi fattibili e riproducibili per il monitoraggio continuo della BP.
Mentre i conigli presentano un immenso potenziale per i progressi nella comprensione patobiologica delle malattie cerebrovascolari, presentano anche sfide tecniche. Secondo i rapporti aneddotici dei collaboratori veterinari, i conigli hanno una meritata reputazione di essere emodinamicamente instabili. L'ipotensione durante l'induzione dell'anestesia è inevitabile. Per mitigare gli effetti, è necessaria un'intubazione tempestiva dopo la sedazione. L'esposizione efficiente e l'accesso tempestivo a un'arteria femorale consentono un monitoraggio emodinamico precoce in virtù della misurazione della pressione arteriosa. Tuttavia, questo deve essere bilanciato con tecniche meticolose per limitare la perdita di sangue durante l'accesso. Anche la limitazione della perdita di sangue deve essere una priorità in tutte le fasi della procedura endovascolare, che può essere ottenuta con un'osservazione concertata durante gli scambi di dispositivi e utilizzando valvole emostatiche rotanti su tutti i cateteri. Poiché l'intero protocollo si verifica per diverse ore, sono necessari anche fluidi endovenosi sostitutivi per contrastare la perdita di sangue e le perdite insensibili. Infine, le arterie di coniglio sono profondamente sensibili e inclini al vasospasmo, che può essere preparato con nitroglicerina topica, come descritto sopra. Una strumentazione minima può limitare il vasospasmo, e questo è meglio ottenuto con una pianificazione concertata per ridurre al minimo l'esposizione arteriosa a fattori di stress meccanici. La lidocaina gocciolata sull'arteria può contrastare questa reazione e verapamil (1 mg / ml) può essere gocciolato in modo simile sul vaso o infuso nell'arteria attraverso un catetere. Infine, una pausa di alcuni minuti può consentire al vasospasmo di risolversi.
Nonostante le sfide, la somiglianza dell'anatomia e della fisiologia del coniglio con gli esseri umani può essere utile nella modellazione delle malattie umane e la capacità di ridurre al minimo queste sfide le rende adatte alla sperimentazione. Insieme al sequenziamento e all'imaging all'avanguardia, i conigli offrono una notevole opportunità per studiare le malattie cerebrovascolari. In particolare, le metodiche sopra descritte consentono lo studio ben controllato dell'IS e degli effetti di vari parametri emodinamici sulla sua fisiopatologia, diagnosi e gestione.
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Disclosures
MDA, GH e MAJ sono consulenti per Certus Critical Care, Inc. MDA è consulente per Johnson & Johnson.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Center for Advancing Translational Sciences del National Institutes of Health con i numeri di premio UL1TR002538 e KL2TR002539 e dal Transformational Grant 19TPA34910194 dell'American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk Suture | Ethicon | A184H | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B9275 | |
| Catheter | Terumo | CG415 | 4F glide catheter |
| Endovascular Pressure Sensor | Millar | SPR-524 | |
| Euthasol | Virbac | PVS111 | |
| Guidewire | Terumo | GR1804 | |
| Iohexol | ThermoFisher | 466651000 | Iodinated Contrast |
| Ketamine | Biorbyt | orb61131 | |
| LabChart Software | ADInstruments | ||
| Lidocaine | Spectrum | LI102 | |
| Microcatheter | Medtronic | EV3 105-5056 | Marathon Microcatheter |
| Microwire | Medtronic | EV3 103-0608 | Mirage Microwire |
| PowerLab | ADInstruments | ||
| Rabbit Brain 2mm Coronal Cutting Matrix | Ted Pella | 15026 | |
| Saline | FisherScientific | 23-535435 | |
| Sheath | Merit Medical | PSI-5F-11 | |
| Xylazine | ThermoFisher | J61430.14 |
References
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