Summary
Denne protokol beskriver de vigtigste trin til at generere og karakterisere murin oral-esophageal 3D-organoider, der repræsenterer normale, præneoplastiske og pladecellekarcinomlæsioner induceret via kemisk carcinogenese.
Abstract
Esophageal pladecellekarcinom (ESCC) er udbredt over hele verden og tegner sig for 90% af alle tilfælde af spiserørkræft hvert år og er den dødeligste af alle humane pladecellekarcinomer. På trods af de seneste fremskridt med at definere de molekylære ændringer, der ledsager ESCC-initiering og -udvikling, er patientprognosen fortsat dårlig. Den funktionelle annotering af disse molekylære ændringer er det nødvendige næste skridt og kræver modeller, der både fanger ESCC's molekylære egenskaber og let og billigt kan manipuleres til funktionel annotation. Mus behandlet med tobaksrøg mimetisk 4-nitroquinolin 1-oxid (4NQO) danner forudsigeligt ESCC og esophageal preneoplasi. Bemærk, at 4NQO læsioner også opstår i mundhulen, oftest i tungen, såvel som formaven, som alle deler det lagdelte pladeepitel. Disse mus kan dog ikke blot manipuleres til funktionel hypotesetest, da generering af isogene musemodeller er tids- og ressourcekrævende. Heri overvinder vi denne begrænsning ved at generere enkeltcelleafledte tredimensionelle (3D) organoider fra mus behandlet med 4NQO for at karakterisere murin ESCC eller præneoplastiske celler ex vivo. Disse organoider fanger de fremtrædende træk ved ESCC og esophageal preneoplasi, kan billigt og hurtigt udnyttes til at danne isogene modeller og kan bruges til syngeneiske transplantationseksperimenter. Vi demonstrerer, hvordan man genererer 3D-organoider fra normalt, præneoplastisk og SCC murin spiserørvæv og vedligeholder og kryobevarer disse organoider. Anvendelserne af disse alsidige organoider er brede og omfatter udnyttelse af genetisk manipulerede mus og yderligere karakterisering ved flowcytometri eller immunhistokemi, generering af isogene organoidlinjer ved hjælp af CRISPR-teknologier og lægemiddelscreening eller syngeneisk transplantation. Vi mener, at en udbredt anvendelse af de teknikker, der er demonstreret i denne protokol, vil fremskynde fremskridtene på dette område for at bekæmpe den alvorlige byrde, der er forbundet med ESCC.
Introduction
Esophageal pladecellekarcinom (ESCC) er den dødeligste af humane pladecellekarcinomer på grund af dens sene diagnose, terapiresistens og metastase 1,2. ESCC stammer fra det lagdelte pladeepitel, som linjer spiserørets luminale overflade. Planoepitelet består af proliferative basalceller og differentierede celler i det suprabasale cellelag. Under fysiologiske forhold udtrykker basalceller markører som p63, Sox2 og cytokeratin K5 og K14, mens differentierede celler udtrykker K4, K13 og IVL. Basalceller selv er heterogene og omfatter formodede stamceller defineret af markører som K153 og CD734. I homeostase gennemgår basalceller postmitotisk terminal differentiering inden for det suprabasale cellelag, mens differentierede celler migrerer og afskaler ind i lumen for at fuldføre epitelfornyelsen. ESCC minder om deres oprindelsesceller og viser pladecelledifferentiering i varierende grad. ESCC ledsages ofte af multifokale histologiske forløberlæsioner, kendt som intraepitelial neoplasi (IEN) eller dysplasi, der omfatter atypiske basaloidceller. Ud over epitelændringer viser ESCC vævsmodellering inden for subepitelrummet, hvor aktiveringen af kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) og rekruttering af immun- / inflammatoriske celler finder sted for at fremme det tumorfremmende mikromiljø.
Patogenesen af ESCC involverer genetiske ændringer og eksponering for miljømæssige risikofaktorer. Vigtige genetiske læsioner omfatter inaktivering af tumorsuppressorgenerne TP53 og CDKN2A (p16INK4A) og aktivering af CCND1 (cyclin D1) og EGFR onkogener, som kulminerer i nedsat cellecykluskontrolpunktfunktion, afvigende proliferation og overlevelse under genotoksisk stress relateret til eksponering for kræftfremkaldende stoffer i miljøet. Faktisk interagerer genetiske ændringer tæt med adfærdsmæssige og miljømæssige risikofaktorer, oftest tobaks- og alkoholbrug. Tobaksrøg indeholder humane kræftfremkaldende stoffer såsom acetaldehyd, som også er alkoholens vigtigste metabolit. Acetaldehyd inducerer DNA-addukter og interstrand DNA-tværbindinger, hvilket fører til DNA-skader og akkumulering af DNA-mutationer og kromosomal ustabilitet. I betragtning af overdreven mitogen stimuli og afvigende proliferation fra onkogenaktivering lettes den ondartede transformation af esophageal epitelceller af mekanismer til at klare genotoksisk stress, herunder aktivering af antioxidanter, autofagi og epitel-mesenkymal overgang (EMT). Interessant nok aktiveres disse cytoprotektive funktioner ofte i ESCC-kræftstamceller (CSC'er), der er kendetegnet ved høj CD44 (CD44H) ekspression og har evnen til tumorinitiering, invasion, metastase og terapiresistens 5,6,7.
ESCC er modelleret i cellekultur og i gnavermodeller 8,9. I de sidste tre årtier er der udviklet robuste gensplejsede musemodeller af ESCC. Disse omfatter CCND1 og EGFR transgene mus 10,11 og p53 og p120Ctn knockout mus 12,13. Imidlertid resulterer enkelte genetiske ændringer typisk ikke i hurtigt indsættende ESCC. Denne udfordring er blevet overvundet med brugen af esophageal carcinogener, der rekapitulerer godt de humane genetiske læsioner i ESCC14. For eksempel fremskynder 4-nitroquinolin-1-oxid (4NQO) ESCC-udvikling i CCND1 transgene mus15. I de senere år er formodede esophageal epitelstamceller, stamceller og deres respektive skæbner blevet undersøgt i celleafstamningssporbare musemodeller 3,4. Desuden er disse celleafstamningssporbare mus blevet brugt til at udforske ESCC's oprindelsesceller, og hvordan sådanne celler giver anledning til CD44H CSC'er via konventionel histologi og omics-baseret molekylær karakterisering7.
Et nyt område relateret til disse musemodeller er den nye anvendelse af cellekulturteknikker til at analysere levende ESCC- og forløberceller i et tredimensionelt (3D) organoidsystem, hvor arkitekturen af det originale væv rekapituleres ex vivo 7,8,9. Disse 3D-organoider vokser hurtigt fra en enkeltcellesuspension isoleret fra murinvæv, herunder primære og metastatiske tumorer (f.eks. lymfeknuder, lunge- og leverlæsioner). Cellerne er indlejret i kældermembranekstrakt (BME) og fodres med et veldefineret serumfrit cellekulturmedium. 3D-organoiderne vokser inden for 7-10 dage, og de resulterende sfæriske strukturer er modtagelige for subkultur, kryopræservering og assays til analyse af en række cellulære egenskaber og funktioner, herunder CSC-markører, EMT, autofagi, proliferation, differentiering og apoptotisk celledød.
Disse metoder kan bredt anvendes til 3D-organoidkulturer etableret fra ethvert lagdelt pladeepitelvæv, såsom hoved- og halsslimhinden (mundhule, tunge, svælg og strubehoved) og endda formaven. Hoved- og halsslimhinden er sammenhængende med spiserøret, og de to væv deler lignende vævsorganisation, funktion og modtagelighed for sygdom. Både pladecellekarcinom (HNSCC) og ESCC deler genetiske læsioner og livsstilsrelaterede miljømæssige risikofaktorer såsom tobaks- og alkoholeksponering. For at understrege denne lighed udvikler mus behandlet med tobaksrøgmimetik 4NQO let både HNSCC og ESCC. I betragtning af den lethed, hvormed protokollerne beskrevet nedenfor kan anvendes til modellering af HNSCC, inkluderer vi specifikke instruktioner til etablering af 3D-organoidkulturer fra disse læsioner.
Heri leverer vi detaljerede protokoller til generering af murine esophageal 3D-organoider (MEO'er), der repræsenterer normale, præneoplastiske og ESCC-læsioner, der udvikler sig hos mus behandlet med 4NQO. Forskellige musestammer kan anvendes, herunder almindelige laboratoriestammer såsom C57BL / 6 og celleafstamningssporbare og andre genetisk manipulerede derivater. Vi lægger vægt på de vigtigste trin, herunder isolering af normalt eller sygt murin esophageal epitel, fremstilling af enkeltcellesuspensioner, dyrkning og overvågning af de voksende 3D-organoider, subkultur, kryopræservering og behandling til efterfølgende analyser, herunder morfologi og andre applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Murinforsøgene blev planlagt og udført i overensstemmelse med regler og under dyreprotokol #AABB1502, gennemgået og godkendt af Columbia University's Institutional Animal Care and Use Committee. Musene blev anbragt på et ordentligt dyreplejeanlæg, der sikrer human behandling af mus og giver passende veterinærpleje til musene og laboratoriesikkerhedsuddannelse til laboratoriepersonalet.
1. Behandling af mus med 4NQO for at inducere esophageal IEN og ESCC læsioner (tidsovervejelse: op til 28 uger)
BEMÆRK: For at generere MEO'er, der repræsenterer neoplastiske esophageal læsioner, udsættes musene for 4NQO-medieret kemisk carcinogenese som tidligere beskrevet af Tang et al.14. Normale/ikke-neoplastiske MEO'er genereres fra ubehandlede mus.
- Mus
- Hus fire til fem mus pr. bur, og akklimatisere dem til dyreanlægget i mindst 1 uge, før du starter et forsøg. For at reducere muligheden for, at aldersrelaterede lidelser resulterer i for tidlig afbrydelse af hele 28 ugers eksperimentet, skal du starte med 8 uger gamle til 16 uger gamle mus.
BEMÆRK: C57BL/6-mus, der vejer ca. 20-30 g, blev anvendt i denne protokol. Til kortere forsøg kan ældre mus anvendes. Han- eller hunmus er acceptable. Kontrolmus (ingen behandling, se pkt. 1.3.1) skal matches med hensyn til alder og køn.
- Hus fire til fem mus pr. bur, og akklimatisere dem til dyreanlægget i mindst 1 uge, før du starter et forsøg. For at reducere muligheden for, at aldersrelaterede lidelser resulterer i for tidlig afbrydelse af hele 28 ugers eksperimentet, skal du starte med 8 uger gamle til 16 uger gamle mus.
- Fremstilling af drikkevand indeholdende 4NQO
- Forbered 1 mg/ml 4NQO stamopløsning i ethylenpropylenglycol (materialetabel). 100 mg 4NQO opløses i 100 ml 99,9% ethylenpropylenglycol i et 500 ml glasbægerglas dækket med forseglingsfilm. Bland grundigt ved stuetemperatur (RT) ved hjælp af en magnetisk omrører ved 800 omdr./min. i 30 minutter. Opbevares ved 4 °C.
- Tilsæt 900 ml autoklaveret deioniseret vand til 100 ml 1 mg / ml 4NQO stamopløsning, og bland ved invertering i en 2 L plastgradueret cylinder dækket med forseglingsfilm. Et volumen på 1 L 100 μg/ml 4NQO i 10% ethylenpropylenglycol vil tjene to musebure udstyret med en 500 ml drikkeflaske.
FORSIGTIG: Bemærk, 4NQO er et syntetisk kemisk kræftfremkaldende stof, der kan forårsage kræft. Håndtag med nitrilhandsker og en langærmet laboratoriefrakke, og brug sko med lukket tå. Overvej korrekt øjenbeskyttelse, ansigtsbeskyttelse og hovedbeklædning. Til bortskaffelse af affald skal 4NQO placeres i en mærket beholder i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer for håndtering af farligt affald ved miljøsundhed og sikkerhed.
- Behandling med 4NQO og monitorering
- Sæt drikkeflasken på, og administrer 4NQO via drikkevandet ad libitum til musene i 16 uger. Brug 10% (w/v) propylenglycol som køretøjskontrol (ingen behandling).
BEMÆRK: Kortere varighed af 4NQO behandling kan anvendes til at inducere IEN. - Påfyld vandet en gang om ugen.
- Hver mus vejes ugentligt ved at lægge den i en plastikbeholder på en laboratorievægt.
- Ved afslutningen af den 16 ugers 4NQO behandlingsperiode skal du begynde at give musene regelmæssigt drikkevand i post-4NQO observationsperioden i op til 12 uger (figur 1).
- Overvåg musene dagligt for tegn på nød (f.eks. nedsat mobilitet, krumbøjet habitus og tilbagetrukket adfærd), dysfagi og dehydrering. Derudover skal du evaluere musene ugentligt for ændringer i kropsvægt eller føde- og væskeindtag. Hvis kropsvægten falder med mere end 10% fra den oprindelige kropsvægt, skal du fodre musene med et flydende kosttilskud.
BEMÆRK: Et tab af kropsvægt, der er ildfast over for flydende kosttilskud, kan være tegn på ESCC, og mus, der mister mere end 20% af deres kropsvægt, bør aflives. Det er vigtigt, at MEO'er kan genereres fra for tidligt aflivede mus. Bemærk, at C57BL/6-mus uden genetiske modifikationer typisk ikke viser tegn på sygelighed eller har synlige ESCC-læsioner før slutningen af observationsperioden efter 4NQO.
- Sæt drikkeflasken på, og administrer 4NQO via drikkevandet ad libitum til musene i 16 uger. Brug 10% (w/v) propylenglycol som køretøjskontrol (ingen behandling).
- Forberedelse af dyr
- Aflive musene i et CO 2 kammer fyldt med CO2 med en strømningshastighed, der fortrænger 30% -70% af kammerets volumen pr. Minut. Bekræft døden ved cervikal dislokation.
- Fastgør musens lemmer og næse i liggende stilling til dissektionsplatformen ved hjælp af 21 G nåle.
- Desinficer musens ventrale overflade med 70% ethanol.
- Dissektion (tidsovervejelse: 0,5 timer)
- Åbn huden ved at klemme den midterste mavepels og hud for at sikre, at den frigives fra indvoldene nedenfor. Brug den kirurgiske saks til at lave et kraniocaudalt, ventralt midterlinjesnit fra underlivet til hagen.
- Start ved midterlinjesnittet, brug kirurgisk saks til at lave radiale snit, der strækker sig til lemmerne på begge sider af musen. Flay hudflapperne åbne.
- For at udsætte livmoderhalsrøret skal du bruge dissekeringssaksen til at opdele spytkirtlerne ved midterlinjen. Luftrøret ligger dybt i kirtlerne.
- For at udsætte thoraxluftrøret skal du fjerne brystbenet.
- Klem forsigtigt og løft bughinden med tang, og brug en saks til at opdele bughinden kraniokautalt og lateralt langs brystkassen.
- Træk forsigtigt leveren tilbage fra membranens kaudale overflade, og brug en saks til at lave et lille snit i membranen ved brysthakket, specifikt på den dorsale overflade af xiphoidprocessen. Dette frigiver lungen og hjertet fra den viscerale pleura.
- Adskil brystkassen fra brystindholdet. Indsæt en saks i snittet i membranen, og disseker kranielt til livmoderhalsbæltet. Under denne dissektion skal du holde dig tæt på brystbenets dorsale overflade for at undgå skade på organerne nedenfor. Sørg for, at dissektionsplanet er foran luftrøret.
- Skær ribbenene på hver side af brystbenet ved hjælp af en saks, og fjern brystbenet. Sørg for, at brystindholdet er eksponeret.
- Udsæt abdominal spiserøret. Løft forsigtigt maven anteriort ved at holde antrummet med tang. Disseker milten, bugspytkirtlen og mesenteriet fra maven og spiserøret med en saks.
- Udsæt thoraxspiserøret (figur 2).
- Løft forsigtigt luftrøret straks kaudal til skjoldbruskkirtlen, og dissekere spiserøret på den dorsale side af luftrøret ved hjælp af irissaks.
- Opdel luftrøret ved skjoldbruskkirtlen brusk med iris saks.
- Skræl luftrøret af resten af spiserøret via omhyggelig dissektion i kaudale retning.
- Fjern lungen, hjertet og thymus en masse med luftrøret. Pas på at undgå skader på spiserøret, når du dissekerer og deler aorta og vena cava.
- Del maven ved pylorus med en saks.
- Adskil spiserøret fra hvirvlen ved at holde antrummet med tang og dissekere kranielt.
- Opdel spiserøret på niveauet af skjoldbruskkirtlen, og høst spiserøret og maven en masse (figur 3).
- Adskil maven og spiserøret ved at dele spiserøret ved cardia (figur 4, øverste panel, rød linje).
- Dissekere enhver fascia på spiserørets ydre overflade. For at reservere en prøve til histologi (valgfrit) skal du fjerne halvdelen af spiserøret og opdele i længderetningen med en saks. Placer den resterende intakte spiserør i kold PBS på is.
- Åbn maven langs den større krumning, og vask tilstrækkeligt med PBS. Adskil formaven, og vask med kold PBS. Placer formaven i kold PBS på is.
- For at høste tungen skal du fjerne 21 G nålen på næsen og trække tungen ud med pincet. Skær tungen så længe som muligt. Placer tungen i kold PBS på is.
2. Etablering af murine esophageal organoid (MEO) kultur
BEMÆRK: Denne protokol kan også bruges til at etablere en murine tunge organoid kultur med tilføjelse af et trin, hvor tungevævet hakkes før trypsinisering. Se bemærkningen i trin 2.2.3.
- Fremstilling af reagenser
BEMÆRK: En liste over reagenser findes i materialefortegnelsen. Stamopløsningerne fremstilles og opbevares i overensstemmelse med producentens anvisninger, medmindre andet er angivet.- Sørg for, at de alikvoter til engangsbrug af kældermembranmatrixen (BME), der anvendes i denne protokol, opbevares ved -20 °C indtil brugsdagen, efterfølgende optøes på is eller ved 2-8 °C og opbevares på is til enhver tid, når de ikke er i brug.
- Opløs 250 mg sojabønnetrypsinhæmmer (STI) i 1.000 ml PBS (250 mg / ml stamkoncentration), og filtrer steriliser (0,22 μm) det. Hæld 50 ml alikvoter i koniske rør og opbevar i op til 6 måneder ved 4 °C.
- Forbered musens organoidmedium (MOM): Suppler avanceret DMEM / F12 med 1 mM N-acetyl-L-cystein (NAC), 2% R-Spondin og Noggin konditioneret medium (RN CM), 1x N-2 supplement, 1x B-27 supplement, 10 mM HEPES, 1x antibiotika-antimykotisk, 1x GlutaMAX supplement og 100 ng / ml museepidermal vækstfaktor (mEGF). Forbered MOM 500 ml ad gangen, del den i 50 ml alikvoter, og opbevar den ved 2-8 °C, indtil den er klar til brug. Tilsæt 0,5 μg/ml amphotericin B og 10 μM Y-27632 lige før brug.
- Forvarm MOM, 0,25% trypsin og sojabønnetrypsinhæmmer (STI) til 37 °C i et vand- eller perlebad før brug.
- Isolering af keratinocytter fra det dissekerede musevæv (tidsbetragtning: 2 timer)
- Spiserørsvævet overføres til 500 μL dispase i PBS (2,5-5 enheder i alt), og inkuberes i en termomixer i 10 minutter ved 37 °C og 800 omdr./min.
- Overfør vævet til en kulturskål, og fjern forsigtigt muskellaget fra epitelet ved hjælp af tang (figur 4).
BEMÆRK: Dette trin kan også udføres af en erfaren forskerfør inkubation med dispase. - Epitelet overføres til et mikrocentrifugeglas indeholdende 500 μL 0,25% trypsin, og inkuberes i en termomixer i 10 minutter ved 37 °C og 800 omdr./min.
BEMÆRK: Hvis udgangsmaterialet er tungevæv, hakkes vævet med en steril skalpel i mindre stykker, ca. 1-2 mm2 i størrelse, inden trypsinet tilsættes. - Centrifuger kortvarigt i 5-10 s ved 2.000 x g for at pelletere vævet. Forbered et 50 ml konisk rør med en 100 μm cellesi. Vævet/cellesuspensionen overføres gennem sien med en bred borespids ved hjælp af cirkulære bevægelser.
- Tilsæt 3 ml STI gennem silen ved hjælp af cirkulære bevægelser til vask.
- Skrub sien med bunden af et 1 ml tuberkulinsprøjtestempel for at skubbe cellerne igennem.
- Silen vaskes med 3 ml PBS 3-5 gange, og skrubbe silen med bunden af sprøjten mellem vaskerne.
- Centrifuger glasset ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pelletere cellerne.
- Supernatanten fjernes, og der efterlades 1 ml opløsning i glasset.
- Resuspender pellet i de resterende 1 ml, og overfør cellesuspensionen gennem en 70 μm cellesil til et nyt 50 ml konisk rør.
- Centrifuger glasset ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pelletere cellerne.
- Resuspender pellet i 100 μL MOM; Juster lydstyrken efter behov. Udfør en automatiseret celletælling ved udelukkelse af trypanblå.
- Såning af den indledende cellesuspension (tidsbetragtning: <1 time)
- Forvarm en 24-brønds cellekulturplade i en 37 °C inkubator.
- Plade 5.000 levedygtige celler i 75% (v / v) BME / MOM med 50 μL totalvolumen pr. Brønd. Maksimer antallet af udlagte brønde og forbered nok celler i BME til en ekstra brønd i henhold til eksempelberegningerne nedenfor.
BEMÆRK: Kryopræserver eventuelle overskydende celler i kryopræserveringsmediet (10% DMSO i FBS) ved en maksimal koncentration på 1 x 106 celler/ml. Kryoialerne opbevares i en frysebeholder natten over ved -80 °C. Overfør dem til flydende nitrogen med dampfase til langtidsopbevaring. - I et mikrocentrifugerør fremstilles først en passende cellefortynding i MOM, og der tilsættes derefter BME ved hjælp af en bred borespids lige før plettering.
- Brug en 200 μL bred borespids langsomt til at tilføje en 50 μL dråbe til midten af brønden, undgå kontakt mellem spidsen og bunden eller siderne af brønden (figur 5). Pas på ikke at bruge for meget kraft til at udvise væsken fra spidsen, ellers flader kuplen ud.
- Lad BME størkne i 30 minutter i en 37 °C, 5% CO2, 95% relativ luftfugtighed (RH) inkubator.
- Der tilsættes forsigtigt 500 μL MOM pr. brønd suppleret med 0,5 μg/ml amphotericin B og 10 μM Y-27632.
BEMÆRK: Tilføj amphotericin til alle MOM gennem den oprindelige primære kultur. Tilføj kun Y-27632 på dagen for passage (dag 0) for alle passager. - Skift mor på dag 3-4 og derefter hver 2-3 dage efter det, indtil den er klar til passage.
- På dag 7-10 skal du afbilde organoiderne og måle organoiddannelseshastigheden (OFR) ved at dividere antallet af organoider dannet af antallet af celler, der oprindeligt blev podet.
Eksempler på beregninger:
- Passering og kryopræservering af murine esophageal organoider (MEO'er) (tidsovervejelse: <1,5 timer)
- Optø og hold BME på is. Forvarm MOM, 0,05% trypsin og STI til 37 °C i et vand- eller perlebad før brug. Forvarm en 24-brønds cellekulturplade i en 37 °C inkubator.
- Brug en mikropipettespids med bred boring til at samle organoiderne i BME-kuplen sammen med supernatanten. Afbryd BME ved at pipettere op og ned.
BEMÆRK: Kombiner hullerne med identiske prøver i et enkelt mikrocentrifugeglas. - Centrifuger kortvarigt i 10-15 s ved 2.000 x g for at pelletere organoiderne. Supernatanten fjernes og kasseres.
- Løsn forsigtigt pelleten, og resuspender pelleten i 500 μL 0,05% trypsin.
- Sutglasset/glassene inkuberes i en termomixer ved 37 °C og 800 o/min i 10 min.
- Inaktiver trypsin med 600 μL STI.
- Centrifuger glasset ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere cellerne.
- Supernatanten fjernes og kasseres. Resuspender cellepellet i 100 μL MOM. Udfør en automatiseret celletælling ved udelukkelse af trypanblå.
BEMÆRK: Lydstyrken kan justeres efter behov. - Plade 2.000-5.000 levedygtige celler i 75% (v / v) BME / MOM med 50 μL samlet volumen pr. Brønd. Maksimer antallet af udlagte brønde og forbered nok celler i BME til en ekstra brønd i henhold til de tidligere nævnte eksempelberegninger.
BEMÆRK: Kryopræserver eventuelle overskydende celler i kryopræserveringsmediet (10% DMSO i FBS) ved en maksimal koncentration på 1 x 106 celler/ml. Kryoialerne opbevares i en frysebeholder natten over ved -80 °C. Overfør dem til flydende nitrogen med dampfase til langtidsopbevaring. - I et mikrocentrifugerør fremstilles først en passende cellefortynding i MOM, og der tilsættes derefter BME ved hjælp af en bred borespids lige før plettering.
- Brug en 200 μL bred borespids til langsomt at tilføje en 50 μL dråbe til midten af brønden, undgå kontakt mellem spidsen og bunden eller siderne af brønden. Pas på ikke at bruge for meget kraft til at udvise væsken fra spidsen, ellers flader kuplen ud.
- Pladen inkuberes i 30 minutter i en 5 % CO 2,95% RH inkubator på 37 °C.
- Der tilsættes forsigtigt 500 μL MOM pr. brønd suppleret med 10 μM Y-27632.
BEMÆRK: Tilføj kun Y-27632 på dagen for passaging (dag 0). Det er unødvendigt at tilføje det under medieændringerne. Tilføjelse af amphotericin B er ikke længere nødvendigt. - Skift mor på dag 3-4 og derefter hver 2-3 dage efter det, indtil den er klar til passage.
- På dag 7-10 skal du afbilde organoiderne og måle OFR.
- Optøning og genopretning af murine esophageal organoids (MEO'er) (tidsovervejelse: <1 time)
- Optø og hold BME på is. Forvarm en 24-brønds cellekulturplade i en 37 °C inkubator.
- Forbered 10 ml kold eller RT MOM eller PBS i et 15 ml konisk rør.
- Optø en kryovial i et 37 °C vandbad eller perlebad i ca. 30 s til 1 min, eller indtil der er en lille ispille tilbage.
- Med en forvædet pipetspids overføres langsomt cellesuspensionen til røret, der indeholder MOM eller PBS, dråbevis.
- Centrifuger røret i 300 x g og 4 °C i 5 minutter for at pelletere cellerne.
- Supernatanten fjernes og kasseres. Resuspender cellepelleten i 100 μL MOM; Juster lydstyrken efter behov. Udfør en automatiseret celletælling ved udelukkelse af trypanblå.
- Plade 5.000-10.000 levedygtige celler i 75% (v / v) BME / MOM med 50 μL totalvolumen pr. Brønd. Maksimer antallet af brønde, der er belagt, og forbered nok celler i BME til en ekstra brønd i henhold til tidligere nævnte eksempelberegninger.
- Fortsæt med de resterende trin i protokollen for passage og kryopræservering af murine esophageal organoider (MEO) (se trin 2.4.11).
3. Fremstilling af organoider til paraffinindlejring (tidsovervejelse: <1 time [plus 1,5 time til reagenspræparation])
- Brug en bredboret mikropipettespids til at samle tre brønde pr. Mikrocentrifugerør. Organoiderne samles i BME-kuplen sammen med supernatanten. Afbryd BME ved at pipettere op og ned.
- Centrifuger kortvarigt i 10-15 s ved 2.000 x g for at pelletere organoiderne. Supernatanten fjernes og kasseres.
- Pillen løsnes forsigtigt, og pelletsen resuspenderes i 300 μL 4% paraformaldehyd (PFA).
- Organoiderne fastgøres natten over ved 4 °C.
- Centrifuger kortvarigt i 10-15 s ved 2.000 x g for at pelletere organoiderne. Fjern og kassér så meget PFA som muligt.
- Pillen løsnes forsigtigt, og pelletsen resuspenderes i 500 μL PBS.
BEMÆRK: Faste organoider kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger, før de fortsætter til næste trin. - Forbered en 50 ml bestand agargel (2% agar plus 2,5% gelatine).
BEMÆRK: Forbered agargelstammen på forhånd på grund af inkubationstiden efterfulgt af udførelse af autoklavcyklussen.- 1 g Bacto-agar og 1,25 g gelatine opløses i 50 ml vand i et 150 ml autoklaverbart glasbægerglas.
- Hvirvl affjedringen, og lad den sidde i 30-60 min ved RT.
- Autoklave i 20 minutter ved 121 °C.
- Afkøl lidt og fordel 5 ml alikvoter i 15 ml koniske rør.
- Opbevares i op til 6 måneder hos RT.
- Forbered en indlejringsoverflade ved at vende et mikrocentrifugerørstativ og dække overfladen med et ark tætningsfilm. Etiket med de(t) tilsvarende organoid-ID(er).
- Centrifuger røret ved 300 x g i 5 minutter for at pelletere organoiderne. Supernatanten fjernes og kasseres.
- I mellemtiden gøres agargelen flydende ved at anbringe et 15 ml konisk rør indeholdende agargelen i et 150 ml glasbægerglas indeholdende 100 ml vand og mikrobølgeovn ved den højeste effektindstilling i 1-2 minutter, eller indtil vandet begynder at koge, og agargelen er i flydende tilstand.
FORSIGTIG: Løsn hætten på det koniske rør, der indeholder agargelen, inden mikrobølgeovn. - Mikrocentrifugerøret indeholdende organoidpelleten nedsænkes delvist i det varme vand uden at indføre vand i mikrocentrifugerøret.
- Overlejr forsigtigt den organoide pellet ved at tilsætte 50 μL agar ned ad siden af røret.
- Uden at forstyrre pelleten (resuspender ikke, hold pelleten intakt), overfør pellet i agargeldråben til tætningsfilmen på indlejringsoverfladen.
- Gentag trin 3.12 og trin 3.13 med yderligere 50 μL flydende agargel for at opsamle eventuelle resterende organoidpiller, og tilsæt forsigtigt til den samme geldråbe.
- Dråben indeholdende den organoide pellet inkuberes i 45 minutter ved 4 °C.
- Brug tang til forsigtigt at overføre dråben indeholdende organoidpelleten til en mærket patologikassette.
- Opbevar kassetten i 70% ethanol ved 4 °C i op til 1 måned.
- Fortsæt med paraffinindlejring via rutinemæssig histologisk behandling for at forberede paraffinblokke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver processen med at generere murine esophageal organoider (MEO'er) fra normalt spiserørvæv eller ESCC-tumorvæv fra 4NQO-behandlede mus i henhold til et specifikt behandlingsregime bestående af 16 ugers 4NQO administreret i drikkevand efterfulgt af en observationsperiode på 10 uger til 12 uger (figur 1). Musene aflives derefter til dissektion af tungen eller spiserørvævet (figur 2 og figur 3). Vi beskriver en metode til isolering af epitellaget, fra det intakte spiserør (figur 4), der skal anvendes til efterfølgende enkeltcelleisolering. Esophagus-afledte epitelceller er oprindeligt belagt med 5.000 celler pr. Brønd i 50 μL dråber indeholdende celler i en kældermembranmatrix og velkarakteriseret serumfrit cellekulturmedium (figur 5) og får lov til at danne organoider i løbet af 7-10 dage i gennemsnit. Murine spiserør, tunge og formaveorganoider kan yderligere karakteriseres ved morfologisk analyse ved fasekontrast / brightfield billeddannelse og histopatologi (figur 6). Organoidernes selvfornyelseskapacitet kan vurderes ved at bestemme OFR ved subkultur (figur 7). OFR påvirkes i høj grad af indholdet af de proliferative basaloidceller, som det fremgår af vækstkinetikanalysen kombineret med deres morfologi (figur 8). Endelig vokser disse organoider, herunder normale strukturer fra 4NQO-ubehandlede mus, kontinuerligt og kan opretholdes i lang tid (figur 9).
Figur 1: 4NQO behandlingsregimen. Musene behandles med 4NQO i drikkevand i 16 uger efterfulgt af en observationsperiode på 10 uger til 12 uger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksponering af thoraxspiserøret. Luftrøret (blå linjer) skrælles væk fra spiserøret (hvide linjer). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Spiserør (hvide linjer) forbundet med maven (gule linjer) ved pladesøjlekrydset (blå linje). Forkortelser: FS = formave, DS = distal mave, L = lever. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Adskillelse af mavesækken og spiserøret og isolering af epitelet. Øvre: Maven er adskilt fra spiserøret. Den røde linje angiver, hvor spiserøret skal løsnes under dissektion. Midten: Epitelet (hvid linje) skrælles væk fra muskellaget. Nedre: De spiserørsbærende tumorer efter behandlingsplanen beskrevet i figur 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Plating af BME-dråben indeholdende enkeltceller ved hjælp af en bred borespids. Organoiderne begynder at danne sig omkring dag 4-7 og er klar til at blive passeret efter 7-10 dage i gennemsnit. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Karakterisering af organoiderne ved morfologisk analyse. A) Repræsentative billeder af normale markedsøkonomiske aktører og ESCC's markedsøkonomiske operatører. Øverst til venstre: Brightfield-billede af en normal MEO. Nederst til venstre: H&E-farvning af en normal MEO. Øverst til højre: Brightfield-billede af en ESCC MEO fra en 4NQO-behandlet mus. Nederst til højre: H&E-farvning af en ESCC MEO fra en 4NQO-behandlet mus, der viser nuklear atypi og abrupt keratinisering, sidstnævnte minder om en keratinperle, der repræsenterer et veldifferentieret rum i en SCC-tumor. (B) Repræsentative billeder af normale organoider i musetungen og formaven (henholdsvis MTO og MFO). Øverst til venstre: Brightfield-billede af en normal MTO. Nederst til venstre: H&E-farvning af en normal MTO. Øverst til højre: Brightfield-billede af en normal MFO. Nederst til højre: H&E-farvning af en normal MFO. Alle skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Bestemmelse af organoidfornyelseskapacitet. (A) Eksperimentelt design til bestemmelse af organoidfornyelseskapaciteten efter subkultur. De voksende primære organoider (P0) dissocieres på forskellige tidspunkter og gøres til enkeltcellesuspensioner. Disse celler passeres for at bestemme OFR på dag 7 i subkulturen (P1). B) Repræsentative OFR-data fra overførte markedsøkonomiske oplysninger genereret fra 4NQO-ubehandlede mus. Bemærk, at OFR falder som funktion af tiden, hvilket afspejler nedsatte proliferative basaloidceller i de modne organoider, som indeholder flere celler, der har gennemgået postmitotisk terminal differentiering (se figur 8). p < 0,001 (n = 6) OFR på dag 7, dag 11 og dag 21 versus OFR på dag 4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Organoiders vækstkinetik som afsløret ved deres morfologi på forskellige tidspunkter. Der vises repræsentative lysfelt- og H&E-farvningsbilleder af en normal MEO fra 4NQO-ubehandlede mus. Bemærk, at keratiniseringen af organoidernes indre kerne bliver fremtrædende ved dag 10. De proliferative basaloidceller forbliver i det yderste cellelag, selv på dag 14 og dag 21 tidspunkter. For immunhistokemi / immunofluorescens kan akkumuleret keratin forårsage ikke-specifik farvning, som det er tilfældet for originalt pladeepitelvæv, hvilket berettiger en omhyggelig optimering af farvningsbetingelserne, kontroller (f.eks. Kun sekundært antistof) og datafortolkning. Alle skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: En populationsfordoblingskurve for en repræsentativ normal MTO genereret fra 4NQO-ubehandlede mus. Disse organoider blev tidligere genereret, kryopræserveret og optøet for at demonstrere deres stabile vækst over flere passager og langvarig kultur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin og overvejelser i forbindelse med generering og analyse af markedsøkonomiske aktører i de protokoller, der er beskrevet her. For at sikre reproducerbarhed og stringens i MEO-eksperimenter er både biologiske og tekniske replikater vigtige. For biologiske replikater er to til tre uafhængige mus med ESCC generelt tilstrækkelige pr. eksperimentel tilstand. Det passende antal biologiske replikater kan dog variere afhængigt af de parametre, der skal testes i individuelle undersøgelser. For eksempel er det i øjeblikket ukendt, hvor tidligt og hvor ofte neoplastiske organoider kan påvises fra 4NQO-behandlede mus uden makroskopisk synlige læsioner eller histologiske IEN og ESCC læsioner. Selvom 4NQO inducerer esophageal læsioner i forskellige musestammer14, er MEO'er kun genereret fra C57BL/6 mus. Udviklingen og progressionen af ESCC accelereres hos mus med genetisk manipulerede genetiske læsioner såsom Trp53-tab og cyclin D1-overekspression 7,14,15. I sådanne mus kan neoplastiske MEO'er dukke op hyppigere og tidligere end hos vildtype C57BL/6-mus under eller efter 4NQO-behandling. Om nødvendigt bør der udføres pilotundersøgelser for at anslå den passende stikprøvestørrelse af mus i planlagte forsøg. Med multi-well cellekulturplader oprettes tekniske replikater (n = 3-6) let. Imidlertid er omhyggelig pipettering og praksis berettiget for at minimere brønd-til-brønd-variabilitet, da cellerne dispenseres i et tyktflydende medium indeholdende BME.
Der kan forventes en succesrate på næsten 100 % for etablering af markedsøkonomiske aktører i de beskrevne protokoller. Imidlertid afhænger vellykket MEO-kultur af levedygtigheden af de indledende isolerede esophageal epitelceller, som i vid udstrækning er relateret til udgangsmaterialets kvalitet. Når musene ikke umiddelbart kan dissekeres ved eutanasi, kan kadaverne opbevares ved 4 °C natten over for at isolere spiserøret den følgende dag. Slagtekroppene bør dog ikke fryses, da frosset væv ikke giver levedygtige celler. De dissocierede esophageal epitelceller kan kryopræserveres som en enkeltcellesuspension i et frysemedium (90% FBS og 10% DMSO) og opbevares i flydende nitrogen for at generere organoider på et senere tidspunkt. Spiserøret (epitelark) kan kryopræserveres på en lignende måde, omend mindre optimalt. Mens MEO'er kan initieres med celler renset ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og andre metoder til at rense unikke undergrupper af esophageal epitelceller, kan cellelevedygtigheden mindskes efter oprensning. Det skal bemærkes, at cellelevedygtighedsassays såsom trypanblå udelukkelsestest kan skelne levende celler fra døde celler, men ikke døende celler, og dermed undervurdere cellelevedygtigheden før organoidkulturinitiering. Efter etablering kan MEO'er fra både 4NQO-behandlede og ubehandlede mus passeres på ubestemt tid (>20 passager), med >80% levedygtighed forventet ved hver passage i det angivne medium. Det er bemærkelsesværdigt, at der er organoide mediumkomponenter, hvis krav forbliver uklare. Zheng et al. demonstrerede for nylig, at et supplement bestående af Wnt3A, RSpondin-1 og Noggin er påkrævet for at dyrke murine esophageal organoider16. Vi bruger dog ikke Wnt3A i denne protokol, da organoider fra tungen, spiserøret og formaven vokser og kan passeres flere gange (>10 passager) uden det 7,3,17. Det skal bemærkes, at kravene til disse faktorer ikke er blevet testet individuelt.
Epitelplader bruges til at generere MEO'er fra den normale spiserør eller spiserørslimhinden uden makroskopisk synlige læsioner såsom tumorer. Anvendelsen af epitelplader tillader berigelse af epitelceller som udgangsmateriale. Imidlertid er isoleringen af epitelarkene fra den tumorbærende esophageal slimhinde vanskelig på grund af ESCC invasion i subepitelrummene. Hele spiserøret kan bruges til at indlede MEO-kultur, selvom tilstedeværelsen af ikke-epitelcellepopulationer kan reducere organoiddannelseshastigheden (OFR) i den oprindelige kultur. OFR forventes at stige i de efterfølgende passager, da de nuværende MEO-dyrkningsbetingelser tillader epitelceller at vokse inden for BME. Bemærk, at protokollerne beskrevet her også kan anvendes på andre organer, især mundtungen og formaven, som begge er modtagelige for 4NQO-induceret pladecellecarcinogenese. Det skal bemærkes, at vi har genereret musetungeorganoider (MTO'er) og museformaveorganoider (MFO'er) fra hele vævene uden at isolere epitelcellerne. Om nødvendigt kan disse organoider fremstilles af en underpopulation af epitelceller oprenset ved fluorescensaktiveret cellesortering (f.eks. Kræftstamceller karakteriseret ved høj CD44-ekspression, CD73+ formodede esophageal stamceller).
Derudover kan ikke-epitelceller, især fibroblaster, migrere ud af BME for at vokse i et monolag på plastoverfladen, hvilket muliggør samtidig etablering af murine esophageal fibroblaster, herunder kræftassocierede fibroblaster. Selektiviteten for epitelcellevækst i 3D BME kan begrænse samdyrkning af MEO'er med immunceller og andre celletyper under de nuværende betingelser, der er beskrevet her. Optimering til samkultureksperimenter er i gang. Derudover kan den tumorinvasive front bedre rekapituleres i epitel-stromal-grænsefladen modelleret ved alternative 3D-kulturmetoder såsom organotypisk 3D-kultur 8,18. Desuden er MEO'er muligvis ikke en egnet platform til måling af epitelbarrierefunktionen, som bedre kan evalueres ved at anvende luft-væske-grænsefladekultur til at vurdere den transepitelielle elektriske modstand 19,20,21.
Den største fordel ved MEO'er, og faktisk MTO'er og MFO'er, er den hurtige vækst af enkeltcelleafledte strukturer, der rekapitulerer de oprindelige epitelstrukturer, både godartede og ondartede. Fordoblingstiden (DT) for disse organoider anslås typisk til at være <20 timer. Vækstkinetikken for normale MTO'er fra 4NQO-ubehandlede mus illustrerer både evnen til langsigtet dyrkning af normale organoider såvel som det forventede populationsfordobling (PD) niveau og DT (figur 9). I dette eksempel forekom der ca. 10 populationsfordoblinger under hver passage med en beregnet DT på 18,5 timer og 18,3 timer i gennemsnit. Efter den indledende primære kultur forventes typisk en OFR på 15%-25%, uanset såtæthed, og MEO'er kan dukke op allerede på dag 4 (figur 8), selvom de kan være mindre i størrelse. Under fasekontrastmikroskopi viser organoider fra den normale esophageal slimhinde sfæriske strukturer med glatte overflader. Som en funktion af tiden viser normale organoider en koncentrisk struktur, da den indre cellemasse gennemgår postmitotisk terminal differentiering, hvilket genererer en differentieringsgradient, der efterligner det lagdelte pladeepitel. Neoplastiske organoider viser uregelmæssige overflader, hvilket afspejler basaloidcellernes høje proliferative aktivitet, som kan ekspandere udad. MEO'ernes evne til at vise en proliferation-differentieringsgradient kan bruges til at undersøge, hvordan proliferative esophageal basale keratinocytter kan formere sig og gennemgå postmitotisk terminal differentiering. Ved subkulturation af dissocierede MEO-celler kan man evaluere epitelcelle selvfornyelse (figur 7) såvel som regenerering eller transformation under genotoksisk stress induceret af 4NQO. Lignende undersøgelser kan også udføres ved hjælp af MTO-modellen i forbindelse med oral cancer, hvilket udvider anvendelsen af den beskrevne 4NQO museorganoidmodel til hoved og hals SCC. Mens epitelfornyelse kan indebære stamceller, er en potentiel svaghed ved MEO-systemet, at det muligvis ikke detekterer hvilende eller sjældent deler stamceller, da MEO-dannelse afhænger af celleproliferation. En nylig enkeltcelleanalyseundersøgelse af MEO'er gav betydelig indsigt i esophageal epitelcelleheterogenitet22.
Ondartet transformation kan vurderes ved omhyggelig morfologisk vurdering af individuelle MEO-strukturer og den nukleare atypi af celler, der omfatter MEO'er. Den molekylære profilering af MEO'er ved hel-eksom-sekventering og RNA-sekventering kan afsløre den særlige karakter af præneoplastiske og ESCC-læsioner. Den ultimative test for ondartet transformation kan dog kræve transplantation af MEO'er i enten immundefekte eller immunkompetente mus for at dokumentere ESCC-cellernes tumorigenicitet. ESCC MEO'er transplanteret i syngeneiske immunkompetente mus kan også give en fremragende platform til at undersøge tumorimmunmikromiljøet.
Anvendelsesområderne for de markedsøkonomiske aktører er brede. Udover morfologi, biokemi og multi-omics tilgange kan flowcytometri ikke kun bruges til at analysere cellulære processer såsom DNA-syntese, apoptose, autofagi og mitokondriel respiration, men også celleoverflademarkører, der definerer unikke delmængder af celler inden for MEO'er svarende til genetiske og farmakologiske modifikationer ex vivo 7,23 . Desuden kan organoider anvendes til co-kultureksperimenter for at evaluere interaktionerne mellem epitelcellerne og stroma, immuncellerne eller endda mikrobiomet24. Endelig kan MEO'er genereres fra mus, der bærer celleafstamningssporbare genetiske modifikationer, såsom fluorescerende reporterprotein udtrykt under en celletypespecifik genregulerende promotor (f.eks. Sox2, cytokeratiner Krt5 og Krt15)3,4,7,25.
Sammenfattende er markedsøkonomiske aktører et uvurderligt redskab til undersøgelse af ESCC. De her beskrevne protokoller har til formål at vise, at MEO'er repræsenterer en alsidig model, der er relativt let at generere, vedligeholde og karakterisere og har evnen til at rekapitulere funktionerne i ESCC og esophageal neoplasi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker de delte ressourcer (flowcytometri, molekylær patologi og konfokal og specialiseret mikroskopi) på Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University for teknisk support. Vi takker Dr. Alan Diehl, Adam J. Bass og Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mekanismer for esophageal carcinogenese) og medlemmer af Rustgi og Nakagawa laboratorier for nyttige diskussioner. Denne undersøgelse blev støttet af følgende NIH-tilskud: P01CA098101 (H.N. og A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. og H.N.) og P30CA013696 (A.K.R.). H.N. og CL er modtagere af Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. er modtager af Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. er modtager af The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) og en American Association for Cancer Research Award. J.G. er modtager af American Gastroenterological Association (AGA) prisen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B.
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
