Summary
Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Erzeugung und Charakterisierung von murinen oral-ösophagealen 3D-Organoiden, die normale, präneoplastische und Plattenepithelkarzinomläsionen darstellen, die durch chemische Karzinogenese induziert werden.
Abstract
Das Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre (ESCC) ist weltweit weit verbreitet und macht jedes Jahr 90 % aller Fälle von Speiseröhrenkrebs aus und ist das tödlichste aller menschlichen Plattenepithelkarzinome. Trotz jüngster Fortschritte bei der Definition der molekularen Veränderungen, die mit der Initiierung und Entwicklung von ESCC einhergehen, bleibt die Prognose der Patienten schlecht. Die funktionelle Annotation dieser molekularen Veränderungen ist der notwendige nächste Schritt und erfordert Modelle, die sowohl die molekularen Eigenschaften von ESCC erfassen als auch leicht und kostengünstig für die funktionelle Annotation manipuliert werden können. Mäuse, die mit dem Tabakrauchmimetikum 4-Nitrochinolin-1-oxid (4NQO) behandelt wurden, bilden vorhersagbar ESCC und ösophageale Präneoplasien. Bemerkenswert ist, dass 4NQO-Läsionen auch in der Mundhöhle auftreten, am häufigsten in der Zunge, sowie im Vormagen, die alle das geschichtete Plattenepithel teilen. Diese Mäuse können jedoch nicht einfach für funktionale Hypothesentests manipuliert werden, da die Erstellung isogener Mausmodelle zeit- und ressourcenintensiv ist. In dieser Arbeit überwinden wir diese Einschränkung, indem wir aus Einzelzellen abgeleitete dreidimensionale (3D) Organoide von Mäusen erzeugen, die mit 4NQO behandelt wurden, um murine ESCC oder präneoplastische Zellen ex vivo zu charakterisieren. Diese Organoide erfassen die hervorstechenden Merkmale von ESCC und ösophagealer Präneoplasie, können kostengünstig und schnell zur Bildung isogener Modelle genutzt und für syngene Transplantationsexperimente verwendet werden. Wir zeigen, wie man 3D-Organoide aus normalem, präneoplastischem und SCC-murinem Ösophagusgewebe erzeugt und diese Organoide erhält und kryokonserviert. Die Anwendungen dieser vielseitigen Organoide sind breit gefächert und umfassen die Verwendung von gentechnisch veränderten Mäusen und die weitere Charakterisierung durch Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie, die Erzeugung isogener Organoidlinien unter Verwendung von CRISPR-Technologien sowie das Wirkstoffscreening oder die syngene Transplantation. Wir glauben, dass die weit verbreitete Übernahme der in diesem Protokoll demonstrierten Techniken die Fortschritte in diesem Bereich beschleunigen wird, um die schwere Belastung durch ESCC zu bekämpfen.
Introduction
Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) ist aufgrund seiner späten Diagnose, Therapieresistenz und Metastasierung das tödlichste Plattenepithelkarzinom des Menschen 1,2. ESCC entsteht aus dem geschichteten Plattenepithel, das die luminale Oberfläche der Speiseröhre auskleidet. Das Plattenepithel besteht aus proliferativen Basalzellen und differenzierten Zellen innerhalb der suprabasalen Zellschicht. Unter physiologischen Bedingungen exprimieren Basalzellen Marker wie p63, Sox2 und Zytokeratin K5 und K14, während differenzierte Zellen K4, K13 und IVL exprimieren. Basalzellen selbst sind heterogen und umfassen mutmaßliche Stammzellen, die durch Marker wie K153 und CD734 definiert sind. Bei der Homöostase durchlaufen Basalzellen eine postmitotische terminale Differenzierung innerhalb der suprabasalen Zellschicht, während differenzierte Zellen in das Lumen wandern und abschuppen, um die Epithelerneuerung abzuschließen. ESCC erinnert an ihre Ursprungszellen und zeigt in unterschiedlichem Ausmaß eine Plattenepithelzelldifferenzierung. Das ESCC wird häufig von multifokalen histologischen Vorläuferläsionen begleitet, die als intraepitheliale Neoplasien (IEN) oder Dysplasien bezeichnet werden und aus atypischen basaloiden Zellen bestehen. Zusätzlich zu den epithelialen Veränderungen zeigt das ESCC einen Gewebeumbau innerhalb des subepithelialen Kompartiments, wo die Aktivierung von krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs) und die Rekrutierung von Immun-/Entzündungszellen stattfinden, um die tumorfördernde Mikroumgebung zu fördern.
Die Pathogenese der ESCC beinhaltet genetische Veränderungen und die Exposition gegenüber umweltbedingten Risikofaktoren. Zu den wichtigsten genetischen Läsionen gehören die Inaktivierung der Tumorsuppressorgene TP53 und CDKN2A (p16INK4A) sowie die Aktivierung der Onkogene CCND1 (Cyclin D1) und EGFR, die in einer beeinträchtigten Funktion des Zellzyklus-Checkpoints, einer aberranten Proliferation und einem Überleben unter genotoxischem Stress im Zusammenhang mit der Exposition gegenüber Umweltkarzinogenen gipfeln. In der Tat stehen genetische Veränderungen in engem Zusammenhang mit Verhaltens- und Umweltrisikofaktoren, am häufigsten Tabak- und Alkoholkonsum. Tabakrauch enthält für den Menschen krebserregende Stoffe wie Acetaldehyd, das auch der Hauptmetabolit von Alkohol ist. Acetaldehyd induziert DNA-Addukte und Interstrang-DNA-Quervernetzungen, was zu DNA-Schäden und der Anhäufung von DNA-Mutationen und chromosomaler Instabilität führt. Angesichts übermäßiger mitogener Stimuli und abweichender Proliferation durch Onkogenaktivierung wird die maligne Transformation von Ösophagusepithelzellen durch Mechanismen zur Bewältigung von genotoxischem Stress erleichtert, einschließlich der Aktivierung von Antioxidantien, Autophagie und epithelial-mesenchymaler Transition (EMT). Interessanterweise werden diese zytoprotektiven Funktionen häufig in ESCC-Krebsstammzellen (CSCs) aktiviert, die sich durch eine hohe CD44 (CD44H)-Expression auszeichnen und die Fähigkeiten zur Tumorinitiierung, -invasion, -metastasierung und -resistenz aufweisen 5,6,7.
ESCC wurde in Zellkultur- und Nagetiermodellenmodelliert 8,9. In den letzten drei Jahrzehnten wurden robuste gentechnisch veränderte Mausmodelle von ESCC entwickelt. Dazu gehören die transgenen CCND1- und EGFR-Mäuse 10,11 sowie die p53- und p120-Ctn-Knockout-Mäuse 12,13. Einzelne genetische Veränderungen führen jedoch in der Regel nicht zu einem rasch einsetzenden ESCC. Diese Herausforderung wurde durch den Einsatz von Ösophaguskarzinogenen überwunden, die die humanen genetischen Läsionen in ESCC14 gut rekapitulieren. Zum Beispiel beschleunigt 4-Nitrochinolin-1-oxid (4NQO) die ESCC-Entwicklung in CCND1-transgenen Mäusen15. In den letzten Jahren wurden mutmaßliche ösophageale Epithelstammzellen, Vorläuferzellen und ihr jeweiliges Schicksal in zelllinienrückverfolgbaren Mausmodellen untersucht 3,4. Darüber hinaus wurden diese Mäuse, die die Zelllinie zurückverfolgen können, verwendet, um die Ursprungszellen von ESCC zu erforschen und zu untersuchen, wie solche Zellen CD44H-CSCs durch konventionelle Histologie und Omics-basierte molekulare Charakterisierung hervorbringen7.
Ein aufstrebendes Gebiet im Zusammenhang mit diesen Mausmodellen ist die neuartige Anwendung von Zellkulturtechniken zur Analyse lebender ESCC- und Vorläuferzellen in einem dreidimensionalen (3D) Organoidsystem, in dem die Architektur des ursprünglichen Gewebes ex vivo rekapituliert wird 7,8,9. Diese 3D-Organoide werden schnell aus einer einzelligen Suspension gezüchtet, die aus murinem Gewebe isoliert wird, einschließlich primärer und metastasierender Tumoren (z. B. Lymphknoten-, Lungen- und Leberläsionen). Die Zellen werden in Basalmembranextrakt (BME) eingebettet und mit einem genau definierten serumfreien Zellkulturmedium gefüttert. Die 3D-Organoide wachsen innerhalb von 7-10 Tagen, und die resultierenden kugelförmigen Strukturen eignen sich für Subkulturen, Kryokonservierung und Assays zur Analyse einer Vielzahl von zellulären Eigenschaften und Funktionen, einschließlich CSC-Markern, EMT, Autophagie, Proliferation, Differenzierung und apoptotischem Zelltod.
Diese Methoden können breit auf 3D-Organoidkulturen angewendet werden, die aus jedem geschichteten Plattenepithelgewebe wie der Kopf- und Halsschleimhaut (Mundhöhle, Zunge, Rachen und Kehlkopf) und sogar dem Vormagen hergestellt werden. Die Kopf- und Halsschleimhaut grenzt an die Speiseröhre, und die beiden Gewebe haben eine ähnliche Gewebeorganisation, Funktion und Anfälligkeit für Krankheiten. Sowohl das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) als auch das ESCC teilen genetische Läsionen und lebensstilbedingte Umweltrisikofaktoren wie Tabak- und Alkoholexposition. Um diese Ähnlichkeit zu unterstreichen, entwickeln Mäuse, die mit dem Tabakrauchmimetikum 4NQO behandelt wurden, sowohl HNSCC als auch ESCC. Aufgrund der Leichtigkeit, mit der die unten beschriebenen Protokolle auf die Modellierung von HNSCC angewendet werden können, enthalten wir spezifische Anweisungen für die Etablierung von 3D-Organoidkulturen aus diesen Läsionen.
In dieser Arbeit stellen wir detaillierte Protokolle zur Erzeugung von murinen ösophagealen 3D-Organoiden (MEOs) zur Verfügung, die normale, präneoplastische und ESCC-Läsionen repräsentieren, die sich bei Mäusen entwickeln, die mit 4NQO behandelt wurden. Es können verschiedene Mausstämme verwendet werden, darunter gängige Laborstämme wie C57BL/6 und Zelllinien-rückverfolgbare und andere gentechnisch veränderte Derivate. Wir betonen die wichtigsten Schritte, einschließlich der Isolierung von normalem oder erkranktem murinem Ösophagusepithel, der Herstellung von Einzelzellsuspensionen, der Kultivierung und Überwachung der wachsenden 3D-Organoide, der Subkultur, der Kryokonservierung und der Verarbeitung für nachfolgende Analysen, einschließlich Morphologie und anderer Anwendungen.
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Protocol
Die Mausexperimente wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und unter den #AABB1502 des Tierprotokolls geplant und durchgeführt, vom Institutional Animal Care and Use Committee der Columbia University geprüft und genehmigt. Die Mäuse wurden in einer geeigneten Tierpflegeeinrichtung untergebracht, die eine humane Behandlung der Mäuse gewährleistet und eine angemessene tierärztliche Versorgung der Mäuse sowie eine Laborsicherheitsschulung für das Laborpersonal gewährleistet.
1. Behandlung von Mäusen mit 4NQO zur Induktion ösophagealer IEN- und ESCC-Läsionen (Zeitbetrachtung: bis zu 28 Wochen)
HINWEIS: Um MEOs zu erzeugen, die neoplastische Ösophagusläsionen repräsentieren, werden die Mäuse einer 4NQO-vermittelten chemischen Karzinogenese unterzogen, wie sie zuvor von Tang et al.14 beschrieben wurde. Normale/nicht-neoplastische MEOs werden aus unbehandelten Mäusen erzeugt.
- Mäuse
- Unterbringen Sie vier bis fünf Mäuse pro Käfig und gewöhnen Sie sie mindestens 1 Woche lang an die Tieranlage, bevor Sie mit einem Experiment beginnen. Um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass altersbedingte Störungen zu einem vorzeitigen Abbruch des gesamten 28-wöchigen Experiments führen, beginnen Sie mit 8 bis 16 Wochen alten Mäusen.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 20-30 g verwendet. Für kürzere Experimente können ältere Mäuse verwendet werden. Männliche oder weibliche Mäuse sind akzeptabel. Kontrollmäuse (keine Behandlung, siehe Abschnitt 1.3.1) müssen in Alter und Geschlecht übereinstimmen.
- Unterbringen Sie vier bis fünf Mäuse pro Käfig und gewöhnen Sie sie mindestens 1 Woche lang an die Tieranlage, bevor Sie mit einem Experiment beginnen. Um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass altersbedingte Störungen zu einem vorzeitigen Abbruch des gesamten 28-wöchigen Experiments führen, beginnen Sie mit 8 bis 16 Wochen alten Mäusen.
- Aufbereitung von 4NQO-haltigem Trinkwasser
- 1 mg/ml 4NQO-Stammlösung in Ethylen-Propylenglykol herstellen (Materialtabelle). Lösen Sie 100 mg 4NQO in 100 ml 99,9%igem Ethylenpropylenglykol in einem 500-ml-Glasbecher auf, der mit einer Siegelfolie bedeckt ist. Bei Raumtemperatur (RT) mit einem Magnetrührer bei 800 U/min 30 Minuten lang gründlich mischen. Bei 4 °C lagern.
- 900 ml autoklaviertes deionisiertes Wasser zu 100 ml 1 mg/ml 4NQO-Stammlösung geben und durch Umkehrung in einem mit Dichtungsfolie bedeckten 2-Liter-Kunststoff-Messzylinder mischen. Ein Volumen von 1 l mit 100 μg/ml 4NQO in 10 % Ethylen-Propylenglykol reicht für zwei Mauskäfige, die mit einer 500-ml-Trinkflasche ausgestattet sind.
ACHTUNG: Beachten Sie, dass 4NQO ein synthetisches chemisches Karzinogen ist, das Krebs verursachen kann. Tragen Sie Nitrilhandschuhe und einen langärmeligen Laborkittel und tragen Sie geschlossene Schuhe. Achten Sie auf den richtigen Augenschutz, Gesichtsschutz und Kopfbedeckung. Für die Abfallentsorgung sollte 4NQO in einem gekennzeichneten Behälter in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Bewirtschaftung gefährlicher Abfälle im Hinblick auf Umweltgesundheit und -sicherheit aufbewahrt werden.
- Behandlung mit 4NQO und Überwachung
- Setzen Sie die Trinkflasche auf und verabreichen Sie den Mäusen 16 Wochen lang ad libitum 4NQO über das Trinkwasser. Verwenden Sie 10 % (w/v) Propylenglykol als Vehikelkontrolle (keine Behandlung).
HINWEIS: Eine kürzere Dauer der 4NQO-Behandlung kann zur Induktion einer IEN verwendet werden. - Füllen Sie das Wasser einmal pro Woche nach.
- Wiegen Sie jede Maus wöchentlich, indem Sie sie in einen Plastikbehälter auf eine Laborwaage legen.
- Beginnen Sie am Ende der 16-wöchigen 4NQO-Behandlungsphase damit, den Mäusen während der Beobachtungsphase nach 4NQO bis zu 12 Wochen lang regelmäßig Trinkwasser zu geben (Abbildung 1).
- Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Anzeichen von Stress (z. B. eingeschränkte Mobilität, gekrümmter Habitus und zurückgezogenes Verhalten), Dysphagie und Dehydrierung. Untersuchen Sie die Mäuse zusätzlich wöchentlich auf Veränderungen des Körpergewichts oder der Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme. Sollte das Körpergewicht um mehr als 10 % gegenüber dem ursprünglichen Körpergewicht sinken, füttern Sie die Mäuse mit einem flüssigen Nahrungsergänzungsmittel.
HINWEIS: Ein Verlust des Körpergewichts, der auf flüssige Nahrungsergänzungsmittel refraktär ist, kann auf ESCC hindeuten, und Mäuse, die mehr als 20% ihres Körpergewichts verlieren, sollten eingeschläfert werden. Wichtig ist, dass MEOs aus vorzeitig eingeschläferten Mäusen erzeugt werden können. Es ist zu beachten, dass C57BL/6-Mäuse ohne genetische Modifikationen in der Regel bis zum Ende des Beobachtungszeitraums nach 4NQO keine Anzeichen von Morbidität zeigen oder sichtbare ESCC-Läsionen aufweisen.
- Setzen Sie die Trinkflasche auf und verabreichen Sie den Mäusen 16 Wochen lang ad libitum 4NQO über das Trinkwasser. Verwenden Sie 10 % (w/v) Propylenglykol als Vehikelkontrolle (keine Behandlung).
- Tiervorbereitung
- Euthanasieren Sie die Mäuse in einer CO 2 -Kammer, die mit CO2 gefüllt ist, mit einer Flussrate, die 30 % bis 70 % des Kammervolumens pro Minute verdrängt. Bestätigen Sie den Tod durch Zervixluxation.
- Stecken Sie die Gliedmaßen und die Nase der Maus in Rückenlage mit 21 G-Nadeln an die Präparierplattform.
- Desinfizieren Sie die ventrale Oberfläche der Maus mit 70%igem Ethanol.
- Präparation (Zeitbetrachtung: 0,5 h)
- Öffne die Haut, indem du das Fell und die Haut in der Mitte des Bauches kneifst, um sicherzustellen, dass sie sich von den darunter liegenden Eingeweiden löst. Verwenden Sie die chirurgische Schere, um einen kraniokaudalen, ventralen Mittellinienschnitt vom Unterbauch bis zum Kinn zu machen.
- Beginnen Sie an der Mittellinie, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um radiale Schnitte zu machen, die sich bis zu den Gliedmaßen auf beiden Seiten der Maus erstrecken. Die Hautlappen öffnen sich.
- Um die zervikale Luftröhre freizulegen, teilen Sie mit der Präparierschere die Speicheldrüsen an der Mittellinie. Die Luftröhre liegt tief in den Drüsen.
- Um die thorakale Luftröhre freizulegen, entfernen Sie das Brustbein.
- Kneifen und heben Sie das Bauchfell vorsichtig mit einer Pinzette an und teilen Sie das Bauchfell mit einer Schere kraniokaudal und seitlich entlang des Brustkorbs.
- Ziehen Sie die Leber vorsichtig von der kaudalen Oberfläche des Zwerchfells zurück und machen Sie mit einer Schere einen kleinen Einschnitt in das Zwerchfell an der sternalen Kerbe, insbesondere an der dorsalen Oberfläche des Xipoidfortsatzes. Dadurch werden Lunge und Herz aus dem viszeralen Rippenfell befreit.
- Trennen Sie den Brustkorb vom Thoraxinhalt. Führen Sie eine Schere in den Einschnitt im Zwerchfell ein und präparieren Sie kranial bis zum Halsgürtel. Halten Sie sich während dieser Präparation eng an die dorsale Oberfläche des Brustbeins, um Schäden an den darunter liegenden Organen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Dissektionsebene vor der Luftröhre liegt.
- Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten des Brustbeins mit einer Schere ab und entfernen Sie das Brustbein. Stellen Sie sicher, dass der Thoraxinhalt freigelegt ist.
- Legen Sie die abdominale Speiseröhre frei. Heben Sie den Bauch sanft nach vorne an, indem Sie das Antrum mit einer Pinzette festhalten. Präparieren Sie die Milz, die Bauchspeicheldrüse und das Mesenterium von Magen und Speiseröhre mit einer Schere.
- Legen Sie die thorakale Speiseröhre frei (Abbildung 2).
- Heben Sie die Luftröhre unmittelbar kaudal zum Schilddrüsenknorpel sanft an und präparieren Sie die Speiseröhre der dorsalen Seite der Luftröhre mit einer Irisschere.
- Durchtrennen Sie die Luftröhre am Schilddrüsenknorpel mit einer Irisschere.
- Schälen Sie die Luftröhre durch vorsichtige Präparation in kaudaler Richtung vom Rest der Speiseröhre ab.
- Entfernen Sie Lunge, Herz und Thymusdrüse en masse mit der Luftröhre. Achten Sie darauf, dass die Speiseröhre nicht beschädigt wird, wenn Sie die Aorta und die Hohlvene präparieren und teilen.
- Den Magen am Pylorus mit einer Schere teilen.
- Trennen Sie die Speiseröhre vom Wirbel, indem Sie das Antrum mit einer Pinzette festhalten und kranial präparieren.
- Teilen Sie die Speiseröhre auf Höhe des Schilddrüsenknorpels und entnehmen Sie die Speiseröhre und den Magen en masse (Abbildung 3).
- Trennen Sie Magen und Speiseröhre, indem Sie die Speiseröhre an der Kardia teilen (Abbildung 4, oberes Bild, rote Linie).
- Präparieren Sie alle Faszien an der Außenseite der Speiseröhre. Um eine Probe für die Histologie (optional) zu reservieren, entfernen Sie die Hälfte der Speiseröhre und spalten Sie sie in Längsrichtung mit einer Schere. Legen Sie die verbleibende intakte Speiseröhre in kaltes PBS auf Eis.
- Öffnen Sie den Magen entlang der größeren Krümmung und waschen Sie ihn ausreichend mit PBS. Trennen Sie den Vormagen und waschen Sie ihn mit kaltem PBS. Legen Sie den Vorbauch in kaltes PBS auf Eis.
- Um die Zunge zu ernten, entfernen Sie die 21-G-Nadel an der Nase und ziehen Sie die Zunge mit einer Pinzette heraus. Schneiden Sie die Zunge so lang wie möglich ab. Legen Sie die Zunge in kaltes PBS auf Eis.
2. Etablierung einer murinen Ösophagus-Organoid-Kultur (MEO)
HINWEIS: Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um eine murine Zungenorganoidkultur zu etablieren, wobei ein Schritt hinzugefügt wird, in dem das Zungengewebe vor der Trypsinisierung zerkleinert wird. Siehe den Hinweis in Schritt 2.2.3.
- Aufbereitung von Reagenzien
HINWEIS: Eine Liste der Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle. Bereiten Sie die Stammlösungen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und lagern Sie sie, sofern nicht anders angegeben.- Stellen Sie sicher, dass die in diesem Protokoll verwendeten Einweg-Aliquots der Basalmembranmatrix (BME) bis zum Tag der Verwendung bei −20 °C gelagert, anschließend auf Eis oder bei 2-8 °C aufgetaut und bei Nichtgebrauch immer auf Eis aufbewahrt werden.
- Lösen Sie 250 mg Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI) in 1.000 ml PBS (250 mg/ml Stammkonzentration) auf und filtern Sie es (0,22 μm). 50 ml Aliquots in konische Röhrchen geben und bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie das Maus-Organoid-Medium (MOM) vor: Ergänzen Sie fortgeschrittenes DMEM/F12 mit 1 mM N-Acetyl-L-Cystein (NAC), 2% R-Spondin und Noggin-konditioniertem Medium (RN CM), 1x N-2-Supplement, 1x B-27-Supplement, 10 mM HEPES, 1x Antibiotikum-Antimykotikum, 1x GlutaMAX-Supplement und 100 ng/ml mMouse Epidermal Growth Factor (mEGF). Bereiten Sie die MOM jeweils 500 ml vor, teilen Sie sie in 50-ml-Aliquots und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 2-8 °C. Fügen Sie 0,5 μg/ml Amphotericin B und 10 μM Y-27632 kurz vor der Anwendung hinzu.
- MOM, 0,25 % Trypsin und Sojabohnen-Trypsin-Hemmer (STI) vor Gebrauch in einem Wasser- oder Perlenbad auf 37 °C vorwärmen.
- Isolierung von Keratinozyten aus dem präparierten Mausgewebe (Zeitbetrachtung: 2 h)
- Das Ösophagusgewebe wird in 500 μl Dispase in PBS (insgesamt 2,5-5 Einheiten) übertragen und 10 min lang in einem Thermomixer bei 37 °C und 800 U/min inkubiert.
- Übertragen Sie das Gewebe in eine Kulturschale und entfernen Sie vorsichtig die Muskelschicht mit einer Pinzette vom Epithel (Abbildung 4).
HINWEIS: Dieser Schritt kann auch von einem erfahrenen Forscher vor der Inkubation mit Dispase durchgeführt werden. - Das Epithel wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl 0,25%igem Trypsin überführt und 10 min lang in einem Thermomischer bei 37 °C und 800 U/min inkubiert.
Anmerkungen: Wenn das Ausgangsmaterial Zungengewebe ist, zerkleinern Sie das Gewebe mit einem sterilen Skalpell in kleinere, etwa 1-2 mm2 große Stücke, bevor Sie das Trypsin hinzufügen. - Kurz 5-10 s bei 2.000 x g zentrifugieren, um das Gewebe zu pelletieren. Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit einem 100-μm-Zellsieb vor. Übertragen Sie die Gewebe-/Zellsuspension mit einer breiten Bohrungsspitze in kreisenden Bewegungen durch das Sieb.
- Geben Sie 3 ml STI durch das Sieb und waschen Sie es mit kreisenden Bewegungen.
- Schrubben Sie das Sieb mit dem Boden eines 1-ml-Tuberkulin-Spritzenkolbens, um die Zellen hindurchzudrücken.
- Waschen Sie das Sieb 3-5 Mal mit 3 ml PBS und schrubben Sie das Sieb zwischen den Waschgängen mit dem Boden der Spritze.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren.
- Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie 1 ml Lösung im Röhrchen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in den verbleibenden 1 ml und übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 70-μm-Zellsieb in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl MOM; Passen Sie die Lautstärke nach Bedarf an. Führen Sie eine automatische Zellenzählung durch Trypanblau-Ausschluss durch.
- Aussaat der initialen Zellsuspension (Zeitbetrachtung: <1 h)
- Eine 24-Well-Zellkulturplatte in einem 37 °C-Inkubator vorwärmen.
- Platte von 5.000 lebensfähigen Zellen in 75 % (v/v) BME/MOM mit 50 μl Gesamtvolumen pro Well. Maximieren Sie die Anzahl der plattierten Wells und bereiten Sie genügend Zellen in BME für ein zusätzliches Well vor, wie in den folgenden Beispielberechnungen beschrieben.
Anmerkungen: Kryokonservieren Sie überschüssige Zellen im Kryokonservierungsmedium (10 % DMSO in FBS) bei einer maximalen Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml. Lagern Sie die Kryoflaschen in einem Gefrierbehälter über Nacht bei −80 °C. Übertragen Sie sie zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff in der Dampfphase. - Bereiten Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen zuerst eine geeignete Zellverdünnung in MOM vor und fügen Sie dann kurz vor dem Plattieren BME mit einer Spitze mit breiter Bohrung hinzu.
- Geben Sie mit einer 200-μl-Spitze mit breiter Bohrung langsam ein 50-μl-Tröpfchen in die Mitte des Wells und vermeiden Sie den Kontakt zwischen der Spitze und dem Boden oder den Seiten des Wells (Abbildung 5). Achten Sie darauf, nicht zu viel Kraft aufzuwenden, um die Flüssigkeit aus der Spitze auszustoßen, da sich sonst die Kuppel abflacht.
- Lassen Sie den BME 30 Minuten lang in einem Inkubator mit 37 °C, 5 % CO2 und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) erstarren.
- Fügen Sie vorsichtig 500 μl MOM pro Well hinzu, ergänzt mit 0,5 μg/ml Amphotericin B und 10 μM Y-27632.
HINWEIS: Fügen Sie Amphotericin zu allen MOM während der ursprünglichen Primärkultur hinzu. Füge Y-27632 nur am Tag des Durchgangs (Tag 0) für alle Passagen hinzu. - Wechseln Sie das MOM an den Tagen 3-4 und danach alle 2-3 Tage, bis es für die Passage bereit ist.
- Stellen Sie an den Tagen 7-10 die Organoide dar und messen Sie die Organoid-Bildungsrate (OFR), indem Sie die Anzahl der gebildeten Organoide durch die Anzahl der ursprünglich ausgesäten Zellen teilen.
Beispielrechnungen:
- Passage und Kryokonservierung von murinen Ösophagusorganoiden (MEOs) (Zeitbetrachtung: <1,5 h)
- Tauen Sie den BME auf und halten Sie ihn auf Eis. MOM, 0,05 % Trypsin und STI vor Gebrauch in einem Wasser- oder Perlenbad auf 37 °C vorwärmen. Eine 24-Well-Zellkulturplatte in einem 37 °C-Inkubator vorwärmen.
- Sammeln Sie mit einer Mikropipettenspitze mit breiter Bohrung die Organoide zusammen mit dem Überstand in der BME-Kuppel. Stören Sie den BME, indem Sie auf und ab pipettieren.
HINWEIS: Kombinieren Sie die Vertiefungen mit identischen Proben in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen. - Kurz 10-15 s bei 2.000 x g zentrifugieren, um die Organoide zu pelletieren. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Entfernen Sie das Pellet vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl 0,05 % Trypsin.
- Inkubieren Sie das/die Röhrchen(s) in einem Thermomischer bei 37 °C und 800 U/min für 10 min.
- Inaktivieren Sie das Trypsin mit 600 μL STI.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl MOM. Führen Sie eine automatische Zellenzählung durch Trypanblau-Ausschluss durch.
Anmerkungen: Die Lautstärke kann nach Bedarf angepasst werden. - Platte von 2.000-5.000 lebensfähigen Zellen in 75 % (v/v) BME/MOM mit 50 μl Gesamtvolumen pro Well. Maximieren Sie die Anzahl der plattierten Wells und bereiten Sie genügend Zellen in BME für ein zusätzliches Well gemäß den zuvor erwähnten Beispielberechnungen vor.
Anmerkungen: Kryokonservieren Sie überschüssige Zellen im Kryokonservierungsmedium (10 % DMSO in FBS) bei einer maximalen Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml. Lagern Sie die Kryoflaschen in einem Gefrierbehälter über Nacht bei −80 °C. Übertragen Sie sie zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff in der Dampfphase. - Bereiten Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen zuerst eine geeignete Zellverdünnung in MOM vor und fügen Sie dann kurz vor dem Plattieren BME mit einer Spitze mit breiter Bohrung hinzu.
- Geben Sie mit einer 200-μl-Spitze mit breiter Bohrung langsam ein 50-μl-Tröpfchen in die Mitte des Wells und vermeiden Sie den Kontakt zwischen der Spitze und dem Boden oder den Seiten des Wells. Achten Sie darauf, nicht zu viel Kraft aufzuwenden, um die Flüssigkeit aus der Spitze auszustoßen, da sich sonst die Kuppel abflacht.
- Die Platte wird 30 Minuten lang in einem Inkubator mit 37 °C, 5 % COund 2,95 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.
- Fügen Sie vorsichtig 500 μl MOM pro Well hinzu, ergänzt mit 10 μM Y-27632.
HINWEIS: Fügen Sie Y-27632 nur am Tag des Übergangs (Tag 0) hinzu. Es ist nicht erforderlich, es während des Medienwechsels hinzuzufügen. Die Zugabe von Amphotericin B ist nicht mehr notwendig. - Wechseln Sie das MOM an den Tagen 3-4 und danach alle 2-3 Tage, bis es für die Passage bereit ist.
- Stellen Sie an den Tagen 7-10 die Organoide dar und messen Sie den OFR.
- Auftauen und Wiederfindung der murinen Ösophagusorganoide (MEOs) (Zeitbetrachtung: <1 h)
- Tauen Sie den BME auf und halten Sie ihn auf Eis. Eine 24-Well-Zellkulturplatte in einem 37 °C-Inkubator vorwärmen.
- Bereiten Sie 10 ml kalt oder RT MOM oder PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen vor.
- Tauen Sie ein Kryoöl in einem 37 °C warmen Wasserbad oder Perlenbad für ca. 30 s bis 1 min auf oder bis ein kleines Eispellet übrig bleibt.
- Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer vorbenetzten Pipettenspitze langsam und tropfenweise in das Röhrchen mit MOM oder PBS.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen für 300 x g und 4 °C für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl MOM; Passen Sie die Lautstärke nach Bedarf an. Führen Sie eine automatische Zellenzählung durch Trypanblau-Ausschluss durch.
- Platte von 5.000-10.000 lebensfähigen Zellen in 75% (v/v) BME/MOM mit 50 μl Gesamtvolumen pro Well. Maximieren Sie die Anzahl der plattierten Wells und bereiten Sie genügend Zellen in BME für ein zusätzliches Well vor, wie in den zuvor erwähnten Beispielberechnungen beschrieben.
- Fahren Sie mit den verbleibenden Schritten des Protokolls für die Passage und Kryokonservierung von murinen ösophagealen Organoiden (MEO) fort (siehe Schritt 2.4.11).
3. Herstellung von Organoiden für die Paraffineinbettung (Zeitbetrachtung: <1 h [plus 1,5 h für Reagenzienpräparation])
- Sammeln Sie mit einer Mikropipettenspitze mit breitem Durchmesser drei Vertiefungen pro Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Organoide in der BME-Kuppel zusammen mit dem Überstand. Stören Sie den BME, indem Sie auf und ab pipettieren.
- Kurz 10-15 s bei 2.000 x g zentrifugieren, um die Organoide zu pelletieren. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Lösen Sie das Pellet vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA).
- Fixieren Sie die Organoide über Nacht bei 4 °C.
- Kurz 10-15 s bei 2.000 x g zentrifugieren, um die Organoide zu pelletieren. Entfernen und entsorgen Sie so viel PFA wie möglich.
- Lösen Sie das Pellet vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl PBS.
Anmerkungen: Fixierte Organoide können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. - Bereiten Sie eine 50-ml-Brühe Agar-Gel (2 % Agar plus 2,5 % Gelatine) vor.
Anmerkungen: Bereiten Sie die Agar-Gelbrühe aufgrund der Inkubationszeit im Voraus vor und führen Sie anschließend den Autoklavenzyklus durch.- 1 g Bacto-Agar und 1,25 g Gelatine in 50 ml Wasser in einem 150 ml autoklavierbaren Glasbecherglas resuspendieren.
- Schwenken Sie die Federung und lassen Sie sie 30-60 Minuten bei RT stehen.
- 20 min bei 121 °C autoklavieren.
- Etwas abkühlen lassen und 5 ml Aliquots in konische 15-ml-Röhrchen dosieren.
- Bis zu 6 Monate bei RT lagern.
- Bereiten Sie eine Einbettfläche vor, indem Sie ein Mikrozentrifugenröhrchengestell umdrehen und die Oberfläche mit einer Folie Siegelfolie abdecken. Etikett mit der/den entsprechende(n) Organoid-ID(s).
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 Minuten, um die Organoide zu pelletieren. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- In der Zwischenzeit verflüssigen Sie das Agar-Gel, indem Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen mit dem Agar-Gel in ein 150-ml-Glasbecherglas mit 100 ml Wasser geben und 1-2 Minuten lang auf höchster Leistungsstufe in der Mikrowelle erhitzen oder bis das Wasser zu kochen beginnt und sich das Agar-Gel in einem flüssigen Zustand befindet.
VORSICHT: Lösen Sie die Kappe des konischen Röhrchens mit dem Agar-Gel, bevor Sie es in die Mikrowelle stellen. - Tauchen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Organoid-Pellet teilweise in das warme Wasser, ohne Wasser in das Mikrozentrifugenröhrchen zu geben.
- Überlagern Sie das Organoid-Pellet vorsichtig, indem Sie 50 μl Agar an der Seite des Röhrchens hinzufügen.
- Ohne das Pellet zu stören (nicht resuspendieren, das Pellet intakt lassen), übertragen Sie das Pellet im Agar-Gel-Tröpfchen auf die Versiegelungsfolie auf der Einbettfläche.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.12 und 3.13 mit zusätzlichen 50 μl flüssigem Agar-Gel, um das verbleibende Organoid-Pellet aufzufangen, und geben Sie es vorsichtig in dasselbe Geltröpfchen.
- Das Tröpfchen mit dem Organoid-Pellet wird 45 min bei 4 °C inkubiert.
- Übertragen Sie das Tröpfchen mit dem Organoid-Pellet vorsichtig mit einer Pinzette in eine markierte Pathologiekassette.
- Lagern Sie die Kassette in 70%igem Ethanol bei 4 °C bis zu 1 Monat lang.
- Fahren Sie mit der Paraffineinbettung über die routinemäßige histologische Verarbeitung fort, um Paraffinblöcke herzustellen.
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung von murinen Ösophagus-Organoiden (MEOs) aus normalem Ösophagusgewebe oder ESCC-Tumorgewebe von 4NQO-behandelten Mäusen gemäß einem spezifischen Behandlungsschema, das aus 16 Wochen 4NQO besteht, das im Trinkwasser verabreicht wird, gefolgt von einem Beobachtungszeitraum von 10 bis 12 Wochen (Abbildung 1). Die Mäuse werden dann für die Sektion der Zunge oder des Speiseröhrengewebes eingeschläfert (Abbildung 2 und Abbildung 3). Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung der Epithelschicht aus der intakten Speiseröhre (Abbildung 4), die für die anschließende Einzelzellisolierung verwendet werden kann. Aus der Speiseröhre gewonnene Epithelzellen werden zunächst mit 5.000 Zellen pro Vertiefung in 50-μl-Tröpfchen plattiert, die Zellen in einer Basalmembranmatrix und einem gut charakterisierten serumfreien Zellkulturmedium enthalten (Abbildung 5), und im Laufe von durchschnittlich 7-10 Tagen Organoide bilden lassen. Mause Ösophagus-, Zungen- und Vormagenorganoide können durch morphologische Analysen mittels Phasenkontrast-/Hellfeldbildgebung und Histopathologie weiter charakterisiert werden (Abbildung 6). Die Selbsterneuerungskapazität von Organoiden kann durch die Bestimmung der OFR in der Subkultur beurteilt werden (Abbildung 7). Die OFR wird weitgehend durch den Gehalt der proliferativen basaloiden Zellen beeinflusst, wie die Analyse der Wachstumskinetik in Verbindung mit ihrer Morphologie zeigt (Abbildung 8). Schließlich wachsen diese Organoide, einschließlich normaler Strukturen von 4NQO-unbehandelten Mäusen, kontinuierlich und können über einen langen Zeitraum erhalten werden (Abbildung 9).
Abbildung 1: Das 4NQO-Behandlungsschema. Die Mäuse werden 16 Wochen lang mit 4NQO im Trinkwasser behandelt, gefolgt von einem Beobachtungszeitraum von 10 bis 12 Wochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Freilegung des thorakalen Ösophagus. Die Luftröhre (blaue Linien) wird von der Speiseröhre abgezogen (weiße Linien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ösophagus (weiße Linien) mit dem Magen (gelbe Linien) am Plattenepithel-Säulenübergang (blaue Linie). Abkürzungen: FS = Vormagen, DS = distaler Magen, L = Leber. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Trennung von Magen und Speiseröhre und Isolierung des Epithels. Obermaterial: Der Magen ist von der Speiseröhre getrennt. Die rote Linie zeigt an, wo die Speiseröhre während der Dissektion abgelöst werden soll. Mitte: Das Epithel (weiße Linie) wird von der Muskelschicht abgezogen. Unten: Der Ösophagus, der Tumoren trägt, folgt dem in Abbildung 1 beschriebenen Behandlungsschema. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beschichtung des BME-Tröpfchens, das einzelne Zellen enthält, mit einer Spitze mit breiter Bohrung. Die Organoide beginnen sich um den 4.-7. Tag herum zu bilden und sind im Durchschnitt nach 7-10 Tagen bereit für die Passage. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Charakterisierung der Organoide durch morphologische Analyse. (A) Repräsentative Bilder von normalen und ESCC-MEOs. Oben links: Hellfeldbild eines normalen MEO. Unten links: H&E-Färbung eines normalen MEO. Oben rechts: Hellfeldbild eines ESCC-MEO von einer 4NQO-behandelten Maus. Unten rechts: H&E-Färbung eines ESCC-MEO aus einer 4NQO-behandelten Maus mit nukleären Atypien und abrupter Keratinisierung, wobei letztere an eine Keratinperle erinnert, die ein gut differenziertes Kompartiment innerhalb eines SCC-Tumors darstellt. (B) Repräsentative Bilder von normalen Organoiden der Mauszunge und des Vormagens (MTO bzw. MFO). Oben links: Hellfeldbild eines normalen MTOs. Unten links: H&E-Färbung eines normalen MTO. Oben rechts: Hellfeldbild eines normalen MFOs. Unten rechts: H&E-Färbung eines normalen MFO. Alle Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Bestimmung der Erneuerungskapazität von Organoiden. (A) Versuchsplanung zur Bestimmung der Erneuerungskapazität von Organoiden durch Subkulturen. Die wachsenden primären Organoide (P0) werden zu verschiedenen Zeitpunkten dissoziiert und zu einzelligen Suspensionen verarbeitet. Diese Zellen werden zur Bestimmung der OFR an Tag 7 in der Subkultur (P1) durchquert. (B) Repräsentative OFR-Daten von durchgelassenen MEOs, die von 4NQO-unbehandelten Mäusen generiert wurden. Es ist zu beachten, dass die OFR in Abhängigkeit von der Zeit abnimmt, was die Abnahme der proliferativen basaloiden Zellen in den reifen Organoiden widerspiegelt, die mehr Zellen enthalten, die eine postmitotische terminale Differenzierung durchlaufen haben (siehe Abbildung 8). p < 0,001 (n = 6) OFR an Tag 7, Tag 11 und Tag 21 im Vergleich zu OFR an Tag 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Wachstumskinetik von Organoiden, wie sie sich aus ihrer Morphologie zu verschiedenen Zeitpunkten ergeben. Gezeigt werden repräsentative Hellfeld- und H&E-Färbebilder eines normalen MEO von 4NQO-unbehandelten Mäusen. Beachten Sie, dass die Verhornung des inneren Kerns von Organoiden am 10. Tag auffällig wird. Die proliferativen basaloiden Zellen verbleiben auch zu den Zeitpunkten Tag 14 und Tag 21 in der äußersten Zellschicht. Bei der Immunhistochemie/Immunfluoreszenz kann akkumuliertes Keratin zu einer unspezifischen Färbung führen, wie dies bei ursprünglichen Plattenepithelgeweben der Fall ist, was eine sorgfältige Optimierung der Färbebedingungen, Kontrollen (z. B. nur sekundäre Antikörper) und Dateninterpretation erfordert. Alle Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Eine Populationsverdopplungskurve eines repräsentativen normalen MTO, generiert aus 4NQO-unbehandelten Mäusen. Diese Organoide wurden zuvor erzeugt, kryokonserviert und aufgetaut, um ihr stetiges Wachstum über mehrere Passagen und eine langfristige Kultur zu demonstrieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte und Überlegungen für die Generierung und Analyse von MEOs in den hier beschriebenen Protokollen. Um die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit von MEO-Experimenten zu gewährleisten, sind sowohl biologische als auch technische Replikate wichtig. Für biologische Replikate sind in der Regel zwei bis drei unabhängige Mäuse mit ESCC pro Versuchsbedingung ausreichend. Die angemessene Anzahl biologischer Replikate kann jedoch in Abhängigkeit von den zu testenden Parametern in den einzelnen Studien variieren. So ist derzeit nicht bekannt, wie früh und wie häufig neoplastische Organoide bei 4NQO-behandelten Mäusen ohne makroskopisch sichtbare Läsionen oder histologische IEN- und ESCC-Läsionen nachgewiesen werden können. Obwohl 4NQO in verschiedenen Mausstämmen ösophageale Läsionen induziert14, wurden MEOs nur von C57BL/6-Mäusen generiert. Die Entwicklung und das Fortschreiten von ESCC werden in Mäusen mit gentechnisch veränderten genetischen Läsionen wie Trp53-Verlust und Cyclin-D1-Überexpression beschleunigt 7,14,15. Bei solchen Mäusen können neoplastische MEOs während oder nach der 4NQO-Behandlung häufiger und früher auftreten als bei Wildtyp-C57BL/6-Mäusen. Gegebenenfalls sollten Pilotstudien durchgeführt werden, um die geeignete Stichprobengröße von Mäusen in geplanten Experimenten abzuschätzen. Mit Multi-Well-Zellkulturplatten lassen sich technische Replikate (n = 3-6) einfach erstellen. Sorgfältiges Pipettieren und Üben sind jedoch erforderlich, um die Well-to-Well-Variabilität zu minimieren, da die Zellen in einem viskosen Medium mit BME dosiert werden.
Bei der Etablierung von MEO in den beschriebenen Protokollen ist eine Erfolgsquote von nahezu 100 % zu erwarten. Eine erfolgreiche MEO-Kultur hängt jedoch von der Lebensfähigkeit der anfänglich isolierten Ösophagusepithelzellen ab, die weitgehend mit der Qualität des Ausgangsmaterials zusammenhängt. Wenn die Mäuse nach der Euthanasie nicht sofort seziert werden können, können die Kadaver über Nacht bei 4 °C gehalten werden, um die Speiseröhren am nächsten Tag zu isolieren. Die Kadaver sollten jedoch nicht eingefroren werden, da gefrorenes Gewebe keine lebensfähigen Zellen hervorbringt. Die dissoziierten ösophagealen Epithelzellen können als einzellige Suspension in einem Gefriermedium (90 % FBS und 10 % DMSO) kryokonserviert und in flüssigem Stickstoff gelagert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt Organoide zu erzeugen. Die Ösophagi (Epithelschichten) können auf ähnliche Weise kryokonserviert werden, wenn auch weniger optimal. Während MEOs mit Zellen initiiert werden können, die durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und andere Methoden zur Aufreinigung einzigartiger Untergruppen von Ösophagusepithelzellen gereinigt werden, kann die Zellviabilität nach der Reinigung verringert sein. Es sollte beachtet werden, dass Zellviabilitätstests wie der Trypanblau-Ausschlusstest lebende Zellen von toten Zellen, aber nicht von absterbenden Zellen unterscheiden können, wodurch die Zellviabilität vor der Initiierung der Organoidkultur unterschätzt wird. Nach der Etablierung können MEOs sowohl von 4NQO-behandelten als auch von unbehandelten Mäusen auf unbestimmte Zeit (>20 Passagen) passaget werden, wobei bei jeder Passage im angegebenen Medium eine Lebensfähigkeit von >80 % erwartet wird. Bemerkenswert ist, dass es organoide Mediumkomponenten gibt, deren Anforderungen noch unklar sind. Zheng et al. haben kürzlich gezeigt, dass ein Nahrungsergänzungsmittel, das Wnt3A, RSpondin-1 und Noggin enthält, erforderlich ist, um murine Ösophagusorganoide zu züchten16. Wir verwenden Wnt3A jedoch nicht in diesem Protokoll, da Organoide aus der Zunge, der Speiseröhre und dem Vormagen wachsen und mehrmals (>10 Passagen) ohne es durchgelassen werden können 7,3,17. Es ist zu beachten, dass die Anforderungen an diese Faktoren nicht einzeln geprüft wurden.
Epithelschichten werden verwendet, um MEOs aus der normalen Speiseröhre oder der Ösophagusschleimhaut ohne makroskopisch sichtbare Läsionen wie Tumore zu erzeugen. Die Verwendung von Epithelfolien ermöglicht die Anreicherung von Epithelzellen als Ausgangsmaterial. Die Isolierung der Epithelschichten von der tumortragenden Ösophagusschleimhaut ist jedoch aufgrund der ESCC-Invasion in die subepithelialen Kompartimente schwierig. Die gesamte Speiseröhre kann verwendet werden, um die MEO-Kultur zu initiieren, obwohl das Vorhandensein von nicht-epithelialen Zellpopulationen die Organoid-Bildungsrate (OFR) in der ursprünglichen Kultur verringern kann. Es wird erwartet, dass die OFR in den folgenden Passagen ansteigen wird, da die aktuellen MEO-Kulturbedingungen das Wachstum von Epithelzellen innerhalb des BME ermöglichen. Bemerkenswert ist, dass die hier beschriebenen Protokolle auch auf andere Organe angewendet werden können, insbesondere auf die Mundzunge und den Vormagen, die beide anfällig für 4NQO-induzierte Plattenepithelkarzinogenese sind. Bemerkenswert ist, dass wir Mauszungen-Organoide (MTOs) und Maus-Vormagen-Organoide (MFOs) aus dem gesamten Gewebe generiert haben, ohne die Epithelzellen zu isolieren. Bei Bedarf können diese Organoide aus einer Subpopulation von Epithelzellen hergestellt werden, die durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gereinigt wurden (z. B. Krebsstammzellen mit hoher CD44-Expression, CD73+ putative Ösophagusstammzellen).
Darüber hinaus können nicht-epitheliale Zellen, insbesondere Fibroblasten, aus dem BME migrieren, um in einer Monoschicht auf der Kunststoffoberfläche zu wachsen, wodurch die gleichzeitige Etablierung von murinen ösophagealen Fibroblasten, einschließlich krebsassoziierter Fibroblasten, ermöglicht wird. Die Selektivität für das Wachstum von Epithelzellen im 3D-BME könnte die Co-Kultivierung von MEOs mit Immunzellen und anderen Zelltypen unter den hier beschriebenen Bedingungen einschränken. Die Optimierung für Co-Kultur-Experimente ist im Gange. Darüber hinaus kann die tumorinvasive Front in der epithelial-stromalen Grenzfläche, die durch alternative 3D-Kulturmethoden wie die organotypische 3D-Kultur modelliert wurde, besser rekapituliert werden 8,18. Darüber hinaus sind MEOs möglicherweise keine geeignete Plattform für die Messung der epithelialen Barrierefunktion, die durch die Verwendung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur zur Beurteilung des transepithelialen elektrischen Widerstands besser bewertet werden kann 19,20,21.
Der größte Vorteil von MEOs, und in der Tat von MTOs und MFOs, ist das schnelle Wachstum von Einzelzellstrukturen, die die ursprünglichen Epithelstrukturen, sowohl gutartige als auch bösartige, rekapitulieren. Die Verdopplungszeit (DT) dieser Organoide wird typischerweise auf <20 h geschätzt. Die Wachstumskinetik normaler MTOs von 4NQO-unbehandelten Mäusen veranschaulicht sowohl die Fähigkeit zur Langzeitkultur normaler Organoide als auch die erwartete Populationsverdopplung (PD) und DT (Abbildung 9). In diesem Beispiel traten während jeder Passage etwa 10 Populationsverdopplungen auf, mit einem berechneten DT von durchschnittlich 18,5 h und 18,3 h. Nach der anfänglichen Primärkultur wird in der Regel eine OFR von 15 % bis 25 % erwartet, unabhängig von der Aussaatdichte, und MEOs können bereits an Tag 4 auftauchen (Abbildung 8), obwohl sie kleiner sein können. In der Phasenkontrastmikroskopie zeigen Organoide aus der normalen Ösophagusschleimhaut kugelförmige Strukturen mit glatten Oberflächen. Als Funktion der Zeit weisen normale Organoide eine konzentrische Struktur auf, wenn die innere Zellmasse eine postmitotische terminale Differenzierung durchläuft, wodurch ein Differenzierungsgradient entsteht, der das geschichtete Plattenepithel nachahmt. Neoplastische Organoide weisen unregelmäßige Oberflächen auf, was die hohe proliferative Aktivität der basaloiden Zellen widerspiegelt, die sich nach außen ausdehnen können. Die Fähigkeit von MEOs, einen Proliferations-Differenzierungsgradienten zu zeigen, kann genutzt werden, um zu untersuchen, wie sich proliferative ösophageale basale Keratinozyten vermehren und eine postmitotische terminale Differenzierung durchlaufen können. Durch die Subkultivierung dissoziierter MEO-Zellen kann die Selbsterneuerung der Epithelzellen (Abbildung 7) sowie die Regeneration oder Transformation unter genotoxischem Stress, der durch 4NQO induziert wird, untersucht werden. Ähnliche Studien können auch unter Verwendung des MTO-Modells im Zusammenhang mit Mundkrebs durchgeführt werden, wodurch die Anwendung des beschriebenen 4NQO-Maus-Organoidmodells auf Kopf-Hals-SCC erweitert wird. Während die Erneuerung des Epithels Stammzellen implizieren kann, besteht eine potenzielle Schwäche des MEO-Systems darin, dass es ruhende oder sich selten teilende Stammzellen möglicherweise nicht erkennt, da die MEO-Bildung von der Zellproliferation abhängt. Eine kürzlich durchgeführte Einzelzellanalyse von MEOs lieferte einen wesentlichen Einblick in die Heterogenität der Ösophagusepithelzellen22.
Die maligne Transformation kann durch die sorgfältige morphologische Beurteilung einzelner MEO-Strukturen und der nukleären Atypien von Zellen, die MEOs enthalten, beurteilt werden. Die molekulare Profilierung von MEOs durch Ganzexom-Sequenzierung und RNA-Sequenzierung könnte die unterschiedliche Natur von präneoplastischen und ESCC-Läsionen aufzeigen. Der ultimative Test für eine maligne Transformation könnte jedoch die Transplantation von MEOs in immundefiziente oder immunkompetente Mäuse erfordern, um die Tumorigenität der ESCC-Zellen zu dokumentieren. ESCC-MEOs, die in syngene immunkompetente Mäuse transplantiert wurden, könnten auch eine hervorragende Plattform für die Untersuchung der Mikroumgebung des Tumorimmuns bieten.
Die Einsatzmöglichkeiten von MEOs sind breit gefächert. Neben morphologischen, biochemischen und Multi-Omics-Ansätzen kann die Durchflusszytometrie nicht nur zur Analyse zellulärer Prozesse wie DNA-Synthese, Apoptose, Autophagie und mitochondrialer Atmung eingesetzt werden, sondern auch zur Analyse von Zelloberflächenmarkern, die einzigartige Untergruppen von Zellen innerhalb von MEOs definieren, die genetischen und pharmakologischen Modifikationen ex vivo entsprechen 7,23 . Darüber hinaus können Organoide für Kokulturexperimente verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen den Epithelzellen und dem Stroma, den Immunzellen oder sogar dem Mikrobiomzu bewerten 24. Schließlich können MEOs aus Mäusen generiert werden, die genetische Modifikationen tragen, die auf die Zelllinie zurückgeführt werden können, wie z. B. fluoreszierendes Reporterprotein, das unter einem zelltypspezifischen genregulatorischen Promotor (z. B. Sox2, Zytokeratine Krt5 und Krt15) exprimiert wird3,4,7,25.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass MEOs ein unschätzbares Werkzeug für das Studium des ESCC sind. Die hier beschriebenen Protokolle zielen darauf ab, zu zeigen, dass MEOs ein vielseitiges Modell darstellen, das relativ einfach zu generieren, zu pflegen und zu charakterisieren ist und die Fähigkeit besitzt, die Merkmale von ESCC und ösophagealen Neoplasien zu rekapitulieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken den Shared Resources (Durchflusszytometrie, Molekularpathologie und konfokale und spezialisierte Mikroskopie) am Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University für die technische Unterstützung. Wir danken Dr. Alan Diehl, Dr. Adam J. Bass und Dr. Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanismen der Ösophaguskarzinogenese) sowie den Mitgliedern der Laboratorien von Rustgi und Nakagawa für die hilfreichen Diskussionen. Diese Studie wurde durch die folgenden NIH Grants unterstützt: P01CA098101 (H.N. und A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. und H.N.) und P30CA013696 (A.K.R.). H.N. und C.L. wurden mit dem Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award der Columbia University ausgezeichnet. H.N. wurde mit dem Fanconi Anemia Research Fund Award ausgezeichnet. F.M.H. wurde mit dem Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) und dem American Association for Cancer Research Award ausgezeichnet. J.G. wurde von der American Gastroenterological Association (AGA) ausgezeichnet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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