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Biology

अनुदैर्ध्य प्रतिदीप्ति निगरानी और प्रतिकूल हस्तक्षेप के लिए ठोस मीडिया पर व्यक्तिगत केनोरहाब्डिस एलिगेंस की दीर्घकालिक संस्कृति

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64682
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम आजीवन शारीरिक पैरामीटर ट्रैकिंग और प्रतिदीप्ति परिमाणीकरण के लिए ठोस मीडिया पर अलग-अलग नेमाटोड को कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस संस्कृति प्रणाली में जानवरों को भागने से रोकने के लिए एकल-कृमि कुओं के आसपास एक पामिटिक एसिड बाधा शामिल है, जिससे रोगजनक बैक्टीरिया और रासायनिक तनावों सहित प्रतिकूल हस्तक्षेप के उपयोग की अनुमति मिलती है।

Abstract

उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए केनोरहाब्डिस एलिगेंस का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। एलिगेंस एजिंग अध्ययनों में मानक अभ्यास ठोस नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) पर कीड़े के समूहों को कल्चर करना है, जिससे जीवित रहने और अन्य शारीरिक फेनोटाइप के लिए जनसंख्या-स्तर के डेटा के कुशल संग्रह की अनुमति मिलती है, और फ्लोरोसेंट बायोमार्कर परिमाणीकरण के लिए उप-आबादी का आवधिक नमूना करण होता है। इस दृष्टिकोण की सीमाएं (1) रुचि के फेनोटाइप्स के लिए आयु प्रक्षेपपथ विकसित करने के लिए समय के साथ व्यक्तिगत कीड़े का पालन करने में असमर्थता है और (2) संस्कृति पर्यावरण के संदर्भ में सीधे फ्लोरोसेंट बायोमार्कर की निगरानी करती है। वैकल्पिक संस्कृति दृष्टिकोण समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों की निगरानी के लिए तरल संस्कृति या माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करते हैं, कुछ मामलों में प्रतिदीप्ति परिमाणीकरण सहित, इस व्यापार के साथ कि संस्कृति वातावरण ठोस एनजीएम से प्रासंगिक रूप से अलग है। वोरमोटल ठोस एनजीएम पर पृथक कीड़े की खेती के लिए पहले से वर्णित माइक्रोफैब्रिकेटेड मल्टी-वेल डिवाइस है। प्रत्येक कीड़े को कॉपर सल्फेट से भरी खाई से घिरे एक ठोस एनजीएम वाले कुएं में बनाए रखा जाता है, जो सी एलिगेंस के लिए एक संपर्क विकर्षक है, जिससे व्यक्तिगत जानवरों की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति मिलती है। हम कॉपर सल्फेट को उम्र बढ़ने के अनुसंधान में आम प्रतिकूल हस्तक्षेपों के अधीन होने पर कीड़े को भागने से रोकने के लिए अपर्याप्त पाते हैं, जिसमें आहार प्रतिबंध, रोगजनक बैक्टीरिया और रासायनिक एजेंट शामिल हैं जो सेलुलर तनाव को प्रेरित करते हैं। मल्टी-वेल डिवाइस को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन से भी ढाला जाता है, जो फ्लोरेसेंस इमेजिंग में उच्च पृष्ठभूमि कलाकृतियों का उत्पादन करता है। यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीस्टाइनिन माइक्रोट्रे का उपयोग करके ठोस एनजीएम पर पृथक राउंडवर्म की खेती के लिए एक नए दृष्टिकोण का वर्णन करता है, जिसे मूल रूप से मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) टाइपिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे जीवन भर में अस्तित्व, शारीरिक फेनोटाइप और प्रतिदीप्ति के माप की अनुमति मिलती है। एक पामिटिक एसिड अवरोध प्रतिकूल परिस्थितियों की उपस्थिति में भी कीड़े को भागने से रोकता है। प्रत्येक प्लेट 96 जानवरों तक कल्चर कर सकती है और आसानी से आहार प्रतिबंध, आरएनएआई और रासायनिक योजक सहित विभिन्न स्थितियों के अनुकूल होती है, और जीवनकाल और गतिविधि डेटा एकत्र करने के लिए स्वचालित प्रणालियों के साथ संगत है।

Introduction

एलिगेंस आनुवंशिकी, सेलुलर जीव विज्ञान और आणविक जीव विज्ञान में अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव हैं, क्योंकि वे प्रयोगशाला में आसानी से सुसंस्कृत होते हैं, एक छोटी पीढ़ी का समय और जीवनकाल होता है, स्तनधारियों के साथ प्रोटीन होमोलॉजी की एक उच्च डिग्री साझा करता है, और एक पारदर्शी शरीर संरचना होती है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन और रंजक1 के विवो विज़ुअलाइज़ेशन में अनुमति देती है। विकासात्मक जीव विज्ञान और उम्र बढ़ने सहित कई क्षेत्रों में एक प्रमुख मॉडल प्रणाली के रूप में सी एलिगेंस के लंबे समय से उपयोग के परिणामस्वरूप, उनकी वृद्धि और विकास को अच्छी तरह से समझा गया है, उनके जीनोम को पूरी तरह से अनुक्रमित किया गया है, और जीनोम-वाइड आरएनएआई फीडिंग लाइब्रेरी और हजारों उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक उपभेदों सहित कई शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण बनाए गए हैं। एलिगेंस को ठोस आगर नेमाटोड विकास मीडिया (एनजीएम) पर आबादी के रूप में खेती की जाती है, और फेनोटाइप्स का मूल्यांकन मैन्युअल रूप से प्रत्यक्ष अवलोकन या इमेजिंग और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण द्वारा किया जाता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग व्यक्तिगत सी एलिगेंस में रंजक या ट्रांसजेनिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करके विभिन्न प्रकार के आणविक फेनोटाइप को पकड़ने के लिए किया जाता है।फ्लोरोसेंट इमेजिंग में आमतौर पर पतले अगारोस पैड युक्त स्लाइड पर एक जानवर को ठीक करना या पैरालाइज करना शामिल होता है, जो आक्रामक और अक्सर घातक होता है। इसमें रसायनों का उपयोग भी शामिल है, जैसे कि लेवामिसोल या सोडियम एज़ाइड, जो संभावित रूप से रुचि 2,3 की आणविक प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकता है। साथ में, ये दृष्टिकोण क्रॉस-अनुभागीय, जनसंख्या-स्तर के डेटा को फेनोटाइप की एक विस्तृत श्रृंखला में एकत्र करने की अनुमति देते हैं, लेकिन समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों की ट्रैकिंग की अनुमति नहीं देते हैं।

एलिगेंस की खेती के लिए कई दृष्टिकोण उभरे हैं, जिससे शोधकर्ताओं को नई इमेजिंग प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके समय के साथ जानवरों के शारीरिक और आणविक फेनोटाइप में गतिशील परिवर्तनों को पकड़ने की अनुमति मिलती है। एलिगेंस कल्चर दृष्टिकोण की एक श्रेणी माइक्रोफ्लुइडिक्स डिवाइस है, जिसमें वर्मफार्म4, नेमालाइफ चिप5, और क्रोनिस एट अल.6 द्वारा 'व्यवहार' चिप शामिल है, विभिन्न अन्य 7,8,9 के बीच। इनसे संबंधित तरल-आधारित संस्कृति विधियां हैं, जो समय10,11 के साथ व्यक्तिगत कीड़े या छोटी आबादी को चिह्नित करने के लिए बहु-अच्छी प्लेटों का उपयोग करती हैं। माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रोप्लेट सिस्टम सी एलिगेंस में फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं के उत्कृष्ट मात्रात्मक माप प्रदान करते हैं, लेकिन संस्कृति वातावरण एक महत्वपूर्ण सीमा प्रस्तुत करता है। एलिगेंस में पिछले शोध का विशाल बहुमत, विशेष रूप से उम्र बढ़ने के क्षेत्र में, ठोस अगर-आधारित मीडिया पर पूरा किया गया है। एलिगेंस को लगातार तैरने का कारण बनता है और एक अलग पर्यावरणीय संदर्भ का प्रतिनिधित्व करता है जो अंतर्निहित जीव विज्ञान को बदल सकता है। उदाहरण के लिए, तरल मीडिया में सुसंस्कृत जानवरों ने वसा सामग्री और जीन अभिव्यक्ति में काफी बदलाव किया है - विशेष रूप से तनाव प्रतिक्रिया में शामिल जीन के लिए - अगर आधारित ठोस एनजीएम12,13 पर सुसंस्कृत जानवरों के सापेक्ष। एकल-पशु इमेजिंग विधियों की एक वैकल्पिक श्रेणी में पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) उपकरण शामिल हैं जो ठोस मीडिया पर व्यक्तिगत जानवरों को अलग करते हैं, पेट्री प्लेटों पर समूह संस्कृति में ठोस एनजीएम पर संवर्धित कीड़े द्वारा अनुभव किए गए मानक वातावरण की अधिक बारीकी से नकल करने के प्रयास में। वोरमोटल एक 240-अच्छी तरह से पीडीएमएस डिवाइस है जिसे ठोस मीडिया पर व्यक्तिगत जानवरों को कल्चर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रत्येक कुएं को एक संशोधित एनजीएम से भरा जाता है जिसमें आगर के स्थान पर कम-पिघले हुए अगारोस का उपयोग किया जाता है और बैक्टीरिया के भोजन के साथ बीज दिया जाता है, जिससे पेट्री प्लेटों का उपयोग करके सबसे आम संस्कृति प्रणाली के समान एक ठोस मीडिया वातावरण बनता है। कुएं की दीवारें गोल होती हैं, जिससे प्रत्येक जानवर को कुएं में स्थान की परवाह किए बिना चित्रित किया जा सकता है (एक बहु-कुएं प्लेट में एक दीवार के पास एक जानवर के कारण होने वाली दृश्य बाधा से बचना)। प्रत्येक कुएं के आसपास एक संकीर्ण खाई में कॉपर सल्फेट का उपयोग जानवरों को उनके कुओं में रखने के लिए एक निवारक के रूप में किया जाता है। इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि कॉपर सल्फेट कीड़े को भागने से रोकने में अप्रभावी है जब प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितियां मौजूद होती हैं, जिसमें आहार प्रतिबंध, रोगजनक बैक्टीरिया, या रसायन शामिल हैं जो सेलुलर तनाव को प्रेरित करते हैं (जैसे, पैराक्वाट)।

एक दूसरी प्रणाली जो ठोस मीडिया का उपयोग करती है वह है वर्म कोरल, जो एक स्लाइड पर प्रत्येक कीड़े के लिए एक छोटा सील वातावरण बनाने के लिए एक हाइड्रोगेल को नियोजित करता है, जिससे व्यक्तिगत रूप सेपृथक जानवरों की दीर्घकालिक निगरानी की अनुमति मिलती है। एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि जानवरों को अंडे के रूप में पर्यावरण में सील किया जाना चाहिए, प्रजनन को रोकने के लिए बाँझ जानवरों के उपयोग की आवश्यकता होती है, और दवा उपचार को एक ही आवेदन तक सीमित किया जाता है। वोरमोटल में बहु-खुराक दवा परीक्षण ों को या तो डिवाइस में कीड़े को स्थानांतरित करने से पहले एक्सपोजर के कई दौर आयोजित करके या प्रयोग के दौरान कुओं में अतिरिक्त दवाओं को जोड़कर पूरा किया जा सकता है; हालांकि, बाद के मामले में, मौजूदा कुएं में एक अतिरिक्त दवा जोड़ने के बाद वास्तविक जोखिम खुराक को ठीक से मापना मुश्किल है और यह इस बात पर निर्भर करता है कि दवा कितनी तेजी से खराब होती है। वोरमोटल और वर्म कोरल दोनों गतिविधि और पशु शरीर विज्ञान (जैसे, विकास और विकास) से संबंधित जानकारी को पकड़ने के लिए ब्राइटफील्ड या डार्कफील्ड इमेजिंग के लिए उत्कृष्ट हैं। जबकि इन प्रणालियों का उपयोग प्रतिदीप्ति की निगरानी के लिए किया जा सकता है, हमारे अनुभव में, अन्य एकल-कृमि इमेजिंग प्रौद्योगिकियों को बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीडीएमएस में माइक्रोबबल बनाने, कणों को पकड़ने और अन्य छोटी असामान्यताएं होती हैं जो अनियमित फ्लोरोसेंट कलाकृतियों को उत्पन्न करती हैं जो लगातार फ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण में हस्तक्षेप करती हैं, विशेष रूप से जीएफपी के लिए उत्सर्जन सीमा में, सी एलिगेंस अनुसंधान में उपयोग किया जाने वाला सबसे आम फ्लोरोफोरे। आज तक, एक अनुदैर्ध्य तरीके से सी एलिगेंस व्यक्तिगत जानवरों की लाइव फ्लोरेसेंस इमेजिंग मुख्य रूप से माइक्रोफ्लुइडिक्स डिवाइस17 पर निर्भर करती है।

यहां, हम ठोस मीडिया पर व्यक्तिगत सी एलिगेंस की खेती के लिए एक नई विधि का वर्णन करते हैं जो प्रतिकूल हस्तक्षेप और प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट इमेजिंग दोनों के साथ संगत है। यह दृष्टिकोण अन्य एकल-कृमि इमेजिंग प्रौद्योगिकियों की अवधारणा के समान है, सिवाय इसके कि कस्टम-मोल्ड किए गए पीडीएमएस चिप को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीस्टाइनिन माइक्रोट्रे के साथ बदल दिया जाता है जो मूल रूप से माइक्रो साइटोटॉक्सिसिटी परख (जिसे आमतौर पर टेरासाकी ट्रे भी कहा जाता है) के लिए विकसित किया जाता है। इन माइक्रोट्रे में कुएं होते हैं जिन्हें ठोस मीडिया से भरा जा सकता है और बैक्टीरिया के भोजन के साथ बीज दिया जा सकता है, जो मानक ठोस एनजीएम संस्कृति पद्धति के तहत जानवरों द्वारा अनुभव किए गए पर्यावरण की बारीकी से नकल करते हैं। प्रत्येक कुआं कॉपर सल्फेट के बजाय पामिटिक एसिड के एक प्रतिकूल अवरोध से घिरा हुआ है। पामिटिक एसिड का उपयोग आमतौर पर कीड़े को ठोस मीडिया से भागने से रोकने के लिए किया जाता है, प्रयोगों में पेट्री प्लेटों पर मानक समूह संस्कृति का उपयोग करके जहां कीड़े को आहार प्रतिबंध या रासायनिक तनाव के संपर्क जैसे प्रतिकूल वातावरण के साथ चुनौती दी जाती है। माइक्रोट्रे भी न्यूनतम और सुसंगत फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि का उत्पादन करते हैं, जिससे जानवरों की फ्लोरोसेंट इमेजिंग सीधे उनके संस्कृति वातावरण में होती है। यह नई एकल-पशु ठोस अगर-आधारित संस्कृति प्रणाली न केवल जीवन भर व्यक्तिगत जानवरों को ट्रैक करने और विकास, विकास, गतिविधि और जीवनकाल की निगरानी करने की अनुमति देती है, बल्कि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ भी संगत है। क्योंकि कीड़े को पक्षाघात या निर्धारण के बिना चित्रित किया जा सकता है, विवो फ्लोरेसेंस बायोमार्कर में उनके संस्कृति मीडिया पर शेष व्यक्तिगत जानवरों में अनुदैर्ध्य रूप से मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जिससे प्रत्येक जानवर के जीवनकाल में गतिशील परिवर्तनों का अवलोकन हो सकता है। यह संस्कृति प्रणाली जीवनकाल और अन्य स्वास्थ्य मैट्रिक्स14,19 को ट्रैक करने के लिए वर्तमान पीढ़ी के स्वचालित सिस्टम के साथ भी संगत है। हम इस माइक्रोट्रे-आधारित प्रणाली में व्यक्तिगत सी एलिगेंस की खेती के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, संभावित नुकसान और समस्या निवारण पर चर्चा करते हैं, और अन्य प्रणालियों के सापेक्ष फायदे और सीमाओं पर चर्चा करते हैं, और विशेष रूप से, एक अद्यतन और अनुकूलित वोरमोटल प्रोटोकॉल15।

प्रत्येक एकल-कृमि संस्कृति वातावरण में कस्टम 3 डी-मुद्रित एडाप्टर (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके एक मानक एकल-वेल ट्रे के अंदर एक माइक्रोट्रे लगाया जाता है। कुएं कम-पिघले हुए अगारोस नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एलएमएनजीएम) से भरे होते हैं, जो खाद्य स्रोत के रूप में केंद्रित बैक्टीरिया के साथ बीजित होते हैं, और कीड़े को भागने से रोकने के लिए पामिटिक एसिड कोटिंग से घिरे होते हैं (चित्रा 1 बी)। माइक्रोट्रे और एकल-वेल प्लेट की दीवारों के बीच की जगह नमी बनाए रखने के लिए संतृप्त पानी के क्रिस्टल से भरी होती है (चित्रा 1 बी)। संघनन को रोकने के लिए ट्रे ढक्कन पर एक डिटर्जेंट कोटिंग लगाई जाती है। प्रत्येक कुएं में एक एकल कीड़ा जोड़ा जाता है, और नमी बनाए रखने और ऑक्सीजन विनिमय की अनुमति देने के लिए एकल-कुएं ट्रे को पैराफिल्म के साथ सील किया जाता है। एक अभ्यास शोधकर्ता द्वारा समानांतर में छह माइक्रोट्रे तक उचित रूप से तैयार किए जा सकते हैं।

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Protocol

1. व्यंजनों

नोट: माइक्रोट्रे प्लेट तैयारी शुरू करने से पहले स्टॉक समाधान तैयार करें।

  1. कम-पिघल वाले अगारोस नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एलएमएनजीएम) के लिए स्टॉक समाधान
    1. 1 लीटर की बोतल में 1 लीटर बाँझ विआयनीकृत पानी में 174.18 ग्राम के 2 एचपीओ 4 के2एचपीओ 4 को घोलकर 1 एम के2एचपीओ4 तैयार करें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआई पर समाधान को आटोक्लेव करें और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें।
    2. 1 लीटर की बोतल में बाँझ विआयनीकृत पानी के 1 लीटर में 136.09 ग्राम केएच2एचपीओ4 को घोलकर 1 एम केपीआई (पीएच 6.0) तैयार करें। पीएच 6.0 प्राप्त करने के लिए 1 एम के2एचपीओ4 के साथ घोल को टाइट करें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी पर घोल को आटोक्लेव करें और इसे आरटी पर स्टोर करें।
    3. 500 एमएल की बोतल में 500 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी में 73.5 ग्राम सीएसीएल2 को घोलकर 1 एम सीएसीएल2 तैयार करें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी पर घोल को आटोक्लेव करें और इसे आरटी पर स्टोर करें।
    4. 500 एमएल की बोतल में 500 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी में 123.25 ग्राम एमजीएसओ4 को घोलकर 1 एम एमजीएसओ4 तैयार करें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी पर घोल को आटोक्लेव करें और इसे आरटी पर स्टोर करें।
    5. एलएमएनजीएम के लिए 3 एम एनएसीएल तैयार करें: साफ 100 एमएल बोतल में, 100 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी और 18.20 ग्राम एनएसीएल मिलाएं। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीसिग पर आटोक्लेव।
    6. 500 एमएल एम्बर बोतल में 2.5 ग्राम कोलेस्ट्रॉल, 275 एमएल 100% इथेनॉल, और 25 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी के संयोजन से 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल तैयार करें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी पर घोल को आटोक्लेव करें और इसे आरटी पर स्टोर करें।
    7. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर बाँझ विआयनीकृत पानी में 0.1231 ग्राम एफयूडीआर घोलकर 50 एमएम फ्लोरोडीऑक्सीयूरिडीन (एफयूडीआर) तैयार करें। घोल को निष्फल करने के लिए 10 एमएल सिरिंज और 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करें। प्रत्येक घोल के 1 मिलीलीटर को 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डालें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर बाँझ विआयनीकृत पानी में 500 मिलीग्राम कार्बेनिसिलिन घोलकर 50 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन तैयार करें। घोल को निष्फल करने के लिए 10 एमएल सिरिंज और 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करें। प्रत्येक घोल के 1 मिलीलीटर को 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डालें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 10 एमएल बाँझ विआयनीकृत पानी में 2.38 ग्राम आईपीटीजी को घोलकर 1 एमएम आइसोप्रोपिल बी-डी-1-थियोगैलेक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) तैयार करें। घोल को निष्फल करने के लिए 10 एमएल सिरिंज और 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करें। प्रत्येक घोल के 1 मिलीलीटर को 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डालें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    10. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 10 मिलीलीटर बाँझ विआयनीकृत पानी में 1 ग्राम एम्पीसिलिन घोलकर 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन तैयार करें। घोल को निष्फल करने के लिए 10 एमएल सिरिंज और 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करें। 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन समाधान के एलिकोट 1 एमएल प्रत्येक को 10 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डालें और ट्यूबों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सामान्य सी एलिगेंस रखरखाव के लिए नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) तैयार करना।
    1. 50 प्लेटें बनाने के लिए, 1 एल फ्लास्क में 486 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी में 10 ग्राम बैक्टो एगर, 1.5 ग्राम एनएसीएल और 1.25 ग्राम बैक्टो पेप्टोन घोलें। कम से कम 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी पर तरल चक्र पर इसे ऑटोक्लेव करके माध्यम को बाँझ करें।
    2. आटोक्लेव के बाद, माध्यम को 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। फिर, 1 M KPi के 12.5 mL, 1 M MgSO4 के 500 μL, 1 M CaCl2 के 500 μL, और 5 mg/mL कोलेस्ट्रॉल के 500 μL को घोल में जोड़ें।
    3. एक बाँझ तकनीक का उपयोग करके, चरण 1.2.2 में तैयार माध्यम के 10 मिलीलीटर को प्रत्येक 60 मिमी प्लेट (कुल 50) में डालें। प्लेटों को ठोस होने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए मीडिया के साथ छोड़ दें। प्लेट के केंद्र पर रात भर उगाए गए बैक्टीरिया कल्चर के पिपेट 300 μL और प्लेट को बेंच पर छोड़ दें। संस्कृति को सूखने दें और 1-2 दिनों के लिए मोटा हो जाएं। बैक्टीरिया के साथ इन एनजीएम प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. एलएमएनजीएम प्रीमिक्सचर तैयार करना
    1. 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में, 2 ग्राम कम-पिघला हुआ अगारोस, 0.25 ग्राम पेप्टोन, 1 एमएल 3 एम एनएसीएल और 99 एमएल अल्ट्राप्योर पानी मिलाएं। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी पर घोल को आटोक्लेव करें।
    2. तरल के नुकसान को रोकने के लिए परीक्षण ट्यूबों में एलएमएनजीएम के 10 एमएल को एलिकोट करें और पैराफिल्म के साथ कवर करें। ट्यूबों को कैप करें और उन्हें ठंडा और ठोस होने दें।
  4. बैक्टीरियल भोजन के लिए 85 एमएम एनएसीएल तैयार करें: 100 एमएल की बोतल में, 515.61 मिलीग्राम एनएसीएल मिलाएं और अल्ट्राप्योर पानी के साथ 100 एमएल तक भरें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीसिग पर आटोक्लेव।
  5. एक ऑटोक्लेवेबल निचोड़ बोतल में 150 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी में टाइप एस सुपर शोषक बहुलक के 1 ग्राम को घोलकर पानी को अवशोषित करने वाले पॉलीक्रिलामाइड क्रिस्टल तैयार करें। पर्याप्त वितरण आकार सुनिश्चित करने के लिए टिप को काटें। 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव, 15 पीसिग, 30 मिनट के लिए, टिनफॉइल के साथ कैप करें, और क्रिस्टल को मिश्रण करने के लिए हिलाएं।
  6. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी में 7 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी के साथ 100% ट्वीन -20 के 3 मिलीलीटर को मिलाकर एक डिटर्जेंट घोल तैयार करें।
  7. 500 एमएल की बोतल में 2.5 ग्राम कोलेस्ट्रॉल, 100% ईटीओएच के 275 एमएल और 25 एमएल अल्ट्राप्योर पानी के संयोजन से 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल तैयार करें।
  8. पामिटिक एसिड वर्किंग घोल तैयार करें
    1. 500 मिलीग्राम ठोस पामिटिक एसिड को मोर्टार और मूसल में पीस लें और इसे 50 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी में ट्वीन -20 के 15 मिलीलीटर के साथ मिलाएं। भंवर द्वारा मिलाएं, जितना संभव हो उतने क्रिस्टल को घोलें।
    2. 100% इथेनॉल के 17.5 एमएल जोड़ें और जितना संभव हो उतना पामिटिक एसिड घोलने के लिए घोल को भंवर करें।
    3. 17.5 एमएल अल्ट्राप्योर पानी और भंवर को कठोरता से जोड़ें। धीरे से 80 डिग्री सेल्सियस पर एक मोती स्नान में घोल को गर्म करें जब तक कि पामिटिक एसिड पूरी तरह से घुल न जाए। ठंडा होने के दौरान कुछ पामिटिक एसिड अवक्षेपित हो सकते हैं।
  9. 1 लीटर या उससे बड़े बीकर में 1 लीटर विआयनीकृत पानी में 20 ग्राम एलबी पाउडर मिलाकर लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) तैयार करें। 500 एमएल शोरबा को दो 500 एमएल बीकर में विभाजित करें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी पर शोरबा को ऑटोक्लेव करें। तैयार शोरबा को आरटी में स्टोर करें।
  10. लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) एगर प्लेटें तैयार करना
    1. 1 लीटर फ्लास्क में 500 μL विआयनीकृत पानी में 10 ग्राम एलबी पाउडर और 7.5 ग्राम बैक्टो एगर मिलाएं। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआईजी पर तरल चक्र पर घोल को आटोक्लेव करें।
    2. यदि वांछित हो, तो आटोक्लेव मीडिया को 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के बाद वैकल्पिक एंटीबायोटिक्स (100 μg / mL एम्पीसिलिन का 500 μL) जोड़ें। एक बाँझ तकनीक का उपयोग करके, प्रत्येक 100 मिमी प्लेट (कुल 25) में 20 मिलीलीटर मीडिया डालकर एलबी एगार प्लेट बनाएं। प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. आयु-सिंक्रनाइज़ कीड़े की आबादी तैयार करना

  1. आयु-सिंक्रनाइज़ कीड़े की एक आबादी तैयार करें जो लार्वा चरण 4 (एल 4) में माइक्रोट्रे में जोड़ने के लिए तैयार हैं। वैकल्पिक रूप से, किसी भी जीवन स्तर पर कीड़े जोड़े जा सकते हैं (एफयूडीआर को माइक्रोट्रे मीडिया से बाहर रखा जाना चाहिए यदि विकासात्मक गिरफ्तारी को रोकने के लिए एल 4 से पहले विकास ता्मक चरण में कीड़े जोड़े जाते हैं)।
    नोट: यह चरण माइक्रोट्रे में कीड़े जोड़ने से 2 दिन पहले पूरा किया जाना चाहिए यदि प्रयोग की शुरुआत में लक्ष्य जीवन चरण एल 4 है। कीड़े को वांछित जीवन चरण तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए सिंक्रनाइज़ेशन समय को समायोजित किया जा सकता है।
  2. तापमान जीवनकाल को प्रभावित कर सकता है। लगातार परिणामों के लिए, सी एलिगेंस को 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए मानक एनजीएम प्लेटों (अनुभाग 1 देखें) का उपयोग करें, और यदि वे बैक्टीरिया के भोजन पर कम चलते हैं तो कीड़े को ताजा प्लेटों में स्थानांतरित करें।
  3. कई युवा वयस्क कीड़े वाले स्टॉक प्लेटों से, आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी उत्पन्न करने के लिए एक मानक दृष्टिकोण का उपयोग करें, आमतौर पर20 या समयबद्ध अंडे देने21 को ब्लीच करें।
  4. अंडे को अलग करें और उन्हें बैक्टीरिया-स्पॉटेड एनजीएम प्लेट में जोड़ें। यदि जंगली प्रकार के सी एलिगेंस का उपयोग किया जाता है, तो अंडे 2 दिनों में एल 4 लार्वा चरण तक पहुंच जाएंगे।

3. बैक्टीरिया कल्चर तैयार करना

  1. प्रयोग की शुरुआत से एक दिन पहले, वांछित जीवाणु खाद्य स्रोत को टीका लगाएं। प्रति प्लेट ~ 5 एमएल बैक्टीरियल कल्चर तैयार करें।
    नोट: बैक्टीरियल स्ट्रीक को 1 महीने पहले तक तैयार किया जा सकता है और ई कोलाई खाद्य स्रोत के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से एलबी एगर प्लेट पर एकल कॉलोनियों के लिए स्ट्रीक बैक्टीरिया।
    2. संस्कृति को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाएं।
    3. प्रति टीकाकरण एक कॉलोनी के साथ तरल एलबी शोरबा का टीका लगाएं।
    4. 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 250 आरपीएम पर हिलाएं।

4. माइक्रोट्रे में पामिटिक एसिड कोटिंग लागू करना

नोट: पामिटिक एसिड व्यक्तिगत कुओं से जानवरों के पलायन को रोकने के लिए एक प्रतिकूल बाधा के रूप में कार्य करता है। कोटिंग कुओं की अंदर की सतहों के अपवाद के साथ, माइक्रोट्रे की पूरी निचली सतह पर लागू होती है। फंगल संदूषण को कम करने के लिए पामिटिक एसिड में निस्टैटिन जोड़ा जाता है। यदि वांछित हो तो प्रयोग शुरू होने से 1 दिन पहले यह चरण पूरा किया जा सकता है।

  1. प्रीहीट करने के लिए समय देने के लिए मोती स्नान को 80 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. उपयोग से तुरंत पहले, पामिटिक एसिड वर्किंग घोल के प्रति माइक्रोट्रे के 1 एमएल को एक अलग बाँझ कंटेनर (आमतौर पर 15 एमएल शंक्वाकार शीशी) में डालें और गर्म करने से पहले पामिटिक एसिड समाधान के प्रति 1 एमएल 10,000 यूनिट / एमएल निस्टैटिन के 4 μL जोड़ें।
  3. संतृप्ति के लिए इथेनॉल (70% या अधिक) के साथ माइक्रोट्रे के अंदर और बाहर स्प्रे करें और अतिरिक्त इथेनॉल को हिलाएं।
    नोट: यूवी क्रॉसलिंकिंग (चरण 4.4) में उपचार के दौरान अवशिष्ट इथेनॉल वाष्पित होना चाहिए।
  4. माइक्रोट्रे को निष्फल करने के लिए यूवी क्रॉसलिंकर का उपयोग करें (निम्नलिखित निर्देश इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले यूवी क्रॉसलिंकर के लिए हैं):
    1. माइक्रोट्रे और ढक्कन को यूवी क्रॉसलिंकर में अलग से रखें (यानी, प्लेटों पर ढक्कन न रखें, क्योंकि यूवी प्लास्टिक में प्रवेश नहीं करता है)।
    2. दरवाजा बंद करें और यूवी क्रॉसलिंकर चालू करें।
    3. समय दबाएँ, 20 मिनट दर्ज करें, और उसके बाद प्रारंभ दबाएँ।
    4. 20 मिनट के बाद, प्लेट और ढक्कन पर पलटें और चरण 4.2.2-4.2.3 दोहराएं।
    5. दस्ताने पहनते समय, नसबंदी के बाद संदूषण को रोकने के लिए माइक्रोट्रे पर ढक्कन रखें।
  5. पामिटिक एसिड के काम करने वाले घोल को भंवर और इनवर्टिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  6. मोती स्नान में पामिटिक एसिड वर्किंग सॉल्यूशन के साथ 15 एमएल शंक्वाकार शीशी रखें और उपयोग से पहले किसी भी दृश्य मान क्रिस्टल को पूरी तरह से घुलने दें।
  7. मोती स्नान के आसपास के किनारे पर माइक्रोट्रे को गर्म होने के लिए ~ 2 मिनट के लिए ढक्कन के साथ रखें।
  8. माइक्रोट्रे ढक्कन हटा दें। धीरे-धीरे माइक्रोट्रे की पिछली दीवार (लंबी तरफ) के पार 200 μL पामिटिक एसिड वर्किंग सॉल्यूशन जोड़ें। ढक्कन बदलें और माइक्रोट्रे को 2-3 मिनट के लिए मोती स्नान पर बैठने दें ताकि पामिटिक एसिड समाधान माइक्रोट्रे के तल पर बस सके।
    नोट: जबकि माइक्रोट्रे का पूरा तल चरण 4.10 तक पूरी तरह से लेपित नहीं होगा, समाधान को नीचे की सतह के आधे से अधिक हिस्से में समान रूप से फैलना चाहिए। यदि पामिटिक एसिड का घोल समान रूप से नहीं फैल रहा है, तो माइक्रोट्रे के पास एक भंवर या कंपन मोटर चालू करें। यह कंपन की एक छोटी मात्रा प्रदान करेगा जो पामिटिक एसिड समाधान को अधिक आसानी से फैलाने की अनुमति देने में मदद कर सकता है। संदूषण को कम करने के लिए माइक्रोट्रे ढक्कन रखें।
  9. चरण 4.8 दोहराएँ।
    नोट: माइक्रोट्रे के तल के लगभग आधे, या अधिक, तरल पामिटिक एसिड के साथ स्पष्ट रूप से कवर किया जाना चाहिए।
  10. माइक्रोट्रे को 180° घुमाएं और ट्रे के दूसरी ओर चरण 4.8 और 4.9 दोहराएं।
    नोट: टेरासाकी ट्रे के निचले हिस्से को केवल पामिटिक एसिड समाधान की एक पतली परत के साथ कवर किया जाएगा जब दोनों पक्षों में पूर्ण संयुक्त मात्रा जोड़ी गई है (चरण 4.9 और 4.10)। मिश्रण की तैयारी, तापमान और अन्य कारकों के आधार पर अधिक या कम पामिटिक एसिड मिश्रण की आवश्यकता हो सकती है। आम तौर पर, पामिटिक एसिड मिश्रण के 400 से 800 μL के बीच माइक्रोट्रे के पूरे तल को कोट करने के लिए पर्याप्त होगा। जैसे ही माइक्रोट्रे के तल को स्पष्ट रूप से कवर किया जाता है, कोई अतिरिक्त पामिटिक एसिड नहीं जोड़ा जाना चाहिए, क्योंकि यह कुओं को दूषित कर सकता है।
  11. ट्रे को एक बाँझ सुखाने वाले बॉक्स या लैमिनर फ्लो हुड में कम से कम 1 घंटे तक सुखाएं। वैकल्पिक रूप से, प्लेटों को लोड करने से एक दिन पहले इस चरण को पूरा करें (अनुभाग 5), कम से कम 16 घंटे के लिए आरटी पर ढक्कन के साथ माइक्रोट्रे को सुखाएं।

5. कम पिघलने वाले नेमाटोड विकास मीडिया (एलएमएनजीएम) के साथ माइक्रोट्रे लोड करना

नोट: यह विधि सामान्य आगर के स्थान पर कम-पिघले हुए अगारोस के साथ मिश्रित मानक एनजीएम का उपयोग करती है। एगर 45 डिग्री सेल्सियस पर जेल करना शुरू कर सकता है। माइक्रोट्रे कुओं को भरने के लिए आवश्यक छोटी मात्रा के साथ काम करते समय, आगर-आधारित एनजीएम अक्सर पिपेट टिप को बंद कर देता है और / या तेजी से गेलिंग के कारण असमान अच्छी सतहों का उत्पादन करता है। कम-पिघले हुए अगारोस का उपयोग करके एनजीएम ~ 28 डिग्री सेल्सियस पर जेल करना शुरू कर देता है, जिससे पिघला हुआ मीडिया आसानी से पाइप किया जा सकता है और लगातार सपाट कुएं की सतहों का निर्माण कर सकता है। एलएमएनजीएम को उसी दिन तैयार करें जिस दिन कीड़े को माइक्रोट्रे पर रखा जाना है। यदि एलएमएनजीएम के साथ माइक्रोट्रे तैयार करना, बैक्टीरिया के साथ सीडिंग करना, और सी एलिगेंस को एक ही दिन के भीतर लोड करना, तो सुनिश्चित करें कि चरणों के इस सेट को शुरू करने से पहले जानवर वांछित उम्र में या उसके करीब हैं।

  1. गर्म होने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस बीड स्नान में एक पिपेट बेसिन रखें।
  2. माइक्रोवेव में ~ 30-45 सेकंड के लिए तैयार किए जा रहे प्रति माइक्रोट्रे (चरण 1.1) में एक 10 एमएल एलएमएनजीएम प्रीमिक्सचर पिघलाएं।
    1. एलएमएनजीएम प्रीमिक्सचर टेस्ट ट्यूब को 200 एमएल बीकर में रखें, बिना ढके हुए ताकि वे टिप न करें।
    2. ~ 10-15 सेकंड के बाद, या जब एलएमएनजीएम प्रीमिक्सचर सिर्फ बुलबुला बनने लगता है, तो माइक्रोवेव को रोक दें, एलएमएनजीएम प्रीमिक्सचर को बाँझ 200 एमएल बीकर में डालें, और माइक्रोवेविंग फिर से शुरू करें।
    3. इसे उबलने से रोकने के लिए आवश्यकतानुसार विराम दें, और मिश्रण करने के लिए घुमाएं।
    4. एक बार जब सभी एलएमएनजीएम बिना किसी टुकड़े के तरल में बदल जाते हैं तो माइक्रोवेविंग बंद कर दें।
      नोट: कुल 192 कुओं (दो माइक्रोट्रे) को भरने के लिए एक 10 एमएल एलिकोट पर्याप्त है।
  3. गर्म कम पिघले हुए अगारोस में सूचीबद्ध क्रम में निम्नलिखित घटकों को जोड़कर एलएमएनजीएम तैयार करें (मात्रा प्रति 10 एमएल कम पिघला हुआ अगारोस है): 250 μL 25 mM KPi (pH 6), 1 M CaCl2 का 10 μL, 1 M MgSO4 का 10 μL, और 5 mg/mL कोलेस्ट्रॉल का 10 μL।
    1. यदि शोधकर्ता समय के साथ वयस्क जानवरों की जांच करने की योजना बना रहा है और प्रजनन को रोकने की आवश्यकता है, तो 50 एमएम एफयूडीआर के 10 μL भी जोड़ें।
    2. यदि सामान्य एचटी 115 आरएनएआई ई कोलाई स्ट्रेन और संबंधित आरएनएआई प्लास्मिड का उपयोग करके आरएनएआई फीडिंग प्रयोग का संचालन किया जाता है, तो 50 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन (आरएनएआई प्लास्मिड का चयन करने के लिए) के 5 μL और 1 एमएम आईपीटीजी के 12 μL (आरएनएआई प्लास्मिड से डबल-फंसे आरएनए की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए) भी जोड़ें।
      नोट: वांछित खाद्य स्रोत के लिए आवश्यक चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं और अन्य रसायनों के आधार पर अतिरिक्त योजक शामिल किए जा सकते हैं। इस स्तर पर एलएमएनजीएम में ड्रग्स या रासायनिक तनाव भी जोड़ा जा सकता है। एनजीएम और एलएमएनजीएम में एनएसीएल की एक ही अंतिम एकाग्रता होती है, लेकिन मीडिया में एनएसीएल को जोड़ने के तरीके में अंतर होता है। एनजीएम के लिए, मीडिया तैयारी (चरण 1.2) के दौरान सभी एनएसीएल को जोड़ा जाता है। एलएमएनजीएम के लिए, एनएसीएल का एक हिस्सा मीडिया तैयारी (चरण 5.3) के दौरान जोड़ा जाता है और एक हिस्सा बैक्टीरिया भोजन (धारा 6) के साथ जोड़ा जाता है। इस परिवर्तन का कारण प्रत्येक माइक्रोट्रे में अच्छी तरह से छोटे मीडिया वॉल्यूम से उपजा है। एलबी में निलंबित 5 μL केंद्रित बैक्टीरिया को 20 μL मीडिया वाले कुएं में जोड़ने से मीडिया की पोषक संरचना में काफी बदलाव आएगा (तुलनीय मात्रा में एलबी के घटकों को जोड़कर)। इससे बचने के लिए, बैक्टीरिया पर आसमाटिक तनाव को रोकते हुए एलबी घटकों को हटाने के लिए बैक्टीरिया को एनएसीएल के समाधान में फिर से निलंबित कर दिया जाता है। बैक्टीरिया में जोड़े गए नमक के लिए मीडिया में जोड़े गए एनएसीएल को तदनुसार कम किया जाता है।
  4. गर्म पिपेट बेसिन में एलएमएनजीएम डालो।
  5. एक बेंचटॉप पर माइक्रोट्रे के साथ, प्रत्येक माइक्रोट्रे में 20 μL lmNGM का उपयोग करें। संदूषण को कम करने के लिए पिपेट को फिर से भरते समय माइक्रोट्रे को कवर करें।
    नोट: यह कदम इलेक्ट्रॉनिक दोहराए जाने वाले पिपेट के साथ आसान है।

6. बैक्टीरिया के भोजन के साथ माइक्रोट्रे कुओं को सीडिंग करना

नोट: रात भर के टीकाकरण संस्कृति से 10 x केंद्रित भोजन का 5 μL अपने जीवनकाल की संपूर्णता के लिए एक सी एलिगेंस को खिलाने के लिए पर्याप्त है।

  1. बैक्टीरिया को रातोंरात कल्चर से 50 एमएल शंक्वाकार शीशी में स्थानांतरित करें।
  2. 20 मिनट के लिए ~ 3,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  3. सतह पर तैरने वाले को हटा दें। 85 mM NaCl समाधान के साथ 10x सांद्रता (मूल संस्कृति का 1/10 मात्रा) पर बैक्टीरिया संस्कृति को पुन: निलंबित करें।
  4. कुओं में बैक्टीरिया जोड़ने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोट्रे का निरीक्षण करें कि ठोस एलएमएनजीएम पूरी तरह से प्रत्येक कुएं के भीतर निहित है। यदि कोई एलएमएनजीएम कुएं के किनारे लटका हुआ है, तो अतिरिक्त एलएमएनजीएम को पिपेट टिप से खुरच लें। यह अतिरिक्त मीडिया भोजन को पामिटिक एसिड में चलाने का कारण बन सकता है यदि साफ नहीं किया जाता है।
  5. प्रत्येक कुएं में एलएमएनजीएम की सतह पर 10x केंद्रित बैक्टीरिया कल्चर के सावधानीपूर्वक पिपेट 5 μL। बैक्टीरिया कल्चर को कुएं के किनारे और पामिटिक एसिड में चलाने की अनुमति देने से बचने की कोशिश करें, क्योंकि यह कीड़े को कुएं को छोड़ने के लिए आकर्षित करेगा।
  6. माइक्रोट्रे को ~ 35 मिनट के लिए बाँझ सुखाने वाले बॉक्स या लैमिनर फ्लो हुड में सूखने दें। हर ~ 5 मिनट की जांच करें और ध्यान रखें कि अधिक सूखा न हो। जब कुछ कुएं स्पष्ट रूप से थोड़े गीले हों, तो हटा दें, क्योंकि नेमाटोड जोड़े जाने के दौरान कुएं और सूख जाएंगे।

7. प्रत्येक माइक्रोट्रे को सिंगल-वेल प्लेट के अंदर संलग्न करना

नोट: इस खंड में, माइक्रोट्रे को कस्टम 3 डी-मुद्रित सम्मिलित का उपयोग करके एक मानक एकल-वेल प्लेट के अंदर रखा जाता है और पानी को अवशोषित करने वाले क्रिस्टल से घिरा होता है। सिंगल-वेल प्लेट को फिर बंद कर दिया जाता है और पैराफिल्म के साथ सील कर दिया जाता है। यह संदूषण को रोकने और कई सप्ताह के प्रयोगों के दौरान एलएमएनजीएम को सूखने से रोकने के लिए पर्याप्त आर्द्रता बनाए रखते हुए ऑक्सीजन विनिमय की अनुमति देता है (जीवनकाल-विस्तारित उत्परिवर्तन या पर्यावरणीय स्थितियों की जांच करने पर कृमि जीवनकाल प्रयोग 6-8 सप्ताह तक चल सकते हैं)। तैयारी के दौरान, जब भी बैक्टीरिया या फंगल संदूषण को कम करने के लिए सक्रिय रूप से कुछ नहीं जोड़ा जाता है, तो प्लेट को कवर करना सुनिश्चित करें।

  1. एक सिंगल-वेल प्लेट और 3 डी प्रिंटेड एडाप्टर और ढक्कन को 10% ब्लीच घोल में डुबोकर कीटाणुरहित करें। बाँझ डीआई पानी से अच्छी तरह से धो लें। टास्क वाइप से सूखा पोंछ लें।
  2. सिंगल-वेल प्लेट और 3 डी प्रिंटेड एडाप्टर और ढक्कन को 70% या अधिक इथेनॉल समाधान के साथ स्प्रे करें और टास्क वाइप से साफ करें। किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल हवा को सूखने दें।
    नोट: यूवी विकिरण का उपयोग माइक्रोट्रे के समान मापदंडों के साथ ब्लीच और इथेनॉल के बाद भी किया जा सकता है, जैसा कि चरण 4.4 में ऊपर वर्णित है।
  3. बाँझ 3 डी-मुद्रित सम्मिलित को बाँझ एकल-वेल प्लेट में रखें।
  4. तैयार माइक्रोट्रे के बाहर को 70% इथेनॉल के साथ छिड़ककर निष्फल करें।
  5. माइक्रोट्रे को सिंगल-वेल प्लेट में 3 डी-मुद्रित एडाप्टर में रखें।
  6. माइक्रोट्रे ढक्कन को हटा दें।
  7. माइक्रोट्रे की बाहरी दीवार और एकल-वेल प्लेट की आंतरिक दीवार के बीच 3 डी-मुद्रित सम्मिलित के शीर्ष पर उदारतापूर्वक पानी के क्रिस्टल वितरित करें।
  8. तुरंत कीड़े (अनुभाग 8) जोड़ें या अगले दिन उपयोग करने के लिए माइक्रोट्रे को सील करें। ट्रे ढक्कन बंद करें और माइक्रोट्रे को सील करने के लिए सभी चार पक्षों को लपेटने के लिए पैराफिल्म के एक टुकड़े का उपयोग करें। पैराफिल्म के साथ सीलिंग चरण को कुल तीन परतों के लिए दो और बार दोहराएं।
  9. माइक्रोट्रे को सील करने के बाद, कीड़े जोड़ने से पहले इसे आरटी में बेंच पर 4 दिनों तक छोड़ दें (धारा 8)।

8. माइक्रोट्रे में कीड़े जोड़ना

नोट: प्लैटिनम पिक का उपयोग करके आयु-सिंक्रनाइज़ कीड़े आबादी (खंड 2) से जानवरों को स्थानांतरित करके प्रत्येक कुएं में एक कीड़ा मैन्युअल रूप से जोड़ा जा सकता है। केवल वांछित जीवन स्तर पर जानवरों को स्थानांतरित करें। यदि स्थानांतरण प्रक्रिया में 1 घंटे से अधिक समय लगता है, तो माइक्रोट्रे कुओं में एलएमएनजीएम देसी हो सकता है। एक समय में 10 से 20 कीड़े के समूहों को स्थानांतरित करना इस कदम को तेज कर सकता है, लेकिन प्रति कुएं केवल एक जानवर को लगातार छोड़ने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है।

  1. वांछित जीवन चरण तक पहुंचने के बाद प्रति कुएं एक निमेटोड जोड़ें।
  2. संदूषण को कम करने के लिए स्रोत प्लेट से कीड़े चुनते समय ढक्कन को माइक्रोट्रे पर वापस रखें।

9. दीर्घकालिक उपयोग के लिए संस्कृति वातावरण तैयार करना समाप्त करना।

नोट: नीचे दिए गए चरण ों को यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि माइक्रोट्रे में मीडिया और कीड़े प्रयोग अवधि के लिए हाइड्रेटेड रहें।

  1. सिंगल-वेल प्लेट के ढक्कन में डिटर्जेंट समाधान के ~ 40 μL जोड़ें और ढक्कन को समान रूप से कोट करने के लिए एक टास्क वाइप का उपयोग करें। प्लेट सील होने के बाद यह कोटिंग समय के साथ संघनन को रोक देगी। डिटर्जेंट समाधान को फैलाने के लिए अतिरिक्त टास्क वाइप्स का उपयोग करें जब तक कि ढक्कन के माध्यम से दृष्टि विकृत न हो (इसमें आमतौर पर लगभग दो टास्क वाइप्स लगते हैं)।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए पानी के क्रिस्टल की जांच करें कि वे दोनों माइक्रोट्रे के शीर्ष किनारे के साथ स्तर पर हैं और अतिप्रवाह नहीं कर रहे हैं। यदि आवश्यक हो, तो प्लेट में पानी के क्रिस्टल जोड़ें या निकालें।
  3. निम्नलिखित दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, ट्रे को पैराफिल्म (कुल तीन टुकड़े) के साथ लपेटें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि पैराफिल्म सील लंबे समय तक चलेगी।
    1. ट्रे के दो किनारों को कवर करने के लिए पैराफिल्म के पहले टुकड़े को थोड़ा खींचें।
    2. पैराफिल्म के दूसरे टुकड़े को थोड़ा खींचें और ट्रे के शेष किनारों को कवर करें।
    3. पैराफिल्म के अंतिम टुकड़े को फैलाएं और ट्रे के सभी चार किनारों को पूरी तरह से लपेटें, पैराफिल्म के पहले और दूसरे टुकड़े को कवर करें। एक ठीक से सील माइक्रोट्रे ~ 2 महीने तक हाइड्रेटेड रह सकता है।
      नोट: प्रयोग के दौरान हर 1-2 सप्ताह में पैराफिल्म अखंडता की निगरानी करें, और आवश्यकतानुसार बदलें।
    4. किसी भी फिंगरप्रिंट को हटाने के लिए ट्रे के शीर्ष को 70% इथेनॉल के साथ नम, टास्क वाइप के साथ पोंछें।
  4. टेप का उपयोग करके एकल-वेल प्लेट को लेबल करें। माइक्रोट्रे अब समय के साथ कीड़े की निगरानी के लिए इमेजिंग और दीर्घकालिक भंडारण के लिए तैयार है। इमेजिंग सत्रों के बीच, ट्रे को 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। माइक्रोट्रे को दवा की खुराक या अन्य प्रक्रियाओं के लिए कई बार खोला और फिर से सील किया जा सकता है, लेकिन संदूषण और नमी के नुकसान को रोकने के लिए इसे कम से कम किया जाना चाहिए।

10. माइक्रोट्रे कुओं में व्यक्तिगत कीड़े की इमेजिंग।

नोट: इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य माइक्रोट्रे संस्कृति वातावरण तैयार करने के तरीके का विस्तृत विवरण प्रदान करना है। एक बार कीड़े के साथ तैयार और आबाद होने के बाद, माइक्रोट्रे सिंगल-वर्म कल्चर वातावरण का उपयोग पेट्री प्लेटों पर मानक संस्कृति के लिए स्थापित तकनीकों का उपयोग करके कई फेनोटाइप ्स की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए किया जा सकता है। निम्नलिखित अनुभाग कुछ सामान्य फेनोटाइप को मापने के लिए बुनियादी निर्देश प्रदान करता है। फ्लोरोसेंट इमेजिंग एक ईमानदार माइक्रोस्कोप में किया जाना चाहिए। टेरासाकी ट्रे के माध्यम से प्रकाश का अपवर्तन एक अंधेरे कमरे में कम से कम होता है।

  1. जीवनकाल: प्लेट के किनारे या शीर्ष पर धीरे से टैप करके या प्लेट पर एक उज्ज्वल नीली रोशनी चमकाकर और प्रत्येक जानवर का अवलोकन करके जीवनकाल को मापें। एक जानवर को "मृत" स्कोर करें यदि वह कुछ सेकंड के भीतर नहीं चलता है। इस कार्य को हर 1-3 दिनों में दोहराएं जब तक कि सभी कीड़े मर न जाएं।
    नोट: माइक्रोट्रे संस्कृति वातावरण उन प्रणालियों के साथ संगत है जो जीवनकाल अनुमान14,19 के लिए छवि संग्रह और विश्लेषण को स्वचालित करते हैं।
  2. मानक माइक्रोस्कोपी: व्यक्तिगत कुओं पर या उच्च-रिज़ॉल्यूशन कैमरा या स्कैनर के साथ पूरी ट्रे पर ब्राइटफील्ड (या डार्कफील्ड) इमेजिंग करें। इस इमेजिंग डेटा का उपयोग विभिन्न प्रकार के फेनोटाइप्स के लिए किया जा सकता है, जिसमें जानवरों का आकार 22,23,24, विकास 25, गतिविधि 14,19 और जीवनकाल शामिल हैं।
  3. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी: एकल कुओं पर फ्लोरोसेंट इमेजिंग या तो मैन्युअल रूप से या मोटर चालित प्लेटफॉर्म सिस्टम के साथ करें। सिंगल-वेल ट्रे मानक मल्टी-वेल प्लेट एडेप्टर के साथ संगत हैं। सिग्नल-टू-शोर कम हो जाता है यदि उपकरण को काली दीवार वाले बॉक्स में रखा जाता है।
    नोट: क्योंकि कीड़े को क्रॉल करने के लिए स्वतंत्र रहते हुए चित्रित किया जाता है, यह कल्चर सिस्टम पूरे शरीर की प्रतिदीप्ति और फ्लोरोफोरे के खुरदरे ऊतक स्थानीयकरण को पकड़ने के लिए कम-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन और उच्च-आवर्धन इमेजिंग के लिए आमतौर पर जानवरों को आंदोलन को रोकने के लिए स्थिर होने की आवश्यकता होती है। हालांकि प्रत्येक कुएं पर पैरालाइजिंग एजेंट (जैसे, सोडियम एज़ाइड या लेवामिसोल) को शीर्ष रूप से लागू करना और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ आगे बढ़ना संभव होना चाहिए, यह बाद के समय बिंदुओं पर एक ही कीड़े के बार-बार माप को रोक देगा। संस्कृति प्रणाली, जैसा कि वर्णित है, उलटा होने का इरादा भी नहीं है, जो उल्टे माइक्रोस्कोप सिस्टम के उपयोग को रोकता है।
    1. यदि ब्राइटफील्ड का उपयोग जीवनकाल को मापने के लिए नहीं किया जा रहा है और केवल प्रतिदीप्ति पर कब्जा किया जा रहा है, तो जीवनकाल को मैन्युअल रूप से मापें। 5 सेकंड के लिए कीड़े पर नीली रोशनी (जीएफपी उत्तेजना के लिए उपयोग किया जाता है) छोड़ने से जानवर को स्थानांतरित करने के लिए प्रेरित किया जाएगा। यदि जानवर 5 सेकंड के भीतर नहीं चला है, तो जानवर को मृत मानें।

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Representative Results

यहां वर्णित माइक्रोट्रे-आधारित एकल-कृमि संस्कृति वातावरण का उपयोग विभिन्न प्रकार के फेनोटाइप्स की निगरानी के लिए किया जा सकता है, जिसमें जीवनकाल और स्वास्थ्य अवधि, गतिविधि और आंदोलन, शरीर का आकार और क्रॉलिंग ज्यामिति, और समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों में ट्रांसजेनिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट बायोमार्कर की अभिव्यक्ति शामिल है। माइक्रोट्रे कल्चर सिस्टम या तो मैनुअल स्कोरिंग या छवि संग्रह और डाउनस्ट्रीम इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से जीवनकाल विश्लेषण के साथ संगत है। पेट्री प्लेट्स21 पर मानक संस्कृति के साथ, कीड़े को उत्तेजना के बाद आंदोलन के आधार पर मैन्युअल रूप से मृत या जीवित के रूप में स्कोर किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, प्लेट को टैप करना या नीली रोशनी के संपर्क में)। छवि-आधारित जीवनकाल विश्लेषण के लिए, उत्तेजना लागू होने के बाद ली गई छवियों के बीच फ्रेम-टू-फ्रेम अंतर की तुलना का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि प्रत्येक कीड़ा कब चलना बंद कर देता है। यह स्वचालित छवि संग्रह और विश्लेषण प्रणालियों के साथ संगत है और प्रत्येक समय बिंदु पर व्यक्तिगत जानवरों के गतिविधि स्तर के रूप में अतिरिक्त डेटा प्रदान करता है। इस जानकारी का उपयोग न केवल जीवनकाल (आंदोलन की समाप्ति) का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है, बल्कि स्वास्थ्य अवधि (कम गतिविधि की एक सीमा; कई परिभाषाएं प्रस्तावित की गई हैं) का भी अनुमान लगाया जा सकता है। अतिरिक्त मापदंडों (शरीर का आकार, आकार और मुद्रा) को भी इन छवियों से मापा जा सकता है।

इस माइक्रोट्रे कल्चर सिस्टम की प्रमुख विशेषताएं हैं (1) समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों को ट्रैक करने की क्षमता, (2) संस्कृति प्रणाली और आहार प्रतिबंध या रासायनिक तनाव एजेंटों जैसे प्रतिकूल हस्तक्षेपों के बीच संगतता, और (3) संस्कृति वातावरण में सीधे प्रतिदीप्ति को मापने की क्षमता। इन विशेषताओं को प्रदर्शित करने के लिए, हमने कीड़े को भारी धातु तनाव को प्रेरित करने के लिए 250 μM कॉपर सल्फेट (CuSO4) या प्रोटीन मिसफोल्डिंग तनाव को प्रेरित करने के लिए 10 mM dithiothreitol (DTT) से अवगत कराया और दैनिक गतिविधि, जीवनकाल और स्वास्थ्य अवधि को मापा। क्यूएसओ4और डीटीटी दोनों ने कृमि जीवनकाल को काफी कम कर दिया (चित्रा 2 ए)। दैनिक गतिविधि की निगरानी ने हमें प्रत्येक कीड़े के व्यक्तिगत स्वास्थ्य काल का अनुमान लगाने की अनुमति दी, यहां उस उम्र के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर एक कीड़ा अब उत्तेजना के जवाब में पूरे शरीर की लंबाई को स्थानांतरित नहीं कर सकता है। सीयूएसओ4 और डीटीटी ने अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा 2 बी) के सापेक्ष स्वास्थ्य अवधि को कम कर दिया। इसके विपरीत, क्यूएसओ4 ने अच्छे स्वास्थ्य में बिताए गए जीवन के अनुपात को कम कर दिया, जबकि डीटीटी ने नहीं किया (चित्रा 2 सी)। क्यूएसओ4 ने सभी उम्र में डीटीटी की तुलना में आबादी के भीतर व्यक्तियों में औसत गतिविधि को कम कर दिया (चित्रा 2 डी), साथ ही जीवनकाल में प्रत्येक जानवर के लिए संचयी गतिविधि (गतिविधि वक्र [एयूसी] के तहत क्षेत्र के रूप में गणना); चित्रा 2 ई)। इस माइक्रोट्रे सेटअप का एक महत्वपूर्ण लाभ आबादी के भीतर अलग-अलग जानवरों में अलग-अलग समय बिंदुओं पर मापा गया फेनोटाइप को सहसंबंधित करने की क्षमता है। इस मामले में, हम पाते हैं कि 10 वें दिन तक व्यक्तिगत जानवरों के लिए संचयी गतिविधि डीटीटी-चुनौती वाले जानवरों के जीवनकाल के साथ संबंधित है, लेकिन अनुपचारित नियंत्रण या क्यूएसओ4-चुनौती वाले जानवरों के लिए नहीं (चित्रा 2 एफ)।

पूरे जीवनकाल में फ्लोरोसेंट बायोमाकर्स की निगरानी करने की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, हमने किनू -1 जीन के सी-टर्मिनस से जुड़े एमस्कारलेट ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए माइक्रोट्रे कल्चर सिस्टम का उपयोग किया, जो किनुरेनिन चयापचय मार्ग में एंजाइम किनुरेनिनेस को एन्कोडिंग करता है। हमने पहले पाया था कि किनू द्वारा एन्कोड किए गए मानव किनुरेनिनेस की अभिव्यक्ति, रक्त मेंउम्र के साथ बढ़ती है, और सी एलिगेंस में किनू -1 का वध जीवनकाल27 का विस्तार करने के लिए पर्याप्त है। KYNU-1 आयु-निर्भर अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है; यह एल 4 लार्वा चरण में लगभग अज्ञात है और वयस्कता के दिन 9 पर चरम पर है। वयस्कता के दिनों 3 और 8 के बीच अभिव्यक्ति में भारी वृद्धि देखी जाती है, और उसके बाद उम्र के साथ प्रगतिशील गिरावट होती है (चित्रा 3 ए, पूरक चित्रा 1)। केवाईएनयू -1 और सी एलिगेंस उम्र बढ़ने के बीच संबंधों का आकलन करने के लिए, हमने वयस्कता के 14 वें दिन तक केवाईएनयू -1 की संचयी बहुतायत को निर्धारित किया (एक उम्र जिस पर अधिकांश जानवर अभी भी जीवित थे) और जीवनकाल के साथ एक महत्वपूर्ण सहसंबंध पाया (चित्रा 3 बी)। चूंकि KYNU1 अभिव्यक्ति जीवनकाल के दौरान गतिशील है, इसलिए हमने अलग-अलग जानवरों में समग्र अस्तित्व के लिए अलग-अलग उम्र में KYNU-1 अभिव्यक्ति की तुलना की। किसी भी समय बिंदु पर केवाईएनयू -1 अभिव्यक्ति अस्तित्व के साथ महत्वपूर्ण रूप से सहसंबद्ध नहीं थी (चित्रा 3 सी-एफ), यह दर्शाता है कि आजीवन अभिव्यक्ति एकल समय बिंदु आकलन की तुलना में जीवनकाल प्रभाव का बेहतर संकेत है।

संयुक्त रूप से, ये प्रयोग प्रतिनिधि डेटा प्रदान करते हैं जो माइक्रोट्रे-आधारित एकल-कृमि संस्कृति प्रणाली की क्षमताओं को उजागर करते हैं ताकि कृमि गतिविधि, स्वास्थ्य, जीवनकाल और फ्लोरोसेंट बायोमाकर्स में गतिशील परिवर्तनों को कैप्चर किया जा सके और व्यक्तिगत जानवरों में उम्र में तुलना की जा सके। विशेष रूप से, कई समय बिंदुओं पर व्यक्तियों की निगरानी करने की क्षमता विवो में शारीरिक और आणविक फेनोटाइप दोनों में गतिशील परिवर्तनों को ट्रैक करने की अनुमति देती है, जिससे पैटर्न का पता लगाने में मदद मिलती है जो आबादी में क्रॉस-अनुभागीय माप का उपयोग करके स्पष्ट नहीं होगी।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोट्रे एकल-कृमि संस्कृति वातावरण। (ए) कस्टम 3 डी-मुद्रित एडाप्टर का उपयोग करके एकल-वेल प्लेट के भीतर लगाए गए माइक्रोट्रे का 3 डी प्रतिपादन। (बी) एकल-कृमि संवर्धन प्रणाली का योजनाबद्ध जो कम-पिघले हुए अगारोस नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम), जीवाणु भोजन, पृथक सी एलिगेंस, प्रतिकूल पामिटिक एसिड कोटिंग, 3 डी मुद्रित एडाप्टर, पानी के क्रिस्टल और एकल-वेल प्लेट के साथ एक माइक्रोट्रे की सापेक्ष स्थिति को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोट्रे एकल-कृमि वातावरण का उपयोग करके आबादी में अलग-अलग जानवरों में फेनोटाइप का सहसंबंध। सभी पैनल एक प्रयोग से डेटा प्रदान करते हैं जो जंगली-प्रकार (एन 2) सी एलिगेंस के तीन समूहों की तुलना करते हैं। एन = 55), 250 μM कॉपर सल्फेट (CuS04; एन = 38), या 10 एमएम डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी; एन = 34) वयस्कता के दिन 2 से शुरू होता है। जीवनकाल (ए) और स्वास्थ्य अवधि (बी) दोनों क्यूएसओ4 या डीटीटी के पुराने संपर्क से मामूली रूप से कम हो जाते हैं। स्वास्थ्य अवधि को अंतिम दिन के रूप में परिभाषित किया गया है जब एक जानवर प्लेट पर कम से कम एक पूर्ण शरीर की लंबाई को स्थानांतरित कर सकता है। युग्मवार महत्व की गणना लॉग-रैंक टेस्ट (आर सुर्वडिफ फ़ंक्शन) का उपयोग करके की जाती है। (सी) प्रत्येक आबादी के भीतर स्वास्थ्य अवधि और जीवनकाल औसत (शीर्ष: पूर्ण मूल्य; नीचे: प्रत्येक समूह के औसत जीवनकाल के लिए सामान्यीकृत)। (डी) जीवनकाल में प्रत्येक समूह के भीतर औसत कृमि गतिविधि (दैनिक गतिविधि का 3 दिन का रोलिंग औसत) और (ई) जीवनकाल गतिविधि वक्र (एयूसी) के तहत व्यक्तिगत पशु क्षेत्र की जनसंख्या औसत दोनों सीयूएसओ4 या डीटीटी द्वारा काफी हद तक क्षीण हैं। समूहों के बीच अलग-अलग जानवरों के लिए एयूसी की तुलना करने के लिए मान-व्हिटनी यू परीक्षण द्वारा निर्धारित महत्व। (एफ) दिन 10 (नीचे) तक व्यक्तिगत जानवरों के लिए संचयी गतिविधि डीटीटी के संपर्क में आने वाले जानवरों के लिए जीवनकाल से संबंधित है, लेकिन क्यूएसओ4 के संपर्क में आने वाले नियंत्रित जानवरों या जानवरों के लिए नहीं, जैसा कि रैखिक प्रतिगमन (आर में एलएम फ़ंक्शन) द्वारा निर्धारित किया गया है। n.s. = महत्वपूर्ण नहीं, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. कई तुलनाओं के लिए सभी पी-मानों को समायोजित करने के लिए बोनफेरोनी विधि का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पूरे जीवनकाल में व्यक्तिगत सी एलिगेंस में केवाईएनयू -1 की गतिशील मात्रा। एमस्कारलेट के साथ एलिगेंस को काइनू -1 जीन (केवाईएनयू -1: : एमस्कारलेट) के सी-टर्मिनस से इन-फ्रेम में जोड़ा गया था, जिसे 36 दिनों के लिए हर 1-4 दिनों में मोनोक्रोम कैमरे से लैस फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था जब तक कि सभी जानवर मर नहीं गए थे। (ए) केवाईएनयू -1, जैसा कि केवाईएनयू -1 की दैनिक मात्रा द्वारा मापा जाता है: एमस्कारलेट फ्लोरेसेंस, पूरे जीवनकाल में एक अलग आयु-निर्भर अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाता है (प्रत्येक उम्र में दिखाए गए कीड़े में औसत मूल्य)। (बी) संचयी केवाईएनयू -1: वयस्कता के दिन 14 के माध्यम से स्कारलेट अभिव्यक्ति व्यक्तिगत जानवरों में जीवनकाल के साथ संबंधित है। (सी) एल 4 लार्वा चरण (वयस्कता का दिन 0), (डी) वयस्कता का दिन 4, (ई) वयस्कता का दिन 9, और (एफ) वयस्कता का दिन 15 में स्कार्लेट अभिव्यक्ति व्यक्तिगत जानवरों में जीवनकाल के साथ सहसंबंधित नहीं थी। रैखिक प्रतिगमन (Microsoft Excel में डेटा विश्लेषण प्रतिगमन फ़ंक्शन) द्वारा गणना किए गए सहसंबंध। n.s. = महत्वपूर्ण नहीं, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. सभी पी-मानों को बोनफेरोनी विधि का उपयोग करके कई तुलनाओं के लिए समायोजित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: एकल KYNU-1:: mScarlet C. एलिगेंस लाल चैनल के तहत पूरे जीवनकाल में छवि। एक पूर्वनिर्मित माइक्रोट्रे का एकल कुआं जिसमें एमस्कारलेट टैग किए गए केवाईएनयू -1 के साथ एक एकल सी एलिगेंस होता है जो केंद्रित ई कोलाई खाद्य स्रोत पर रहता है। जानवर को पहले एल 4 लार्वा चरण में चित्रित किया गया था और फिर उसके शेष जीवन के लिए 1-5 दिनों की वृद्धि पर चित्रित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2: टेरासाकी ट्रे बनाम वोरमोटल पृष्ठभूमि और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत आर्टिफैक्ट तुलना। प्रीफैब्रिकेटेड माइक्रोट्रे (ऊपर) या मोल्ड किए गए पीडीएमएस वोरमोटेल (नीचे) के कुओं को जीएफपी (ए), आरएफपी (बी), और डीएपीआई (सी) फ्लोरेसेंस चैनलों के तहत मोनोक्रोम कैमरे से लैस फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। छवियों को झूठे रंग में दिखाया जाता है, और संतृप्ति के बिंदुओं को उजागर करने के लिए एक हीटमैप का उपयोग किया जाता है। दोनों संस्कृति प्रणालियों में सभी चैनलों में निम्न-स्तरीय पृष्ठभूमि है। वोरमोटेल प्लेटें छिटपुट उच्च-सिग्नल कलाकृतियों से ग्रस्त हैं, जो पीडीएमएस मोल्डिंग प्रक्रिया14,15 के दौरान अनजाने में कैप्चर किए गए माइक्रोबबल या धूल या अन्य कण हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. 3 डी-मुद्रित सम्मिलित करने के लिए एक स्टीरियोलिथोग्राफी (एसटीएल) फ़ाइल जिस पर माइक्रोट्रे को एकल-वेल प्लेट में रखा जाता है। इस फ़ाइल में एक ठोस तल के साथ पूर्ण संस्करण है और एक ऐसी प्रणाली में उपयोग के लिए सबसे उपयुक्त है जहां प्रकाश स्रोत प्लेट के ऊपर है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. 3 डी-मुद्रित सम्मिलित करने के लिए एक स्टीरियोलिथोग्राफी (एसटीएल) फ़ाइल जिस पर माइक्रोट्रे को एकल-वेल प्लेट में रखा जाता है। इस फ़ाइल में अथाह संस्करण है और यह एक ऐसी प्रणाली में उपयोग के लिए सबसे उपयुक्त है जहां प्रकाश स्रोत प्लेट के नीचे है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम एक नई संस्कृति प्रणाली का वर्णन करते हैं जो मूल रूप से मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन ऊतक टाइपिंग परख के लिए विकसित माइक्रोट्रे को अनुकूलित करता है, ताकि एक ठोस मीडिया वातावरण में समय के साथ एकल सी एलिगेंस के अलगाव और लक्षण वर्णन की अनुमति मिल सके जो प्रासंगिक रूप से एगर-आधारित एनजीएम के समान है जो सी एलिगेंस अनुसंधान में मानक है। यह प्रणाली आहार प्रतिबंध, बहिर्जात दवा उपचार, रासायनिक या पर्यावरणीय तनावों के साथ एक चुनौती, और आरएनएआई सहित विभिन्न हस्तक्षेपों के साथ संगत है। यह आगे व्यक्तिगत जानवरों में विवो में फ्लोरोसेंट बायोमार्कर की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति देता है। एक आबादी के भीतर व्यक्तिगत जानवरों का पालन करने की क्षमता अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को एक अलग अस्थायी घटक के साथ फेनोटाइप के लिए आबादी के भीतर मूल्यांकन करने की अनुमति देती है, जिसमें व्यवहार, रोगजनन, तनावपूर्ण स्थितियों की प्रतिक्रिया और स्वास्थ्य में गिरावट शामिल है। यह प्रारंभिक जीवन के लक्षणों को भी सक्षम बनाता है जो आबादी के भीतर भिन्न होते हैं, जिन्हें जीवन काल और स्वास्थ्य सहित देर से जीवन के परिणामों से जोड़ा जाता है। अन्य एकल-कृमि इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के समान, यह माइक्रोट्रे-आधारित संस्कृति प्रणाली संभावित भ्रामक कारकों से बचते हुए व्यक्तिगत जानवरों को पूरे जीवन में कई समय बिंदुओं पर निगरानी करने में सक्षम बनाती है, जैसे कि तनाव प्रतिक्रिया मार्गों की सक्रियता जो तब होती है जब कीड़े तरल वातावरण में सुसंस्कृत होते हैं (जैसा कि कई माइक्रोफ्लुइडिक्स उपकरणों में होता है)। यह इस संस्कृति प्रणाली में एकत्र किए गए डेटा को ठोस मीडिया पर किए गए पिछले सी एलिगेंस काम के बहुमत के साथ अधिक सीधे तुलना करने की अनुमति देता है। हाल की तकनीकी प्रगति सी एलिगेंस लक्षण वर्णन के कई पहलुओं के स्वचालन की अनुमति देती है, जिसमें विकास, विकास और उम्र बढ़ने28 शामिल हैं। यह संस्कृति प्रणाली, जब स्वचालित माइक्रोस्कोपी और संबंधित सॉफ़्टवेयर के साथ संयुक्त होती है, तो जीवनकाल, स्वास्थ्य अवधि, गतिविधि और अन्य शारीरिक मापदंडों14,19 के स्वचालित, उच्च-थ्रूपुट संग्रह के साथ संगत होती है।

हम नियमित रूप से दवा उपचार और आरएनएआई जैसी गैर-तनावपूर्ण परिस्थितियों में व्यक्तिगत सी एलिगेंस के लिए शारीरिक फेनोटाइप (जैसे, आजीवन गतिविधि), स्वास्थ्य अवधि और दीर्घायु की निगरानी के लिए वोरमोटेल14,15 का उपयोग करते हैं। हमारे अनुभव में, अन्य एकल-कृमि इमेजिंग प्रौद्योगिकियां इन फेनोटाइप्स में व्यक्तिगत भिन्नता की निगरानी के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करती हैं, लेकिन उनकी दो सीमाएं हैं। सबसे पहले, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के संदर्भ में, चिप को ढालने के लिए उपयोग की जाने वाली पीडीएमएस सामग्री माइक्रोबबल बनाती है और छोटे कण पदार्थ को पकड़ती है, जिनमें से दोनों जीएफपी उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के पास फ्लोरेस करते हैं। यह दृश्य कलाकृतियों को उत्पन्न करता है जब प्लेटों को विभिन्न प्रतिदीप्ति चैनलों (पूरक चित्रा 2) के तहत देखा जाता है। एक दूसरी सीमा यह है कि कॉपर सल्फेट भागने से रोकने के लिए एक अपर्याप्त निवारक है जब कीड़े को हस्तक्षेप के अधीन किया जाता है जो स्वयं प्रतिकूल होते हैं, विशेष रूप से आहार प्रतिबंध, रोगजनक बैक्टीरिया, या तनाव-उत्प्रेरण एजेंट। अन्य एकल-कृमि सेटअप ों की खाई पामिटिक एसिड को समायोजित करने के लिए बहुत संकीर्ण और हाइड्रोफोबिक है, जो आमतौर पर पेट्री प्लेटों पर आहार प्रतिबंध या अन्य प्रतिकूल परिस्थितियों में आबादी को बनाए रखने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक मजबूत प्रतिकूल एजेंट है।

यहां प्रस्तुत माइक्रोट्रे सिंगल-वर्म कल्चर तकनीक दोनों सीमाओं को संबोधित करती है। माइक्रोट्रे की बड़ी खाई का आकार और हाइड्रोफिलिक सामग्री, गर्मी के आवेदन और ट्वीन 20 को शामिल करने के साथ, पामिटिक एसिड को एलएमएनजीएम पैड को दूषित किए बिना प्रत्येक कुएं के चारों ओर एक बढ़ी हुई प्रतिकूल बाधा के रूप में लागू करने की अनुमति देता है। माइक्रोट्रे का पॉलीस्टाइनिन निर्माण केवल निम्न-स्तरीय, लगातार वितरित ऑटोफ्लोरेसेंस उत्पन्न करता है, जो ऑटोफ्लोरोसेंट माइक्रोबबल और पीडीएमएस के कण समावेशन के मुद्दे से बचता है (पूरक चित्रा 2)। विवर्तन को कम करने के लिए ट्रे के नीचे और आसपास एक काली सतह का उपयोग करके पृष्ठभूमि शोर और कलाकृतियों दोनों को और कम किया जाता है। हम एक खोखले एडाप्टर (ब्राइटफील्ड इमेजिंग की अनुमति देने वाले) और एक ठोस ब्लैक एडाप्टर (एक डार्कफील्ड प्रदान करने वाले जो डार्कफील्ड और फ्लोरेसेंस इमेजिंग दोनों में सुधार करता है; पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 देखें) दोनों के लिए 3 डी प्रिंटिंग फाइलें शामिल हैं। जबकि एलएमएनजीएम स्वयं कुछ ऑटोफ्लोरेसेंस उत्पन्न करता है, छवि की गुणवत्ता पर प्रभाव छोटे कुएं की मात्रा से कम हो जाता है। ये कारक माइक्रोट्रे को विवो में व्यक्तिगत जानवरों के बार-बार फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए इष्टतम बनाते हैं, उन्हें उनके संस्कृति वातावरण से हटाए बिना। अन्य एकल-कृमि इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के सापेक्ष माइक्रोट्रे एकल-संस्कृति प्रणाली का मुख्य नुकसान नमूना आकार है; प्रत्येक माइक्रोट्रे 96 व्यक्तिगत रूप से सुसंस्कृत जानवरों को समायोजित कर सकता है, प्रत्येक वोरमोटेल14,15 की 240-पशु क्षमता के विपरीत। दोनों सक्षम एकल-कृमि संस्कृति प्रणाली प्रदान करते हैं, और प्रयोगात्मक अनुप्रयोग यह निर्धारित करता है कि कौन सा सबसे उपयुक्त है।

माइक्रोट्रे संस्कृति प्रणाली की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, पेट्री प्लेटों का उपयोग करके मानक संस्कृति विधियों की तुलना में माइक्रोट्रे-आधारित संस्कृति प्रणाली स्थापित करना अधिक कठिन और अधिक समय लेने वाला है। एलिगेंस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में कई सामान्य उत्तेजना तरंग दैर्ध्य द्वारा उत्तेजित होते हैं। क्योंकि इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान जानवरों को स्थिर नहीं किया जाता है, फ्लोरोसेंट बायोमार्कर जिन्हें लंबे समय तक एक्सपोजर समय की आवश्यकता होती है, उन्हें धुंधला किया जा सकता है। हम पाते हैं कि प्रत्येक समय बिंदु के दौरान कई छवियों को कैप्चर करना आम तौर पर फ्लोरोसेंट सिग्नल के सटीक पूरे-पशु परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, इस मुद्दे के कारण, माइक्रोट्रे कल्चर सिस्टम उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ संगत नहीं है, जैसे कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ, और इमेजिंग कम-सिग्नल बायोमार्कर के लिए इष्टतम नहीं है। इन सीमाओं के प्रकाश में भी, यह नई विधि गतिविधि और अस्तित्व के संदर्भ में समय-निर्भर गतिशीलता या उच्च व्यक्तिगत-से-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के साथ जटिल शारीरिक प्रक्रियाओं को समझने की क्षमता प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों का कहना है कि उनके पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच आर 35 जीएम 133588 द्वारा जीएलएस, एलई को एनआईएचटी 32 जीएम 008659 प्रशिक्षण अनुदान, जीएलएस को यूनाइटेड स्टेट्स नेशनल एकेडमी ऑफ मेडिसिन कैटेलिस्ट अवार्ड और एरिज़ोना बोर्ड ऑफ रीजेंट्स द्वारा प्रशासित एरिज़ोना टेक्नोलॉजी एंड रिसर्च इनिशिएटिव फंड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed terasaki inserts Custom printing company Robot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		 FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood Fisher Scientific 36-100-4376
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
CaCl2 Acros organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin Goldbio C-103-25
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2 Fisher Scientific G-560
FUdR  Research Products International F10705-1.0
Hydrating water crystals  M2 Polymer Technologies Type S Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera Leica Microsystems 11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope Leica Microsystems 10450826
Low-melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4  Fisher Chemical M-8900
NaCl Fisher bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Scientific 264728
Nystatin Sigma N1538
Palmitic acid Acros organics 129700010
Paper towels Coastwide Professional 365374
Parafilm M Parafilm 16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075 UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda) One Lambda 151431
Thermolyne Dri-bath Thermolyne DB28125
Tween  Thermo Scientific J20605-AP

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References

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