Langsiktig kultur av individuelle Caenorhabditis elegans på faste medier for langsgående fluorescensovervåking og aversive intervensjoner

Summary

Her presenterer vi en protokoll til dyrkningsisolerte individuelle nematoder på faste medier for livslang fysiologisk parametersporing og fluorescenskvantifisering. Dette kultursystemet inkluderer en palmitinsyrebarriere rundt enkeltormbrønner for å forhindre at dyr flykter, noe som tillater bruk av aversive inngrep, inkludert patogene bakterier og kjemiske stressorer.

Abstract

Caenorhabditis elegans er mye brukt til å studere aldringsbiologi. Standard praksis i C. elegans aldringsstudier er å dyrke grupper av ormer på faste nematodevekstmedier (NGM), noe som muliggjør effektiv innsamling av populasjonsnivådata for overlevelse og andre fysiologiske fenotyper, og periodisk prøvetaking av subpopulasjoner for fluorescerende biomarkørkvantifisering. Begrensninger for denne tilnærmingen er manglende evne til å (1) følge individuelle ormer over tid for å utvikle aldersbaner for fenotyper av interesse og (2) overvåke fluorescerende biomarkører direkte i sammenheng med kulturmiljøet. Alternative kulturtilnærminger bruker flytende kultur eller mikrofluidikk for å overvåke individuelle dyr over tid, i noen tilfeller inkludert fluorescenskvantifisering, med avveiningen at kulturmiljøet er kontekstuelt forskjellig fra fast NGM. WorMotel er en tidligere beskrevet mikrofabrikert flerbrønnsenhet for dyrking av isolerte ormer på fast NGM. Hver orm opprettholdes i en brønn som inneholder fast NGM omgitt av en vollgrav fylt med kobbersulfat, et kontaktmiddel for C. elegans, som tillater langsgående overvåking av individuelle dyr. Vi finner kobbersulfat utilstrekkelig til å forhindre ormer i å flykte når de blir utsatt for aversive inngrep som er vanlige i aldringsforskning, inkludert diettbegrensning, patogene bakterier og kjemiske midler som induserer cellulær stress. Multibrønnsenhetene er også støpt fra polydimetylsiloksan, som produserer høye bakgrunnsartefakter i fluorescensavbildning. Denne protokollen beskriver en ny tilnærming for dyrking av isolerte rundorm på fast NGM ved bruk av kommersielt tilgjengelige polystyrenmikrobrett, opprinnelig designet for human leukocyttantigen (HLA) typing, som tillater måling av overlevelse, fysiologiske fenotyper og fluorescens over hele levetiden. En palmitinsyrebarriere forhindrer ormer i å flykte, selv i nærvær av aversive forhold. Hver tallerken kan dyrke opptil 96 dyr og tilpasser seg enkelt til en rekke forhold, inkludert diettbegrensning, RNAi og kjemiske tilsetningsstoffer, og er kompatibel med automatiserte systemer for innsamling av levetid og aktivitetsdata.

Introduction

C. elegans er en kraftig modellorganisme for forskning innen genetikk, cellulær biologi og molekylærbiologi, fordi de lett dyrkes i laboratoriet, har kort generasjonstid og levetid, deler en høy grad av proteinhomologi med pattedyr og har en gjennomsiktig kroppsstruktur som tillater in vivo visualisering av fluorescerende proteiner og fargestoffer¹. Som et resultat av den langvarige bruken av C. elegans som et viktig modellsystem på en rekke felt, inkludert utviklingsbiologi og aldring, er deres vekst og utvikling godt forstått, deres genom har blitt fullstendig sekvensert, og en rekke kraftige genetiske verktøy er opprettet, inkludert genombrede RNAi-fôringsbiblioteker og tusenvis av mutante og transgene stammer. Historisk dyrkes C. elegans som populasjoner på faste agarnematodevekstmedier (NGM), og fenotyper evalueres manuelt enten ved direkte observasjon eller ved avbildning og nedstrømsanalyse. Fluorescerende mikroskopi brukes til å fange en rekke molekylære fenotyper ved hjelp av fargestoffer eller transgent uttrykte fluorescerende koder i individuelle C. elegans. Fluorescerende avbildning innebærer vanligvis å fikse eller lamme et dyr på lysbilder som inneholder tynne agaroseputer, noe som er invasivt og ofte dødelig. Det innebærer også bruk av kjemikalier, som levamisol eller natriumazid, som potensielt kan forstyrre den molekylære prosessen av interesse ^2,3. Sammen gjør disse tilnærmingene det mulig å samle inn data på tverrsnittsnivå på populasjonsnivå over et bredt spekter av fenotyper, men tillater ikke sporing av individuelle dyr over tid.

I de senere år har flere tilnærminger dukket opp for å dyrke isolerte C. elegans, slik at forskere kan fange dynamiske endringer i fysiologiske og molekylære fenotyper av dyr over tid ved hjelp av nye bildebehandlingsteknologier. En kategori av C. elegans kultur tilnærming er microfluidics enheter, inkludert WormFarm⁴, Nemalife chip⁵, og "atferd" chip av Chronis et ^al.6, blant annet ^7,8,9. Relatert til disse er væskebaserte kulturmetoder, som bruker flerbrønnsplater for å karakterisere individuelle ormer eller små populasjoner over tid^10,11. Mikrofluidikk og mikroplatesystemer gir gode kvantitative målinger av fenotypiske responser i C. elegans ned til et enkelt dyr, men kulturmiljøet presenterer en viktig begrensning. Det store flertallet av tidligere forskning i C. elegans, spesielt innen aldring, har blitt fullført på solide agarbaserte medier. Flytende kultur får C. elegans til å svømme kontinuerlig og representerer en distinkt miljøkontekst som kan endre den underliggende biologien. For eksempel har dyr dyrket i flytende medier drastisk endret fettinnhold og genuttrykk - spesielt for gener involvert i stressresponsen - i forhold til dyr dyrket på agarbasert fast NGM^12,13. En alternativ kategori av enkeltdyravbildningsmetoder involverer polydimetylsiloksan (PDMS) enheter som isolerer individuelle dyr på faste medier, i et forsøk på å etterligne standardmiljøet som oppleves av ormer dyrket på fast NGM i gruppekultur på petrisklater. WorMotel er en 240-brønns PDMS-enhet designet for å dyrke individuelle dyr på faste medier. Hver brønn er fylt med en modifisert NGM ved bruk av lavsmelteagarose i stedet for agar og frøet med bakteriell mat, noe som skaper et solid mediemiljø som ligner på det vanligste kultursystemet ved bruk av petrisklater. Brønnveggene er runde, slik at hvert dyr kan avbildes uavhengig av plassering i brønnen (unngå visuell tilsløring forårsaket av et dyr nær en vegg i en flerbrønnsplate). Kobbersulfat i en smal vollgrav som omgir hver brønn brukes som avskrekkende for å holde dyr i brønnene^{sine 14,15}. En begrensning av denne tilnærmingen er at kobbersulfatet er ineffektivt for å hindre ormer i å flykte når aversive miljøforhold er tilstede, inkludert diettbegrensning, patogene bakterier eller kjemikalier som induserer cellulær stress (f.eks. Paraquat).

Et annet system som bruker faste medier er Worm Corral, som benytter en hydrogel for å skape et lite forseglet miljø for hver orm på et lysbilde, noe som muliggjør langsiktig overvåking av individuelt isolerte dyr¹⁶. En viktig begrensning er at dyr må forsegles i miljøet som egg, noe som krever bruk av sterile dyr for å forhindre reproduksjon, og begrenser medikamentell behandling til en enkelt applikasjon. Multi-dose narkotika forsøk kan oppnås i WorMotel enten ved å gjennomføre flere runder med eksponering før overføring av ormer til enheten eller ved lokalt å legge til flere legemidler til brønnene under forsøket; I sistnevnte tilfelle er imidlertid den faktiske eksponeringsdosen etter tilsetning av et ekstra legemiddel til en eksisterende brønn vanskelig å nøyaktig kvantifisere og avhenger av hvor raskt stoffet nedbrytes. Både WorMotel og Worm Corral er utmerket for brightfield eller darkfield imaging for å fange opp informasjon relatert til aktivitet og dyrefysiologi (f.eks. Vekst og utvikling). Selv om disse systemene kan brukes til å overvåke fluorescens, er PDMS som brukes til å lage de andre enkeltormbildeteknologiene, etter vår erfaring tilbøyelige til å danne mikrobobler, fange partikler og andre små abnormiteter som genererer uregelmessige fluorescerende artefakter som forstyrrer konsistent fluorescensvisualisering og kvantifisering, spesielt i utslippsområdet for GFP, den vanligste fluoroforen som brukes i C. elegans-forskning. Til dags dato er levende fluorescensavbildning av C. elegans individuelle dyr på en langsgående måte primært avhengig av mikrofluidiske enheter¹⁷.

Her beskriver vi en ny metode for dyrking av individuelle C. elegans på faste medier som er kompatibel med både aversive inngrep og direkte fluorescerende avbildning. Denne tilnærmingen ligner i konsept til andre enkeltormbildeteknologier, bortsett fra at den spesialstøpte PDMS-brikken erstattes med kommersielt tilgjengelige polystyrenmikrobrett opprinnelig utviklet for mikrocytotoksisitetsanalyser (også ofte kalt Terasaki-brett)¹⁸. Disse mikrobrettene har brønner som kan fylles med faste medier og frøes med bakteriefôr, noe som etterligner miljøet som oppleves av dyr under standard solid NGM-kulturmetodikk. Hver brønn er omgitt av en aversiv barriere av palmitinsyre i stedet for kobbersulfat. Palmitinsyre brukes ofte til å forhindre ormer fra å flykte fra faste medier, ved hjelp av standard gruppekultur på petrisklater i eksperimenter der ormer utfordres med et aversivt miljø som diettbegrensning eller eksponering for en kjemisk stressor. Mikrobrettene produserer også minimal og konsistent fluorescerende bakgrunn, noe som tillater fluorescerende avbildning av dyr direkte i deres kulturmiljø. Dette nye solide agarbaserte kultursystemet med ett dyr gjør det ikke bare mulig å spore individuelle dyr gjennom livet og overvåke vekst, utvikling, aktivitet og levetid, men er også kompatibelt med direkte fluorescerende mikroskopi. Fordi ormene kan avbildes uten lammelse eller fiksering, kan in vivo fluorescensbiomarkører kvantifiseres i lengderetningen hos individuelle dyr som forblir på deres kulturmedier, slik at man kan observere dynamiske endringer i løpet av hvert dyrs levetid. Dette kultursystemet er også kompatibelt med nåværende generasjons automatiserte systemer for sporing av levetid og andre helsemålinger^14,19. Vi gir en detaljert protokoll for dyrking av individuelle C. elegans i dette mikroskuffbaserte systemet, diskuterer potensielle fallgruver og feilsøking, og diskuterer fordeler og begrensninger i forhold til andre systemer, og spesielt en oppdatert og optimalisert WorMotel-protokoll¹⁵.

Hvert kulturmiljø med én orm består av et mikrobrett montert inne i et standard enkeltbrønnsbrett ved hjelp av en tilpasset 3D-printet adapter (figur 1A). Brønnene er fylt med lavsmelte agarose nematode vekstmedier (lmNGM), sådd med konsentrerte bakterier som matkilde, og omgitt av et palmitinsyrebelegg for å hindre ormer i å flykte (figur 1B). Rommet mellom mikrobrettet og veggene på enkeltbrønnsplaten er fylt med mettede vannkrystaller for å opprettholde fuktighet (figur 1B). Et vaskemiddelbelegg påføres brettlokket for å forhindre kondens. En enkelt orm legges til hver brønn, og enkeltbrønnsbrettet er forseglet med Parafilm for å opprettholde fuktighet og tillate oksygenutveksling. Opptil seks mikrobrett kan med rimelighet tilberedes parallelt av en enkelt praktisert forsker.

Protocol

1. Oppskrifter

NOTAT: Forbered lagerløsninger før du starter klargjøring av mikrobrettplater.

1. Stamløsninger for vekstmedier med agarosenematode med lav smeltekraft (lmNGM)
   1. Forbered 1 M_K2 HPO₄ ved å oppløse 174,18 g K₂HPO4 i 1 liter sterilt avionisert vann i en 1 l flaske. Autoklav oppløsningen ved 121 °C, 15 psi, i 30 minutter og oppbevar den ved romtemperatur (RT).
   2. Forbered 1 M KP i (pH 6,0) ved å oppløse 136,09 g KH₂HPO₄ i 1 liter sterilt avionisert vann_i en 1 l flaske. Titrer løsningen med 1 M K₂HPO₄ for å oppnå pH 6,0. Autoklav oppløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter og oppbevar den ved RT.
   3. Klargjør 1 M CaCl 2 ved å løse opp 73,5 g CaCl₂ i 500 ml sterilt avionisert vann i en 500 ml flaske. Autoklav oppløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter og oppbevar den ved RT
   4. Klargjør 1 M MgSO 4 ved å løse opp 123,25 g MgSO₄ i 500 ml sterilt avionisert vann i en 500 ml flaske. Autoklav oppløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter og oppbevar den ved RT.
   5. Forbered 3 M NaCl for lmNGM: I ren 100 ml flaske, kombiner 100 ml ultrarent vann og 18,20 g NaCl. Autoklav ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter.
   6. Forbered 5 mg / ml kolesterol ved å kombinere 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% etanol og 25 ml sterilt avionisert vann i en 500 ml ravflaske. Autoklav oppløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter og oppbevar den ved RT.
   7. Forbered 50 mM fluorodeoksyuridin (FUdR) ved å oppløse 0,1231 g FUdR i 10 ml sterilt avionisert vann i et 15 ml konisk rør. Bruk en 10 ml sprøyte og 0,22 μm filter for å sterilisere oppløsningen. Aliquot 1 ml av oppløsningen hver i 10 mikrosentrifugerør og oppbevar dem ved -20 °C.
   8. Tilbered 50 mg / ml karbenicillin ved å oppløse 500 mg karbenicillin i 10 ml sterilt avionisert vann i et 15 ml konisk rør. Bruk en 10 ml sprøyte og 0,22 μm filter for å sterilisere oppløsningen. Aliquot 1 ml av oppløsningen hver i 10 mikrosentrifugerør og oppbevar dem ved -20 °C.
   9. Klargjør 1 mM isopropyl ß-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) ved å oppløse 2,38 g IPTG i 10 ml sterilt avionisert vann i et 15 ml konisk rør. Bruk en 10 ml sprøyte og 0,22 μm filter for å sterilisere oppløsningen. Aliquot 1 ml av oppløsningen hver i 10 mikrosentrifugerør og oppbevar dem ved -20 °C.
   10. Tilbered 100 mg / ml ampicillin ved å oppløse 1 g ampicillin i 10 ml sterilt avionisert vann i et 15 ml konisk rør. Bruk en 10 ml sprøyte og 0,22 μm filter for å sterilisere oppløsningen. Aliquot 1 ml av 100 mg/ml ampicillinoppløsningen hver i 10 mikrosentrifugerør og oppbevar rørene ved -20 °C.
2. Klargjøring av nematodevekstmedier (NGM) for generelt vedlikehold av C. elegans
   1. For å lage 50 plater, oppløs 10 g Bacto agar, 1,5 g NaCl og 1,25 g Bacto pepton i 486 ml ultrarent vann i en 1 l kolbe. Steriliser mediet ved å autoklavere det på en væskesyklus ved 121 °C, 15 psig, i minst 30 minutter.
   2. Etter autoklav, la mediet avkjøles til 55 °C. Deretter tilsettes 12,5 ml 1 M KP_i, 500 μL 1 M MgSO₄, 500 μL 1 M_CaCl2 og 500 μL 5 mg / ml kolesterol til løsningen.
   3. Bruk en steril teknikk til å helle 10 ml av mediet tilberedt i trinn 1.2.2 i hver 60 mm plate (50 totalt). La platene stå med media i minst 30 minutter for å stivne. Pipett 300 μL bakteriekultur over natten på midten av platen og la platen stå på benken. La kulturen tørke og vokse tykkere i 1-2 dager. Oppbevar disse NGM-platene med bakterier ved 4 °C.
3. Klargjøring av lmNGM forblanding
   1. I en 250 ml Erlenmeyer-kolbe blandes 2 g lavsmelteagarose, 0,25 g pepton, 1 ml 3 M NaCl og 99 ml ultrarent vann. Autoklav oppløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter.
   2. Aliquot 10 ml lmNGM i reagensrør og dekk med Parafilm for å forhindre tap av væske. Sett lokk på rørene og la dem avkjøles og stivne.
4. Forbered 85 mM NaCl for bakteriell mat: Kombiner 515,61 mg NaCl i en 100 ml flaske og fyll opptil 100 ml med ultrarent vann. Autoklav ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter.
5. Forbered vannabsorberende polyakrylamidkrystaller ved å oppløse 1 g Type S superabsorberende polymer i 150 ml ultrarent vann i en autoklaverbar klemmeflaske. Klipp spissen for å sikre en tilstrekkelig dispenseringsstørrelse. Autoklav ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter, lokk med tinfoil, og rist for å blande krystallene.
6. Forbered en vaskemiddelløsning ved å kombinere 3 ml 100 % Tween-20 med 7 ml ultrarent vann i et 15 ml konisk hetteglass.
7. Tilbered 5 mg / ml kolesterol ved å kombinere 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% EtOH og 25 ml ultrarent vann i en 500 ml flaske.
8. Forbered palmitinsyre arbeidsløsning
   1. Mal 500 mg fast palmitinsyre i en mørtel og pistill og kombiner den med 15 ml Tween-20 i et 50 ml konisk hetteglass. Bland ved vortexing, oppløs så mange av krystallene som mulig.
   2. Tilsett 17,5 ml 100% etanol og virvel løsningen for å oppløse så mye palmitinsyre som mulig.
   3. Tilsett 17,5 ml ultrarent vann og virvel grundig. Varm oppløsningen forsiktig opp i et perlebad ved 80 °C til palmitinsyren er helt oppløst. Noen palmitinsyre kan utfelle under avkjøling.
9. Forbered lysogen buljong (LB) ved å blande 20 g LB-pulver i 1 liter avionisert vann i et 1 l eller større beger. Aliquot 500 ml av buljongen i to 500 ml begerglass. Autoklav buljongen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter. Oppbevar den tilberedte buljongen på RT.
10. Forbereder lysogen buljong (LB) agarplater
    1. Bland 10 g LB-pulver og 7,5 g Bacto-agar i 500 μL avionisert vann i en 1 L-kolbe. Autoklav oppløsningen på en væskesyklus ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter.
    2. Tilsett eventuelt antibiotika (500 μL 100 μg/ml ampicillin) etter at det autoklavede mediet er avkjølt til 55 °C. Bruk en steril teknikk til å lage LB-agarplater ved å helle 20 ml medier i hver 100 mm plate (25 totalt). Oppbevar platene ved 4 °C.

2. Forberede en populasjon av alderssynkroniserte ormer

1. Forbered en populasjon av alderssynkroniserte ormer som er klare til å legges til mikrobrettet ved larvestadium 4 (L4). Alternativt kan ormer i ethvert livsstadium tilsettes (FUdR bør utelukkes fra mikroskuffmediet hvis ormer tilsettes på et utviklingsstadium tidligere enn L4 for å forhindre utviklingsstans).
   MERK: Dette trinnet bør fullføres 2 dager før ormene legges til mikrobrettet hvis mållivsstadiet ved starten av forsøket er L4. Synkroniseringstidspunktet kan justeres slik at ormene når ønsket livsstadium.
2. Temperaturen kan påvirke levetiden. For konsistente resultater, bruk standard NGM-plater (se avsnitt 1) for å opprettholde C. elegans ved 20 °C, og overfør ormer til ferske tallerkener hvis de har lite bakteriell mat.
3. Fra lagerplatene med mange unge voksne ormer, bruk en standard tilnærming for å generere en alderssynkronisert populasjon, oftest bleking²⁰ eller tidsbestemt egglegging²¹.
4. Isoler eggene og legg dem til en bakterieflekket NGM-plate. Hvis du bruker villtype C. elegans, vil eggene klekkes og danne ormer, og nå L4 larvalstadiet om 2 dager.

3. Forbereder bakteriekultur

1. Dagen før begynnelsen av forsøket, inokulere ønsket bakteriell matkilde. Forbered ~ 5 ml bakteriekultur per plate.
   MERK: Bakteriestreken kan tilberedes opptil 1 måned i forveien og oppbevares ved 4 °C for E. coli-matkilde.
   1. Strekbakterier for enkeltkolonier på LB-agarplaten fra en frossen glyserolbestand.
   2. Dyrk kulturen ved 37 °C over natten.
   3. Inokuler flytende LB-buljong med en enkelt koloni per inokulasjon.
   4. Rist ved ~250 o / min ved 37 ° C i 12-16 timer.

4. Påføring av palmitinsyrebelegg på mikrobrett

MERK: Palmitinsyre fungerer som en aversiv barriere for å forhindre flukt av dyr fra de enkelte brønnene. Belegget påføres hele bunnflaten av mikrobrettet, med unntak av brønnens indre overflater. Nystatin tilsettes palmitinsyre for å redusere soppforurensning. Dette trinnet kan fullføres 1 dag før eksperimentet starter hvis ønskelig.

1. Sett perlebadet på 80 °C for å gi tid til forvarming.
2. Umiddelbart før bruk, aliquot 1 ml av palmitinsyre arbeidsoppløsning per mikrobrett i en separat steril beholder (vanligvis en 15 ml konisk hetteglass) og tilsett 4 mikrol av 10.000 enheter / ml nystatin per 1 ml palmitinsyreoppløsning før oppvarming.
3. Spray innsiden og utsiden av mikrobrettet med etanol (70% eller høyere) til metning og rist av overflødig etanol.
   MERK: Gjenværende etanol skal fordampe under behandling ved UV-tverrbinding (trinn 4.4).
4. Bruk en UV-kryssbinder for å sterilisere mikrobrettet (følgende instruksjoner er for UV-kryssbinderen som brukes i denne studien):
   1. Plasser mikrobrettet og lokket i UV-tverrbinderen separat (dvs. ikke plasser lokkene på platene, da UV ikke trenger gjennom plasten).
   2. Lukk døren og slå på UV-tverrbinderen.
   3. Trykk Tid, skriv inn 20 min, og trykk deretter Start.
   4. Etter 20 min, snu tallerkenen og lokket og gjenta trinn 4.2.2-4.2.3.
   5. Mens du bruker hansker, legg lokkene på mikrobrettet for å forhindre forurensning etter sterilisering.
5. Bland palmitinsyre arbeidsløsningen grundig ved vortexing og invertering.
6. Plasser det 15 ml koniske hetteglasset med palmitinsyrearbeidsløsningen i perlebadet og la eventuelle synlige krystaller løse seg helt opp før bruk.
7. Plasser mikrobrettet på avsatsen rundt perlebadet med lokkene på i ~2 min for å varme opp.
8. Fjern mikroskufflokket. Tilsett sakte 200 μL palmitinsyre arbeidsløsning over bakveggen (langsiden) av mikrobrettet. Sett på lokkene igjen og la mikrobrettet sitte på perlebadet i 2-3 minutter for å la palmitinsyreoppløsningen legge seg over bunnen av mikrobrettet.
   MERK: Selv om hele bunnen av mikrobrettet ikke blir fullstendig belagt før trinn 4.10, skal oppløsningen spres jevnt over mer enn halvparten av bunnoverflaten. Hvis palmitinsyreoppløsningen ikke sprer seg jevnt, slår du på en hvirvel eller vibrerende motor nær mikrobrettet. Dette vil gi en liten mengde vibrasjon som kan bidra til at palmitinsyreoppløsningen sprer seg lettere. Hold lokkene på mikrobrettet på plass for å redusere kontaminering.
9. Gjenta trinn 4.8.
   MERK: Omtrent halvparten eller mer av bunnen av mikrobrettet skal være synlig dekket med flytende palmitinsyre.
10. Drei mikroskuffen 180° og gjenta trinn 4,8 og 4,9 på den andre siden av skuffen.
    MERK: Bunnen av Terasaki-brettet dekkes kun med et tynt lag palmitinsyreoppløsning etter at hele det kombinerte volumet er tilsatt på begge sider (trinn 4.9 og 4.10). Mer eller mindre palmitinsyreblanding kan være nødvendig, avhengig av blandingspreparatet, temperaturen og andre faktorer. Vanligvis vil mellom 400 og 800 μl av palmitinsyreblandingen være tilstrekkelig til å belegge hele bunnen av mikrobrettet. Så snart bunnen av mikrobrettet er synlig dekket, bør det ikke tilsettes ekstra palmitinsyre, da dette kan forurense brønnene.
11. Tørk brettet i en steril tørkeboks eller avtrekkshette med laminær luftmengde uten lokk i minst 1 time. Alternativt kan du fullføre dette trinnet dagen før du legger i plater (seksjon 5), og tørke mikrobrettet med lokket på RT i minst 16 timer.

5. Legge mikrobrettet i et nematodevekstmedium med lav smeltekraft (lmNGM)

MERK: Denne metoden bruker standard NGM blandet med lavsmelteagarose i stedet for den vanlige agar. Agar kan begynne å gelere ved 45 °C. Når man arbeider med de små volumene som trengs for å fylle mikrobrettbrønnene, tetter den agarbaserte NGM ofte pipettespissen og/eller produserer ujevne brønnoverflater på grunn av rask gelering. NGM som bruker lavsmelteagarose begynner å gelere ved ~ 28 ° C, slik at smeltede medier lett kan pipetteres og konsekvent danne flate brønnflater. Forbered lmNGM samme dag som ormene skal plasseres på mikrobrettet. Hvis mikrobrettet klargjøres med lmNGM, sås med bakterier og legger C. elegans i løpet av samme dag, må du sørge for at dyrene er i eller nær ønsket alder før du begynner dette trinnsettet.

1. Plasser et pipettebasseng i et perlebad på 80 °C for å varme opp.
2. Smelt en 10 ml lmNGM forblanding per mikrobrett som tilberedes (trinn 1.1) i mikrobølgeovnen i ~30-45 s.
   1. Plasser lmNGM premix reagensrør i et 200 ml beger, avdekket slik at de ikke velter.
   2. Etter ~10-15 s, eller når lmNGM-forblandingen bare begynner å boble, pause mikrobølgeovnen, hell lmNGM-forblandingen i et sterilt 200 ml beger og fortsett mikrobølgeovnen.
   3. Pause etter behov for å forhindre at det koker over, og virvle for å blande.
   4. Stopp mikrobølgeovnen når all lmNGM har blitt til væske uten biter.
      MERK: En enkelt 10 ml aliquot er tilstrekkelig til å fylle totalt 192 brønner (to mikrobrett).
3. Forbered lmNGM ved å tilsette følgende komponenter i oppført rekkefølge til den varme lavsmelteagarose (volum per 10 ml lavsmelteagarose): 250 μL på 25 mM KPi (pH 6), 10 μL 1 M CaCl2, 10 μL 1 M MgSO₄ og 10 μL 5 mg/ml kolesterol
   1. Hvis forskeren planlegger å undersøke voksne dyr over tid og trenger å forhindre reproduksjon, tilsett også 10 μL av 50 mM FUdR.
   2. Hvis du utfører et RNAi-fôringseksperiment ved bruk av den vanlige HT115 RNAi E. coli-stammen og tilhørende RNAi-plasmider, tilsett også 5 μL 50 mg / ml karbenicillin (for å velge RNAi-plasmidet) og 12 μL 1 mM IPTG (for å indusere ekspresjon av det dobbeltstrengede RNA fra RNAi-plasmidet).
      MERK: Ytterligere tilsetningsstoffer kan inkluderes avhengig av selektiv antibiotika og andre kjemikalier som trengs for ønsket matkilde. Narkotika eller kjemiske stressorer kan også legges til lmNGM på dette stadiet. NGM og lmNGM inneholder den samme endelige konsentrasjonen av NaCl, men varierer i hvordan NaCl legges til mediet. For NGM legges all NaCl til under medieforberedelsen (trinn 1.2). For lmNGM tilsettes en del av NaCl under medietilberedning (trinn 5.3) og en del med bakteriefôret (avsnitt 6). Årsaken til denne endringen stammer fra det lille medievolumet i hver mikroskuffbrønn. Tilsetning av 5 μL konsentrerte bakterier suspendert i LB til en brønn som inneholder 20 μL medier, vil vesentlig endre næringssammensetningen av mediet (ved å tilsette komponentene i LB ved et sammenlignbart volum). For å unngå dette blir bakteriene i stedet resuspendert i en løsning av NaCl for å fjerne LB-komponentene samtidig som det forhindrer osmotisk stress på bakteriene. NaCl tilsatt mediet reduseres tilsvarende for å ta hensyn til saltet som tilsettes bakteriene.
4. Hell lmNGM i det oppvarmede pipettebassenget.
5. Med mikrobrettet på en benkeplate, pipett 20 μL lmNGM inn i hvert mikrobrett. Dekk til mikrobrettet når du fyller på pipetten for å minimere kontaminering.
   MERK: Dette trinnet er enklere med en elektronisk repeterende pipette.

6. Såing av mikrobrettbrønnene med bakteriell mat

MERK: 5 μL 10x konsentrert mat fra en inokulert kultur over natten er tilstrekkelig til å mate en enkelt C. elegans for hele levetiden.

1. Overfør bakteriene fra dyrkningen over natten til et 50 ml konisk hetteglass.
2. Sentrifuge ved ~3 500 x g i 20 minutter.
3. Fjern supernatanten. Resuspender bakteriekulturen ved en 10x konsentrasjon (1/10 volum av den opprinnelige kulturen) med 85 mM NaCl-løsning.
4. Før du legger bakterier til brønnene, må du inspisere mikrobrettet visuelt for å sikre at den faste lmNGM er helt inneholdt i hver brønn. Hvis noen lmNGM henger på siden av en brønn, skrap overflødig lmNGM av med en pipettespiss. Dette overflødige mediet kan føre til at maten løper inn i palmitinsyre hvis den ikke ryddes.
5. Pipett forsiktig 5 μL 10x konsentrert bakteriekultur på overflaten av lmNGM i hver brønn. Prøv å unngå at bakteriekulturen løper over siden av brønnen og inn i palmitinsyren, da dette vil tiltrekke ormer til å forlate brønnen.
6. La mikrobrettene tørke i en steril tørkeboks eller avtrekkshette med laminær luftmengde i ~35 minutter. Sjekk hver ~ 5 min og pass på at du ikke tørker for mye. Fjern når noen få brønner er synlig litt våte, da brønnene tørker ytterligere mens nematoder blir lagt til.

7. Lukk hvert mikrobrett inne i en enkeltbrønnplate

MERK: I denne delen er mikrobrettet montert inne i en standard enkeltbrønnplate ved hjelp av en tilpasset 3D-trykt innsats og omgitt av vannabsorberende krystaller. Enkeltbrønnsplaten blir deretter lukket og forseglet med Parafilm. Dette tillater oksygenutveksling samtidig som det forhindrer forurensning og opprettholder tilstrekkelig fuktighet for å forhindre at lmNGM tørker ut i løpet av flere ukers eksperimenter (ormens levetidseksperimenter kan vare 6-8 uker hvis man undersøker levetidsforlengende mutasjoner eller miljøforhold). Under forberedelsen, sørg for å dekke platen når noe ikke er aktivt tilsatt for å minimere bakteriell eller soppforurensning.

1. Steriliser en enkeltbrønnsplate og 3D-trykt adapter og lokk ved å dyppe hver i en 10% blekemiddelløsning. Skyll grundig med sterilt DI-vann. Tørk av med en oppgaveserviett.
2. Spray enkeltbrønnsplaten og 3D-printet adapter og lokket med 70% eller større etanoloppløsning og tørk av med en arbeidstørke. La eventuell gjenværende etanol lufttørke.
   MERK: UV-stråling kan også brukes etter blekemiddel og etanol med samme parametere som mikrobrettet, som beskrevet ovenfor i trinn 4.4.
3. Plasser den sterile 3D-printede innsatsen i en steril enkeltbrønnsplate.
4. Steriliser utsiden av den tilberedte mikroskuffen ved å sprøyte den med 70% etanol.
5. Plasser mikroskuffen i den 3D-printede adapteren i enkeltbrønnsplaten.
6. Kast lokket på mikroskuffen.
7. Dispenser vannkrystaller liberalt på toppen av den 3D-printede innsatsen mellom mikrobrettets ytre vegg og den indre veggen på enkeltbrønnplaten.
8. Tilsett ormene umiddelbart (seksjon 8) eller forsegl mikrobrettet for bruk neste dag. Lukk brettlokket og bruk et enkelt stykke Parafilm til å vikle alle fire sidene for å forsegle mikrobrettet. Gjenta forseglingstrinnet med Parafilm to ganger til, totalt tre lag.
9. Etter forsegling av mikrobrettet, la det stå på benken ved RT i opptil 4 dager før du tilsetter ormene (avsnitt 8).

8. Legge ormer til mikrobrettet

MERK: En orm kan legges manuelt til hver brønn ved å overføre dyr fra de alderssynkroniserte ormepopulasjonene (seksjon 2) ved hjelp av en platinaplekter. Overfør kun dyr i ønsket livsfase. Hvis overføringsprosessen tar mer enn 1 time, kan lmNGM i mikroskuffbrønnene tørke ut. Overføring av grupper på 10 til 20 ormer om gangen kan fremskynde dette trinnet, men det krever litt øvelse å konsekvent slippe ut bare ett enkelt dyr per brønn.

1. Legg til en nematode per brønn når de når ønsket livsstadium.
2. Sett lokket tilbake over mikrobrettet når du plukker ormer fra kildeplaten for å minimere forurensning.

9. Ferdig med å forberede kulturmiljøet for langvarig bruk

MERK: Trinnene nedenfor utføres for å sikre at mediet og ormene i mikrobrettet forblir hydrert i løpet av eksperimentet.

1. Tilsett ~40 μL av vaskemiddelløsningen til lokket på en enkeltbrønnsplate og bruk en arbeidsserviett for å belegge lokket jevnt. Dette belegget vil forhindre kondens over tid når platen er forseglet. Bruk ekstra arbeidsservietter for å spre vaskemiddelløsningen til synet gjennom lokket ikke er forvrengt (dette tar vanligvis omtrent to arbeidsservietter).
2. Undersøk vannkrystallene for å sikre at de begge er på nivå med den øvre kanten av mikrobrettet og ikke overfylte. Om nødvendig, tilsett eller fjern vannkrystaller på platen.
3. Bruk følgende tilnærming, pakk brettet med Parafilm (tre stykker totalt) for å sikre at Parafilm-forseglingen varer lenge.
   1. Strekk den første delen av Parafilm litt for å dekke to sider av brettet.
   2. Strekk den andre delen av Parafilm litt og dekk til de resterende sidene av brettet.
   3. Strekk det siste stykket Parafilm og pakk alle fire sidene av brettet helt inn, som dekker den første og andre delen av Parafilm. En riktig forseglet mikroskuff kan forbli hydrert i ~ 2 måneder.
      MERK: Overvåk Parafilms integritet hver 1-2 uke gjennom hele eksperimentet, og bytt ut etter behov.
   4. Tørk av toppen av skuffen med en arbeidsserviett, fuktig med 70 % etanol, for å fjerne eventuelle fingeravtrykk.
4. Merk enkeltbrønnsplaten med tape. Mikrobrettet er nå klart for avbildning og langtidslagring for å overvåke ormer over tid. Mellom bildeøktene skal brettet holdes på 20 °C. Mikrobrettet kan åpnes og forsegles flere ganger for dosering av legemidler eller andre prosedyrer, men bør minimeres for å forhindre forurensning og fuktighetstap.

10. Avbildning av individuelle ormer i mikroskuffbrønner

MERK: Formålet med denne protokollen er å gi en detaljert beskrivelse av hvordan du forbereder mikroskuffkulturmiljøet. Når de er forberedt og befolket med ormer, kan mikrobrettkulturmiljøene med en orm brukes til å overvåke mange fenotyper i lengderetningen ved hjelp av teknikker etablert for standardkultur på petrisklater. Følgende avsnitt inneholder grunnleggende instruksjoner for måling av noen vanlige fenotyper. Fluorescerende avbildning må utføres i et oppreist mikroskop. Brytning av lys gjennom Terasaki-brettet minimeres i et mørkt rom.

1. Levetid: Mål levetiden ved å banke forsiktig på siden eller toppen av platen eller skinne et sterkt blått lys på platen og observere hvert dyr. Score et dyr "dødt" hvis det ikke beveger seg innen få sekunder. Gjenta denne oppgaven hver 1-3 dag til alle ormer er døde.
   MERK: Mikrobrettkulturmiljøet er kompatibelt med systemer som automatiserer bildeinnsamling og analyse for levetidsestimering^14,19.
2. Standard mikroskopi: Utfør brightfield (eller darkfield) avbildning på individuelle brønner eller på hele skuffen med et høyoppløselig kamera eller skanner. Disse bildedataene kan brukes til en rekke fenotyper, inkludert dyrestørrelse 22,23,24, utvikling ²⁵, aktivitet^14,19 og levetid.
3. Fluorescerende mikroskopi: Utfør fluorescerende avbildning på enkeltbrønner enten manuelt eller med et motorisert plattformsystem. Skuffene med én brønn er kompatible med standard plateadaptere med flere brønner. Signal-til-støy minimeres hvis apparatet er plassert i en boks med svarte vegger.
   MERK: Fordi ormene er avbildet mens de forblir frie til å krype, er dette kultursystemet godt egnet til lavoppløselig avbildning for å fange helkroppsfluorescens og grov vevslokalisering av fluoroforer. Høyoppløselig og høy forstørrelse avbildning krever vanligvis at dyrene blir immobilisert for å hindre bevegelse. Selv om det bør være mulig å påføre et lammende middel lokalt (f.eks. natriumazid eller levamisol) på hver brønn og fortsette med avbildning med høyere oppløsning, vil dette utelukke gjentatte målinger av samme orm på senere tidspunkter. Kultursystemet, som beskrevet, er heller ikke ment å bli invertert, noe som forhindrer bruk av inverterte mikroskopsystemer.
   1. Hvis brightfield ikke brukes til å måle levetiden og bare fluorescens fanges opp, måler du levetiden manuelt. Hvis du forlater det blå lyset (brukes til GFP-eksitasjon) på ormen i 5 s, vil dyret bli bedt om å bevege seg. Hvis dyret ikke har beveget seg innen 5 s, vurder dyret som dødt.

Representative Results

Det mikrobrettbaserte enkeltormkulturmiljøet som er beskrevet her, kan brukes til å overvåke en rekke fenotyper, inkludert levetid og helsespenn, aktivitet og bevegelse, kroppsform og krypende geometri, og uttrykket av transgent uttrykte fluorescerende biomarkører hos individuelle dyr over tid. Mikrobrettkultursystemet er kompatibelt med levetidsanalyse gjennom enten manuell scoring eller bildeinnsamling og nedstrøms bildeanalyse. Som med standardkultur på petrisklate²¹, kan ormer manuelt skåres som døde eller levende basert på bevegelse etter en stimulus (f.eks. tapping av platen eller eksponering for blått lys). For bildebasert levetidsanalyse brukes en sammenligning av bilde-til-ramme-forskjeller mellom bilder tatt etter at stimulansen er påført, til å bestemme når hver orm slutter å bevege seg. Dette er kompatibelt med automatiserte bildeinnsamlings- og analysesystemer og gir tilleggsdata i form av aktivitetsnivået til enkeltdyr på hvert tidspunkt. Denne informasjonen kan da ikke bare brukes til å estimere levetid (opphør av bevegelse), men også helsespenn (en terskel for redusert aktivitet; flere definisjoner er foreslått). Ytterligere parametere (kroppsstørrelse, form og holdning) kan også måles fra disse bildene.

Hovedfunksjonene i dette mikrobrettkultursystemet er (1) kapasiteten til å spore individuelle dyr over tid, (2) kompatibiliteten mellom kultursystemet og aversive inngrep som kostholdsbegrensning eller kjemiske stressmidler, og (3) evnen til å måle fluorescens direkte i kulturmiljøet. For å demonstrere disse egenskapene, eksponerte vi ormer for 250 μM kobbersulfat (CuSO₄) for å indusere tungmetallstress eller 10 mM dithiothreitol (DTT) for å indusere protein misfolding stress og målt daglig aktivitet, levetid og helsespenn. Både CuSO₄og DTT reduserte ormens levetid signifikant (figur 2A). Overvåking av daglig aktivitet tillot oss å estimere den individuelle helsespennet til hver orm, her definert som alderen der en orm ikke lenger kan bevege seg en hel kroppslengde som svar på stimulansen. CuSO₄ og DTT reduserte helsespennet i forhold til ubehandlede kontroller (figur 2B). I motsetning til dette reduserte CuSO₄ andelen av livet brukt i god helse, mens DTT ikke gjorde det (figur 2C). CuSO₄ reduserte også gjennomsnittlig aktivitet på tvers av individer i populasjonen i større grad enn DTT i alle aldre (figur 2D), samt kumulativ aktivitet for hvert dyr over livsløpet (beregnet som arealet under aktivitetskurven [AUC]; Figur 2E). En viktig fordel med dette mikrobrettoppsettet er dets evne til å korrelere fenotyper målt på forskjellige tidspunkter på tvers av individuelle dyr i en populasjon. I dette tilfellet finner vi at kumulativ aktivitet for individuelle dyr frem til dag 10 korrelerer med levetid for DTT-utfordrede dyr, men ikke for ubehandlede kontroller eller CuSO_4-utfordrede dyr (figur 2F).

For å demonstrere evnen til å overvåke fluorescerende biomarkører over hele levetiden, brukte vi mikrobrettkultursystemet til å overvåke uttrykket av mScarlet-transgen fusjonert til C-terminalen av kynu-1-genet, som koder for enzymet kynureninase i kynureninmetabolsk vei, ved dets endogene lokus. Vi har tidligere funnet at ekspresjon av human kynureninase, kodet av Kynu, øker med alderen i blod²⁶, og at knockdown av kynu-1 i C. elegans er tilstrekkelig til å forlenge levetiden²⁷. KYNU-1 viser aldersavhengig uttrykk; det er nesten umulig å oppdage på L4 larvestadiet og topper på dag 9 i voksen alder. En drastisk økning i uttrykk observeres mellom dag 3 og 8 i voksen alder, og det er en progressiv nedgang med alderen deretter (figur 3A, tilleggsfigur 1). For å vurdere forholdet mellom KYNU-1 og C. elegans aldring, kvantifiserte vi den kumulative overflod av KYNU-1 opp til dag 14 i voksen alder (en alder hvor de fleste dyr fortsatt var i live) og fant en signifikant korrelasjon med levetid (figur 3B). Siden KYNU1-uttrykk er dynamisk i løpet av en levetid, sammenlignet vi KYNU-1-uttrykk i ulike aldre med total overlevelse på tvers av individuelle dyr. Ikke på et enkelt tidspunkt var KYNU-1-uttrykk signifikant korrelert med overlevelse (figur 3C-F), noe som viser at livslangt uttrykk er en bedre indikasjon på levetidspåvirkning enn enkeltpunktvurderinger.

Kombinert gir disse eksperimentene representative data som fremhever egenskapene til det mikrobrettbaserte enkeltormkultursystemet for å muliggjøre dynamiske endringer i ormaktivitet, helse, levetid og fluorescerende biomarkører som skal fanges og sammenlignes på tvers av aldre hos individuelle dyr. Spesielt gjør evnen til å overvåke individer på flere tidspunkter det mulig å spore dynamiske endringer i både fysiologiske og molekylære fenotyper in vivo, noe som gjør det mulig å oppdage mønstre som ikke ville være synlige ved hjelp av tverrsnittsmålinger på tvers av populasjoner.

Figur 1: Mikrobrett enkeltormkulturmiljø . (A) 3D-gjengivelse av et mikrobrett montert i en enkeltbrønnsplate ved hjelp av en tilpasset 3D-trykt adapter. (B) Skjematisk fremstilling av enkeltormkultursystemet som viser den relative posisjonen til en mikrobrettbrønn med lavsmeltet agarosenematodevekstmedium (NGM), bakteriell mat, isolerte C. elegans, aversivt palmitinsyrebelegg, 3D-printet adapter, vannkrystaller og enkeltbrønnsplaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Korrelasjon av fenotyper hos individuelle dyr på tvers av populasjoner ved bruk av mikroskål enkeltormmiljøer. Alle panelene gir data fra et eksperiment som sammenligner tre grupper av villtype (N2) C. elegans utsatt for ingen tilsetningsstoffer (kontroll; N = 55), 250 μM kobbersulfat (CuS0₄; N = 38), eller 10 mM dithiothreitol (DTT; N = 34) fra dag 2 i voksen alder. Levetid (A) og helsespan (B) reduseres begge moderat ved kronisk eksponering for enten CuSO₄ eller DTT. Helsespenn er definert som den siste dagen et dyr kan bevege seg minst en hel kroppslengde på tallerkenen. Parvis signifikans beregnes ved hjelp av log-rank-testen (R survdiff-funksjonen). (C) Gjennomsnitt av helsespenn og levetid i hver populasjon (øverst: absolutte verdier; nederst: normalisert til hver gruppes gjennomsnittlige levetid). (D) Gjennomsnittlig ormeaktivitet (3 dagers rullerende gjennomsnitt av daglig aktivitet) innenfor hver gruppe over hele levetiden og (E) populasjonsgjennomsnittet for det enkelte dyrearealet under livstidsaktivitetskurven (AUC) er begge betydelig svekket av CuSO₄ eller DTT. Signifikans bestemt av Mann-Whitney U-testen for å sammenligne AUC for individuelle dyr mellom grupper. (F) Kumulativ aktivitet for individuelle dyr til dag 10 (nederst) korrelerer med en levetid for dyr utsatt for DTT, men ikke for kontrolldyr eller dyr utsatt for CuSO₄, som bestemt ved lineær regresjon (lm-funksjon i R). n.s. = ikke signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bonferroni-metoden ble brukt til å justere alle p-verdier for multiple sammenligninger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Dynamisk kvantifisering av KYNU-1 i individuelle C. elegans gjennom hele levetiden. C. elegans med mScarlet transgent smeltet i rammen til C-terminalen av kynu-1-genet (KYNU-1::mScarlet) ble avbildet ved hjelp av et fluorescerende stereomikroskop utstyrt med et monokromt kamera hver 1-4 dag i 36 dager til alle dyrene hadde dødd. (A) KYNU-1, målt ved daglig kvantifisering av KYNU-1::mScarlet fluorescens, viser et distinkt aldersavhengig uttrykksmønster over hele levetiden (gjennomsnittsverdi på tvers av ormer vist ved hver alder). (B) Kumulativt KYNU-1::mScarlet uttrykk gjennom dag 14 i voksen alder korrelerer med levetid hos individuelle dyr. KYNU1::mSkarlet uttrykk på (C) L4 larvestadiet (dag 0 i voksen alder), (D) dag 4 i voksen alder, (E) dag 9 i voksen alder, og (F) dag 15 i voksen alder korrelerte ikke med levetid hos enkelte dyr. Korrelasjoner beregnet ved lineær regresjon (regresjonsfunksjon for dataanalyse i Microsoft Excel). n.s. = ikke signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alle p-verdier ble justert for multiple sammenlikninger med Bonferroni-metoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Enkel KYNU-1::mScarlet C. elegans avbildet gjennom hele levetiden under rød kanal. Enkel brønn av et prefabrikkert mikrobrett som inneholder en enkelt C. elegans med mScarlet merket KYNU-1 som lever på konsentrert E. coli matkilde. Dyret ble først avbildet på L4 larvestadiet og deretter avbildet i trinn på 1-5 dager for resten av livet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Terasaki-brett versus WorMotel-bakgrunn og artefaktsammenligning under fluorescensmikroskopi. Brønner av prefabrikkerte mikrobrett (øverst) eller støpte PDMS WorMotels (nederst) ble avbildet under GFP (A), RFP (B) og DAPI (C) fluorescenskanaler ved hjelp av et fluorescerende stereomikroskop utstyrt med et monokromt kamera. Bilder vises i falske farger, og et varmekart brukes til å markere metningspunkter. Begge kultursystemene har bakgrunn på lavt nivå i alle kanaler. WorMotel-platene er utsatt for sporadiske høysignalartefakter, som sannsynligvis enten er mikrobobler eller støv eller andre partikler fanget utilsiktet under PDMS-støpeprosessen^14,15. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. En stereolitografifil (STL) for den 3D-printede innsatsen som mikroskuffen er plassert på i enkeltbrønnsplaten. Denne filen inneholder fullversjonen med en solid bunn og er best egnet for bruk i et system der lyskilden er over platen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. En stereolitografifil (STL) for den 3D-printede innsatsen som mikroskuffen er plassert på i enkeltbrønnsplaten. Denne filen inneholder den bunnløse versjonen og er best egnet for bruk i et system der lyskilden er under platen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Her beskriver vi et nytt kultursystem som tilpasser mikroskuffer, opprinnelig utviklet for humane leukocyttantigenvevstypingsanalyser, for å tillate isolering og karakterisering av enkelt C. elegans over tid i et solid mediemiljø som er kontekstuelt lik den agarbaserte NGM som er standarden i C. elegans forskning. Dette systemet er kompatibelt med en rekke inngrep, inkludert diettbegrensning, eksogen medikamentell behandling, en utfordring med kjemiske eller miljømessige stressorer og RNAi. Det tillater videre longitudinell overvåking av fluorescerende biomarkører in vivo hos individuelle dyr. Kapasiteten til å følge individuelle dyr i en populasjon gjør det mulig å vurdere intraindividuell variabilitet innen en populasjon for fenotyper med en distinkt tidskomponent, inkludert atferd, patogenese, respons på stressende forhold og nedgang i helse. Det gjør det også mulig for tidlige livstrekk som varierer innenfor en befolkning å være knyttet til senlivsutfall, inkludert levetid og helse. I likhet med andre enkeltormbildeteknologier gjør dette mikroskuffbaserte kultursystemet det mulig å overvåke individuelle dyr på flere tidspunkter gjennom livet, samtidig som potensielle forstyrrende faktorer unngås, for eksempel aktivering av stressresponsveier som oppstår når ormer dyrkes i flytende miljøer (som det er tilfelle i mange mikrofluidikkenheter). Dette gjør at data samlet inn i dette kultursystemet kan sammenlignes mer direkte med flertallet av tidligere C. elegans arbeid utført på solide medier. Nylige teknologiske fremskritt tillater automatisering av mange aspekter av C. elegans karakterisering, inkludert vekst, utvikling og aldring²⁸. Dette kultursystemet, når det kombineres med automatisert mikroskopi og tilhørende programvare, er kompatibelt med en automatisert, høy gjennomstrømningssamling av levetid, helsespenn, aktivitet og andre fysiologiske parametere^14,19.

Vi bruker rutinemessig WorMotels^14,15 for å overvåke fysiologiske fenotyper (f.eks. livstidsaktivitet), helsespenn og levetid for individuelle C. elegans under ikke-stressende forhold som medikamentelle behandlinger og RNAi. Vår erfaring er at andre enkeltormavbildningsteknologier er et utmerket verktøy for å overvåke individuell variasjon i disse fenotypene, men de har to begrensninger. For det første, i sammenheng med fluorescensavbildning, har PDMS-materialet som brukes til å støpe brikken en tendens til å danne mikrobobler og fange små partikler, som begge fluorescerer nær GFP-utslippsbølgelengden. Dette genererer visuelle artefakter når plater visualiseres under ulike fluorescenskanaler (tilleggsfigur 2). En annen begrensning er at kobbersulfat ikke er tilstrekkelig avskrekkende for å hindre flukt når ormer blir utsatt for inngrep som i seg selv er aversive, spesielt diettbegrensning, patogene bakterier eller stressfremkallende midler. Vollgraven til andre enkeltormoppsett er for smal og hydrofob for å imøtekomme palmitinsyre, som er et sterkere aversivt middel som vanligvis brukes til å opprettholde populasjoner under diettbegrensning eller andre aversive forhold på petrisklater.

Mikrobrettkulturteknikken med en orm som presenteres her, adresserer begge begrensningene. Den større vollgravstørrelsen og det hydrofile materialet til mikrobrettene, sammen med påføring av varme og inkludering av Tween 20, gjør at palmitinsyre kan påføres som en forbedret aversiv barriere rundt hver brønn uten å forurense selve lmNGM-putene. Polystyrenkonstruksjonen til mikrobrettene genererer bare lavt nivå, konsekvent distribuert autofluorescens, og unngår problemet med autofluorescerende mikrobobler og partikkelinneslutninger av PDMS (tilleggsfigur 2). Både bakgrunnsstøy og artefakter reduseres ytterligere ved å bruke en svart overflate under og rundt skuffen for å minimere diffraksjon. Vi inkluderer 3D-utskriftsfiler for både en hul adapter (tillater brightfield-avbildning) og en solid svart adapter (som gir et mørkefelt som forbedrer både mørkefelt- og fluorescensavbildning; se tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2). Mens lmNGM i seg selv genererer noe autofluorescens, minimeres virkningen på bildekvaliteten av det lille brønnvolumet. Disse faktorene gjør mikrobrett optimale for gjentatt fluorescerende avbildning av individuelle dyr in vivo uten å fjerne dem fra kulturmiljøet. Den største ulempen ved mikroskuff-enkeltkultursystemet i forhold til andre enkeltormbildeteknologier er prøvestørrelsen; hver mikrobrett har plass til opptil 96 individuelt dyrkede dyr, i motsetning til kapasiteten på 240 dyr på hver WorMotel^14,15. Begge tilbyr dyktige enkeltormkultursystemer, og den eksperimentelle applikasjonen bestemmer hvilken som er mest hensiktsmessig.

Det er flere begrensninger for mikroskuffkultursystemet. For det første er det mikrobrettbaserte dyrkningssystemet både vanskeligere og mer tidkrevende å sette opp enn vanlige dyrkningsmetoder ved bruk av petrisklater. For det andre stimuleres C. elegans av flere vanlige eksitasjonsbølgelengder i fluorescensmikroskopi. Fordi dyr ikke er immobilisert under avbildningsprosessen, kan fluorescerende biomarkører som krever lange eksponeringstider, bli uskarpe. Vi finner at det å ta flere bilder i løpet av hvert tidspunkt generelt er tilstrekkelig til å muliggjøre nøyaktig kvantifisering av fluorescerende signal. På grunn av dette problemet er imidlertid mikroskuffkultursystemet ikke kompatibelt med høyoppløselig bildebehandling, for eksempel med konfokalmikroskopi, og er ikke optimalt for avbildning av biomarkører med lavt signal. Selv i lys av disse begrensningene gir denne nye metoden potensial til å forstå komplekse fysiologiske prosesser med tidsavhengig dynamikk eller høy individ-til-individuell variabilitet i sammenheng med aktivitet og overlevelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP