Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel caenorhabditis elegans'ın uzun süreli kültürü

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64682
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

Burada, yaşam boyu fizyolojik parametre takibi ve floresan ölçümü için katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu kültür sistemi, hayvanların kaçmasını önlemek için tek solucan kuyularının etrafında bir palmitik asit bariyeri içerir ve patojenik bakteriler ve kimyasal stresörler de dahil olmak üzere önleyici müdahalelerin kullanılmasına izin verir.

Abstract

Caenorhabditis elegans yaşlanma biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. C. elegans yaşlanma çalışmalarındaki standart uygulama, solucan gruplarının katı nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde kültürlenmesi, hayatta kalma ve diğer fizyolojik fenotipler için popülasyon düzeyinde verilerin verimli bir şekilde toplanmasına ve floresan biyobelirteç niceliği için alt popülasyonların periyodik olarak örneklenmesine izin vermektir. Bu yaklaşımın sınırlamaları, (1) ilgilenilen fenotipler için yaş yörüngeleri geliştirmek üzere zaman içinde bireysel solucanları takip edememe ve (2) floresan biyobelirteçleri doğrudan kültür ortamı bağlamında izleyememedir. Alternatif kültür yaklaşımları, bireysel hayvanları zaman içinde izlemek için sıvı kültür veya mikroakışkanlar kullanır, bazı durumlarda floresan niceliği de dahil olmak üzere, kültür ortamının katı NGM'den bağlamsal olarak farklı olduğu ödünleşimi ile. WorMotel, katı NGM üzerinde izole solucanların kültürlenmesi için daha önce tarif edilmiş mikrofabrikasyon çok kuyucuklu bir cihazdır. Her solucan, C. elegans için bir temas kovucu olan bakır sülfatla doldurulmuş bir hendekle çevrili katı NGM içeren bir kuyuda tutulur ve bireysel hayvanların uzunlamasına izlenmesini sağlar. Bakır sülfatın, diyet kısıtlaması, patojenik bakteriler ve hücresel strese neden olan kimyasal ajanlar da dahil olmak üzere yaşlanma araştırmalarında yaygın olan engelleyici müdahalelere maruz kaldıklarında solucanların kaçmasını önlemek için yetersiz buluyoruz. Çok kuyucuklu cihazlar ayrıca floresan görüntülemede yüksek arka plan artefaktları üreten polidimetilsiloksandan kalıplanmıştır. Bu protokol, orijinal olarak insan lökosit antijeni (HLA) tiplemesi için tasarlanmış, yaşam süresi boyunca hayatta kalma, fizyolojik fenotipler ve floresan ölçümüne izin veren, ticari olarak temin edilebilen polistiren mikrotrayları kullanarak katı NGM üzerinde izole yuvarlak kurtların kültürlenmesi için yeni bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bir palmitik asit bariyeri, engelleyici koşulların varlığında bile solucanların kaçmasını önler. Her plaka 96 hayvana kadar kültür yapabilir ve diyet kısıtlaması, RNAi ve kimyasal katkı maddeleri dahil olmak üzere çeşitli koşullara kolayca adapte olur ve kullanım ömrü ve aktivite verilerini toplamak için otomatik sistemlerle uyumludur.

Introduction

C. elegans, genetik, hücresel biyoloji ve moleküler biyoloji araştırmaları için güçlü bir model organizmadır, çünkü laboratuvarda kolayca kültürlenirler, kısa bir üretim süresine ve ömrüne sahiptirler, memelilerle yüksek derecede protein homolojisini paylaşırlar ve floresan proteinlerin ve boyaların in vivo görselleştirilmesine izin veren şeffaf bir vücut yapısına sahiptirler1. C. elegans'ın gelişim biyolojisi ve yaşlanma da dahil olmak üzere bir dizi alanda büyük bir model sistem olarak uzun süredir kullanılmasının bir sonucu olarak, büyüme ve gelişmeleri iyi anlaşılmış, genomları tamamen sıralanmış ve genom çapında RNAi besleme kütüphaneleri ve binlerce mutant ve transgenik suş da dahil olmak üzere bir dizi güçlü genetik araç yaratılmıştır. Tarihsel olarak, C. elegans katı agar nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde popülasyonlar olarak yetiştirilir ve fenotipler doğrudan gözlem veya görüntüleme ve aşağı akış analizi ile manuel olarak değerlendirilir. Floresan mikroskopi, bireysel C. elegans'ta boyalar veya transjenik olarak eksprese edilmiş floresan etiketleri kullanarak çeşitli moleküler fenotipleri yakalamak için kullanılır.Floresan görüntüleme tipik olarak, bir hayvanı invaziv ve genellikle ölümcül olan ince agaroz pedleri içeren slaytlara sabitlemeyi veya felç etmeyi içerir. Ayrıca, levamisol veya sodyum azid gibi kimyasalların kullanımını da içerir ve bu da potansiyel olarak ilgilenilen moleküler sürece müdahale edebilir 2,3. Birlikte, bu yaklaşımlar kesitsel, popülasyon düzeyinde verilerin geniş bir fenotip yelpazesinde toplanmasına izin verir, ancak zaman içinde bireysel hayvanların izlenmesine izin vermez.

Son yıllarda, izole C. elegans'ı yetiştirmek için çeşitli yaklaşımlar ortaya çıkmış ve araştırmacıların yeni görüntüleme teknolojilerini kullanarak zaman içinde hayvanların fizyolojik ve moleküler fenotiplerindeki dinamik değişiklikleri yakalamalarına olanak sağlamıştır. C. elegans kültür yaklaşımının bir kategorisi, WormFarm4, Nemalife çip5 ve Chronis ve ark.6'nın 'davranış' çipi de dahil olmak üzere mikroakışkan cihazlardırve diğerleri 7,8,9'dur. Bunlarla ilgili olarak, zaman içinde bireysel solucanları veya küçük popülasyonları karakterize etmek için çok kuyucuklu plakalar kullanan sıvı bazlı kültür yöntemlerivardır 10,11. Mikroakışkanlar ve mikroplaka sistemleri, C. elegans'taki fenotipik tepkilerin tek bir hayvana kadar mükemmel nicel ölçümlerini sağlar, ancak kültür ortamı önemli bir sınırlama sunar. C. elegans'ta, özellikle yaşlanma alanında, geçmiş araştırmaların büyük çoğunluğu, katı agar bazlı medya üzerinde tamamlanmıştır. Sıvı kültür, C. elegans'ın sürekli yüzmesine neden olur ve altta yatan biyolojiyi değiştirebilecek farklı bir çevresel bağlamı temsil eder. Örneğin, sıvı ortamda kültürlenen hayvanlar, agar bazlı katı NGM12,13 üzerinde kültürlenen hayvanlara göre, yağ içeriğini ve gen ekspresyonunu - özellikle stres tepkisinde yer alan genler için - büyük ölçüde değiştirmiştir. Tek hayvanlı görüntüleme yöntemlerinin alternatif bir kategorisi, Petri plakaları üzerindeki grup kültüründe katı NGM üzerinde kültürlenen solucanların yaşadığı standart ortamı daha yakından taklit etmek amacıyla, katı ortam üzerinde bireysel hayvanları izole eden polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlarını içerir. WorMotel, bireysel hayvanları katı ortamlarda kültürlemek için tasarlanmış 240 kuyucuklu bir PDMS cihazıdır. Her kuyucuk, agar yerine düşük erimeli agaroz kullanılarak modifiye edilmiş bir NGM ile doldurulur ve bakteriyel gıdalarla tohumlanır, böylece Petri plakaları kullanılarak en yaygın kültür sistemine benzer katı bir ortam ortamı yaratılır. Kuyu duvarları yuvarlaktır ve kuyudaki konumdan bağımsız olarak her hayvanın görüntülenmesine izin verir (çok kuyulu bir plakadaki bir duvarın yakınındaki bir hayvanın neden olduğu görsel belirsizlikten kaçınır). Her kuyuyu çevreleyen dar bir hendekte bulunan bakır sülfat, hayvanları kuyularında tutmak için caydırıcı olarak kullanılır14,15. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, bakır sülfatın, diyet kısıtlaması, patojenik bakteriler veya hücresel strese neden olan kimyasallar (örneğin, paraquat) dahil olmak üzere engelleyici çevresel koşullar mevcut olduğunda solucanların kaçmasını önlemede etkisiz olmasıdır.

Katı ortam kullanan ikinci bir sistem, bir slayttaki her solucan için küçük bir sızdırmaz ortam oluşturmak için bir hidrojel kullanan ve bireysel olarak izole edilmiş hayvanların uzun süreli izlenmesine izin veren Worm Corral'dır16. Önemli bir sınırlama, hayvanların yumurta olarak çevreye kapatılması gerektiği, üremeyi önlemek için steril hayvanların kullanılmasını gerektirmesi ve ilaç tedavilerinin tek bir uygulamayla sınırlandırılmasıdır. Çok dozlu ilaç denemeleri, WorMotel'de solucanları cihaza aktarmadan önce birden fazla maruz kalma turu gerçekleştirerek veya deney sırasında kuyucuklara topikal olarak ek ilaçlar ekleyerek gerçekleştirilebilir; Bununla birlikte, ikinci durumda, mevcut bir kuyucuğa ek bir ilaç eklendikten sonra gerçek maruz kalma dozunun kesin olarak ölçülmesi zordur ve ilacın ne kadar hızlı bozulduğuna bağlıdır. Hem WorMotel hem de Worm Corral, aktivite ve hayvan fizyolojisi (örneğin, büyüme ve gelişme) ile ilgili bilgileri yakalamak için parlak alan veya karanlık alan görüntüleme için mükemmeldir. Bu sistemler floresanı izlemek için kullanılabilse de, deneyimlerimize göre, diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojilerini oluşturmak için kullanılan PDMS, özellikle C. elegans araştırmasında kullanılan en yaygın florofor olan GFP emisyon aralığında, tutarlı floresan görselleştirme ve nicelleştirmeye müdahale eden düzensiz floresan artefaktlar üreten mikrokabarcıklar oluşturmaya, partikülleri yakalamaya ve diğer küçük anormalliklere eğilimlidir. Bugüne kadar, C. elegans bireysel hayvanlarının uzunlamasına bir şekilde canlı floresan görüntülemesi öncelikle mikroakışkan cihazlara dayanmaktadır17.

Burada, bireysel C. elegans'ı katı ortam üzerinde kültürlemek için hem engelleyici müdahaleler hem de doğrudan floresan görüntüleme ile uyumlu yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşım, özel olarak kalıplanmış PDMS çipinin, başlangıçta mikro sitotoksisite testleri için geliştirilen ticari olarak temin edilebilen polistiren mikro tepsilerle (yaygın olarak Terasaki tepsileri olarak da adlandırılır) değiştirilmesi dışında, konsept olarak diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojilerine benzerdir18. Bu mikro tepsiler, katı ortamlarla doldurulabilen ve bakteriyel gıdalarla tohumlanabilen, standart katı NGM kültür metodolojisi altında hayvanların yaşadığı çevreyi yakından taklit eden kuyucuklara sahiptir. Her kuyu, bakır sülfat yerine palmitik asidin engelleyici bir bariyeri ile çevrilidir. Palmitik asit, solucanların katı ortamlardan kaçmasını önlemek için, solucanların diyet kısıtlaması veya kimyasal bir stresöre maruz kalma gibi engelleyici bir ortamla zorlandığı deneylerde Petri plakaları üzerinde standart grup kültürünü kullanarak yaygın olarak kullanılır. Mikro tepsiler ayrıca minimal ve tutarlı floresan arka plan üreterek hayvanların doğrudan kültür ortamlarında floresan görüntülemesine olanak tanır. Bu yeni tek hayvanlı katı agar tabanlı kültür sistemi, yalnızca yaşam boyunca bireysel hayvanların izlenmesine ve büyümenin, gelişmenin, aktivitenin ve ömrün izlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda doğrudan floresan mikroskobu ile de uyumludur. Solucanlar felç veya fiksasyon olmadan görüntülenebildiğinden, in vivo floresan biyobelirteçleri, kültür ortamlarında kalan bireysel hayvanlarda uzunlamasına ölçülebilir ve her hayvanın ömrü boyunca dinamik değişikliklerin gözlemlenmesine izin verir. Bu kültür sistemi, kullanım ömrünü ve diğer sağlık ölçümlerini izlemek için mevcut nesil otomatik sistemlerle de uyumludur14,19. Bu mikrotepsi tabanlı sistemde bireysel C. elegans'ı kültürlemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, potansiyel tuzakları ve sorun gidermeyi tartışıyoruz ve diğer sistemlere göre avantajları ve sınırlamaları ve özellikle güncellenmiş ve optimize edilmiş bir WorMotel protokolü15'i tartışıyoruz.

Her tek solucan kültürü ortamı, özel bir 3B yazdırılmış adaptör kullanılarak standart bir tek kuyucuklu tepsinin içine monte edilmiş bir mikro tepsiden oluşur (Şekil 1A). Kuyucuklar düşük erimeli agaroz nematod büyüme ortamı (lmNGM) ile doldurulur, besin kaynağı olarak konsantre bakterilerle tohumlanır ve solucanların kaçmasını önlemek için palmitik asit kaplaması ile çevrilidir (Şekil 1B). Mikro tepsi ile tek kuyucuklu plakanın duvarları arasındaki boşluk, nemi korumak için doymuş su kristalleri ile doldurulur (Şekil 1B). Yoğuşmayı önlemek için tepsi kapağına bir deterjan kaplaması uygulanır. Her bir kuyucuğa tek bir solucan eklenir ve tek kuyucuklu tepsi, nemi korumak ve oksijen değişimine izin vermek için Parafilm ile kapatılır. Altı adede kadar mikro tepsi, tek bir deneyimli araştırmacı tarafından paralel olarak makul bir şekilde hazırlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Yemek tarifleri

NOT: Mikrotepsi plaka hazırlamaya başlamadan önce stok çözeltileri hazırlayın.

  1. Düşük erimeli agaroz nematod büyüme ortamı (lmNGM) için stok çözümleri
    1. 1 L şişede 1 L steril deiyonize su içinde 174.18 g K 2 HPO4 çözerek 1MK 2HPO4 hazırlayın. Çözeltiyi 121 ° C, 15 psi'de 30 dakika boyunca otoklavlayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
    2. 1 L şişede 136.09 g KH2HPO4 in 1 L steril deiyonize su çözerek 1 M KPi (pH 6.0) hazırlayın. pH 6.0'a ulaşmak için çözeltiyi 1 M K2HPO4 ile titre edin. Çözeltiyi 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın.
    3. 73.5 g CaCl2'yi 500 mL'lik steril deiyonize suda 500 mL'lik bir şişede çözerek 1 M CaCl2 hazırlayın. Çözeltiyi 121 ° C, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın
    4. 123.25 g MgSO4'ü 500 mL'lik steril deiyonize suda 500 mL'lik bir şişede çözerek 1 M MgSO4 hazırlayın. Çözeltiyi 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın.
    5. lmNGM için 3 M NaCl hazırlayın: Temiz 100 mL şişede, 100 mL ultra saf su ve 18.20 g NaCl birleştirin. 121 °C'de otoklav, 15 psig, 30 dakika boyunca.
    6. 2.5 g kolesterol, 275 mL% 100 etanol ve 25 mL steril deiyonize suyu 500 mL'lik kehribar bir şişede birleştirerek 5 mg / mL kolesterol hazırlayın. Çözeltiyi 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın.
    7. 0.1231 g FUdR'yi 10 mL'lik steril deiyonize suda 15 mL'lik bir konik tüpte çözerek 50 mM florodeoksiüridin (FUdR) hazırlayın. Çözeltiyi sterilize etmek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm filtre kullanın. Çözeltinin her biri 1 mL'sini 10 mikrosantrifüj tüpüne alın ve -20 ° C'de saklayın.
    8. 500 mg karbenisilin, 15 mL'lik bir konik tüp içinde 10 mL steril deiyonize su içinde 500 mg karbenisilin eritilerek hazırlanın. Çözeltiyi sterilize etmek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm filtre kullanın. Çözeltinin her biri 1 mL'sini 10 mikrosantrifüj tüpüne alın ve -20 ° C'de saklayın.
    9. 15 mL'lik bir konik tüp içinde 10 mL steril deiyonize su içinde 2.38 g IPTG'yi çözerek 1 mM izopropil ß-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) hazırlayın. Çözeltiyi sterilize etmek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm filtre kullanın. Çözeltinin her biri 1 mL'sini 10 mikrosantrifüj tüpüne alın ve -20 ° C'de saklayın.
    10. 15 mL'lik bir konik tüp içinde 10 mL steril deiyonize suda 1 g ampisilin çözerek 100 mg/mL ampisilin hazırlayın. Çözeltiyi sterilize etmek için 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm filtre kullanın. Her biri 100 mg/mL ampisilin çözeltisinin 1 mL'sini 10 mikrosantrifüj tüpüne alın ve tüpleri -20 ° C'de saklayın.
  2. Genel C. elegans bakımı için nematod büyüme ortamının (NGM) hazırlanması
    1. 50 plaka yapmak için, 10 g Bacto agar, 1.5 g NaCl ve 1.25 g Bacto peptonunu 486 mL ultra saf suda 1 L'lik bir şişede çözün. Ortamı, 121 ° C, 15 psig'de bir sıvı döngüsünde en az 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
    2. Otoklav sonrası, ortamın 55 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin. Daha sonra, çözeltiye 12.5 mL 1 M KPi, 500 μL 1 M MgSO4, 500 μL 1 M CaCl2 ve 500 μL 5 mg / mL kolesterol ekleyin.
    3. Steril bir teknik kullanarak, adım 1.2.2'de hazırlanan ortamın 10 mL'sini her 60 mm'lik plakaya dökün (toplam 50). Katılaşması için plakaları en az 30 dakika boyunca ortamla bırakın. Pipet 300 μL gece boyunca yetiştirilen bakteri kültürünü plakanın ortasına koyun ve tabağı tezgahın üzerinde bırakın. Kültürün 1-2 gün boyunca kurumasına ve kalınlaşmasına izin verin. Bu NGM plakalarını bakterilerle birlikte 4 °C'de saklayın.
  3. lmNGM ön karışımının hazırlanması
    1. 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde, 2 g düşük erimeli agaroz, 0.25 g pepton, 1 mL 3 M NaCl ve 99 mL ultra saf su birleştirin. Çözeltiyi 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın.
    2. 10 mL lmNGM'yi test tüplerine alın ve sıvı kaybını önlemek için Parafilm ile örtün. Tüpleri kapatın ve soğumalarını ve katılaşmalarını sağlayın.
  4. Bakteriyel gıdalar için 85 mM NaCl hazırlayın: 100 mL'lik bir şişede, 515.61 mg NaCl'yi birleştirin ve 100 mL'ye kadar ultra saf suyla doldurun. 121 °C'de otoklav, 15 psig, 30 dakika boyunca.
  5. 1 g Tip S süper emici polimeri otoklavlanabilir bir sıkma şişesinde 150 mL ultra saf su içinde çözerek su emici poliakrilamid kristalleri hazırlayın. Yeterli bir dağıtım boyutu sağlamak için ucu kesin. 121 ° C'de otoklav, 15 psig, 30 dakika boyunca, infoil ile kapatın ve kristalleri karıştırmak için çalkalayın.
  6. 3 mL% 100 Tween-20'yi 15 mL'lik konik bir şişede 7 mL ultra saf su ile birleştirerek bir deterjan çözeltisi hazırlayın.
  7. 2.5 g kolesterol, 275 mL% 100 EtOH ve 25 mL ultra saf suyu 500 mL'lik bir şişede birleştirerek 5 mg / mL kolesterol hazırlayın.
  8. Palmitik asit çalışma çözeltisi hazırlayın
    1. Bir harç ve havanede 500 mg katı palmitik asit öğütün ve 50 mL'lik konik bir şişede 15 mL Tween-20 ile birleştirin. Vorteks yaparak karıştırın, kristallerin mümkün olduğunca çoğunu çözün.
    2. 17.5 mL% 100 etanol ekleyin ve mümkün olduğunca fazla palmitik asidi çözmek için çözeltiyi vorteks.
    3. 17.5 mL ultra saf su ve vorteksi titizlikle ekleyin. Çözeltiyi, palmitik asit tamamen çözünene kadar 80 ° C'de bir boncuk banyosunda hafifçe ısıtın. Bazı palmitik asit soğutma sırasında çökelebilir.
  9. 1 L veya daha büyük bir beherde 1 L deiyonize suda 20 g LB tozunu karıştırarak lizojen suyu (LB) hazırlayın. Aliquot 500 mL et suyu iki adet 500 mL beher haline getirilir. Suyu 121 ° C'de, 15 psig'de, 30 dakika boyunca otoklavlayın. Hazırlanan suyu RT'de saklayın.
  10. Lizojeni et suyu (LB) agar plakalarının hazırlanması
    1. 10 g LB tozu ve 7.5 g Bacto agar'ı 500 μL deiyonize suda 1 L'lik bir şişede karıştırın. Çözeltiyi 121 ° C, 15 psig'de bir sıvı döngüsünde 30 dakika boyunca otoklavlayın.
    2. İstenirse, otoklavlanmış ortam 55 ° C'ye soğutulduktan sonra isteğe bağlı antibiyotikler (500 μL 100 μg / mL ampisilin) ekleyin. Steril bir teknik kullanarak, her 100 mm'lik plakaya (toplam 25) 20 mL ortam dökerek LB agar plakaları yapın. Plakaları 4 °C'de saklayın.

2. Yaş senkronize solucan popülasyonunun hazırlanması

  1. Larva evresi 4'te (L4) mikro tepsiye eklenmeye hazır olan yaş senkronize solucanlardan oluşan bir popülasyon hazırlayın. Alternatif olarak, herhangi bir yaşam aşamasındaki solucanlar eklenebilir (solucanlar, gelişimsel durmayı önlemek için L4'ten önceki bir gelişim aşamasında eklenirse, FUdR mikrotepsi ortamından çıkarılmalıdır).
    NOT: Bu adım, deneyin başlangıcındaki hedef yaşam aşaması L4 ise, solucanları mikro tepsiye eklemeden 2 gün önce tamamlanmalıdır. Senkronizasyon zamanlaması, solucanların istenen yaşam aşamasına ulaşmasına izin verecek şekilde ayarlanabilir.
  2. Sıcaklık kullanım ömrünü etkileyebilir. Tutarlı sonuçlar için, C. elegans'ı 20 ° C'de tutmak için standart NGM plakalarını (bkz. bölüm 1) kullanın ve bakteriyel gıdalarda azalma varsa solucanları taze plakalara aktarın.
  3. Birçok genç yetişkin solucanı olan stok plakalarından, yaş senkronize bir popülasyon oluşturmak için standart bir yaklaşım kullanın, en yaygın olarak20 ağartma veya zamanlanmış yumurtlama21.
  4. Yumurtaları izole edin ve bakteri lekeli bir NGM plakasına ekleyin. Vahşi tip C. elegans kullanılıyorsa, yumurtalar yumurtadan çıkar ve solucanlar oluşturur ve 2 gün içinde L4 larva aşamasına ulaşır.

3. Bakteri kültürünün hazırlanması

  1. Deneyin başlamasından bir gün önce, istenen bakteriyel besin kaynağını aşılayın. Plaka başına ~ 5 mL bakteri kültürü hazırlayın.
    NOT: Bakteri çizgisi 1 ay öncesine kadar hazırlanabilir ve E. coli besin kaynağı için 4 °C'de saklanabilir.
    1. Tek koloniler için bakterileri dondurulmuş bir gliserol stoğundan LB agar plakasına çizin.
    2. Kültürü bir gecede 37 ° C'de büyütün.
    3. Sıvı LB suyunu aşılama başına tek bir koloni ile aşılayın.
    4. 12-16 saat boyunca 37 ° C'de ~ 250 rpm'de çalkalayın.

4. Mikrotraya palmitik asit kaplama uygulanması

NOT: Palmitik asit, hayvanların bireysel kuyucuklardan kaçmasını önlemek için caydırıcı bir bariyer görevi görür. Kaplama, kuyucukların iç yüzeyleri hariç, mikro tepsinin tüm alt yüzeyine uygulanır. Mantar kontaminasyonunu azaltmak için palmitik aside nistatin eklenir. İstenirse bu adım, deneme başlamadan 1 gün önce tamamlanabilir.

  1. Ön ısıtma için zaman tanımak için boncuk banyosunu 80 ° C'ye ayarlayın.
  2. Kullanımdan hemen önce, mikro tepsi başına 1 mL palmitik asit çalışma çözeltisini ayrı bir steril kaba (tipik olarak 15 mL'lik bir konik şişe) aliquot edin ve ısıtmadan önce 1 mL palmitik asit çözeltisi başına 4 μL 10.000 birim / mL nistatin ekleyin.
  3. Doygunluğa ulaşmak için mikro tepsinin içine ve dışına etanol (% 70 veya daha fazla) püskürtün ve fazla etanolün çalkalanması.
    NOT: Kalıntı etanol, UV çapraz bağlamada tedavi sırasında buharlaşmalıdır (adım 4.4).
  4. Mikro tepsiyi sterilize etmek için bir UV çapraz bağlayıcı kullanın (aşağıdaki talimatlar bu çalışmada kullanılan UV çapraz bağlayıcı içindir):
    1. Mikro tepsiyi ve kapağı UV çapraz bağlayıcıya ayrı ayrı yerleştirin (yani, UV plastiğe nüfuz etmediğinden kapakları plakaların üzerine yerleştirmeyin).
    2. Kapıyı kapatın ve UV çapraz bağlayıcıyı açın.
    3. Zaman tuşuna basın, 20 dakika girin ve ardından Başlat'a basın.
    4. 20 dakika sonra, plakayı ve kapağı ters çevirin ve 4.2.2-4.2.3 adımlarını tekrarlayın.
    5. Eldiven giyerken, sterilizasyondan sonra kontaminasyonu önlemek için kapakları mikro tepsiye yerleştirin.
  5. Palmitik asit çalışma çözeltisini vorteks ve ters çevirerek iyice karıştırın.
  6. 15 mL'lik konik şişeyi palmitik asit çalışma çözeltisi ile boncuk banyosuna yerleştirin ve görünür kristallerin kullanımdan önce tamamen çözünmesine izin verin.
  7. Mikro tepsiyi, ısınmak için ~ 2 dakika boyunca kapakları açık olacak şekilde boncuk banyosunu çevreleyen çıkıntıya yerleştirin.
  8. Mikro tepsi kapağını çıkarın. Mikro tepsinin arka duvarına (uzun tarafı) yavaşça 200 μL palmitik asit çalışma solüsyonu ekleyin. Kapakları değiştirin ve palmitik asit çözeltisinin mikro tepsinin dibine yerleşmesini sağlamak için mikro tepsinin boncuk banyosunda 2-3 dakika oturmasına izin verin.
    NOT: Mikro tepsinin tam tabanı adım 4.10'a kadar tamamen kaplanmayacak olsa da, çözelti alt yüzeyin yarısından fazlasına eşit olarak yayılmalıdır. Palmitik asit çözeltisi eşit şekilde yayılmıyorsa, mikro tepsinin yakınında bir vorteks veya titreşimli motoru açın. Bu, palmitik asit çözeltisinin daha kolay yayılmasına yardımcı olabilecek az miktarda titreşim sağlayacaktır. Kirlenmeyi azaltmak için mikro tepsi kapaklarını yerinde tutun.
  9. 4.8 adımını yineleyin.
    NOT: Mikrotepsinin tabanının kabaca yarısı veya daha fazlası sıvı palmitik asit ile gözle görülür şekilde kaplanmalıdır.
  10. Mikro tepsiyi 180° döndürün ve tepsinin diğer tarafındaki 4,8 ve 4,9 adımlarını yineleyin.
    NOT: Terasaki tepsisinin tabanı, her iki tarafa da tam birleşik hacim eklendikten sonra sadece ince bir palmitik asit çözeltisi tabakası ile kaplanacaktır (adım 4.9 ve 4.10). Karışım hazırlığına, sıcaklığa ve diğer faktörlere bağlı olarak az ya da çok palmitik asit karışımı gerekebilir. Genel olarak, palmitik asit karışımının 400 ila 800 μL arasında, mikro tepsinin tüm tabanını kaplamak için yeterli olacaktır. Mikro tepsinin tabanı gözle görülür şekilde kaplanır kaplanmaz, kuyucukları kirletebileceğinden ilave palmitik asit eklenmemelidir.
  11. Tepsiyi steril bir kurutma kutusunda veya laminer akış davlumbazında en az 1 saat açıkta bırakacak şekilde kurutun. Alternatif olarak, plakaları yüklemeden bir gün önce bu adımı tamamlayın (bölüm 5), mikro tepsiyi RT'de kapağı açıkken en az 16 saat kurutun.

5. Mikro tepsinin düşük erimeli nematod büyüme ortamı (lmNGM) ile yüklenmesi

NOT: Bu yöntem, normal agar yerine düşük erimeli agaroz ile karıştırılmış standart NGM kullanır. Agar 45 ° C'de jelleşmeye başlayabilir. Mikrotepsi kuyucuklarını doldurmak için gereken küçük hacimlerle çalışırken, agar bazlı NGM genellikle pipet ucunu tıkar ve/veya hızlı jelleşme nedeniyle düzgün olmayan kuyu yüzeyleri üretir. Düşük erimeli agaroz kullanan NGM, ~ 28 ° C'de jelleşmeye başlar, erimiş ortamın kolayca pipetlenmesini ve sürekli olarak düz kuyu yüzeyleri oluşturmasını sağlar. lmNGM'yi, solucanların mikro tepsiye yerleştirileceği gün hazırlayın. Mikro tepsiyi lmNGM ile hazırlıyorsanız, bakterilerle tohumluyorsanız ve C. elegans'ı aynı gün içinde yüklüyorsanız, bu adımlara başlamadan önce hayvanların istenen yaşta veya yakınında olduklarından emin olun.

  1. Isınmak için 80 °C boncuk banyosuna bir pipet havuzu yerleştirin.
  2. Hazırlanmakta olan mikro tepsi başına bir adet 10 mL lmNGM ön karışımını (adım 1.1) mikrodalgada ~30-45 s eritin.
    1. lmNGM ön karışım test tüplerini, devrilmemeleri için açıkta bırakılmış 200 mL'lik bir beher içine yerleştirin.
    2. ~ 10-15 s sonra veya lmNGM ön karışımı kabarcıklanmaya başladığında, mikrodalgayı duraklatın, lmNGM ön karışımını steril bir 200 mL beher içine dökün ve mikrodalga fırınlamaya devam edin.
    3. Kaynamasını önlemek için gerektiği gibi duraklatın ve karıştırmak için girdap yapın.
    4. Tüm lmNGM'ler parça olmadan sıvıya dönüştüğünde mikrodalga fırınlamayı durdurun.
      NOT: Toplam 192 kuyucuğu (iki mikro tepsi) doldurmak için tek bir 10 mL aliquot yeterlidir.
  3. Sıcak düşük erimeli agaroza aşağıdaki bileşenleri listelenen sırayla ekleyerek lmNGM'yi hazırlayın (hacimler 10 mL düşük erimeli agaroz başınadır): 250 μL 25 mM KPi (pH 6), 10 μL 1 M CaCl2, 10 μL 1 M MgSO4 ve 10 μL 5 mg / mL kolesterol
    1. Araştırmacı yetişkin hayvanları zamanla incelemeyi planlıyorsa ve üremeyi önlemesi gerekiyorsa, 10 μL 50 mM FUdR ekleyin.
    2. Ortak HT115 RNAi E. coli suşu ve ilişkili RNAi plazmidlerini kullanarak bir RNAi besleme deneyi yürütüyorsanız, ayrıca 5 μL 50 mg / mL karbenisilin (RNAi plazmidini seçmek için) ve 12 μL 1 mM IPTG (RNAi plazmidinden çift sarmallı RNA'nın ekspresyonunu indüklemek için) ekleyin.
      NOT: İstenilen gıda kaynağı için gerekli olan seçici antibiyotiklere ve diğer kimyasallara bağlı olarak ek katkı maddeleri eklenebilir. Bu aşamada lmNGM'ye ilaçlar veya kimyasal stresörler de eklenebilir. NGM ve lmNGM, aynı nihai NaCl konsantrasyonunu içerir, ancak NaCl'nin medyaya nasıl eklendiği konusunda farklılık gösterir. NGM için, tüm NaCl medya hazırlığı sırasında eklenir (adım 1.2). LmNGM için, ortam hazırlama sırasında NaCl'nin bir kısmı (adım 5.3) ve bakteriyel gıda ile bir kısmı (bölüm 6) eklenir. Bu değişikliğin nedeni, her mikro tepsi kuyusundaki küçük ortam hacminden kaynaklanmaktadır. 20 μL ortam içeren bir kuyucuğa LB içinde asılı 5 μL konsantre bakteri eklenmesi, ortamın besin bileşimini önemli ölçüde değiştirecektir (LB bileşenlerini karşılaştırılabilir bir hacimde ekleyerek). Bunu önlemek için, bakteriler bunun yerine, bakteriler üzerindeki ozmotik stresi önlerken LB bileşenlerini çıkarmak için bir NaCl çözeltisi içinde yeniden askıya alınır. Ortama eklenen NaCl, bakterilere eklenen tuzu hesaba katmak için buna göre azaltılır.
  4. Isıtılmış pipet havuzuna lmNGM dökün.
  5. Mikro tepsi bir tezgahın üzerindeyken, her bir mikro tepsiye 20 μL lmNGM pipet ekleyin. Kirlenmeyi en aza indirmek için pipeti yeniden doldururken mikro tepsiyi örtün.
    NOT: Bu adım, elektronik tekrarlanan pipet ile daha kolaydır.

6. Mikrotepsi kuyucuklarının bakteriyel gıdalarla tohumlanması

NOT: Bir gecede aşılanmış bir kültürden elde edilen 5 μL 10x konsantre gıda, ömrünün tamamı boyunca tek bir C. elegans'ı beslemek için yeterlidir.

  1. Bakterileri gece kültüründen 50 mL'lik bir konik şişeye aktarın.
  2. 20 dakika boyunca ~ 3.500 x g'de santrifüj.
  3. Supernatan'ı çıkarın. Bakteri kültürünü 85 mM NaCl çözeltisi ile 10x konsantrasyonda (orijinal kültürün 1/10 hacmi) yeniden askıya alın.
  4. Kuyucuklara bakteri eklemeden önce, katı lmNGM'nin her bir kuyucukta tamamen bulunduğundan emin olmak için mikro tepsiyi görsel olarak inceleyin. Bir kuyunun kenarından herhangi bir lmNGM sarkıyorsa, fazla lmNGM'yi bir pipet ucuyla kazıyın. Bu fazla madde, temizlenmezse yiyeceğin palmitik aside karışmasına neden olabilir.
  5. Her bir kuyucuktaki lmNGM yüzeyine 5 μL 10x konsantre bakteri kültürünü dikkatlice pipetin. Bakteri kültürünün kuyunun kenarından ve palmitik aside akmasına izin vermekten kaçının, çünkü bu, solucanları kuyudan ayrılmaya çekecektir.
  6. Mikro tepsilerin steril bir kurutma kutusunda veya laminer akış davlumbazında ~ 35 dakika kurumasını bekleyin. Her ~ 5 dakikada bir kontrol edin ve aşırı kurumamaya dikkat edin. Birkaç kuyucuk gözle görülür şekilde hafifçe ıslakken çıkarın, çünkü nematodlar eklenirken kuyular daha da kurur.

7. Her mikro tepsinin tek kuyucuklu bir plaka içine kapatılması

NOT: Bu bölümde, mikro tepsi, özel bir 3D baskılı kesici uç kullanılarak standart bir tek kuyucuklu plakanın içine monte edilir ve su emici kristallerle çevrilidir. Tek kuyucuklu plaka daha sonra kapatılır ve Parafilm ile kapatılır. Bu, kontaminasyonu önlerken ve lmNGM'nin birkaç haftalık deneyler boyunca kurumasını önlemek için yeterli nemi korurken oksijen değişimine izin verir (solucan ömrü deneyleri, ömrünü uzatan mutasyonları veya çevresel koşulları incelerse 6-8 hafta sürebilir). Hazırlık sırasında, bakteri veya mantar kontaminasyonunu en aza indirmek için aktif olarak bir şey eklenmediğinde plakayı kapattığınızdan emin olun.

  1. Tek kuyucuklu bir plakayı, 3D baskılı adaptörü ve kapağı her birini% 10'luk bir ağartıcı çözeltisine batırarak sterilize edin. Steril DI su ile iyice durulayın. Görev silme işlemiyle kurulayın.
  2. Tek kuyucuklu plakayı, 3D baskılı adaptörü ve kapağı %70 veya daha fazla etanol çözeltisiyle püskürtün ve bir görev silme işlemiyle silin. Herhangi bir artık etanol havasının kurumasını bekleyin.
    NOT: UV radyasyonu, yukarıda adım 4.4'te açıklandığı gibi, mikro tepsi ile aynı parametrelere sahip ağartıcı ve etanolden sonra da kullanılabilir.
  3. Steril 3D baskılı kesici ucu steril tek delikli bir plakaya yerleştirin.
  4. Hazırlanan mikro tepsinin dışını %70 etanol ile püskürterek sterilize edin.
  5. Mikro tepsiyi tek delikli plakadaki 3D yazdırılmış adaptöre yerleştirin.
  6. Mikro tepsi kapağını atın.
  7. Su kristallerini, mikro tepsinin dış duvarı ile tek kuyucuklu plakanın iç duvarı arasında 3D baskılı kesici ucun üzerine serbestçe dağıtın.
  8. Solucanları hemen ekleyin (bölüm 8) veya ertesi gün kullanmak için mikro tepsiyi kapatın. Tepsi kapağını kapatın ve mikro tepsiyi kapatmak için dört tarafı da sarmak için tek bir Parafilm parçası kullanın. Toplam üç katman için Parafilm ile sızdırmazlık adımını iki kez daha tekrarlayın.
  9. Mikro tepsiyi kapattıktan sonra, solucanları eklemeden önce RT'deki tezgahta 4 güne kadar bırakın (bölüm 8).

8. Mikro tepsiye solucanlar ekleme

NOT: Platin toplama kullanılarak yaşa senkronize solucan popülasyonlarından (bölüm 2) hayvanlar aktarılarak her kuyucuğa manuel olarak bir solucan eklenebilir. Hayvanları sadece istenen yaşam aşamasında transfer edin. Transfer işlemi 1 saatten fazla sürerse, mikro tepsi kuyucuklarındaki lmNGM kuruyabilir. Bir seferde 10 ila 20 solucandan oluşan grupların aktarılması bu adımı hızlandırabilir, ancak kuyu başına yalnızca tek bir hayvanı tutarlı bir şekilde serbest bırakmak biraz pratik gerektirir.

  1. İstenilen yaşam aşamasına ulaştıklarında kuyu başına bir nematod ekleyin.
  2. Kirlenmeyi en aza indirmek için kaynak plakadan solucanlar toplarken kapağı tekrar mikro tepsinin üzerine yerleştirin.

9. Kültür ortamının uzun süreli kullanıma hazırlanmasının bitirilmesi

NOT: Aşağıdaki adımlar, mikro tepsideki ortamın ve solucanların deney süresi boyunca nemli kalmasını sağlamak için gerçekleştirilir.

  1. Tek kuyucuklu bir plakanın kapağına ~ 40 μL deterjan çözeltisi ekleyin ve kapağı eşit şekilde kaplamak için bir görev mendili kullanın. Bu kaplama, plaka kapatıldıktan sonra zamanla yoğuşmayı önleyecektir. Deterjan çözeltisini, kapaktan görme bozulmayana kadar yaymak için ek görev mendilleri kullanın (bu genellikle yaklaşık iki görev mendili gerektirir).
  2. Su kristallerini, her ikisinin de mikro tepsinin üst kenarı ile aynı hizada olduğundan ve taşmadığından emin olmak için inceleyin. Gerekirse, plakaya su kristalleri ekleyin veya çıkarın.
  3. Aşağıdaki yaklaşımı kullanarak, Parafilm mührünün uzun süre dayanacağından emin olmak için tepsiyi Parafilm (toplamda üç parça) ile sarın.
    1. Tepsinin iki tarafını örtmek için ilk Parafilm parçasını hafifçe gerin.
    2. İkinci Parafilm parçasını hafifçe gerin ve tepsinin kalan taraflarını örtün.
    3. Parafilm'in son parçasını gerin ve birinci ve ikinci Parafilm parçalarını kaplayacak şekilde tepsinin dört tarafını da tamamen sarın. Düzgün kapatılmış bir mikro tepsi ~ 2 ay boyunca sulu kalabilir.
      NOT: Deney boyunca her 1-2 haftada bir Parafilm bütünlüğünü izleyin ve gerektiğinde değiştirin.
    4. Parmak izlerini çıkarmak için tepsinin üst kısmını, %70 etanol ile nemlendirerek bir görev mendili ile silin.
  4. Tek kuyucuklu plakayı bant kullanarak etiketleyin. Mikro tepsi artık solucanları zaman içinde izlemek için görüntüleme ve uzun süreli depolama için hazırdır. Görüntüleme seansları arasında tepsiyi 20 °C'de tutun. Mikro tepsi, ilaç dozlaması veya diğer prosedürler için birden çok kez açılabilir ve yeniden kapatılabilir, ancak kontaminasyonu ve nem kaybını önlemek için en aza indirilmelidir.

10. Mikrotepsi kuyucuklarında bireysel solucanların görüntülenmesi

NOT: Bu protokolün amacı, mikrotepsi kültür ortamının nasıl hazırlanacağına dair ayrıntılı bir açıklama sağlamaktır. Solucanlar hazırlandıktan ve doldurulduktan sonra, mikro tepsi tek solucan kültürü ortamları, Petri plakaları üzerinde standart kültür için oluşturulan teknikleri kullanarak birçok fenotipi uzunlamasına izlemek için kullanılabilir. Aşağıdaki bölümde, bazı yaygın fenotiplerin ölçülmesi için temel talimatlar verilmektedir. Floresan görüntüleme dik mikroskopta yapılmalıdır. Terasaki tepsisindeki ışığın kırılması karanlık bir odada en aza indirilir.

  1. Ömrü: Plakanın yan tarafına veya üstüne hafifçe dokunarak veya plakaya parlak mavi bir ışık yakarak ve her hayvanı gözlemleyerek ömrünü ölçün. Birkaç saniye içinde hareket etmeyen bir hayvanı "ölü" olarak puanlayın. Tüm solucanlar ölene kadar bu görevi her 1-3 günde bir tekrarlayın.
    NOT: Mikrotepsi kültürü ortamı, kullanım ömrü tahmini14,19 için görüntü toplama ve analizini otomatikleştiren sistemlerle uyumludur.
  2. Standart mikroskopi: Yüksek çözünürlüklü bir kamera veya tarayıcı ile tek tek kuyucuklarda veya tüm tepside parlak alan (veya karanlık alan) görüntülemesi gerçekleştirin. Bu görüntüleme verileri, hayvan büyüklüğü 22,23,24, gelişim 25, aktivite14,19 ve yaşam süresi dahil olmak üzere çeşitli fenotipler için kullanılabilir.
  3. Floresan mikroskopi: Tek kuyucuklarda manuel olarak veya motorlu platform sistemi ile floresan görüntüleme yapın. Tek kuyulu tepsiler, standart çok kanallı plaka adaptörleriyle uyumludur. Aparat siyah duvarlı bir kutuya yerleştirilirse sinyal-gürültü en aza indirilir.
    NOT: Solucanlar tarama için serbest kalırken görüntülendiğinden, bu kültür sistemi tüm vücut floresansını ve floroforların kaba doku lokalizasyonunu yakalamak için düşük çözünürlüklü görüntüleme için çok uygundur. Yüksek çözünürlüklü ve yüksek büyütmeli görüntüleme tipik olarak hayvanların hareketi önlemek için hareketsiz hale getirilmesini gerektirir. Her bir kuyucuğa topikal olarak bir felç edici ajan (örneğin, sodyum azid veya levamisol) uygulamak ve daha yüksek çözünürlüklü görüntülemeye devam etmek mümkün olsa da, bu, aynı solucanın daha sonraki zaman noktalarında tekrarlanan ölçümlerini engelleyecektir. Kültür sistemi, tarif edildiği gibi, ters çevrilmiş mikroskop sistemlerinin kullanılmasını önleyen tersine çevrilmesi amaçlanmamıştır.
    1. Ömrü ölçmek için parlak alan kullanılmıyorsa ve yalnızca floresan yakalanıyorsa, ömrü manuel olarak ölçün. Mavi ışığı (GFP uyarımı için kullanılır) solucan üzerinde 5 saniye boyunca bırakmak, hayvanın hareket etmesini sağlayacaktır. Hayvan 5 saniye içinde hareket etmediyse, hayvanı ölü olarak düşünün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan mikrotepsi tabanlı tek solucan kültürü ortamı, yaşam süresi ve sağlık süresi, aktivite ve hareket, vücut şekli ve tarama geometrisi ve zaman içinde bireysel hayvanlarda transjenik olarak eksprese edilen floresan biyobelirteçlerin ekspresyonu dahil olmak üzere çeşitli fenotipleri izlemek için kullanılabilir. Mikrotepsi kültür sistemi, manuel puanlama veya görüntü toplama ve aşağı akış görüntüleme analizi yoluyla kullanım ömrü analizi ile uyumludur. Petri plakaları21'deki standart kültürde olduğu gibi, solucanlar bir uyaranı takip eden harekete bağlı olarak manuel olarak ölü veya canlı olarak puanlanabilir (örneğin, plakaya dokunmak veya mavi ışığa maruz kalmak). Görüntü tabanlı yaşam süresi analizi için, uyaran uygulandıktan sonra çekilen görüntüler arasındaki kareden kareye farklılıkların karşılaştırılması, her solucanın ne zaman hareket etmeyi bıraktığını belirlemek için kullanılır. Bu, otomatik görüntü toplama ve analiz sistemleriyle uyumludur ve her zaman noktasında bireysel hayvanların aktivite seviyesi şeklinde ek veriler sağlar. Bu bilgi daha sonra sadece ömrü (hareketin durması) tahmin etmek için değil, aynı zamanda sağlık süresini (azaltılmış aktivite eşiği; çoklu tanımlar önerilmiştir) tahmin etmek için de kullanılabilir. Bu görüntülerden ek parametreler (vücut büyüklüğü, şekli ve duruşu) da ölçülebilir.

Bu mikrotepsi kültür sisteminin temel özellikleri (1) bireysel hayvanları zaman içinde izleme kapasitesi, (2) kültür sistemi ile diyet kısıtlaması veya kimyasal stres ajanları gibi engelleyici müdahaleler arasındaki uyumluluk ve (3) floresanı doğrudan kültür ortamında ölçme yeteneğidir. Bu özellikleri göstermek için, solucanları ağır metal stresini indüklemek için 250 μM bakır sülfata (CuSO4) veya proteinin yanlış katlanma stresini indüklemek için 10 mM ditiyotreitol'e (DTT) maruz bıraktık ve günlük aktiviteyi, ömrü ve sağlık süresini ölçtük. Hem CuSO4hem de DTT, solucan ömrünü önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 2A). Günlük aktiviteyi izlemek, her solucanın bireysel sağlık süresini tahmin etmemize izin verdi, burada bir solucanın uyarana yanıt olarak artık tam bir vücut uzunluğunu hareket ettiremediği yaş olarak tanımlandı. CuSO4 ve DTT, tedavi edilmeyen kontrollere göre sağlık süresini azaltmıştır (Şekil 2B). Buna karşılık, CuSO4 , sağlıklı bir şekilde geçirilen yaşamın oranını azaltırken, DTT azaltmadı (Şekil 2C). CuSO4 ayrıca popülasyondaki bireyler arasındaki ortalama aktiviteyi her yaştaki DTT'den daha büyük ölçüde azaltmıştır (Şekil 2D) ve yaşam süresi boyunca her hayvan için kümülatif aktivite (aktivite eğrisi [AUC] altındaki alan olarak hesaplanmıştır); Şekil 2E). Bu mikrotepsi kurulumunun önemli bir avantajı, bir popülasyondaki bireysel hayvanlar arasında farklı zaman noktalarında ölçülen fenotipleri ilişkilendirme yeteneğidir. Bu durumda, 10. güne kadar bireysel hayvanlar için kümülatif aktivitenin, DTT'ye meydan okuyan hayvanlar için yaşam süresi ile ilişkili olduğunu, ancak tedavi edilmemiş kontroller veya CuSO4 ile meydan okuyan hayvanlar için ilişkili olmadığını görüyoruz (Şekil 2F).

Yaşam süresi boyunca floresan biyobelirteçleri izleme yeteneğini göstermek için, mikro tepsi kültür sistemini, kynu-1 geninin C-terminüsüne kaynaşmış mScarlet transgeninin ekspresyonunu izlemek için kullandık ve kinürenin metabolik yolundaki kinüreninaz enzimini endojen lokusunda kodladık. Daha önce, Kynu tarafından kodlanan insan kinürenazının ekspresyonunun, kandakiyaşla birlikte 26 ile arttığını ve C. elegans'ta kynu-1'in yıkılmasının ömrüuzatmak için yeterli olduğunu bulmuştuk 27. KYNU-1 yaşa bağlı ifade gösterir; L4 larva aşamasında neredeyse tespit edilemez ve yetişkinliğin 9. gününde zirveye ulaşır. Yetişkinliğin 3. ve 8. günleri arasında ekspresyonda ciddi bir artış gözlenir ve bundan sonra yaşla birlikte ilerleyici bir düşüş olur (Şekil 3A, Ek Şekil 1). KYNU-1 ve C. elegans yaşlanması arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için, KYNU-1'in kümülatif bolluğunu yetişkinliğin 14. gününe kadar (çoğu hayvanın hala hayatta olduğu bir yaş) ölçtük ve yaşam süresi ile anlamlı bir korelasyon bulduk (Şekil 3B). KYNU1 ekspresyonu bir yaşam süresi boyunca dinamik olduğundan, farklı yaşlardaki KYNU-1 ekspresyonunu bireysel hayvanlarda genel hayatta kalma ile karşılaştırdık. Tek bir zaman noktasında KYNU-1 ekspresyonu sağkalım ile anlamlı bir şekilde ilişkili değildi (Şekil 3C-F), yaşam boyu ekspresyonun yaşam süresi etkisinin tek zaman noktası değerlendirmelerinden daha iyi bir göstergesi olduğunu göstermiştir.

Bir araya getirildiğinde, bu deneyler, solucan aktivitesi, sağlık, yaşam süresi ve floresan biyobelirteçlerindeki dinamik değişikliklerin bireysel hayvanlarda yaşlar boyunca yakalanmasını ve karşılaştırılmasını sağlamak için mikrotepsi tabanlı tek solucan kültür sisteminin yeteneklerini vurgulayan temsili veriler sağlar. Özellikle, bireyleri birden fazla zaman noktasında izleme yeteneği, hem fizyolojik hem de moleküler fenotiplerdeki dinamik değişikliklerin in vivo olarak izlenmesine izin vererek, popülasyonlar arasında kesitsel ölçümler kullanılarak belirgin olmayacak kalıpların tespit edilmesini sağlar.

Figure 1
Resim 1: Mikrotepsi tek solucan kültür ortamı . (A) Özel bir 3B baskılı adaptör kullanılarak tek kuyucuklu bir plaka içine monte edilmiş bir mikro tepsinin 3B olarak oluşturulması. (B) Düşük erimeli agaroz nematod büyüme ortamı (NGM), bakteriyel gıda, izole C. elegans, önleyici palmitik asit kaplama, 3D baskılı adaptör, su kristalleri ve tek kuyucuklu plaka içeren bir mikro tepsi kuyusunun göreceli konumunu gösteren tek solucan kültür sisteminin şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Mikrotepsi tek solucan ortamları kullanılarak popülasyonlar arasında bireysel hayvanlarda fenotiplerin korelasyonu. Tüm paneller, hiçbir katkı maddesine maruz kalmayan üç grup vahşi tip (N2) C. elegans'ı karşılaştıran bir deneyden veri sağlar (kontrol; N = 55), 250 μM bakır sülfat (CuS04; N = 38) veya 10 mM ditiyotreitol (DTT; N = 34) yetişkinliğin 2. gününden itibaren. Yaşam süresi (A) ve sağlık süresi (B), CuSO4 veya DTT'ye kronik maruz kalma ile orta derecede azalır. Sağlık süresi, bir hayvanın plaka üzerinde en az bir tam vücut uzunluğunu hareket ettirebileceği son gün olarak tanımlanır. İkili anlamlılık, log-rank testi (R survdiff fonksiyonu) kullanılarak hesaplanır. (C) Her popülasyondaki sağlık süresi ve yaşam süresi ortalamaları (üst: mutlak değerler; alt: her grubun ortalama ömrüne göre normalleştirilmiş). (D) Yaşam süresi boyunca her gruptaki ortalama solucan aktivitesi (günlük aktivitenin 3 günlük yuvarlanma ortalaması) ve (E) yaşam boyu aktivite eğrisi (AUC) altındaki bireysel hayvan alanının popülasyon ortalaması, CuSO4 veya DTT tarafından önemli ölçüde bozulmuştur. Gruplar arasında bireysel hayvanlar için AUC'yi karşılaştırmak için Mann-Whitney U testi tarafından belirlenen anlamlılık. (F) Bireysel hayvanlar için 10. güne (altta) kadar kümülatif aktivite, DTT'ye maruz kalan hayvanlar için bir yaşam süresi ile ilişkilidir, ancak doğrusal regresyon (R'de lm fonksiyonu) ile belirlendiği gibi, kontrol hayvanları veya CuSO4'e maruz kalan hayvanlar için değildir. n.s. = anlamlı değil, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Bonferroni yöntemi, çoklu karşılaştırmalar için tüm p değerlerini ayarlamak için kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Yaşam süresi boyunca bireysel C. elegans'ta KYNU-1'in dinamik nicelleştirilmesi. Kynu-1 geninin (KYNU-1::mScarlet) C-terminusuna transjenik olarak kaynaştırılmış mScarlet'li C. elegans, tüm hayvanlar ölene kadar 36 gün boyunca her 1-4 günde bir monokrom kamera ile donatılmış bir floresan stereo mikroskop kullanılarak görüntülendi. (A) KYNU-1, günlük KYNU-1::mScarlet floresan kantitasyonu ile ölçüldüğü gibi, yaşam süresi boyunca yaşa bağlı farklı bir ekspresyon paterni gösterir (her yaşta gösterilen solucanlar arasındaki ortalama değer). (B) Kümülatif KYNU-1::mYetişkinliğin 14. gününe kadar olan kızıl ifade, bireysel hayvanlardaki yaşam süresi ile ilişkilidir. KYNU1::m(C) L4 larva aşamasında (yetişkinliğin 0. günü), (D) yetişkinliğin 4. gününde, (E) yetişkinliğin 9. gününde ve (F) yetişkinliğin 15. gününde kırmızı ifade, bireysel hayvanlarda yaşam süresi ile ilişkili değildi. Doğrusal regresyon ile hesaplanan korelasyonlar (Microsoft Excel'de Veri Analizi Regresyon işlevi). n.s. = anlamlı değil, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Tüm p-değerleri, Bonferroni yöntemi kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için ayarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Kırmızı kanal altında yaşam süresi boyunca görüntülenen tek KYNU-1::mScarlet C. elegans. Konsantre E. coli gıda kaynağında yaşayan mScarlet etiketli KYNU-1 ile tek bir C. elegans içeren prefabrik bir mikro tepsinin tek kuyusu. Hayvan ilk olarak L4 larva aşamasında görüntülendi ve daha sonra ömrünün geri kalanında 1-5 günlük artışlarla görüntülendi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Terasaki tepsisine karşı WorMotel arka planı ve floresan mikroskobu altında artefakt karşılaştırması. Prefabrik mikro tepsilerin (üstte) veya kalıplanmış PDMS WorMotel'lerin (altta) kuyuları, GFP (A), RFP (B) ve DAPI (C) floresan kanalları altında, tek renkli bir kamera ile donatılmış bir floresan stereo mikroskop kullanılarak görüntülendi. Görüntüler yanlış renkte gösterilir ve doygunluk noktalarını vurgulamak için bir ısı haritası kullanılır. Her iki kültür sistemi de tüm kanallarda düşük seviyeli geçmişlere sahiptir. WorMotel plakaları, PDMS kalıplama işlemi sırasında yanlışlıkla yakalanan mikro kabarcıklar veya toz veya diğer partiküller olan sporadik yüksek sinyalli eserlere eğilimlidir14,15. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. Mikro tepsinin tek delikli plakaya yerleştirildiği 3B baskılı kesici uç için stereolitografi (STL) dosyası. Bu dosya, sağlam bir tabana sahip tam sürümü içerir ve ışık kaynağının plakanın üzerinde olduğu bir sistemde kullanım için en uygun olanıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek dosya 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. Mikro tepsinin tek delikli plakaya yerleştirildiği 3B baskılı kesici uç için stereolitografi (STL) dosyası. Bu dosya dipsiz sürümü içerir ve ışık kaynağının plakanın altında olduğu bir sistemde kullanım için en uygun olanıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, başlangıçta insan lökosit antijen doku tipleme testleri için geliştirilen mikro tepsileri, C. elegans araştırmasında standart olan agar bazlı NGM'ye bağlamsal olarak benzeyen katı bir ortam ortamında tek C. elegans'ın zaman içinde izolasyonuna ve karakterizasyonuna izin verecek şekilde uyarlayan yeni bir kültür sistemini açıklıyoruz. Bu sistem, diyet kısıtlaması, eksojen ilaç tedavisi, kimyasal veya çevresel stresörlerle ilgili bir zorluk ve RNAi dahil olmak üzere çeşitli müdahalelerle uyumludur. Ayrıca, bireysel hayvanlarda floresan biyobelirteçlerin in vivo olarak uzunlamasına izlenmesini sağlar. Bir popülasyondaki bireysel hayvanları takip etme kapasitesi, davranış, patogenez, stresli koşullara tepki ve sağlıktaki düşüş dahil olmak üzere farklı bir zamansal bileşene sahip fenotipler için bir popülasyon içinde birey içi değişkenliğin değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, bir popülasyon içinde değişen erken yaşam özelliklerinin, yaşam süresi ve sağlık da dahil olmak üzere geç yaşam sonuçlarıyla bağlantılı olmasını sağlar. Diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojilerine benzer şekilde, bu mikrotepsi tabanlı kültür sistemi, bireysel hayvanların yaşam boyunca birden fazla zaman noktasında izlenmesini sağlarken, solucanlar sıvı ortamlarda kültürlendiğinde ortaya çıkan stres tepki yollarının aktivasyonu gibi potansiyel kafa karıştırıcı faktörlerden kaçınır (birçok mikroakışkan cihazda olduğu gibi). Bu, bu kültür sisteminde toplanan verilerin, katı medya üzerinde yürütülen geçmiş C. elegans çalışmalarının çoğunluğu ile daha doğrudan karşılaştırılmasını sağlar. Son teknolojik gelişmeler, büyüme, gelişme ve yaşlanma28 dahil olmak üzere C. elegans karakterizasyonunun birçok yönünün otomasyonuna izin vermektedir. Bu kültür sistemi, otomatik mikroskopi ve ilgili yazılımlarla birleştirildiğinde, kullanım ömrü, sağlık süresi, aktivite ve diğer fizyolojik parametrelerin otomatik, yüksek verimli bir koleksiyonuyla uyumludur14,19.

WorMotels14,15'i, ilaç tedavileri ve RNAi gibi stresli olmayan koşullar altında bireysel C. elegans için fizyolojik fenotipleri (örneğin, yaşam boyu aktivite), sağlık süresini ve uzun ömürlülüğü izlemek için rutin olarak kullanıyoruz. Deneyimlerimize göre, diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojileri, bu fenotiplerdeki bireysel varyasyonları izlemek için mükemmel bir araç sağlar, ancak iki sınırlamaları vardır. İlk olarak, floresan görüntüleme bağlamında, çipi kalıplamak için kullanılan PDMS malzemesi, her ikisi de GFP emisyon dalga boyunun yakınında floresan olan mikro kabarcıklar oluşturma ve küçük partikül maddeleri yakalama eğilimindedir. Bu, plakalar çeşitli floresan kanalları altında görselleştirildiğinde görsel eserler üretir (Ek Şekil 2). İkinci bir sınırlama, bakır sülfatın, solucanlar kendileri de caydırıcı olan müdahalelere, özellikle diyet kısıtlamalarına, patojenik bakterilere veya strese neden olan ajanlara maruz kaldıklarında kaçmayı önlemek için yetersiz bir caydırıcı olmasıdır. Diğer tek solucan kurulumlarının hendeği, popülasyonları diyet kısıtlaması veya Petri plakalarındaki diğer engelleyici koşullar altında tutmak için yaygın olarak kullanılan daha güçlü bir önleyici ajan olan palmitik asidi barındırmak için çok dar ve hidrofobiktir.

Burada sunulan mikrotepsi tek solucan kültürü tekniği her iki sınırlamayı da ele almaktadır. Mikro tepsilerin daha büyük hendek boyutu ve hidrofilik malzemesi, ısı uygulaması ve Tween 20'nin dahil edilmesiyle birlikte, palmitik asidin, lmNGM pedlerinin kendilerini kirletmeden her bir kuyucuğun etrafına gelişmiş bir önleyici bariyer olarak uygulanmasına izin verir. Mikro tepsilerin polistiren yapısı, PDMS'nin otofloresan mikrokabarcıkları ve partikül kapanımları sorununu önleyerek sadece düşük seviyeli, tutarlı bir şekilde dağıtılmış otofloresan üretir (Ek Şekil 2). Hem arka plan gürültüsü hem de yapılar, kırınımı en aza indirmek için tepsinin altında ve çevresinde siyah bir yüzey kullanılarak daha da azaltılır. Hem içi boş bir adaptör (parlak alan görüntülemeye izin veren) hem de düz siyah adaptör (hem karanlık alan hem de floresan görüntülemeyi geliştiren bir karanlık alan sağlayan; Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'ye bakın) için 3B yazdırma dosyaları ekliyoruz. LmNGM'nin kendisi bir miktar otofloresan üretirken, görüntü kalitesi üzerindeki etki küçük kuyu hacmi ile en aza indirilir. Bu faktörler, mikro tepsileri, bireysel hayvanların kültür ortamlarından çıkarmadan in vivo olarak tekrarlanan floresan görüntülemesi için en uygun hale getirir. Mikrotepsi tek kültürlü sistemin diğer tek solucanlı görüntüleme teknolojilerine göre en büyük dezavantajı örneklem büyüklüğüdür; Her bir mikro tepsi, her WorMotel14,15'in 240 hayvan kapasitesinin aksine, 96 adede kadar ayrı ayrı kültürlenmiş hayvanı barındırabilir. Her ikisi de yetenekli tek solucan kültürü sistemleri sunar ve deneysel uygulama hangisinin en uygun olduğunu belirler.

Mikrotepsi kültür sisteminde çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, mikrotepsi tabanlı kültür sisteminin kurulumu, Petri plakaları kullanan standart kültür yöntemlerinden hem daha zor hem de daha fazla zaman alıcıdır. İkincisi, C. elegans , floresan mikroskobunda birkaç yaygın uyarma dalga boyu tarafından uyarılır. Görüntüleme işlemi sırasında hayvanlar hareketsiz hale getirilmediğinden, uzun maruz kalma süreleri gerektiren floresan biyobelirteçler bulanıklaşabilir. Her zaman noktasında birden fazla görüntü yakalamanın, floresan sinyalinin tüm hayvan niceliğini doğru bir şekilde ölçmesine izin vermek için genellikle yeterli olduğunu görüyoruz. Bununla birlikte, bu sorun nedeniyle, mikrotepsi kültür sistemi, konfokal mikroskopi gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile uyumlu değildir ve düşük sinyalli biyobelirteçleri görüntülemek için en uygun değildir. Bu sınırlamaların ışığında bile, bu yeni yöntem, zamana bağlı dinamikler veya aktivite ve hayatta kalma bağlamında yüksek bireyden bireye değişkenlik gösteren karmaşık fizyolojik süreçleri anlama potansiyeli sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma, G.L.S.'ye NIH R35GM133588, L.E.'ye bir NIHT32GM008659 eğitim hibesi, G.L.S.'ye Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Tıp Akademisi Katalizör Ödülü ve Arizona Eyaleti Teknoloji ve Araştırma Girişimi Fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed terasaki inserts Custom printing company Robot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		 FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood Fisher Scientific 36-100-4376
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
CaCl2 Acros organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin Goldbio C-103-25
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2 Fisher Scientific G-560
FUdR  Research Products International F10705-1.0
Hydrating water crystals  M2 Polymer Technologies Type S Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera Leica Microsystems 11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope Leica Microsystems 10450826
Low-melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4  Fisher Chemical M-8900
NaCl Fisher bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Scientific 264728
Nystatin Sigma N1538
Palmitic acid Acros organics 129700010
Paper towels Coastwide Professional 365374
Parafilm M Parafilm 16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075 UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda) One Lambda 151431
Thermolyne Dri-bath Thermolyne DB28125
Tween  Thermo Scientific J20605-AP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
  3. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  4. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  5. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  6. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  7. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
  8. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  9. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  11. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  12. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  13. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  14. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  15. Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  16. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  17. Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
  18. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  19. Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  21. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  22. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142 (2013).
  23. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
  24. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437 (2014).
  25. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
  26. Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).
  27. Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
  28. Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).

Tags

Geri Çekme Sayı 190
Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel <em>caenorhabditis elegans'ın</em> uzun süreli kültürü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espejo, L., Hull, B., Chang, L. M.,… More

Espejo, L., Hull, B., Chang, L. M., DeNicola, D., Freitas, S., Silbar, V., Haskins, A., Turner, E. A., Sutphin, G. L. Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions. J. Vis. Exp. (190), e64682, doi:10.3791/64682 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter