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Biology

Langzeitkultur einzelner Caenorhabditis elegans auf festen Medien für longitudinales Fluoreszenzmonitoring und aversive Interventionen

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64682
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um isolierte einzelne Nematoden auf festen Medien zu kultivieren, um eine lebenslange Verfolgung physiologischer Parameter und eine Fluoreszenzquantifizierung zu ermöglichen. Dieses Kultursystem umfasst eine Palmitinsäurebarriere um einzelne Wurmbrunnen, um die Flucht der Tiere zu verhindern, was den Einsatz aversiver Interventionen, einschließlich pathogener Bakterien und chemischer Stressoren, ermöglicht.

Abstract

Caenorhabditis elegans wird häufig zur Erforschung der Biologie des Alterns verwendet. Die Standardpraxis in Studien zum Altern von C. elegans besteht darin, Gruppen von Würmern auf soliden Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) zu kultivieren, was die effiziente Erfassung von Daten auf Populationsebene für das Überleben und andere physiologische Phänotypen sowie die regelmäßige Probenahme von Subpopulationen zur Quantifizierung fluoreszierender Biomarker ermöglicht. Einschränkungen dieses Ansatzes sind die Unfähigkeit, (1) einzelne Würmer über die Zeit zu verfolgen, um Altersverläufe für Phänotypen von Interesse zu entwickeln, und (2) fluoreszierende Biomarker direkt im Kontext der Kulturumgebung zu überwachen. Alternative Kulturansätze verwenden Flüssigkultur oder Mikrofluidik, um einzelne Tiere im Laufe der Zeit zu überwachen, in einigen Fällen einschließlich Fluoreszenzquantifizierung, mit dem Kompromiss, dass sich die Kulturumgebung kontextuell von festem NGM unterscheidet. Das WorMotel ist ein zuvor beschriebenes mikrofabriziertes Multi-Well-Gerät zur Kultivierung isolierter Würmer auf festem NGM. Jeder Wurm wird in einem Brunnen mit festem NGM gehalten, der von einem mit Kupfersulfat gefüllten Graben umgeben ist, einem Kontaktschutzmittel für C. elegans, das eine longitudinale Überwachung der einzelnen Tiere ermöglicht. Wir stellen fest, dass Kupfersulfat nicht ausreicht, um Würmer an der Flucht zu hindern, wenn sie aversiven Eingriffen ausgesetzt sind, die in der Alternsforschung üblich sind, einschließlich Ernährungseinschränkungen, pathogenen Bakterien und chemischen Wirkstoffen, die zellulären Stress induzieren. Die Multi-Well-Geräte sind ebenfalls aus Polydimethylsiloxan geformt, das bei der Fluoreszenzbildgebung hohe Hintergrundartefakte erzeugt. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz für die Kultivierung isolierter Fadenwürmer auf festem NGM unter Verwendung kommerziell erhältlicher Polystyrol-Mikroschalen, die ursprünglich für die Typisierung des humanen Leukozytenantigens (HLA) entwickelt wurden und die Messung des Überlebens, der physiologischen Phänotypen und der Fluoreszenz über die gesamte Lebensspanne ermöglichen. Eine Palmitinsäurebarriere verhindert die Flucht von Würmern, auch bei aversiven Bedingungen. Jede Platte kann bis zu 96 Tiere kultivieren und passt sich leicht an eine Vielzahl von Bedingungen an, einschließlich diätetischer Restriktionen, RNAi und chemischer Zusätze, und ist mit automatisierten Systemen zur Erfassung von Lebensdauer- und Aktivitätsdaten kompatibel.

Introduction

C. elegans sind ein leistungsfähiger Modellorganismus für die Forschung in Genetik, Zellbiologie und Molekularbiologie, da sie leicht im Labor kultiviert werden können, eine kurze Generationszeit und Lebensdauer haben, ein hohes Maß an Proteinhomologie mit Säugetieren teilen und eine transparente Körperstruktur aufweisen, die die In-vivo-Visualisierung von fluoreszierenden Proteinen und Farbstoffen ermöglicht1. Als Ergebnis der langjährigen Verwendung von C. elegans als wichtiges Modellsystem in einer Reihe von Bereichen, einschließlich der Entwicklungsbiologie und des Alterns, sind ihr Wachstum und ihre Entwicklung gut verstanden, ihr Genom wurde vollständig sequenziert und eine Vielzahl leistungsfähiger genetischer Werkzeuge wurde entwickelt, darunter genomweite RNAi-Fütterungsbibliotheken und Tausende von mutierten und transgenen Stämmen. Historisch gesehen werden C. elegans als Populationen auf soliden Agar-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) kultiviert, und Phänotypen werden manuell entweder durch direkte Beobachtung oder durch Bildgebung und nachgelagerte Analyse bewertet. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um eine Vielzahl von molekularen Phänotypen mit Farbstoffen oder transgen exprimierten Fluoreszenzmarkierungen in einzelnen C. elegans zu erfassen.Bei der Fluoreszenzbildgebung wird in der Regel ein Tier auf Objektträgern mit dünnen Agarosepolstern fixiert oder gelähmt, was invasiv und oft tödlich ist. Es beinhaltet auch den Einsatz von Chemikalien wie Levamisol oder Natriumazid, die möglicherweise in den interessierenden molekularen Prozess eingreifen können 2,3. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die Erhebung von Querschnittsdaten auf Populationsebene über ein breites Spektrum von Phänotypen, erlauben jedoch nicht die Verfolgung einzelner Tiere im Laufe der Zeit.

In den letzten Jahren haben sich mehrere Ansätze zur Kultivierung isolierter C. elegans herausgebildet, die es Forschern ermöglichen, dynamische Veränderungen der physiologischen und molekularen Phänotypen von Tieren im Laufe der Zeit mithilfe neuer Bildgebungstechnologien zu erfassen. Eine Kategorie des Ansatzes der C. elegans-Kultur sind mikrofluidische Geräte, darunter WormFarm4, der Nemalife-Chip5 und der "Verhaltens"-Chip von Chronis et al.6, neben verschiedenen anderen 7,8,9. Verwandt damit sind flüssige Kulturmethoden, die Multi-Well-Platten verwenden, um einzelne Würmer oder kleine Populationen über die Zeit zu charakterisieren10,11. Mikrofluidik und Mikrotiterplattensysteme liefern hervorragende quantitative Messungen der phänotypischen Reaktionen in C. elegans bis hinunter zu einem einzelnen Tier, aber die Kulturumgebung stellt eine wesentliche Einschränkung dar. Die überwiegende Mehrheit der bisherigen Forschungen zu C. elegans, insbesondere auf dem Gebiet des Alterns, wurde auf festen Agar-basierten Medien durchgeführt. Die Flüssigkultur führt dazu, dass C. elegans kontinuierlich schwimmt und stellt einen bestimmten Umweltkontext dar, der die zugrunde liegende Biologie verändern kann. Zum Beispiel haben Tiere, die in flüssigen Medien kultiviert wurden, einen drastisch veränderten Fettgehalt und eine drastische Genexpression – insbesondere für Gene, die an der Stressantwort beteiligt sind – im Vergleich zu Tieren, die auf agarbasiertem festem NGM12,13 kultiviert wurden. Eine alternative Kategorie von Einzeltier-Bildgebungsverfahren sind Polydimethylsiloxan (PDMS)-Geräte, die einzelne Tiere auf festen Medien isolieren, um die Standardumgebung von Würmern, die auf festem NGM kultiviert wurden, in Gruppenkultur auf Petriplatten besser nachzuahmen. Das WorMotel ist ein 240-Well-PDMS-Gerät, das für die Kultivierung einzelner Tiere auf festen Medien entwickelt wurde. Jede Vertiefung wird mit einem modifizierten NGM gefüllt, bei dem anstelle von Agar niedrigschmelzende Agarose verwendet wird, und mit bakterieller Nahrung besiedelt, wodurch eine feste Medienumgebung entsteht, die dem gängigsten Kultursystem mit Petriplatten ähnelt. Die Wände des Brunnens sind rund, so dass jedes Tier unabhängig von seinem Standort im Brunnen abgebildet werden kann (wodurch die visuelle Verschleierung durch ein Tier in der Nähe einer Wand in einer Multiwell-Platte vermieden wird). Kupfersulfat in einem schmalen Graben, der jeden Brunnen umgibt, wird als Abschreckungsmittel verwendet, um Tiere in ihren Brunnen zu halten14,15. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass das Kupfersulfat unwirksam ist, um Würmer an der Flucht zu hindern, wenn aversive Umweltbedingungen vorliegen, einschließlich Ernährungseinschränkungen, pathogener Bakterien oder Chemikalien, die zellulären Stress induzieren (z. B. Paraquat).

Ein zweites System, das feste Medien verwendet, ist der Worm Corral, bei dem ein Hydrogel verwendet wird, um für jeden Wurm auf einem Objektträger eine kleine versiegelte Umgebung zu schaffen, die eine Langzeitüberwachung einzelner isolierter Tiere ermöglicht16. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass Tiere als Eier in der Umwelt versiegelt werden müssen, was die Verwendung steriler Tiere erfordert, um die Fortpflanzung zu verhindern, und die medikamentöse Behandlung auf eine einzige Anwendung beschränkt. Mehrdosis-Arzneimittelstudien können im WorMotel durchgeführt werden, indem entweder mehrere Expositionsrunden durchgeführt werden, bevor die Würmer auf das Gerät übertragen werden, oder indem während des Experiments zusätzliche Medikamente topisch in die Vertiefungen gegeben werden. Im letzteren Fall ist die tatsächliche Expositionsdosis nach Zugabe eines zusätzlichen Medikaments zu einer bestehenden Bohrung jedoch schwer genau zu quantifizieren und hängt davon ab, wie schnell das Medikament abgebaut wird. Sowohl das WorMotel als auch der Worm Corral eignen sich hervorragend für Hellfeld- oder Dunkelfeldaufnahmen, um Informationen über Aktivität und Tierphysiologie (z. B. Wachstum und Entwicklung) zu erfassen. Während diese Systeme zur Überwachung der Fluoreszenz verwendet werden können, ist das PDMS, das zur Herstellung der anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien verwendet wird, unserer Erfahrung nach anfällig für die Bildung von Mikrobläschen, das Einfangen von Partikeln und andere kleine Anomalien, die unregelmäßige Fluoreszenzartefakte erzeugen, die eine konsistente Fluoreszenzvisualisierung und -quantifizierung beeinträchtigen, insbesondere im Emissionsbereich für GFP, den am häufigsten in der C. elegans-Forschung verwendeten Fluorophor. Bisher stützt sich die Live-Fluoreszenzbildgebung von C. elegans-Individuen im Längsschnitt hauptsächlich auf mikrofluidische Geräte17.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine neuartige Methode zur Kultivierung einzelner C. elegans auf festen Medien, die sowohl mit aversiven Interventionen als auch mit direkter Fluoreszenzbildgebung kompatibel ist. Dieser Ansatz ähnelt vom Konzept her anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien, mit der Ausnahme, dass der kundenspezifisch geformte PDMS-Chip durch kommerziell erhältliche Polystyrol-Mikroschalen ersetzt wird, die ursprünglich für Mikrozytotoxizitätsassays entwickelt wurden (auch allgemein als Terasaki-Schalen bezeichnet)18. Diese Mikroschalen verfügen über Vertiefungen, die mit festem Medium gefüllt und mit bakteriellem Futter besiedelt werden können, wodurch die Umgebung, die Tiere mit der Standardmethode der festen NGM-Kultur erleben, genau nachgeahmt wird. Jede Vertiefung ist von einer aversiven Barriere aus Palmitinsäure anstelle von Kupfersulfat umgeben. Palmitinsäure wird häufig verwendet, um Würmer daran zu hindern, aus festen Medien zu fliehen, wobei Standardgruppenkulturen auf Petriplatten in Experimenten verwendet werden, in denen Würmer mit einer aversiven Umgebung wie Ernährungseinschränkungen oder der Exposition gegenüber einem chemischen Stressor konfrontiert werden. Die Mikroschalen erzeugen auch einen minimalen und konsistenten fluoreszierenden Hintergrund, was eine fluoreszierende Bildgebung von Tieren direkt in ihrer Kulturumgebung ermöglicht. Dieses neue Kultursystem auf Basis von festem Agar ermöglicht nicht nur die lebenslange Verfolgung einzelner Tiere und die Überwachung von Wachstum, Entwicklung, Aktivität und Lebensdauer, sondern ist auch mit der direkten Fluoreszenzmikroskopie kompatibel. Da die Würmer ohne Lähmung oder Fixierung abgebildet werden können, können In-vivo-Fluoreszenz-Biomarker in einzelnen Tieren, die auf ihren Nährmedien verbleiben, longitudinal quantifiziert werden, was die Beobachtung dynamischer Veränderungen über die Lebenszeit jedes Tieres ermöglicht. Dieses Kultursystem ist auch mit automatisierten Systemen der aktuellen Generation kompatibel, um die Lebensdauer und andere Gesundheitsmetriken zu verfolgen14,19. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung einzelner C. elegans in diesem Microtray-basierten System zur Verfügung, diskutieren mögliche Fallstricke und Fehlerbehebungen und diskutieren die Vorteile und Einschränkungen im Vergleich zu anderen Systemen und insbesondere ein aktualisiertes und optimiertes WorMotel-Protokoll15.

Jede Einzelschneckenkulturumgebung besteht aus einem Mikrotablett, das mit einem kundenspezifischen 3D-gedruckten Adapter in einem Standard-Single-Well-Tray montiert ist (Abbildung 1A). Die Vertiefungen sind mit niedrigschmelzenden Agarose-Nematoden-Wachstumsmedien (lmNGM) gefüllt, die mit konzentrierten Bakterien als Nahrungsquelle besiedelt und von einer Palmitinsäurebeschichtung umgeben sind, um die Flucht der Würmer zu verhindern (Abbildung 1B). Der Raum zwischen der Mikroschale und den Wänden der Single-Well-Platte ist mit gesättigten Wasserkristallen gefüllt, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten (Abbildung 1B). Der Tablettdeckel wird mit einer Reinigungsmittelbeschichtung versehen, um Kondensation zu verhindern. In jede Vertiefung wird eine einzelne Schnecke gegeben, und die Einvertiefungsschale ist mit Parafilm versiegelt, um die Feuchtigkeit zu erhalten und den Sauerstoffaustausch zu ermöglichen. Bis zu sechs Microtrays können von einem einzigen erfahrenen Forscher sinnvoll parallel präpariert werden.

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Protocol

1. Rezepte

Anmerkungen: Bereiten Sie Stammlösungen vor, bevor Sie mit der Vorbereitung der Mikroschalenplatte beginnen.

  1. Lagerlösungen für niedrigschmelzende Agarosenematoden-Nährmedien (lmNGM)
    1. Bereiten Sie 1 M K 2 HPO4 vor, indem Sie 174,18 g K2HPO4in 1 l sterilem deionisiertem Wasser in einer 1-Liter-Flasche auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psi, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
    2. Bereiten Sie 1 M KPi (pH 6,0) vor, indem Sie 136,09 g KH2HPO4 in 1 l sterilem deionisiertem Wasser in einer 1-Liter-Flasche auflösen. Die Lösung wird mit 1 M K2HPO4 titriert, um einen pH-Wert von 6,0 zu erreichen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei RT.
    3. Bereiten Sie 1 M CaCl 2 vor, indem Sie 73,5 g CaCl2 in 500 ml sterilem deionisiertem Wasser in einer 500-ml-Flasche auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei RT
    4. Bereiten Sie 1 M MgSO 4 zu, indem Sie 123,25 g MgSO4 in 500 ml sterilem deionisiertem Wasser in einer 500-ml-Flasche auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei RT.
    5. Bereiten Sie 3 M NaCl für lmNGM vor: In einer sauberen 100-ml-Flasche 100 ml Reinstwasser und 18,20 g NaCl vermischen. Autoklavieren bei 121 °C, 15 psig, für 30 min.
    6. Bereiten Sie 5 mg/ml Cholesterin zu, indem Sie 2,5 g Cholesterin, 275 ml 100%iges Ethanol und 25 ml steriles deionisiertes Wasser in einer 500-ml-Braunflasche kombinieren. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei RT.
    7. Bereiten Sie 50 mM Fluordesoxyuridin (FUdR) vor, indem Sie 0,1231 g FUdR in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um die Lösung zu sterilisieren. Aliquotieren Sie je 1 mL der Lösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -20 °C.
    8. Bereiten Sie 50 mg/ml Carbenicillin zu, indem Sie 500 mg Carbenicillin in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um die Lösung zu sterilisieren. Aliquotieren Sie je 1 mL der Lösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -20 °C.
    9. Bereiten Sie 1 mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) vor, indem Sie 2,38 g IPTG in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um die Lösung zu sterilisieren. Aliquotieren Sie je 1 mL der Lösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -20 °C.
    10. Bereiten Sie 100 mg/ml Ampicillin zu, indem Sie 1 g Ampicillin in 10 ml sterilem deionisiertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Filter, um die Lösung zu sterilisieren. Aliquotieren Sie je 1 ml der 100 mg/ml Ampicillinlösung in 10 Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie die Röhrchen bei -20 °C.
  2. Vorbereitung von Nematoden-Nährmedien (NGM) für die allgemeine Pflege von C. elegans
    1. Um 50 Platten herzustellen, lösen Sie 10 g Bacto-Agar, 1,5 g NaCl und 1,25 g Bacto-Pepton in 486 ml Reinstwasser in einem 1-Liter-Kolben auf. Sterilisieren Sie das Medium, indem Sie es in einem Flüssigkeitszyklus bei 121 °C, 15 psig, für mindestens 30 Minuten autoklavieren.
    2. Nach dem Autoklavieren das Medium auf 55 °C abkühlen lassen. Dann werden der Lösung 12,5 ml 1 M KPi, 500 μl 1 M MgSO4, 500 μl 1 M CaCl2 und 500 μl 5 mg/ml Cholesterin zugegeben.
    3. Steril werden 10 ml des in Schritt 1.2.2 hergestellten Mediums in jede 60-mm-Platte (insgesamt 50) gegossen. Lassen Sie die Platten mindestens 30 Minuten lang mit Medium erstarren. Pipettieren Sie 300 μl der über Nacht gewachsenen Bakterienkultur auf die Mitte der Platte und lassen Sie die Platte auf der Bank. Lassen Sie die Kultur 1-2 Tage trocknen und dicker werden. Lagern Sie diese NGM-Platten mit Bakterien bei 4 °C.
  3. Vorbereiten der lmNGM-Vormischung
    1. In einem 250-ml-Erlenmeyerkolben 2 g niedrigschmelzende Agarose, 0,25 g Pepton, 1 ml 3 M NaCl und 99 ml Reinstwasser vermischen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten.
    2. 10 ml lmNGM in Reagenzgläser aliquotieren und mit Parafilm abdecken, um Flüssigkeitsverlust zu vermeiden. Verschließen Sie die Röhrchen und lassen Sie sie abkühlen und erstarren.
  4. Bereiten Sie 85 mM NaCl für bakterielle Nahrung vor: In einer 100-ml-Flasche 515,61 mg NaCl vermischen und bis zu 100 ml mit Reinstwasser auffüllen. Autoklavieren bei 121 °C, 15 psig, für 30 min.
  5. Bereiten Sie wasserabsorbierende Polyacrylamidkristalle vor, indem Sie 1 g superabsorbierendes Polymer vom Typ S in 150 ml Reinstwasser in einer autoklavierbaren Quetschflasche auflösen. Schneiden Sie die Spitze ab, um eine ausreichende Dosiergröße zu gewährleisten. Bei 121 °C, 15 psig, 30 Minuten autoklavieren, mit Alufolie verschließen und schütteln, um die Kristalle zu vermischen.
  6. Bereiten Sie eine Reinigungslösung vor, indem Sie 3 ml 100 % Tween-20 mit 7 ml Reinstwasser in einer konischen Durchstechflasche mit 15 ml kombinieren.
  7. Bereiten Sie 5 mg/ml Cholesterin zu, indem Sie 2,5 g Cholesterin, 275 ml 100% EtOH und 25 ml Reinstwasser in einer 500-ml-Flasche kombinieren.
  8. Palmitinsäure-Arbeitslösung vorbereiten
    1. Mahlen Sie 500 mg feste Palmitinsäure in einem Mörser und Stößel und kombinieren Sie sie mit 15 ml Tween-20 in einer konischen 50-ml-Durchstechflasche. Mischen Sie durch Wirbeln und lösen Sie so viele Kristalle wie möglich auf.
    2. Fügen Sie 17,5 ml 100%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Lösung, um so viel Palmitinsäure wie möglich aufzulösen.
    3. Fügen Sie 17,5 ml Reinstwasser hinzu und wirbeln Sie rigoros. Erhitzen Sie die Lösung vorsichtig in einem Perlenbad bei 80 °C, bis sich die Palmitinsäure vollständig aufgelöst hat. Beim Abkühlen kann etwas Palmitinsäure ausfallen.
  9. Bereiten Sie Lysogenbrühe (LB) zu, indem Sie 20 g LB-Pulver in 1 l deionisiertem Wasser in einem 1-Liter-Becherglas oder größer mischen. 500 ml der Brühe in zwei 500-ml-Bechergläser aliquotieren. Die Brühe bei 121 °C, 15 psig, 30 Minuten lang autoklavieren. Bewahren Sie die vorbereitete Brühe bei RT auf.
  10. Zubereitung von Lysogenbrühe (LB) Agarplatten
    1. Mischen Sie 10 g LB-Pulver und 7,5 g Bacto-Agar in 500 μl deionisiertem Wasser in einem 1-Liter-Kolben. Autoklavieren Sie die Lösung in einem Flüssigkeitskreislauf bei 121 °C, 15 psig, für 30 Minuten.
    2. Falls gewünscht, fügen Sie optionale Antibiotika (500 μl oder 100 μg/ml Ampicillin) hinzu, nachdem das autoklavierte Medium auf 55 °C abgekühlt ist. Stellen Sie mit einer sterilen Technik LB-Agarplatten her, indem Sie 20 ml Medium in jede 100-mm-Platte gießen (insgesamt 25). Lagern Sie die Platten bei 4 °C.

2. Vorbereitung einer Population alterssynchronisierter Würmer

  1. Bereiten Sie eine Population alterssynchronisierter Würmer vor, die bereit sind, im Larvenstadium 4 (L4) in die Mikroschale gegeben zu werden. Alternativ können Würmer in jedem Lebensstadium hinzugefügt werden (FUdR sollte aus dem Mikroschalenmedium ausgeschlossen werden, wenn Würmer in einem Entwicklungsstadium vor L4 hinzugefügt werden, um einen Entwicklungsstopp zu verhindern).
    HINWEIS: Dieser Schritt sollte 2 Tage vor der Zugabe der Würmer in die Mikroschale abgeschlossen sein, wenn das angestrebte Lebensstadium zu Beginn des Experiments L4 ist. Der Synchronisationszeitpunkt kann so eingestellt werden, dass die Schnecken das gewünschte Lebensstadium erreichen können.
  2. Die Temperatur kann sich auf die Lebensdauer auswirken. Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie Standard-NGM-Platten (siehe Abschnitt 1), um C. elegans bei 20 °C zu halten, und übertragen Sie die Würmer auf frische Platten, wenn ihnen die bakterielle Nahrung ausgeht.
  3. Verwenden Sie aus den Vorratsplatten mit vielen jungen erwachsenen Würmern einen Standardansatz, um eine alterssynchronisierte Population zu generieren, wobei am häufigsten20 gebleicht oder21 Eier gelegt werden.
  4. Isolieren Sie die Eier und geben Sie sie auf eine mit Bakterien befleckte NGM-Platte. Bei Verwendung von Wildtyp-C. elegans schlüpfen die Eier und bilden Würmer, die in 2 Tagen das L4-Larvenstadium erreichen.

3. Bakterienkultur vorbereiten

  1. Impfen Sie am Tag vor Beginn des Experiments die gewünschte bakterielle Nahrungsquelle. Bereiten Sie ~5 ml Bakterienkultur pro Platte vor.
    Anmerkungen: Der Bakterienstreifen kann bis zu 1 Monat im Voraus vorbereitet und bei 4 °C für die Nahrungsquelle von E. coli gelagert werden.
    1. Streifen Sie Bakterien für einzelne Kolonien aus einem gefrorenen Glycerinstock auf die LB-Agarplatte.
    2. Wachsen Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C.
    3. Beimpfen Sie flüssige LB-Bouillon mit einer einzigen Kolonie pro Inokulation.
    4. Bei ~250 U/min bei 37 °C 12-16 h schütteln.

4. Auftragen der Palmitinsäurebeschichtung auf die Mikroschale

HINWEIS: Palmitinsäure dient als aversive Barriere, um die Flucht von Tieren aus den einzelnen Brunnen zu verhindern. Die Beschichtung wird auf die gesamte Unterseite des Mikrotrays aufgebracht, mit Ausnahme der Innenflächen der Wells. Nystatin wird der Palmitinsäure zugesetzt, um die Pilzkontamination zu mildern. Dieser Schritt kann auf Wunsch 1 Tag vor Beginn des Experiments abgeschlossen werden.

  1. Stellen Sie das Perlenbad auf 80 °C ein, um Zeit zum Vorheizen zu haben.
  2. Aliquotieren Sie unmittelbar vor der Anwendung 1 ml der Palmitinsäure-Arbeitslösung pro Mikroschale in einen separaten sterilen Behälter (in der Regel eine konische Durchstechflasche mit 15 ml) und fügen Sie vor dem Erhitzen 4 μl 10.000 Einheiten/ml Nystatin pro 1 ml Palmitinsäurelösung hinzu.
  3. Besprühen Sie die Innen- und Außenseite der Mikroschale mit Ethanol (70 % oder mehr), um sie zu sättigen, und schütteln Sie das überschüssige Ethanol ab.
    Anmerkungen: Restethanol sollte während der Behandlung in UV-Vernetzung verdampfen (Schritt 4.4).
  4. Verwenden Sie einen UV-Vernetzer, um die Mikroschale zu sterilisieren (die folgenden Anweisungen gelten für den in dieser Studie verwendeten UV-Vernetzer):
    1. Legen Sie die Mikroschale und den Deckel separat in den UV-Vernetzer (d. h. legen Sie die Deckel nicht auf die Platten, da die UV-Strahlung nicht in den Kunststoff eindringt).
    2. Schließen Sie die Tür und schalten Sie den UV-Vernetzer ein.
    3. Drücken Sie Uhrzeit, geben Sie 20 Minuten ein, und drücken Sie dann Start.
    4. Drehen Sie nach 20 Minuten den Teller und den Deckel um und wiederholen Sie die Schritte 4.2.2-4.2.3.
    5. Legen Sie die Deckel mit Handschuhen auf die Mikroschale, um eine Kontamination nach der Sterilisation zu vermeiden.
  5. Mischen Sie die Palmitinsäure-Arbeitslösung gründlich durch Wirbeln und Invertieren.
  6. Stellen Sie die konische 15-ml-Durchstechflasche mit der Palmitinsäure-Arbeitslösung in das Perlenbad und lassen Sie alle sichtbaren Kristalle vor Gebrauch vollständig auflösen.
  7. Stellen Sie die Mikroschale mit aufgesetzten Deckeln für ~2 Minuten auf die Kante, die das Perlenbad umgibt, um sich aufzuwärmen.
  8. Entfernen Sie den Deckel der Mikroschale. Geben Sie langsam 200 μl Palmitinsäure-Arbeitslösung über die Rückwand (lange Seite) der Mikroschale. Setzen Sie die Deckel wieder auf und lassen Sie die Mikroschale 2-3 Minuten auf dem Perlenbad ruhen, damit sich die Palmitinsäurelösung auf dem Boden der Mikroschale absetzen kann.
    Anmerkungen: Während der gesamte Boden der Mikroschale erst in Schritt 4.10 vollständig beschichtet ist, sollte sich die Lösung gleichmäßig über mehr als die Hälfte der Bodenfläche verteilen. Wenn sich die Palmitinsäurelösung nicht gleichmäßig verteilt, schalten Sie einen Wirbel oder einen Vibrationsmotor in der Nähe der Mikroschale ein. Dadurch wird eine kleine Menge an Vibration erzeugt, die dazu beitragen kann, dass sich die Palmitinsäurelösung leichter ausbreiten kann. Lassen Sie die Deckel der Mikroschalen an Ort und Stelle, um eine Kontamination zu verringern.
  9. Wiederholen Sie Schritt 4.8.
    Anmerkungen: Etwa die Hälfte oder mehr des Bodens der Mikroschale sollte sichtbar mit der flüssigen Palmitinsäure bedeckt sein.
  10. Drehen Sie die Mikroschale um 180° und wiederholen Sie die Schritte 4.8 und 4.9 auf der anderen Seite der Schale.
    Anmerkungen: Der Boden der Terasaki-Schale wird erst dann mit einer dünnen Schicht Palmitinsäurelösung bedeckt, wenn das gesamte kombinierte Volumen auf beiden Seiten hinzugefügt wurde (Schritte 4.9 und 4.10). Je nach Zubereitung der Mischung, Temperatur und anderen Faktoren kann mehr oder weniger Palmitinsäuremischung erforderlich sein. Im Allgemeinen reichen zwischen 400 und 800 μl der Palmitinsäuremischung aus, um den gesamten Boden der Mikroschale zu beschichten. Sobald der Boden der Mikroschale sichtbar bedeckt ist, sollte keine zusätzliche Palmitinsäure hinzugefügt werden, da diese die Vertiefungen verunreinigen kann.
  11. Trocknen Sie das Tablett in einer sterilen Trockenbox oder Laminar-Flow-Haube mindestens 1 Stunde unbedeckt. Alternativ können Sie diesen Schritt am Tag vor dem Einlegen der Platten (Abschnitt 5) durchführen und die Mikroschale bei geschlossenem Deckel mindestens 16 Stunden lang bei RT trocknen.

5. Beladen des Mikrotrays mit niedrigschmelzenden Nematoden-Wachstumsmedien (lmNGM)

HINWEIS: Bei dieser Methode wird Standard-NGM gemischt mit niedrig schmelzender Agarose anstelle des üblichen Agars verwendet. Agar kann bei 45 °C zu gelieren beginnen. Bei der Arbeit mit den kleinen Volumina, die zum Befüllen der Microtray-Wells benötigt werden, verstopft das NGM auf Agarbasis häufig die Pipettenspitze und/oder erzeugt aufgrund der schnellen Gelierung unebene Well-Oberflächen. NGM mit niedrigschmelzender Agarose beginnt bei ~28 °C zu gelieren, so dass das geschmolzene Medium leicht pipettiert werden kann und konstant flache Well-Oberflächen bildet. Bereiten Sie lmNGM am selben Tag zu, an dem die Würmer auf die Mikroschale gelegt werden sollen. Wenn Sie die Mikroschale mit lmNGM vorbereiten, Bakterien aussäen und die C. elegans innerhalb desselben Tages beladen, stellen Sie sicher, dass die Tiere das gewünschte Alter erreicht oder sich dem gewünschten Alter nähern, bevor Sie mit diesen Schritten beginnen.

  1. Stellen Sie ein Pipettenbecken zum Aufwärmen in ein 80 °C heißes Perlenbad.
  2. Schmelzen Sie eine 10-ml-lmNGM-Vormischung pro herzustellender Mikroschale (Schritt 1.1) in der Mikrowelle für ~30-45 s.
    1. lmNGM-Vormischungs-Reagenzgläser in ein 200-ml-Becherglas geben, damit sie nicht umkippen.
    2. Nach ~10-15 s oder wenn die lmNGM-Vormischung gerade anfängt zu sprudeln, pausieren Sie die Mikrowelle, gießen Sie die lmNGM-Vormischung in ein steriles 200-ml-Becherglas und setzen Sie die Mikrowelle fort.
    3. Halten Sie nach Bedarf an, um ein Überkochen zu verhindern, und schwenken Sie zum Mischen.
    4. Stoppen Sie die Mikrowelle, sobald sich das gesamte lmNGM ohne Brocken in Flüssigkeit verwandelt hat.
      HINWEIS: Ein einziges 10-ml-Aliquot reicht aus, um insgesamt 192 Vertiefungen (zwei Mikroschalen) zu füllen.
  3. Bereiten Sie lmNGM vor, indem Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge zu der warmen, niedrigschmelzenden Agarose hinzufügen (die Volumina beziehen sich auf 10 ml niedrigschmelzende Agarose): 250 μl 25 mM KPi (pH 6), 10 μl 1 M CaCl2, 10 μl 1 MMgSO4 und 10 μl 5 mg/ml Cholesterin
    1. Wenn der Forscher plant, erwachsene Tiere im Laufe der Zeit zu untersuchen und eine Vermehrung verhindern muss, fügen Sie zusätzlich 10 μl 50 mM FUdR hinzu.
    2. Wenn Sie ein RNAi-Fütterungsexperiment mit dem gängigen HT115 RNAi E. coli-Stamm und den zugehörigen RNAi-Plasmiden durchführen, fügen Sie zusätzlich 5 μl 50 mg/ml Carbenicillin (zur Auswahl des RNAi-Plasmids) und 12 μl 1 mM IPTG (zur Induktion der Expression der doppelsträngigen RNA aus dem RNAi-Plasmid) hinzu.
      Anmerkungen: Abhängig von den selektiven Antibiotika und anderen Chemikalien, die für die gewünschte Nahrungsquelle benötigt werden, können zusätzliche Zusatzstoffe hinzugefügt werden. In diesem Stadium können auch Medikamente oder chemische Stressoren zu lmNGM hinzugefügt werden. NGM und lmNGM enthalten die gleiche Endkonzentration an NaCl, unterscheiden sich jedoch in der Art und Weise, wie das NaCl dem Medium zugeführt wird. Bei NGM wird das gesamte NaCl während der Medienvorbereitung hinzugefügt (Schritt 1.2). Für lmNGM wird ein Teil des NaCl während der Medienvorbereitung (Schritt 5.3) und ein Teil mit dem bakteriellen Futter (Abschnitt 6) zugegeben. Der Grund für diese Änderung liegt in dem geringen Medienvolumen in jeder Mikroschalenmulde. Die Zugabe von 5 μl konzentrierter Bakterien, die in LB suspendiert sind, zu einer Vertiefung, die 20 μl Medium enthält, verändert die Nährstoffzusammensetzung des Mediums erheblich (durch Zugabe der Komponenten von LB in einem vergleichbaren Volumen). Um dies zu vermeiden, wird das Bakterium stattdessen in einer NaCl-Lösung resuspendiert, um die LB-Komponenten zu entfernen und gleichzeitig osmotischen Stress für die Bakterien zu verhindern. Das dem Medium zugesetzte NaCl wird entsprechend reduziert, um dem den Bakterien zugesetzten Salz Rechnung zu tragen.
  4. Gießen Sie lmNGM in das erwärmte Pipettenbecken.
  5. Wenn sich das Mikrotablett auf einem Tischgerät befindet, pipettieren Sie 20 μl lmNGM in jedes Mikrotablett. Decken Sie die Mikroschale beim Nachfüllen der Pipette ab, um eine Kontamination zu minimieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist mit einer elektronischen Repetierpipette einfacher.

6. Aussaat der Microtray-Vertiefungen mit bakteriellem Futter

HINWEIS: 5 μL 10x konzentriertes Futter aus einer über Nacht inokulierten Kultur reichen aus, um einen einzelnen C. elegans während seiner gesamten Lebensdauer zu ernähren.

  1. Übertragen Sie die Bakterien aus der Übernachtkultur in ein konisches 50-ml-Fläschchen.
  2. Bei ~3.500 x g für 20 min zentrifugieren.
  3. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Bakterienkultur in einer 10-fachen Konzentration (1/10 des Volumens der ursprünglichen Kultur) mit 85 mM NaCl-Lösung.
  4. Bevor Sie Bakterien in die Vertiefungen geben, sollten Sie die Mikroschale visuell inspizieren, um sicherzustellen, dass das feste lmNGM vollständig in jeder Vertiefung enthalten ist. Wenn lmNGM an der Seite einer Vertiefung hängt, kratzen Sie das überschüssige lmNGM mit einer Pipettenspitze ab. Dieses überschüssige Medium kann dazu führen, dass die Lebensmittel in Palmitinsäure laufen, wenn sie nicht gereinigt werden.
  5. Pipettieren Sie vorsichtig 5 μl 10x konzentrierte Bakterienkultur auf die Oberfläche des lmNGM in jeder Vertiefung. Vermeiden Sie es, die Bakterienkultur über die Seite des Brunnens in die Palmitinsäure laufen zu lassen, da dies Würmer dazu bringt, den Brunnen zu verlassen.
  6. Lassen Sie die Mikroschalen in einer sterilen Trockenbox oder einer Laminar-Flow-Haube ~35 Minuten trocknen. Überprüfen Sie alle ~5 Minuten und achten Sie darauf, nicht zu stark zu trocknen. Entfernen Sie, wenn einige Vertiefungen sichtbar leicht nass sind, da die Vertiefungen weiter trocknen, während die Nematoden hinzugefügt werden.

7. Einschließen jeder Mikroschale in eine Single-Well-Platte

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Mikroschale mit einem benutzerdefinierten 3D-gedruckten Einsatz in eine Standard-Single-Well-Platte montiert und von wasserabsorbierenden Kristallen umgeben. Anschließend wird die Single-Well-Platte mit Parafilm verschlossen und versiegelt. Dies ermöglicht den Sauerstoffaustausch bei gleichzeitiger Vermeidung von Kontamination und Aufrechterhaltung einer ausreichenden Luftfeuchtigkeit, um zu verhindern, dass das lmNGM im Laufe mehrwöchiger Experimente austrocknet (Experimente zur Lebensdauer von Würmern können 6-8 Wochen dauern, wenn lebensdauerverlängernde Mutationen oder Umweltbedingungen untersucht werden). Achten Sie bei der Zubereitung darauf, den Teller abzudecken, wenn nicht aktiv etwas hinzugefügt wird, um die Kontamination mit Bakterien oder Pilzen zu minimieren.

  1. Sterilisieren Sie eine Single-Well-Platte und einen 3D-gedruckten Adapter und Deckel, indem Sie sie jeweils in eine 10%ige Bleichlösung tauchen. Gründlich mit sterilem DI-Wasser abspülen. Mit einem Arbeitstuch trocken wischen.
  2. Besprühen Sie die Single-Well-Platte und den 3D-gedruckten Adapter sowie den Deckel mit einer Ethanollösung von 70 % oder mehr und wischen Sie sie mit einem Task-Tuch ab. Lassen Sie Ethanolreste an der Luft trocknen.
    HINWEIS: UV-Strahlung kann auch nach Bleichmittel und Ethanol mit den gleichen Parametern wie die Mikroschale verwendet werden, wie oben in Schritt 4.4 beschrieben.
  3. Legen Sie den sterilen 3D-gedruckten Einsatz in eine sterile Single-Well-Platte.
  4. Sterilisieren Sie die Außenseite der vorbereiteten Mikroschale, indem Sie sie mit 70 % Ethanol besprühen.
  5. Setzen Sie die Mikroschale in den 3D-gedruckten Adapter in der Single-Well-Platte ein.
  6. Entsorgen Sie den Deckel der Mikroschale.
  7. Verteilen Sie die Wasserkristalle großzügig auf den 3D-gedruckten Einsatz zwischen der Außenwand des Mikrotrays und der Innenwand der Single-Well-Platte.
  8. Fügen Sie sofort die Würmer hinzu (Abschnitt 8) oder verschließen Sie die Mikroschale, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Schließen Sie den Deckel der Schale und verwenden Sie ein einziges Stück Parafilm, um alle vier Seiten zu umwickeln und die Mikroschale zu versiegeln. Wiederholen Sie den Versiegelungsschritt mit Parafilm noch zwei weitere Male für insgesamt drei Schichten.
  9. Nachdem Sie die Mikroschale versiegelt haben, lassen Sie sie bis zu 4 Tage auf dem Labortisch bei RT, bevor Sie die Würmer hinzufügen (Abschnitt 8).

8. Hinzufügen von Würmern in die Mikroschale

HINWEIS: Ein Wurm kann manuell zu jeder Vertiefung hinzugefügt werden, indem Tiere aus den alterssynchronisierten Wurmpopulationen (Abschnitt 2) mit einem Platin-Pickel übertragen werden. Übertragen Sie Tiere nur im gewünschten Lebensstadium. Dauert der Transfervorgang länger als 1 h, kann das lmNGM in den Microtray-Wells austrocknen. Das Übertragen von Gruppen von jeweils 10 bis 20 Würmern kann diesen Schritt beschleunigen, aber es erfordert etwas Übung, um konsequent nur ein einziges Tier pro Vertiefung freizulassen.

  1. Fügen Sie einen Fadenwurm pro Vertiefung hinzu, sobald sie das gewünschte Lebensstadium erreicht haben.
  2. Setzen Sie den Deckel wieder über die Mikroschale, wenn Sie Würmer von der Quellplatte entnehmen, um die Kontamination zu minimieren.

9. Fertigstellung der Vorbereitung der Kulturumgebung für den langfristigen Einsatz

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden ausgeführt, um sicherzustellen, dass die Medien und Würmer in der Mikroschale während der Dauer des Experiments hydratisiert bleiben.

  1. Geben Sie ~40 μl der Waschmittellösung in den Deckel einer Single-Well-Platte und verwenden Sie ein Task-Wischtuch, um den Deckel gleichmäßig zu beschichten. Diese Beschichtung verhindert die Kondensation im Laufe der Zeit, sobald die Platte versiegelt ist. Verwenden Sie zusätzliche Arbeitstücher, um die Waschmittellösung zu verteilen, bis die Sicht durch den Deckel nicht mehr verzerrt ist (dies dauert normalerweise etwa zwei Arbeitstücher).
  2. Untersuchen Sie die Wasserkristalle, um sicherzustellen, dass sie beide auf gleicher Höhe mit dem oberen Rand der Mikroschale sind und nicht überlaufen. Geben Sie bei Bedarf Wasserkristalle auf den Teller oder entfernen Sie sie.
  3. Wickeln Sie die Schale wie folgt mit Parafilm (insgesamt drei Stück) ein, um sicherzustellen, dass die Parafilm-Versiegelung lange hält.
    1. Dehnen Sie das erste Stück Parafilm leicht, um zwei Seiten des Tabletts zu bedecken.
    2. Dehnen Sie das zweite Stück Parafilm leicht und decken Sie die restlichen Seiten des Tabletts ab.
    3. Dehnen Sie das letzte Stück Parafilm und wickeln Sie alle vier Seiten des Tabletts vollständig ein, wobei Sie das erste und zweite Stück Parafilm abdecken. Eine ordnungsgemäß versiegelte Mikroschale kann ~2 Monate lang hydratisiert bleiben.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Integrität des Parafilms während des gesamten Experiments alle 1-2 Wochen und ersetzen Sie ihn bei Bedarf.
    4. Wischen Sie die Oberseite des Fachs mit einem mit 70 % Ethanol angefeuchteten Arbeitstuch ab, um Fingerabdrücke zu entfernen.
  4. Beschriften Sie die Single-Well-Platte mit Klebeband. Das Microtray ist nun bereit für die Bildgebung und Langzeitlagerung, um Würmer im Laufe der Zeit zu überwachen. Halten Sie das Fach zwischen den Bildgebungssitzungen bei 20 °C. Die Mikroschale kann für die Medikamentendosierung oder andere Verfahren mehrmals geöffnet und wieder verschlossen werden, sollte jedoch minimiert werden, um Kontamination und Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden.

10. Abbildung einzelner Würmer in Microtray-Wells

HINWEIS: Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der Microtray-Kulturumgebung bereitzustellen. Einmal präpariert und mit Würmern besiedelt, können die Mikroschalen-Einzelwurmkulturumgebungen verwendet werden, um viele Phänotypen im Längsschnitt zu überwachen, wobei Techniken verwendet werden, die für die Standardkultur auf Petriplatten etabliert sind. Der folgende Abschnitt enthält grundlegende Anweisungen zum Messen einiger gängiger Phänotypen. Die Fluoreszenzbildgebung muss in einem aufrechten Mikroskop durchgeführt werden. Die Lichtbrechung durch das Terasaki-Tablett wird in einem dunklen Raum minimiert.

  1. Lebensdauer: Messen Sie die Lebensdauer, indem Sie vorsichtig auf die Seite oder Oberseite der Platte klopfen oder ein helles blaues Licht auf die Platte leuchten lassen und jedes Tier beobachten. Erziele ein Tier als "tot", wenn es sich nicht innerhalb weniger Sekunden bewegt. Wiederholen Sie diese Aufgabe alle 1-3 Tage, bis alle Würmer abgestorben sind.
    HINWEIS: Die Microtray-Kulturumgebung ist mit Systemen kompatibel, die die Bilderfassung und -analyse für die Lebensdauerschätzungautomatisieren 14,19.
  2. Standardmikroskopie: Führen Sie Hellfeld- (oder Dunkelfeld-) Bildgebung an einzelnen Wells oder am gesamten Tray mit einer hochauflösenden Kamera oder einem Scanner durch. Diese Bildgebungsdaten können für eine Vielzahl von Phänotypen verwendet werden, einschließlich Tiergröße 22,23,24, Entwicklung 25, Aktivität 14,19 und Lebensdauer.
  3. Fluoreszenzmikroskopie: Führen Sie die Fluoreszenzbildgebung an einzelnen Wells entweder manuell oder mit einem motorisierten Plattformsystem durch. Die Single-Well-Trays sind mit Standard-Multi-Well-Plattenadaptern kompatibel. Das Signal-Rausch-Verhältnis wird minimiert, wenn das Gerät in einem Kasten mit schwarzen Wänden platziert wird.
    HINWEIS: Da die Würmer abgebildet werden, während sie frei kriechen können, eignet sich dieses Kultursystem gut für die Bildgebung mit niedriger Auflösung, um die Ganzkörperfluoreszenz und die Lokalisierung von Fluorophoren im rauen Gewebe zu erfassen. Bei der hochauflösenden Bildgebung mit hoher Vergrößerung müssen die Tiere in der Regel bewegungsunfähig gemacht werden, um Bewegungen zu verhindern. Es sollte zwar möglich sein, ein lähmendes Mittel (z. B. Natriumazid oder Levamisol) topisch auf jede Vertiefung aufzutragen und mit einer höher aufgelösten Bildgebung fortzufahren, dies würde wiederholte Messungen desselben Wurms zu späteren Zeitpunkten ausschließen. Das Kultursystem, wie beschrieben, ist auch nicht invertiert zu sein, was die Verwendung von inversen Mikroskopsystemen verhindert.
    1. Wenn das Hellfeld nicht zur Messung der Lebensdauer verwendet wird und nur die Fluoreszenz erfasst wird, messen Sie die Lebensdauer manuell. Wenn Sie das blaue Licht (das für die GFP-Anregung verwendet wird) 5 s lang auf dem Wurm belassen, wird das Tier aufgefordert, sich zu bewegen. Wenn sich das Tier nicht innerhalb von 5 Sekunden bewegt hat, betrachten Sie das Tier als tot.

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Representative Results

Die hier beschriebene Mikroschalen-basierte Einzelwurmkulturumgebung kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Phänotypen zu überwachen, einschließlich Lebens- und Gesundheitsspanne, Aktivität und Bewegung, Körperform und Krabbelgeometrie sowie die Expression transgen exprimierter fluoreszierender Biomarker in einzelnen Tieren über die Zeit. Das Mikroschalen-Kultursystem ist mit der Lebensdaueranalyse kompatibel, entweder durch manuelles Scoring oder durch Bilderfassung und nachgeschaltete Bildgebungsanalyse. Wie bei der Standardkultur auf Petriplatten21 können Würmer manuell als tot oder lebendig eingestuft werden, basierend auf der Bewegung nach einem Reiz (z. B. Klopfen auf die Platte oder Exposition gegenüber blauem Licht). Bei der bildbasierten Lebensdaueranalyse wird ein Vergleich der Frame-to-Frame-Unterschiede zwischen Bildern, die nach dem Anwenden des Stimulus aufgenommen wurden, verwendet, um festzustellen, wann jeder Wurm aufhört, sich zu bewegen. Diese ist kompatibel mit automatisierten Bilderfassungs- und Analysesystemen und liefert zusätzliche Daten in Form des Aktivitätsniveaus der einzelnen Tiere zu jedem Zeitpunkt. Diese Informationen können dann nicht nur zur Schätzung der Lebensspanne (Einstellung der Bewegung), sondern auch zur Schätzung der Gesundheitsspanne (ein Schwellenwert für reduzierte Aktivität; es wurden mehrere Definitionen vorgeschlagen) verwendet werden. Aus diesen Bildern können auch zusätzliche Parameter (Körpergröße, -form und -haltung) gemessen werden.

Die Hauptmerkmale dieses Mikrotray-Kultursystems sind (1) die Fähigkeit, einzelne Tiere über einen längeren Zeitraum zu verfolgen, (2) die Kompatibilität zwischen dem Kultursystem und aversiven Interventionen wie diätetischen Einschränkungen oder chemischen Stressmitteln und (3) die Fähigkeit, die Fluoreszenz direkt in der Kulturumgebung zu messen. Um diese Eigenschaften zu demonstrieren, setzten wir Würmer 250 μM Kupfersulfat (CuSO4) aus, um Schwermetallstress zu induzieren, oder 10 mM Dithiothreitol (DTT), um Proteinfehlfaltungsstress zu induzieren, und maßen die tägliche Aktivität, Lebensdauer und Gesundheitsspanne. Sowohl CuSO4als auch DTT reduzierten die Lebensdauer der Schnecke signifikant (Abbildung 2A). Die Überwachung der täglichen Aktivität ermöglichte es uns, die individuelle Gesundheitsspanne jedes Wurms abzuschätzen, hier definiert als das Alter, in dem ein Wurm als Reaktion auf den Reiz keine volle Körperlänge mehr bewegen kann. CuSO4 und DVB-T reduzierten die Gesundheitsspanne im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu verringerte CuSO4 den Anteil des Lebens, der bei guter Gesundheit verbracht wurde, während DVB-T dies nicht tat (Abbildung 2C). CuSO4 reduzierte auch die durchschnittliche Aktivität zwischen den Individuen innerhalb der Population in größerem Ausmaß als DVB-T in allen Altersgruppen (Abbildung 2D) sowie die kumulative Aktivität für jedes Tier über die gesamte Lebensspanne (berechnet als die Fläche unter der Aktivitätskurve [AUC]; Abbildung 2E). Ein wichtiger Vorteil dieses Microtray-Aufbaus ist seine Fähigkeit, Phänotypen zu korrelieren, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei einzelnen Tieren innerhalb einer Population gemessen wurden. In diesem Fall stellen wir fest, dass die kumulative Aktivität für einzelne Tiere bis zum Tag 10 mit der Lebensspanne von DTT-belasteten Tieren korreliert, nicht jedoch für unbehandelte Kontrollen oder CuSO 4-belastete Tiere (Abbildung 2F).

Um die Fähigkeit zur Überwachung fluoreszierender Biomarker über die gesamte Lebensspanne zu demonstrieren, verwendeten wir das Mikroschalenkultursystem, um die Expression des mScarlet-Transgens zu überwachen, das mit dem C-Terminus des Kynu-1-Gens fusioniert ist und das Enzym Kynureninase im Kynurenin-Stoffwechselweg an seinem endogenen Locus kodiert. Wir haben bereits herausgefunden, dass die Expression der humanen Kynureninase, die von Kynu kodiert wird, mit zunehmendem Alter im Blut zunimmt26 und dass der Knockdown von Kynu-1 in C. elegans ausreicht, um die Lebensspanne zu verlängern27. KYNU-1 zeigt eine altersabhängige Expression; Es ist im L4-Larvenstadium fast nicht nachweisbar und erreicht seinen Höhepunkt am 9. Tag des Erwachsenenalters. Zwischen dem 3. und 8. Tag des Erwachsenenalters wird ein drastischer Anstieg der Expression beobachtet, und danach kommt es mit zunehmendem Alter zu einer fortschreitenden Abnahme (Abbildung 3A, ergänzende Abbildung 1). Um den Zusammenhang zwischen dem Altern von KYNU-1 und C. elegans zu untersuchen, quantifizierten wir die kumulative Abundanz von KYNU-1 bis zum 14. Tag des Erwachsenenalters (ein Alter, in dem die meisten Tiere noch am Leben waren) und fanden eine signifikante Korrelation mit der Lebensspanne (Abbildung 3B). Da die Expression von KYNU1 über die gesamte Lebensspanne dynamisch ist, verglichen wir die Expression von KYNU-1 in verschiedenen Altersstufen mit dem Gesamtüberleben einzelner Tiere. Zu keinem Zeitpunkt korrelierte die KYNU-1-Expression signifikant mit dem Überleben (Abbildung 3C-F), was zeigt, dass die lebenslange Expression ein besserer Indikator für die Auswirkungen auf die Lebensspanne ist als die Bewertung einzelner Zeitpunkte.

Zusammengenommen liefern diese Experimente repräsentative Daten, die die Fähigkeiten des Microtray-basierten Einzelwurmkultursystems unterstreichen, dynamische Veränderungen der Wurmaktivität, der Gesundheit, der Lebensdauer und der fluoreszierenden Biomarker zu erfassen und über das Alter hinweg bei einzelnen Tieren zu vergleichen. Insbesondere die Möglichkeit, Individuen zu mehreren Zeitpunkten zu überwachen, ermöglicht es, dynamische Veränderungen sowohl der physiologischen als auch der molekularen Phänotypen in vivo zu verfolgen, was die Erkennung von Mustern ermöglicht, die mit Querschnittsmessungen über Populationen hinweg nicht erkennbar wären.

Figure 1
Abbildung 1: Microtray-Einzelwurmkulturumgebung . (A) 3D-Rendering eines Microtrays, das mit einem benutzerdefinierten 3D-gedruckten Adapter in einer Single-Well-Platte montiert ist. (B) Schematische Darstellung des Einzelwurmkultursystems, das die relative Position einer Mikroschalenvertiefung mit niedrig schmelzenden Agarosenematoden-Wachstumsmedien (NGM), bakterieller Nahrung, isolierten C. elegans, aversiver Palmitinsäurebeschichtung, dem 3D-gedruckten Adapter, Wasserkristallen und der Single-Well-Platte zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Korrelation von Phänotypen bei einzelnen Tieren über Populationen hinweg unter Verwendung von Microtray-Einzelwurmumgebungen. Alle Panels liefern Daten aus einem Experiment, in dem drei Gruppen von Wildtyp-C. elegans (N2) verglichen wurden, die keinen Zusatzstoffen ausgesetzt waren (Kontrolle; N = 55), 250 μM Kupfersulfat (CuS04; N = 38) oder 10 mM Dithiothreitol (DTT; N = 34) ab Tag 2 des Erwachsenenalters. Sowohl die Lebenserwartung (A) als auch die Gesundheitsspanne (B) werden durch chronische Exposition gegenüberCuSO4 oder DTT moderat reduziert. Die Gesundheitsspanne ist definiert als der letzte Tag, an dem sich ein Tier mindestens eine ganze Körperlänge auf dem Teller bewegen kann. Die paarweise Signifikanz wird mit dem Log-Rank-Test (R-Survdiff-Funktion) berechnet. (C) Durchschnittswerte der Gesundheitsspanne und der Lebensspanne innerhalb jeder Population (oben: absolute Werte; unten: normalisiert auf die mittlere Lebenserwartung jeder Gruppe). (D) Die durchschnittliche Wurmaktivität (gleitender 3-Tage-Mittelwert der täglichen Aktivität) innerhalb jeder Gruppe über die gesamte Lebensspanne und (E) der Populationsdurchschnitt des einzelnen Tiergebiets unter der Lebenszeitaktivitätskurve (AUC) werden beide durch CuSO4 oder DTT erheblich beeinträchtigt. Signifikanz, die durch den Mann-Whitney-U-Test bestimmt wurde, um AUC für einzelne Tiere zwischen Gruppen zu vergleichen. (F) Die kumulative Aktivität für einzelne Tiere bis Tag 10 (unten) korreliert mit einer Lebensspanne für Tiere, die DTT ausgesetzt waren, nicht jedoch für Kontrolltiere oder Tiere, die CuSO4 ausgesetzt waren, wie durch lineare Regression (lm-Funktion in R) bestimmt. n.s. = nicht signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Die Bonferroni-Methode wurde verwendet, um alle p-Werte für Mehrfachvergleiche anzupassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Dynamische Quantifizierung von KYNU-1 in einzelnen C. elegans über die gesamte Lebensspanne. C. elegans mit mScarlet, das transgen mit dem C-Terminus des kynu-1-Gens (KYNU-1::mScarlet) verschmolzen war, wurden mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, das mit einer Monochromkamera ausgestattet war, alle 1-4 Tage für 36 Tage abgebildet, bis alle Tiere gestorben waren. (A) KYNU-1, gemessen durch tägliche Quantifizierung der KYNU-1::mScarlet-Fluoreszenz, zeigt ein deutliches altersabhängiges Expressionsmuster über die gesamte Lebensspanne (Durchschnittswert der Würmer in jedem Alter). (B) Die kumulative Expression von KYNU-1::mScarlet bis zum 14. Tag des Erwachsenenalters korreliert mit der Lebenserwartung bei einzelnen Tieren. Die Expression von KYNU1::mScharlachrot im Larvenstadium (Tag 0 des Erwachsenenalters), (D) Tag 4 des Erwachsenenalters, (E) Tag 9 des Erwachsenenalters und (F) Tag 15 des Erwachsenenalters korrelierte nicht mit der Lebensspanne bei einzelnen Tieren. Korrelationen, die durch lineare Regression berechnet werden (Datenanalyse-Regressionsfunktion in Microsoft Excel). n.s. = nicht signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alle p-Werte wurden für Mehrfachvergleiche mit der Bonferroni-Methode adjustiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Einzelne KYNU-1::mScarlet C. elegans , aufgenommen über die gesamte Lebensspanne unter rotem Kanal. Einzelvertiefung einer vorgefertigten Mikroschale, die einen einzelnen C. elegans mit mScarlet-markiertem KYNU-1 enthält, der auf konzentrierter E. coli-Nahrungsquelle lebt . Das Tier wurde zunächst im L4-Larvenstadium und dann in Schritten von 1-5 Tagen für den Rest seines Lebens abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Vergleich von Terasaki-Tray und WorMotel-Hintergrund und Artefakten unter Fluoreszenzmikroskopie. Wells von vorgefertigten Microtrays (oben) oder geformten PDMS WorMotels (unten) wurden unter GFP (A), RFP (B) und DAPI (C) Fluoreszenzkanälen mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit einer Monochromkamera abgebildet. Die Bilder werden in Falschfarben angezeigt, und eine Heatmap wird verwendet, um Sättigungspunkte hervorzuheben. Beide Kultursysteme haben in allen Kanälen Low-Level-Hintergründe. Die WorMotel-Platten sind anfällig für sporadische Hochsignalartefakte, bei denen es sich wahrscheinlich entweder um Mikrobläschen oder Staub oder andere Partikel handelt, die versehentlich während des PDMS-Formprozesses eingefangen wurden14,15. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. Eine Stereolithographie-Datei (STL) für den 3D-gedruckten Einsatz, auf dem der Mikrotray in der Single-Well-Platte platziert wird. Diese Datei enthält die Vollversion mit festem Boden und eignet sich am besten für den Einsatz in einem System, in dem sich die Lichtquelle über der Platte befindet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. Eine Stereolithographie-Datei (STL) für den 3D-gedruckten Einsatz, auf dem der Mikrotray in der Single-Well-Platte platziert wird. Diese Datei enthält die bodenlose Version und eignet sich am besten für den Einsatz in einem System, in dem sich die Lichtquelle unter der Platte befindet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

In dieser Arbeit beschreiben wir ein neuartiges Kultursystem, das Mikroschalen, die ursprünglich für humane Leukozytenantigen-Gewebetypisierungsassays entwickelt wurden, so anpasst, dass sie die Isolierung und Charakterisierung einzelner C. elegans im Laufe der Zeit in einer festen Medienumgebung ermöglichen, die kontextuell dem Agar-basierten NGM ähnelt, das der Standard in der C. elegans-Forschung ist. Dieses System ist mit einer Vielzahl von Interventionen kompatibel, darunter diätetische Restriktionen, exogene medikamentöse Behandlung, eine Herausforderung mit chemischen oder umweltbedingten Stressoren und RNAi. Darüber hinaus ermöglicht es die longitudinale Überwachung von fluoreszierenden Biomarkern in vivo in einzelnen Tieren. Die Fähigkeit, einzelne Tiere innerhalb einer Population zu verfolgen, ermöglicht es, die intraindividuelle Variabilität innerhalb einer Population für Phänotypen mit einer bestimmten zeitlichen Komponente zu bewerten, einschließlich Verhalten, Pathogenese, Reaktion auf Stressbedingungen und Verschlechterung des Gesundheitszustands. Es ermöglicht auch, frühkindliche Merkmale, die innerhalb einer Population variieren, mit den Ergebnissen im späten Leben, einschließlich Lebenserwartung und Gesundheit, in Verbindung zu bringen. Ähnlich wie bei anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien ermöglicht dieses Mikroschalen-basierte Kultursystem die Überwachung einzelner Tiere zu mehreren Zeitpunkten im Laufe des Lebens und vermeidet gleichzeitig potenzielle Störfaktoren, wie z. B. die Aktivierung von Stressreaktionswegen, die auftreten, wenn Würmer in flüssiger Umgebung kultiviert werden (wie es bei vielen Mikrofluidikgeräten der Fall ist). Dadurch können die in diesem Kultursystem gesammelten Daten direkter mit den meisten früheren Arbeiten von C. elegans verglichen werden, die auf festen Medien durchgeführt wurden. Jüngste technologische Fortschritte ermöglichen die Automatisierung vieler Aspekte der Charakterisierung von C. elegans, einschließlich Wachstum, Entwicklung und Alterung28. Dieses Kultursystem ist in Kombination mit automatisierter Mikroskopie und zugehöriger Software mit einer automatisierten Hochdurchsatzerfassung von Lebensdauer, Gesundheitsspanne, Aktivität und anderen physiologischen Parametern kompatibel14,19.

Wir verwenden WorMotels14,15 routinemäßig, um physiologische Phänotypen (z.B. Lebenszeitaktivität), Gesundheitsspanne und Langlebigkeit für einzelne C. elegans unter nicht stressigen Bedingungen wie medikamentösen Behandlungen und RNAi zu überwachen. Unserer Erfahrung nach bieten andere Einzelwurm-Bildgebungstechnologien ein hervorragendes Werkzeug zur Überwachung der individuellen Variation dieser Phänotypen, aber sie haben zwei Einschränkungen. Erstens neigt das PDMS-Material, das zur Formgebung des Chips verwendet wird, im Zusammenhang mit der Fluoreszenzbildgebung dazu, Mikrobläschen zu bilden und kleine Partikel einzufangen, die beide in der Nähe der GFP-Emissionswellenlänge fluoreszieren. Dies erzeugt visuelle Artefakte, wenn Platten unter verschiedenen Fluoreszenzkanälen visualisiert werden (ergänzende Abbildung 2). Eine zweite Einschränkung besteht darin, dass Kupfersulfat keine ausreichende Abschreckung darstellt, um die Flucht zu verhindern, wenn Würmer Eingriffen ausgesetzt sind, die selbst aversiv sind, insbesondere Ernährungseinschränkungen, pathogenen Bakterien oder stressauslösenden Stoffen. Der Graben anderer Einzelwurm-Setups ist zu schmal und hydrophob, um Palmitinsäure aufzunehmen, ein stärkeres aversives Mittel, das häufig verwendet wird, um Populationen unter diätetischen Einschränkungen oder anderen aversiven Bedingungen auf Petriplatten zu erhalten.

Die hier vorgestellte Mikroschalen-Einzelwurmkulturtechnik adressiert beide Einschränkungen. Die größere Grabengröße und das hydrophile Material der Mikroschalen sowie die Anwendung von Wärme und der Einschluss von Tween 20 ermöglichen es, Palmitinsäure als verbesserte aversive Barriere um jede Vertiefung herum aufzutragen, ohne die lmNGM-Pads selbst zu kontaminieren. Die Polystyrolkonstruktion der Mikroschalen erzeugt nur eine niedrige, gleichmäßig verteilte Autofluoreszenz, wodurch das Problem von autofluoreszierenden Mikrobläschen und partikulären Einschlüssen des PDMS vermieden wird (ergänzende Abbildung 2). Sowohl Hintergrundgeräusche als auch Artefakte werden durch die Verwendung einer schwarzen Oberfläche unter und um das Tablett herum weiter reduziert, um die Beugung zu minimieren. Wir fügen 3D-Druckdateien sowohl für einen Hohlfeldadapter (für Hellfeld-Bildgebung) als auch für einen Vollschwarz-Adapter (der ein Dunkelfeld bietet, das sowohl die Dunkelfeld- als auch die Fluoreszenzbildgebung verbessert; siehe Supplemental File 1 und Supplemental File 2) bei. Während das lmNGM selbst eine gewisse Autofluoreszenz erzeugt, wird der Einfluss auf die Bildqualität durch das kleine Well-Volumen minimiert. Diese Faktoren machen Mikrotrays optimal für die wiederholte Fluoreszenzbildgebung einzelner Tiere in vivo, ohne sie aus ihrer Kulturumgebung zu entfernen. Der Hauptnachteil des Microtray-Einzelkultursystems im Vergleich zu anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien ist die Probengröße; Jedes Microtray bietet Platz für bis zu 96 individuell kultivierte Tiere, im Gegensatz zu den 240 Tieren jedes WorMotel14,15. Beide bieten leistungsfähige Einzelschneckenkultursysteme, und die experimentelle Anwendung bestimmt, welches am besten geeignet ist.

Es gibt mehrere Einschränkungen für das Microtray-Kultursystem. Erstens ist das Mikrotray-basierte Kultursystem sowohl schwieriger als auch zeitaufwändiger einzurichten als Standardkulturmethoden mit Petriplatten. Zweitens werden C. elegans in der Fluoreszenzmikroskopie durch mehrere gängige Anregungswellenlängen stimuliert. Da die Tiere während des Bildgebungsprozesses nicht immobilisiert werden, können fluoreszierende Biomarker, die lange Belichtungszeiten erfordern, unscharf sein. Wir stellen fest, dass die Aufnahme mehrerer Bilder zu jedem Zeitpunkt im Allgemeinen ausreicht, um eine genaue Quantifizierung des Fluoreszenzsignals am gesamten Tier zu ermöglichen. Aufgrund dieses Problems ist das Mikroschalenkultursystem jedoch nicht mit hochauflösender Bildgebung, wie z. B. mit konfokaler Mikroskopie, kompatibel und nicht optimal für die Bildgebung von Biomarkern mit niedrigem Signal. Auch vor dem Hintergrund dieser Einschränkungen bietet diese neue Methode das Potenzial, komplexe physiologische Prozesse mit zeitabhängiger Dynamik oder hoher Variabilität von Individuum zu Individuum im Kontext von Aktivität und Überleben zu verstehen.

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Disclosures

Die Autoren geben an, dass sie keine Interessenkonflikte offenzulegen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH R35GM133588 für G.L.S., ein NIHT32GM008659-Ausbildungsstipendium für L.E., einen United States National Academy of Medicine Catalyst Award für G.L.S. und den State of Arizona Technology and Research Initiative Fund, der vom Arizona Board of Regents verwaltet wird.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed terasaki inserts Custom printing company Robot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		 FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood Fisher Scientific 36-100-4376
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
CaCl2 Acros organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin Goldbio C-103-25
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2 Fisher Scientific G-560
FUdR  Research Products International F10705-1.0
Hydrating water crystals  M2 Polymer Technologies Type S Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera Leica Microsystems 11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope Leica Microsystems 10450826
Low-melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4  Fisher Chemical M-8900
NaCl Fisher bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Scientific 264728
Nystatin Sigma N1538
Palmitic acid Acros organics 129700010
Paper towels Coastwide Professional 365374
Parafilm M Parafilm 16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075 UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda) One Lambda 151431
Thermolyne Dri-bath Thermolyne DB28125
Tween  Thermo Scientific J20605-AP

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References

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Widerruf Heft 190
Langzeitkultur einzelner <em>Caenorhabditis elegans</em> auf festen Medien für longitudinales Fluoreszenzmonitoring und aversive Interventionen
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Espejo, L., Hull, B., Chang, L. M.,… More

Espejo, L., Hull, B., Chang, L. M., DeNicola, D., Freitas, S., Silbar, V., Haskins, A., Turner, E. A., Sutphin, G. L. Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions. J. Vis. Exp. (190), e64682, doi:10.3791/64682 (2022).

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