Langtidsdyrkning af individuelle Caenorhabditis elegans på faste medier til langsgående fluorescensovervågning og aversive indgreb

Summary

Her præsenterer vi en protokol til dyrkning af isolerede individuelle nematoder på faste medier til livslang fysiologisk parametersporing og fluorescenskvantificering. Dette kultursystem omfatter en palmitinsyrebarriere omkring enkeltormbrønde for at forhindre dyr i at flygte, hvilket tillader anvendelse af aversive indgreb, herunder patogene bakterier og kemiske stressorer.

Abstract

Caenorhabditis elegans bruges i vid udstrækning til at studere aldringsbiologi. Standardpraksis i C. elegans aldringsundersøgelser er at dyrke grupper af orme på faste nematodevækstmedier (NGM), hvilket muliggør effektiv indsamling af data på populationsniveau for overlevelse og andre fysiologiske fænotyper og periodisk prøveudtagning af subpopulationer til fluorescerende biomarkørkvantificering. Begrænsninger for denne tilgang er manglende evne til (1) at følge individuelle orme over tid for at udvikle aldersbaner for fænotyper af interesse og (2) overvåge fluorescerende biomarkører direkte i forbindelse med kulturmiljøet. Alternative dyrkningsmetoder bruger flydende kultur eller mikrofluidik til at overvåge individuelle dyr over tid, i nogle tilfælde inklusive fluorescenskvantificering, med den afvejning, at kulturmiljøet er kontekstuelt adskilt fra fast NGM. WorMotel er en tidligere beskrevet mikrofabrikeret multi-well enhed til dyrkning af isolerede orme på fast NGM. Hver orm opretholdes i en brønd, der indeholder fast NGM omgivet af en voldgrav fyldt med kobbersulfat, et kontaktafvisende middel til C. elegans, hvilket muliggør langsgående overvågning af individuelle dyr. Vi finder kobbersulfat utilstrækkeligt til at forhindre orme i at flygte, når de udsættes for aversive indgreb, der er almindelige i aldringsforskning, herunder diætbegrænsning, patogene bakterier og kemiske agenser, der fremkalder cellulær stress. Multibrøndindretningerne er også støbt af polydimethylsiloxan, som producerer artefakter med høj baggrund i fluorescensbilleddannelse. Denne protokol beskriver en ny tilgang til dyrkning af isolerede rundorme på fast NGM ved hjælp af kommercielt tilgængelige polystyrenmikrobakker, oprindeligt designet til human leukocytantigen (HLA) typning, hvilket muliggør måling af overlevelse, fysiologiske fænotyper og fluorescens over hele levetiden. En palmitinsyrebarriere forhindrer orme i at flygte, selv i nærvær af aversive forhold. Hver plade kan dyrke op til 96 dyr og tilpasser sig let til en række forhold, herunder diætbegrænsning, RNAi og kemiske tilsætningsstoffer, og er kompatibel med automatiserede systemer til indsamling af levetids- og aktivitetsdata.

Introduction

C. elegans er en stærk modelorganisme til forskning inden for genetik, cellulær biologi og molekylærbiologi, fordi de let dyrkes i laboratoriet, har en kort generationstid og levetid, deler en høj grad af proteinhomologi med pattedyr og har en gennemsigtig kropsstruktur, der tillader in vivo-visualisering af fluorescerende proteiner og farvestoffer¹. Som et resultat af den mangeårige brug af C. elegans som et vigtigt modelsystem på en række områder, herunder udviklingsbiologi og aldring, er deres vækst og udvikling godt forstået, deres genom er blevet fuldt sekventeret, og en lang række kraftfulde genetiske værktøjer er blevet skabt, herunder genom-wide RNAi fodring biblioteker og tusindvis af mutante og transgene stammer. Historisk set dyrkes C. elegans som populationer på fast agarnematodevækstmedie (NGM), og fænotyper evalueres manuelt enten ved direkte observation eller ved billeddannelse og nedstrømsanalyse. Fluorescerende mikroskopi bruges til at fange en række molekylære fænotyper ved hjælp af farvestoffer eller transgent udtrykte fluorescerende tags i individuelle C. elegans. Fluorescerende billeddannelse involverer typisk fastsættelse eller lammelse af et dyr på dias, der indeholder tynde agarosepuder, hvilket er invasivt og ofte dødeligt. Det involverer også brugen af kemikalier, såsom levamisol eller natriumazid, som potentielt kan forstyrre den molekylære proces af interesse ^2,3. Tilsammen gør disse tilgange det muligt at indsamle tværsnitsdata på populationsniveau på tværs af en bred vifte af fænotyper, men tillader ikke sporing af individuelle dyr over tid.

I de senere år er der opstået flere tilgange til dyrkning af isolerede C. elegans, hvilket gør det muligt for forskere at fange dynamiske ændringer i fysiologiske og molekylære fænotyper af dyr over tid ved hjælp af nye billeddannelsesteknologier. En kategori af C. elegans kultur tilgang er mikrofluidik enheder, herunder WormFarm⁴, Nemalife chip⁵, og 'adfærd' chip af Chronis et ^al.6, blandt forskellige andre ^7,8,9. Relateret til disse er væskebaserede dyrkningsmetoder, der bruger multibrøndplader til at karakterisere individuelle orme eller små populationer over tid^10,11. Mikrofluidik og mikropladesystemer giver fremragende kvantitative målinger af fænotypiske reaktioner i C. elegans ned til et enkelt dyr, men kulturmiljøet udgør en vigtig begrænsning. Langt størstedelen af tidligere forskning i C. elegans, især inden for aldring, er blevet afsluttet på faste agarbaserede medier. Flydende kultur får C. elegans til at svømme kontinuerligt og repræsenterer en særskilt miljømæssig kontekst, der kan ændre den underliggende biologi. For eksempel har dyr, der dyrkes i flydende medier, drastisk ændret fedtindhold og genekspression - især for gener, der er involveret i stressresponsen - i forhold til dyr, der dyrkes på agarbaseret fast NGM^12,13. En alternativ kategori af billeddannelsesmetoder med et enkelt dyr involverer polydimethylsiloxan (PDMS) enheder, der isolerer individuelle dyr på faste medier i et forsøg på nærmere at efterligne standardmiljøet, der opleves af orme dyrket på fast NGM i gruppekultur på petriplader. WorMotel er en 240-brønds PDMS-enhed designet til at dyrke individuelle dyr på faste medier. Hver brønd er fyldt med en modificeret NGM ved hjælp af lavsmeltet agarose i stedet for agar og podet med bakteriel mad, hvilket skaber et solidt mediemiljø svarende til det mest almindelige kultursystem ved hjælp af petriplader. Brøndvæggene er runde, så hvert dyr kan afbildes uanset placering i brønden (undgå visuel tilsløring forårsaget af et dyr nær en væg i en plade med flere brønde). Kobbersulfat i en smal voldgrav, der omgiver hver brønd, bruges som afskrækkende middel til at holde dyr i deres brønde^14,15. En begrænsning af denne tilgang er, at kobbersulfatet er ineffektivt til at forhindre orme i at flygte, når aversive miljøforhold er til stede, herunder diætbegrænsning, patogene bakterier eller kemikalier, der fremkalder cellulær stress (f.eks. Paraquat).

Et andet system, der bruger faste medier, er Worm Corral, som anvender en hydrogel til at skabe et lille forseglet miljø for hver orm på et dias, hvilket muliggør langsigtet overvågning af individuelt isolerede dyr¹⁶. En vigtig begrænsning er, at dyr skal forsegles i miljøet som æg, hvilket kræver brug af sterile dyr for at forhindre reproduktion og begrænser lægemiddelbehandlinger til en enkelt applikation. Multi-dosis lægemiddelforsøg kan udføres i WorMotel enten ved at gennemføre flere eksponeringsrunder inden overførsel af orme til enheden eller ved topisk at tilføje yderligere lægemidler til brøndene under eksperimentet; I sidstnævnte tilfælde er den faktiske eksponeringsdosis efter tilsætning af et yderligere lægemiddel til en eksisterende brønd imidlertid vanskelig at kvantificere præcist og afhænger af, hvor hurtigt lægemidlet nedbrydes. Både WorMotel og Worm Corral er fremragende til brightfield eller darkfield billeddannelse for at fange information relateret til aktivitet og dyrefysiologi (fx vækst og udvikling). Mens disse systemer kan bruges til at overvåge fluorescens, er det vores erfaring, at PDMS, der bruges til at skabe de andre enkeltormsbilleddannelsesteknologier, er tilbøjelige til at danne mikrobobler, fange partikler og andre små abnormiteter, der genererer uregelmæssige fluorescerende artefakter, der forstyrrer konsekvent fluorescensvisualisering og kvantificering, især i emissionsområdet for GFP, den mest almindelige fluorofor, der anvendes i C. elegans-forskning. Hidtil er levende fluorescensbilleddannelse af C. elegans individuelle dyr på langsgående måde primært afhængig af mikrofluidiske enheder¹⁷.

Her beskriver vi en ny metode til dyrkning af individuelle C. elegans på faste medier, der er kompatibel med både aversive indgreb og direkte fluorescerende billeddannelse. Denne tilgang ligner i koncept andre enkeltormsbilleddannelsesteknologier, bortset fra at den specialstøbte PDMS-chip erstattes med kommercielt tilgængelige polystyrenmikrobakker, der oprindeligt blev udviklet til mikrocytotoksicitetsassays (også almindeligvis kaldet Terasaki-bakker)¹⁸. Disse mikrobakker har brønde, der kan fyldes med faste medier og podes med bakteriel mad, der nøje efterligner det miljø, som dyr oplever under standard solid NGM-kulturmetode. Hver brønd er omgivet af en aversiv barriere af palmitinsyre snarere end kobbersulfat. Palmitinsyre bruges almindeligvis til at forhindre orme i at flygte fra faste medier ved hjælp af standardgruppekultur på petriplader i forsøg, hvor orme udfordres med et aversivt miljø som diætbegrænsning eller udsættelse for en kemisk stressor. Mikrobakkerne producerer også minimal og konsistent fluorescerende baggrund, hvilket muliggør fluorescerende billeddannelse af dyr direkte i deres kulturmiljø. Dette nye enkeltdyrs faste agarbaserede dyrkningssystem giver ikke kun mulighed for at spore individuelle dyr gennem hele livet og overvåge vækst, udvikling, aktivitet og levetid, men er også kompatibelt med direkte fluorescerende mikroskopi. Fordi ormene kan afbildes uden lammelse eller fiksering, kan in vivo fluorescensbiomarkører kvantificeres i længderetningen hos individuelle dyr, der forbliver på deres kulturmedier, hvilket muliggør observation af dynamiske ændringer i løbet af hvert dyrs levetid. Dette kultursystem er også kompatibelt med den nuværende generation af automatiserede systemer til sporing af levetid og andre sundhedsmålinger^14,19. Vi leverer en detaljeret protokol til dyrkning af individuelle C. elegans i dette mikrobakkebaserede system, diskutere potentielle faldgruber og fejlfinding og diskutere fordele og begrænsninger i forhold til andre systemer, og især en opdateret og optimeret WorMotel-protokol¹⁵.

Hvert kulturmiljø med en enkelt orm består af en mikrobakke monteret inde i en standard enkeltbrøndsbakke ved hjælp af en brugerdefineret 3D-printet adapter (figur 1A). Brøndene er fyldt med lavsmeltet agarosenematodevækstmedier (lmNGM), podet med koncentrerede bakterier som fødekilde og omgivet af en palmitinsyrebelægning for at forhindre orme i at flygte (figur 1B). Mellemrummet mellem mikrobakken og væggene på enkeltbrøndpladen er fyldt med mættede vandkrystaller for at opretholde fugtighed (figur 1B). En vaskemiddelbelægning påføres bakkelåget for at forhindre kondens. En enkelt orm tilsættes til hver brønd, og enkeltbrøndbakken forsegles med Parafilm for at opretholde fugt og tillade iltudveksling. Op til seks mikrobakker kan med rimelighed fremstilles parallelt af en enkelt praktiseret forsker.

Protocol

1. Opskrifter

BEMÆRK: Forbered stamopløsninger, inden du starter forberedelsen af mikrobakkepladen.

1. Stamopløsninger til lavsmeltet agarosenematodevækstmedier (lmNGM)
   1. Der fremstilles 1 M K2HPO4 ved at opløse 174,18 g_K2HPO4i1 liter sterilt deioniseret vand i en 1 liter flaske. Opløsningen autoklaveres ved 121 °C, 15 psi, i 30 minutter og opbevares ved stuetemperatur (RT).
   2. Der fremstilles 1 M KP i (pH_6,0 ) ved at opløse 136,09 g KH₂HPO₄ i 1 liter sterilt deioniseret vand i en 1 L flaske. Opløsningen titreres med 1 M K₂HPO₄ for at opnå pH 6,0. Autoklave opløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter og opbevar den ved RT.
   3. Der fremstilles 1 M CaCl2 ved at opløse 73,5 g_CaCl2 i 500 ml sterilt deioniseret vand i en 500 ml flaske. Autoklave opløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter og opbevar den ved RT
   4. Der fremstilles 1 M MgSO4 ved at opløse 123,25 g_MgSO4 i 500 ml sterilt deioniseret vand i en 500 ml flaske. Autoklave opløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter og opbevar den ved RT.
   5. Forbered 3 M NaCl til lmNGM: I ren 100 ml flaske kombineres 100 ml ultrarent vand og 18,20 g NaCl. Autoklave ved 121 °C, 15 psig, i 30 min.
   6. Forbered 5 mg / ml kolesterol ved at kombinere 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% ethanol og 25 ml sterilt deioniseret vand i en 500 ml gul flaske. Autoklave opløsningen ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter og opbevar den ved RT.
   7. Der fremstilles 50 mM fluorodeoxyuridin (FUdR) ved at opløse 0,1231 g FUdR i 10 ml sterilt deioniseret vand i et 15 ml konisk rør. Brug en 10 ml sprøjte og 0,22 μm filter til at sterilisere opløsningen. Der anvendes en prøve på 1 ml af opløsningen hver i 10 mikrocentrifugeglas, som opbevares ved -20 °C.
   8. Der fremstilles 50 mg/ml carbenicillin ved at opløse 500 mg carbenicillin i 10 ml sterilt deioniseret vand i et 15 ml konisk rør. Brug en 10 ml sprøjte og 0,22 μm filter til at sterilisere opløsningen. Der anvendes en prøve på 1 ml af opløsningen hver i 10 mikrocentrifugeglas, som opbevares ved -20 °C.
   9. Der fremstilles 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) ved at opløse 2,38 g IPTG i 10 ml sterilt deioniseret vand i et 15 ml konisk rør. Brug en 10 ml sprøjte og 0,22 μm filter til at sterilisere opløsningen. Der anvendes en prøve på 1 ml af opløsningen hver i 10 mikrocentrifugeglas, som opbevares ved -20 °C.
   10. Der fremstilles 100 mg/ml ampicillin ved at opløse 1 g ampicillin i 10 ml sterilt deioniseret vand i et 15 ml konisk rør. Brug en 10 ml sprøjte og 0,22 μm filter til at sterilisere opløsningen. Der prøves 1 ml 100 mg/ml ampicillinopløsning hver i 10 mikrocentrifugeglas og opbevares ved -20 °C.
2. Forberedelse af nematodevækstmedier (NGM) til generel vedligeholdelse af C. elegans
   1. For at fremstille 50 plader opløses 10 g Bauto-agar, 1,5 g NaCl og 1,25 g Bacto-pepton i 486 ml ultrarent vand i en 1 L-kolbe. Substratet steriliseres ved autoklavering på et væskeprogram ved 121 °C, 15 psig, i mindst 30 minutter.
   2. Efter autoklave, lad mediet afkøle til 55 °C. Derefter tilsættes 12,5 ml 1 M KP_i, 500 μL 1 M_MgSO4, 500 μL 1 M_CaCl2 og 500 μL 5 mg/ml kolesterol til opløsningen.
   3. Ved hjælp af en steril teknik hældes 10 ml af substratet fremstillet i trin 1.2.2 i hver 60 mm plade (50 i alt). Lad pladerne stå med medier i mindst 30 minutter for at størkne. Afpipetter 300 μL bakteriekultur natten over på pladens midte, og lad pladen ligge på bænken. Lad kulturen tørre og vokse tykkere i 1-2 dage. Disse NGM-plader opbevares med bakterier ved 4 °C.
3. Fremstilling af lmNGM-forblanding
   1. I en 250 ml Erlenmeyerkolbe kombineres 2 g lavsmeltet agarose, 0,25 g pepton, 1 ml 3 M NaCl og 99 ml ultrarent vand. Opløsningen autoklaveres ved 121 °C, 15 psig, i 30 min.
   2. Der hældes 10 ml lmNGM i reagensglas og dækkes med parafilm for at forhindre væsketab. Sæt hætten på rørene, og lad dem køle af og størkne.
4. Forbered 85 mM NaCl til bakteriel mad: I en 100 ml flaske kombineres 515,61 mg NaCl og fyldes op til 100 ml med ultrarent vand. Autoklave ved 121 °C, 15 psig, i 30 min.
5. Forbered vandabsorberende polyacrylamidkrystaller ved at opløse 1 g Type S superabsorberende polymer i 150 ml ultrarent vand i en autoklaverbar klemmeflaske. Skær spidsen for at sikre en passende dispenseringsstørrelse. Autoklave ved 121 °C, 15 psig, i 30 min, hætte med tinfolie, og ryst for at blande krystallerne.
6. Forbered en vaskemiddelopløsning ved at kombinere 3 ml 100% Tween-20 med 7 ml ultrarent vand i et 15 ml konisk hætteglas.
7. Forbered 5 mg / ml kolesterol ved at kombinere 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% EtOH og 25 ml ultrarent vand i en 500 ml flaske.
8. Forbered palmitinsyre arbejdsløsning
   1. Slib 500 mg fast palmitinsyre i en morter og støder, og kombiner den med 15 ml Tween-20 i et 50 ml konisk hætteglas. Bland ved hvirvelstrøm, opløs så mange af krystallerne som muligt.
   2. Tilsæt 17,5 ml 100% ethanol og hvirvel opløsningen for at opløse så meget palmitinsyre som muligt.
   3. Tilsæt 17,5 ml ultrarent vand og hvirvel strengt. Opvarm forsigtigt opløsningen i et perlebad ved 80 °C, indtil palmitinsyren er helt opløst. Nogle palmitinsyre kan udfældes under afkøling.
9. Forbered lysogeni bouillon (LB) ved at blande 20 g LB pulver i 1 liter deioniseret vand i et 1 L eller større bægerglas. Alikvote 500 ml bouillon i to 500 ml bægerglas. Autoklave bouillonen ved 121 °C, 15 psig, i 30 min. Opbevar den tilberedte bouillon på RT.
10. Forberedelse af lysogeni bouillon (LB) agarplader
    1. 10 g LB-pulver og 7,5 g Bactoagar blandes i 500 μL deioniseret vand i en 1 liter kolbe. Opløsningen autoklaves på et væskeprogram ved 121 °C, 15 psig, i 30 minutter.
    2. Hvis det ønskes, tilsættes valgfri antibiotika (500 μL 100 μg/ml ampicillin), efter at det autoklaverede medie er afkølet til 55 °C. Ved hjælp af en steril teknik fremstilles LB-agarplader ved at hælde 20 ml medier i hver 100 mm plade (25 i alt). Pladerne opbevares ved 4 °C.

2. Forberedelse af en population af alderssynkroniserede orme

1. Forbered en population af alderssynkroniserede orme, der er klar til at tilføje til mikrobakken på larvestadie 4 (L4). Alternativt kan orme på ethvert livsstadium tilsættes (FUdR bør udelukkes fra mikrobakkemediet, hvis orme tilsættes på et udviklingsstadium tidligere end L4 for at forhindre udviklingsstop).
   BEMÆRK: Dette trin skal udføres 2 dage, før ormene tilsættes til mikrobakken, hvis mållivsstadiet ved eksperimentets start er L4. Synkroniseringstimen kan justeres, så ormene kan nå det ønskede livsstadium.
2. Temperaturen kan påvirke levetiden. For ensartede resultater skal du bruge standard NGM-plader (se afsnit 1) til at holde C. elegans ved 20 °C og overføre orme til friske plader, hvis de løber tør for bakteriel mad.
3. Fra lagerpladerne med mange unge voksne orme skal du bruge en standardmetode til at generere en alderssynkroniseret population, oftest blegning²⁰ eller tidsindstillet æglægning²¹.
4. Isoler æggene og tilsæt dem til en bakterieplettet NGM-plade. Hvis du bruger vildtype C. elegans, vil æggene klække og danne orme og nå L4-larvestadiet om 2 dage.

3. Forberedelse af bakteriekultur

1. Dagen før eksperimentets begyndelse inokuleres den ønskede bakterielle fødekilde. Forbered ~ 5 ml bakteriekultur pr. Plade.
   BEMÆRK: Bakteriestriben kan tilberedes op til 1 måned i forvejen og opbevares ved 4 °C for E. coli fødekilde.
   1. Streak bakterier for enkelte kolonier på LB agar plade fra en frossen glycerol bestand.
   2. Dyrk kulturen ved 37 °C natten over.
   3. Inokulere flydende LB bouillon med en enkelt koloni pr. Inokulation.
   4. Ryst ved ~250 o/min ved 37 °C i 12-16 timer.

4. Påføring af palmitinsyrebelægning på mikrobakke

BEMÆRK: Palmitinsyre tjener som en aversiv barriere for at forhindre flugt af dyr fra de enkelte brønde. Belægningen påføres hele mikrobakkens bundoverflade med undtagelse af brøndenes indvendige overflader. Nystatin tilsættes palmitinsyren for at afbøde svampeforurening. Dette trin kan gennemføres 1 dag før eksperimentets start, hvis det ønskes.

1. Indstil perlebadet til 80 °C for at give tid til at forvarme.
2. Umiddelbart før brug alikvote 1 ml af palmitinsyrearbejdsopløsningen pr. mikrobakke i en separat steril beholder (typisk et 15 ml konisk hætteglas) og tilsættes 4 μL 10.000 enheder/ml nystatin pr. 1 ml palmitinsyreopløsning før opvarmning.
3. Spray i og uden for mikrobakken med ethanol (70% eller mere) til mætning og ryst det overskydende ethanol af.
   BEMÆRK: Resterende ethanol skal fordampe under behandling i UV-tværbinding (trin 4.4).
4. Brug en UV-tværbinding til at sterilisere mikrobakken (følgende instruktioner er til UV-tværbindingen, der blev brugt i denne undersøgelse):
   1. Placer mikrobakken og låget i UV-tværbindingen separat (dvs. placer ikke lågene på pladerne, da UV ikke trænger ind i plasten).
   2. Luk døren, og tænd UV-tværbinderen.
   3. Tryk på Tid, angiv 20 min., og tryk derefter på Start.
   4. Efter 20 minutter vendes pladen og låget, og trin 4.2.2-4.2.3 gentages.
   5. Mens du bærer handsker, skal du placere lågene på mikrobakken for at forhindre forurening efter sterilisering.
5. Bland palmitinsyrearbejdsløsningen grundigt ved hvirvelstrøm og invertering.
6. Anbring det koniske hætteglas på 15 ml med arbejdsopløsningen af palmitinsyre i perlebadet, og lad eventuelle synlige krystaller opløses fuldstændigt før brug.
7. Placer mikrobakken på afsatsen omkring perlebadet med lågene på i ~2 minutter for at varme op.
8. Fjern mikrobakkens låg. Tilsæt langsomt 200 μL palmitinsyrearbejdsopløsning over mikrobakkens bagvæg (langside). Sæt lågene på igen, og lad mikrobakken sidde på perlebadet i 2-3 minutter, så palmitinsyreopløsningen kan sætte sig hen over bunden af mikrobakken.
   BEMÆRK: Mens den fulde bund af mikrobakken ikke vil være helt belagt før trin 4.10, skal opløsningen spredes jævnt over mere end halvdelen af bundoverfladen. Hvis palmitinsyreopløsningen ikke spredes jævnt, tændes en hvirvel eller vibrerende motor nær mikrobakken. Dette vil give en lille mængde vibrationer, der kan hjælpe med at tillade palmitinsyreopløsningen at sprede sig lettere. Hold mikrobakkelågene på plads for at mindske kontaminering.
9. Gentag trin 4.8.
   BEMÆRK: Omkring halvdelen eller mere af bunden af mikrobakken skal være synligt dækket med den flydende palmitinsyre.
10. Drej mikrobakken 180°, og gentag trin 4.8 og 4.9 på den anden side af bakken.
    BEMÆRK: Bunden af Terasaki-bakken dækkes kun med et tyndt lag palmitinsyreopløsning, når hele det kombinerede volumen er tilsat til begge sider (trin 4.9 og 4.10). Mere eller mindre palmitinsyreblanding kan være påkrævet afhængigt af blandingens forberedelse, temperatur og andre faktorer. Generelt vil mellem 400 og 800 μL af palmitinsyreblandingen være tilstrækkelig til at belægge hele bunden af mikrobakken. Så snart bunden af mikrobakken er synligt dækket, bør der ikke tilsættes yderligere palmitinsyre, da dette kan forurene brøndene.
11. Tør bakken i en steril tørrekasse eller laminar strømningshætte i mindst 1 time uden låg. Alternativt kan du fuldføre dette trin dagen før ilægning af plader (sektion 5) og tørre mikrobakken med låget på ved RT i mindst 16 timer.

5. Ilægning af mikrobakken med lavsmeltende nematodevækstmedier (lmNGM)

BEMÆRK: Denne metode bruger standard NGM blandet med lavsmeltet agarose i stedet for den sædvanlige agar. Agar kan begynde at gelere ved 45 °C. Når der arbejdes med de små mængder, der er nødvendige for at fylde mikrobakkehullerne, tilstopper den agarbaserede NGM ofte pipettespidsen og/eller producerer ujævne brøndoverflader på grund af hurtig gelering. NGM ved hjælp af lavsmeltet agarose begynder at gelere ved ~ 28 ° C, hvilket gør det muligt let at pipettere de smeltede medier og konsekvent danne flade brøndoverflader. Forbered lmNGM samme dag, som ormene skal placeres på mikrobakken. Hvis du forbereder mikrobakken med lmNGM, sår med bakterier og fylder C. elegans alle inden for samme dag, skal du sikre dig, at dyrene er i eller nær den ønskede alder, før du begynder dette sæt trin.

1. Anbring et pipettebassin i et 80 °C perlebad for at varme op.
2. Smelt en 10 ml lmNGM-forblanding pr. mikrobakke, der fremstilles (trin 1.1) i mikrobølgeovnen i ~30-45 s.
   1. LmNGM-reagensglas anbringes i et 200 ml bægerglas, der er afdækket, så de ikke vælter.
   2. Efter ~10-15 sek., eller når lmNGM-forblandingen lige er begyndt at boble, sættes mikrobølgeovnen på pause, hældes lmNGM-forblandingen i et sterilt 200 ml bægerglas og mikrobølgeovnen genoptages.
   3. Hold pause efter behov for at forhindre, at det koger over, og hvirvl for at blande.
   4. Stop mikrobølgeovnen, når al lmNGM er blevet til væske uden bidder.
      BEMÆRK: En enkelt 10 ml alikvote er tilstrækkelig til at fylde i alt 192 brønde (to mikrobakker).
3. Forbered lmNGM ved at tilføje følgende komponenter i den anførte rækkefølge til den varme lavsmelteagarose (volumener er pr. 10 ml lavsmelteagarose): 250 μL 25 mM KPi (pH 6), 10 μL 1 M CaCl₂, 10 μL 1 M_MgSO4 og 10 μL 5 mg / ml kolesterol
   1. Hvis forskeren planlægger at undersøge voksne dyr over tid og har brug for at forhindre reproduktion, skal du også tilføje 10 μL 50 mM FUdR.
   2. Hvis der udføres et RNAi-fodringsforsøg med den almindelige HT115 RNAi E. coli-stamme og tilhørende RNAi-plasmider, tilsættes også 5 μL 50 mg / ml carbenicillin (for at vælge RNAi-plasmidet) og 12 μL 1 mM IPTG (for at inducere ekspression af det dobbeltstrengede RNA fra RNAi-plasmidet).
      BEMÆRK: Yderligere tilsætningsstoffer kan inkluderes afhængigt af de selektive antibiotika og andre kemikalier, der er nødvendige for den ønskede fødekilde. Lægemidler eller kemiske stressfaktorer kan også føjes til lmNGM på dette stadium. NGM og lmNGM indeholder den samme endelige koncentration af NaCl, men adskiller sig i, hvordan NaCl tilsættes til mediet. For NGM tilføjes al NaCl under medieforberedelsen (trin 1.2). Til lmNGM tilsættes en portion NaCl under tilberedning af medier (trin 5.3) og en portion med bakterielevnedsmidlet (pkt. 6). Årsagen til denne ændring stammer fra den lille medievolumen i hver mikrobakkebrønd. Tilsætning af 5 μL koncentrerede bakterier suspenderet i LB til en brønd indeholdende 20 μL medier vil væsentligt ændre mediets næringsstofsammensætning (ved at tilføje komponenterne i LB med et sammenligneligt volumen). For at undgå dette resuspenderes bakterierne i stedet i en opløsning af NaCl for at fjerne LB-komponenterne og samtidig forhindre osmotisk stress på bakterierne. NaCl tilsat til medierne reduceres tilsvarende for at tage højde for saltet tilsat bakterierne.
4. Hæld lmNGM i det opvarmede pipettebassin.
5. Med mikrobakken på en bordplade pipetteres 20 μL lmNGM ind i hver mikrobakke. Dæk mikrobakken til, når pipetten genopfyldes for at minimere kontaminering.
   BEMÆRK: Dette trin er lettere med en elektronisk gentagende pipette.

6. Såning af mikrobakkebrøndene med bakteriel mad

BEMÆRK: 5 μL 10x koncentreret mad fra en podet kultur natten over er tilstrækkeligt til at fodre en enkelt C. elegans i hele dens levetid.

1. Overfør bakterierne fra natkulturen til et 50 ml konisk hætteglas.
2. Centrifuger ved ~3.500 x g i 20 min.
3. Supernatanten fjernes. Resuspender bakteriekulturen i en koncentration på 10x (1/10 volumenprocent af den oprindelige kultur) med 85 mM NaCl-opløsning.
4. Før du tilføjer bakterier til brøndene, skal du visuelt inspicere mikrobakken for at sikre, at den faste lmNGM er fuldstændigt indeholdt i hver brønd. Hvis der hænger en lmNGM ud fra siden af en brønd, skal du skrabe den overskydende lmNGM af med en pipettespids. Dette overskydende medie kan få maden til at løbe ind i palmitinsyre, hvis den ikke ryddes.
5. Afpipetter forsigtigt 5 μL 10x koncentreret bakteriekultur på overfladen af lmNGM i hvert hul. Prøv at undgå at lade bakteriekulturen løbe over siden af brønden og ind i palmitinsyren, da dette vil tiltrække orme til at forlade brønden.
6. Lad mikrobakkerne tørre i en steril tørrekasse eller laminar flowhætte i ~35 min. Kontroller hvert ~ 5 minut, og pas på ikke at tørre for meget. Fjern dem, når nogle få brønde er synligt let våde, da brøndene tørrer yderligere, mens nematoderne tilsættes.

7. Omslut hver mikrobakke inde i en plade med en enkelt brønd

BEMÆRK: I dette afsnit er mikrobakken monteret inde i en standard enkeltbrøndplade ved hjælp af en brugerdefineret 3D-printet indsats og omgivet af vandabsorberende krystaller. Enkeltbrøndpladen lukkes derefter og forsegles med parafilm. Dette tillader iltudveksling, samtidig med at det forhindrer forurening og opretholder tilstrækkelig fugtighed til at forhindre lmNGM i at tørre ud i løbet af flere ugers eksperimenter (ormelevetidseksperimenter kan vare 6-8 uger, hvis man undersøger levetidsforlængende mutationer eller miljøforhold). Under forberedelsen skal du sørge for at dække pladen, når noget ikke aktivt tilsættes for at minimere bakteriel eller svampekontaminering.

1. Steriliser en enkeltbrøndplade og 3D-printet adapter og låg ved at dyppe hver i en 10% blegemiddelopløsning. Skyl grundigt med sterilt DI-vand. Tør af med en opgaveserviet.
2. Spray enkeltbrøndspladen og den 3D-printede adapter og låget med 70 % ethanolopløsning eller derover, og tør det af med en opgaveaftørring. Lad eventuel resterende ethanol lufttørre.
   BEMÆRK: UV-stråling kan også anvendes efter blegemiddel og ethanol med de samme parametre som mikrobakken, som beskrevet ovenfor i trin 4.4.
3. Anbring det sterile 3D-printede skær i en steril enkeltbrøndsplade.
4. Steriliser ydersiden af den fremstillede mikrobakke ved at sprøjte den med 70% ethanol.
5. Anbring mikrobakken i den 3D-printede adapter i enkeltbrøndspladen.
6. Kassér låget til mikrobakken.
7. Dispenser rigeligt vandkrystaller oven på den 3D-printede indsats mellem mikrobakkens ydervæg og den indvendige væg af enkeltbrøndpladen.
8. Tilsæt straks ormene (afsnit 8) eller forsegl mikrobakken til brug den næste dag. Luk bakkens låg, og brug et enkelt stykke parafilm til at vikle alle fire sider for at forsegle mikrobakken. Gentag tætningstrinnet med Parafilm to gange mere for i alt tre lag.
9. Efter forsegling af mikrobakken skal du lade den stå på bænken ved RT i op til 4 dage, før ormene tilsættes (afsnit 8).

8. Tilføjelse af orme til mikrobakken

BEMÆRK: En orm kan tilføjes manuelt til hver brønd ved at overføre dyr fra de alderssynkroniserede ormepopulationer (afsnit 2) ved hjælp af en platinpluk. Overfør kun dyr på det ønskede livsstadium. Hvis overførselsprocessen tager mere end 1 time, kan lmNGM i mikrobakkebrøndene tørre. Overførsel af grupper på 10 til 20 orme ad gangen kan fremskynde dette trin, men det kræver en vis øvelse at konsekvent frigive kun et enkelt dyr pr. Brønd.

1. Tilføj en nematode pr. Brønd, når de når det ønskede livsstadium.
2. Placer låget tilbage over mikrobakken, når du plukker orme fra kildepladen for at minimere forurening.

9. Afslutning af forberedelse af kulturmiljøet til langvarig brug

BEMÆRK: Trinene nedenfor udføres for at sikre, at mediet og ormene i mikrobakken forbliver hydreret i eksperimentets varighed.

1. Tilsæt ~40 μL af vaskemiddelopløsningen til låget på en tallerken med en enkelt brønd, og brug en opgaveserviet til at belægge låget jævnt. Denne belægning forhindrer kondens over tid, når pladen er forseglet. Brug yderligere opgaveservietter til at sprede vaskemiddelopløsningen, indtil synet gennem låget ikke er forvrænget (dette tager normalt ca. to opgaveservietter).
2. Undersøg vandkrystallerne for at sikre, at de begge er i niveau med mikrobakkens øverste kant og ikke flyder over. Tilsæt eller fjern om nødvendigt vandkrystaller til pladen.
3. Brug følgende fremgangsmåde til at pakke bakken med Parafilm (tre stykker i alt) for at sikre, at Parafilm-forseglingen holder på lang sigt.
   1. Stræk det første stykke Parafilm lidt for at dække to sider af bakken.
   2. Stræk det andet stykke Parafilm lidt og dæk de resterende sider af bakken.
   3. Stræk det sidste stykke Parafilm og pak alle fire sider af bakken helt ind og dæk det første og andet stykke Parafilm. En korrekt forseglet mikrobakke kan forblive hydreret i ~ 2 måneder.
      BEMÆRK: Overvåg parafilmintegritet hver 1-2 uge under hele eksperimentet, og udskift efter behov.
   4. Tør toppen af bakken af med en opgaveserviet, fugtig med 70% ethanol, for at fjerne fingeraftryk.
4. Mærk enkeltbrøndpladen ved hjælp af tape. Mikrobakken er nu klar til billeddannelse og langtidsopbevaring for at overvåge orme over tid. Mellem billedbehandlingssessionerne skal bakken opbevares ved 20 °C. Mikrobakken kan åbnes og forsegles flere gange til lægemiddeldosering eller andre procedurer, men bør minimeres for at forhindre forurening og fugttab.

10. Billeddannelse af individuelle orme i mikrobakkebrønde

BEMÆRK: Formålet med denne protokol er at give en detaljeret beskrivelse af, hvordan mikrobakkekulturmiljøet tilberedes. Når mikrobakken er tilberedt og befolket med orme, kan mikrobakkens enkeltormkulturmiljøer bruges til langsgående overvågning af mange fænotyper ved hjælp af teknikker, der er etableret til standardkultur på petriplader. Følgende afsnit indeholder grundlæggende instruktioner til måling af nogle almindelige fænotyper. Fluorescerende billeddannelse skal udføres i et opretstående mikroskop. Brydning af lys gennem Terasaki-bakken minimeres i et mørkt rum.

1. Levetid: Mål levetiden ved forsigtigt at banke på siden eller toppen af pladen eller skinne et klart blåt lys på pladen og observere hvert dyr. Scor et dyr "dødt", hvis det ikke bevæger sig inden for få sekunder. Gentag denne opgave hver 1-3 dage, indtil alle orme er døde.
   BEMÆRK: Mikrobakkekulturmiljøet er kompatibelt med systemer, der automatiserer billedindsamling og analyse for estimering af levetid^14,19.
2. Standardmikroskopi: Udfør brightfield (eller darkfield) billeddannelse på individuelle brønde eller på hele bakken med et kamera eller en scanner med høj opløsning. Disse billeddannelsesdata kan bruges til en række fænotyper, herunder dyrestørrelse 22,23,24, udvikling ²⁵, aktivitet ^14,19 og levetid.
3. Fluorescerende mikroskopi: Udfør fluorescerende billeddannelse på enkeltbrønde enten manuelt eller med et motoriseret platformssystem. Enkeltbrøndsbakkerne er kompatible med standard pladeadaptere med flere brønde. Signal-til-støj minimeres, hvis apparatet placeres i en sortvægget kasse.
   BEMÆRK: Fordi ormene er afbildet, mens de forbliver frie til at kravle, er dette kultursystem velegnet til billeddannelse i lav opløsning til at fange helkropsfluorescens og grov vævslokalisering af fluoroforer. Høj opløsning og høj forstørrelse billeddannelse kræver typisk, at dyrene immobiliseres for at forhindre bevægelse. Selv om det skulle være muligt topisk at anvende et lammende middel (f.eks. natriumazid eller levamisol) på hvert hul og fortsætte med billeddannelse med højere opløsning, ville dette udelukke gentagne målinger af den samme orm på senere tidspunkter. Kultursystemet, som beskrevet, er heller ikke beregnet til at blive inverteret, hvilket forhindrer brugen af inverterede mikroskopsystemer.
   1. Hvis brightfield ikke bruges til at måle levetiden, og kun fluorescens registreres, måles levetiden manuelt. Hvis du forlader det blå lys (bruges til GFP-excitation) på ormen i 5 s, vil dyret få det til at bevæge sig. Hvis dyret ikke har bevæget sig inden for 5 s, skal du betragte dyret som dødt.

Representative Results

Det mikrobakkebaserede enkeltormskulturmiljø, der er beskrevet her, kan bruges til at overvåge en række fænotyper, herunder levetid og sundhedsperiode, aktivitet og bevægelse, kropsform og kravlegeometri og ekspression af transgent udtrykte fluorescerende biomarkører hos individuelle dyr over tid. Mikrobakkekultursystemet er kompatibelt med levetidsanalyse gennem enten manuel scoring eller billedindsamling og downstream-billedanalyse. Som med standardkultur på petriplader²¹ kan orme manuelt scores som døde eller levende baseret på bevægelse efter en stimulus (f.eks. Tapping pladen eller udsættelse for blåt lys). Til billedbaseret levetidsanalyse bruges en sammenligning af ramme-til-ramme-forskelle mellem billeder taget efter stimulus er blevet påført til at bestemme, hvornår hver orm holder op med at bevæge sig. Dette er kompatibelt med automatiserede billedindsamlings- og analysesystemer og giver yderligere data i form af aktivitetsniveauet for de enkelte dyr på hvert tidspunkt. Disse oplysninger kan derefter bruges ikke kun til at estimere levetid (ophør af bevægelse), men også sundhedslængde (en tærskel for nedsat aktivitet; flere definitioner er blevet foreslået). Yderligere parametre (kropsstørrelse, form og kropsholdning) kan også måles ud fra disse billeder.

Nøglefunktionerne i dette mikrobakkekultursystem er (1) evnen til at spore individuelle dyr over tid, (2) kompatibiliteten mellem dyrkningssystemet og aversive indgreb som kostbegrænsning eller kemiske stressmidler og (3) evnen til at måle fluorescens direkte i kulturmiljøet. For at demonstrere disse egenskaber udsatte vi orme for 250 μM kobbersulfat (CuSO₄) for at fremkalde tungmetalstress eller 10 mM dithiothreitol (DTT) for at fremkalde proteinfejlfoldningsstress og målte daglig aktivitet, levetid og sundhedsperiode. Både CuSO₄og DTT reducerede ormens levetid betydeligt (figur 2A). Overvågning af daglig aktivitet gjorde det muligt for os at estimere den individuelle sundhedsspændvidde for hver orm, her defineret som den alder, hvor en orm ikke længere kan bevæge sig en fuld kropslængde som reaktion på stimulus. CuSO₄ og DTT reducerede sundhedsspændvidden i forhold til ubehandlede kontroller (figur 2B). I modsætning hertil reducerede_CuSO4 andelen af livet ved godt helbred, mens DTT ikke gjorde det (figur 2C). CuSO₄ reducerede også den gennemsnitlige aktivitet på tværs af individer i populationen i større grad end DTT i alle aldre (figur 2D) samt kumulativ aktivitet for hvert dyr i hele levetiden (beregnet som arealet under aktivitetskurven [AUC]; Figur 2E). En vigtig fordel ved denne mikrobakkeopsætning er dens evne til at korrelere fænotyper målt på forskellige tidspunkter på tværs af individuelle dyr inden for en population. I dette tilfælde finder vi, at kumulativ aktivitet for individuelle dyr op til dag 10 korrelerer med levetid for DTT-udfordrede dyr, men ikke for ubehandlede kontroller eller CuSO 4-udfordrede dyr (figur 2F).

For at demonstrere evnen til at overvåge fluorescerende biomarkører over hele levetiden brugte vi mikrobakkekultursystemet til at overvåge ekspressionen af mScarlet-transgenet fusioneret til C-terminalen af kynu-1-genet, der koder for enzymet kynureninase i kynureninmetaboliseringsvejen på dets endogene locus. Vi har tidligere fundet, at ekspression af human kynureninase, kodet af Kynu, stiger med alderen i blod²⁶, og at knockdown af kynu-1 i C. elegans er tilstrækkelig til at forlænge levetiden²⁷. KYNU-1 viser aldersafhængigt udtryk; det er næsten uopdageligt på L4-larvestadiet og topper på dag 9 i voksenalderen. Der ses en drastisk stigning i ekspression mellem dag 3 og 8 i voksenalderen, og der er et progressivt fald med alderen derefter (figur 3A, supplerende figur 1). For at vurdere forholdet mellem KYNU-1 og C. elegans aldring kvantificerede vi den kumulative overflod af KYNU-1 op til dag 14 i voksenalderen (en alder, hvor de fleste dyr stadig var i live) og fandt en signifikant sammenhæng med levetid (figur 3B). Da KYNU1-ekspression er dynamisk i løbet af en levetid, sammenlignede vi KYNU-1-ekspression i forskellige aldre med den samlede overlevelse på tværs af individuelle dyr. På intet enkelt tidspunkt var KYNU-1-ekspression signifikant korreleret med overlevelse (figur 3C-F), hvilket viser, at livslang ekspression er en bedre indikation af levetidspåvirkning end enkelttidsvurderinger.

Kombineret giver disse eksperimenter repræsentative data, der fremhæver mulighederne i det mikrobakkebaserede enkeltormskultursystem for at gøre det muligt at fange og sammenligne dynamiske ændringer i ormaktivitet, sundhed, levetid og fluorescerende biomarkører på tværs af aldre hos individuelle dyr. Især evnen til at overvåge individer på flere tidspunkter gør det muligt at spore dynamiske ændringer i både fysiologiske og molekylære fænotyper in vivo, hvilket gør det muligt at påvise mønstre, der ikke ville være synlige ved hjælp af tværsnitsmålinger på tværs af populationer.

Figur 1: Mikrobakke enkeltorm kulturmiljø . (A) 3D-gengivelse af en mikrobakke monteret i en enkeltbrøndplade ved hjælp af en brugerdefineret 3D-printet adapter. (B) Skematisk over enkeltormskultursystemet, der viser den relative position af en mikrobakkebrønd med lavsmeltet agarosenematodevækstmedie (NGM), bakteriel mad, isolerede C. elegans, aversiv palmitinsyrebelægning, den 3D-printede adapter, vandkrystaller og enkeltbrøndpladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Korrelation af fænotyper hos individuelle dyr på tværs af populationer ved hjælp af Microtray single-worm miljøer. Alle paneler leverer data fra et eksperiment, der sammenligner tre grupper af vildtype (N2) C. elegans, der ikke udsættes for tilsætningsstoffer (kontrol; N = 55), 250 μM kobbersulfat (CuS0₄; N = 38) eller 10 mM dithiothreitol (DTT; N = 34) fra dag 2 i voksenalderen. Levetid (A) og sundhedslængde (B) reduceres begge moderat ved kronisk eksponering for enten_CuSO4 eller DTT. Sundhedsspændvidde defineres som den sidste dag, et dyr kan bevæge sig mindst en fuld kropslængde på pladen. Parvis signifikans beregnes ved hjælp af log-rank-testen (R survdiff-funktionen). (C) Gennemsnit af sundhedslængde og levetid inden for hver befolkning (øverst: absolutte værdier; nederst: normaliseret til hver gruppes gennemsnitlige levetid). (D) Gennemsnitlig ormeaktivitet (3 dages rullende gennemsnit af daglig aktivitet) inden for hver gruppe i hele levetiden, og (E) populationsgennemsnittet for det enkelte dyreområde under levetidsaktivitetskurven (AUC) er begge væsentligt svækket af_CuSO4 eller DTT. Signifikans bestemt af Mann-Whitney U-testen for at sammenligne AUC for individuelle dyr mellem grupper. F) Kumulativ aktivitet for individuelle dyr indtil dag 10 (nederst) korrelerer med en levetid for dyr, der eksponeres for DTT, men ikke for kontroldyr eller dyr, der eksponeres for_CuSO4, bestemt ved lineær regression (lm-funktion i R). n.s. = ikke signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bonferroni-metoden blev brugt til at justere alle p-værdier til flere sammenligninger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Dynamisk kvantificering af KYNU-1 i individuelle C. elegans gennem hele levetiden. C. elegans med mScarlet transgent smeltet i rammen til C-terminalen af kynu-1 genet (KYNU-1::mScarlet) blev afbildet ved hjælp af et fluorescerende stereomikroskop udstyret med et monokromt kamera hver 1-4 dage i 36 dage, indtil alle dyr var døde. (A) KYNU-1, målt ved daglig kvantificering af KYNU-1::mScarlet fluorescens, viser et tydeligt aldersafhængigt ekspressionsmønster over hele levetiden (gennemsnitsværdi for orme vist i hver alder). (B) Kumulativ KYNU-1::mScarlet ekspression gennem dag 14 i voksenalderen korrelerer med levetiden hos individuelle dyr. KYNU1::mScarlet ekspression på (C) L4-larvestadiet (dag 0 i voksenalderen), (D) dag 4 i voksenalderen, (E) dag 9 i voksenalderen og (F) dag 15 i voksenalderen korrelerede ikke med levetiden hos individuelle dyr. Korrelationer beregnet ved lineær regression (Data Analysis Regression funktion i Microsoft Excel). n.s. = ikke signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alle p-værdier blev justeret for flere sammenligninger ved hjælp af Bonferroni-metoden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Enkelt KYNU-1::mScarlet C. elegans afbildet gennem hele levetiden under rød kanal. Enkelt brønd i en præfabrikeret mikrobakke indeholdende en enkelt C. elegans med mScarlet mærket KYNU-1, der lever på koncentreret E. coli fødekilde. Dyret blev først fotograferet på L4-larvestadiet og derefter fotograferet i trin på 1-5 dage resten af sit liv. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Terasaki-bakke versus WorMotel-baggrund og artefaktsammenligning under fluorescensmikroskopi. Brønde af præfabrikerede mikrobakker (øverst) eller støbte PDMS WorMotels (nederst) blev afbildet under GFP (A), RFP (B) og DAPI (C) fluorescenskanaler ved hjælp af et fluorescerende stereomikroskop udstyret med et monokromt kamera. Billeder vises i falsk farve, og et varmekort bruges til at fremhæve mætningspunkter. Begge kultursystemer har baggrunde på lavt niveau i alle kanaler. WorMotel-pladerne er tilbøjelige til sporadiske artefakter med højt signal, som sandsynligvis enten er mikrobobler eller støv eller andre partikler, der utilsigtet fanges under PDMS-støbeprocessen^14,15. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. En stereolitografifil (STL) til det 3D-printede skær, hvorpå mikrobakken er placeret i enkeltbrøndspladen. Denne fil indeholder den fulde version med en solid bund og er bedst egnet til brug i et system, hvor lyskilden er over pladen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. En stereolitografifil (STL) til det 3D-printede skær, hvorpå mikrobakken er placeret i enkeltbrøndspladen. Denne fil indeholder den bundløse version og er bedst egnet til brug i et system, hvor lyskilden er under pladen. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Her beskriver vi et nyt kultursystem, der tilpasser mikrobakker, oprindeligt udviklet til humane leukocytantigenvævstypeassays, for at muliggøre isolering og karakterisering af enkelte C. elegans over tid i et solidt mediemiljø, der kontekstuelt ligner den agarbaserede NGM, der er standarden i C. elegans-forskning. Dette system er kompatibelt med en række interventioner, herunder diætbegrænsning, eksogen lægemiddelbehandling, en udfordring med kemiske eller miljømæssige stressfaktorer og RNAi. Det muliggør endvidere langsgående overvågning af fluorescerende biomarkører in vivo hos individuelle dyr. Evnen til at følge individuelle dyr inden for en population gør det muligt at vurdere intra-individuel variabilitet inden for en population for fænotyper med en særskilt tidsmæssig komponent, herunder adfærd, patogenese, reaktion på stressende tilstande og fald i sundhed. Det gør det også muligt for tidlige livstræk, der varierer inden for en befolkning, at blive forbundet med resultater sent i livet, herunder levetid og sundhed. I lighed med andre billeddannelsesteknologier med en orm gør dette mikrobakkebaserede kultursystem det muligt at overvåge individuelle dyr på flere tidspunkter i løbet af livet, samtidig med at potentielle forstyrrende faktorer undgås, såsom aktivering af stressresponsveje, der opstår, når orme dyrkes i flydende miljøer (som det er tilfældet i mange mikrofluidikenheder). Dette gør det muligt at sammenligne data indsamlet i dette kultursystem mere direkte med størstedelen af tidligere C. elegans arbejde udført på faste medier. Nylige teknologiske fremskridt tillader automatisering af mange aspekter af C. elegans karakterisering, herunder vækst, udvikling og aldring²⁸. Dette dyrkningssystem, når det kombineres med automatiseret mikroskopi og tilhørende software, er kompatibelt med en automatiseret indsamling med høj kapacitet af levetid, sundhedslevetid, aktivitet og andre fysiologiske parametre^14,19.

Vi bruger rutinemæssigt WorMotels^14,15 til at overvåge fysiologiske fænotyper (f.eks. livstidsaktivitet), sundhedslængde og levetid for individuelle C. elegans under ikke-stressende forhold såsom lægemiddelbehandlinger og RNAi. Det er vores erfaring, at andre billeddannelsesteknologier med en orm er et fremragende værktøj til overvågning af individuel variation i disse fænotyper, men de har to begrænsninger. For det første har PDMS-materialet, der bruges til at forme chippen, i forbindelse med fluorescensbilleddannelse tendens til at danne mikrobobler og fange små partikler, som begge fluorescerer nær GFP-emissionsbølgelængden. Dette genererer visuelle artefakter, når plader visualiseres under forskellige fluorescenskanaler (supplerende figur 2). En anden begrænsning er, at kobbersulfat er et utilstrækkeligt afskrækkende middel til at forhindre flugt, når orme udsættes for indgreb, der selv er aversive, især diætbegrænsning, patogene bakterier eller stressfremkaldende midler. Voldgraven af andre enkeltormsopsætninger er for smal og hydrofob til at rumme palmitinsyre, som er et stærkere aversivt middel, der almindeligvis anvendes til at opretholde populationer under diætbegrænsning eller andre aversive forhold på petriplader.

Microtray single-worm kulturteknikken, der præsenteres her, adresserer begge begrænsninger. Den større voldgravsstørrelse og det hydrofile materiale i mikrobakkerne sammen med påføring af varme og inkludering af Tween 20 gør det muligt at anvende palmitinsyre som en forbedret aversiv barriere omkring hver brønd uden at forurene selve lmNGM-puderne. Mikrobakkernes polystyrenkonstruktion genererer kun lavniveau, konsekvent fordelt autofluorescens, hvilket undgår problemet med autofluorescerende mikrobobler og partikelindeslutninger af PDMS (supplerende figur 2). Både baggrundsstøj og artefakter reduceres yderligere ved at bruge en sort overflade under og omkring bakken for at minimere diffraktion. Vi inkluderer 3D-udskrivningsfiler til både en hul adapter (der tillader brightfield-billeddannelse) og en solid sort adapter (giver et mørkefelt, der forbedrer både darkfield- og fluorescensbilleddannelse; se supplerende fil 1 og supplerende fil 2). Mens lmNGM i sig selv genererer en vis autofluorescens, minimeres indvirkningen på billedkvaliteten af den lille brøndvolumen. Disse faktorer gør mikrobakker optimale til gentagen fluorescerende billeddannelse af individuelle dyr in vivo uden at fjerne dem fra deres dyrkningsmiljø. Den største ulempe ved mikrobakkens enkeltkultursystem i forhold til andre enkeltormbilleddannelsesteknologier er prøvestørrelsen; hver mikrobakke kan rumme op til 96 individuelt dyrkede dyr, i modsætning til kapaciteten på 240 dyr på hver WorMotel^14,15. Begge tilbyder dygtige enkeltormkultursystemer, og den eksperimentelle anvendelse bestemmer, hvilken der er mest hensigtsmæssig.

Der er flere begrænsninger for mikrobakkekultursystemet. For det første er det mikrobakkebaserede kultursystem både vanskeligere og mere tidskrævende at sætte op end standardkulturmetoder med petriplader. For det andet stimuleres C. elegans af flere almindelige excitationsbølgelængder i fluorescensmikroskopi. Fordi dyr ikke immobiliseres under billeddannelsesprocessen, kan fluorescerende biomarkører, der kræver lange eksponeringstider, sløres. Vi finder, at optagelse af flere billeder i løbet af hvert tidspunkt generelt er tilstrækkeligt til at muliggøre nøjagtig kvantificering af fluorescerende signal fra hele dyret. På grund af dette problem er mikrobakkekultursystemet imidlertid ikke kompatibelt med billeddannelse i høj opløsning, såsom med konfokal mikroskopi, og er ikke optimalt til billeddannelse af biomarkører med lavt signal. Selv i lyset af disse begrænsninger giver denne nye metode potentialet til at forstå komplekse fysiologiske processer med tidsafhængig dynamik eller høj individ-til-individuel variation i forbindelse med aktivitet og overlevelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP