Summary
Здесь мы представляем протокол культивирования изолированных отдельных нематод на твердых средах для отслеживания физиологических параметров на протяжении всей жизни и количественной оценки флуоресценции. Эта система культивирования включает в себя барьер пальмитиновой кислоты вокруг лунок с одним червяком, чтобы предотвратить бегство животных, что позволяет использовать аверсивные вмешательства, включая патогенные бактерии и химические стрессоры.
Abstract
Caenorhabditis elegans широко используются для изучения биологии старения. Стандартной практикой в исследованиях старения C. elegans является культивирование групп червей на твердых средах для роста нематод (NGM), что позволяет эффективно собирать данные на уровне популяции для выживания и других физиологических фенотипов, а также периодический отбор проб субпопуляций для количественной оценки флуоресцентных биомаркеров. Ограничениями этого подхода являются неспособность (1) следить за отдельными червями с течением времени для развития возрастных траекторий для интересующих фенотипов и (2) контролировать флуоресцентные биомаркеры непосредственно в контексте культуральной среды. Альтернативные подходы к культивированию используют жидкую культуру или микрофлюидики для мониторинга отдельных животных с течением времени, в некоторых случаях включая количественную оценку флуоресценции, с компромиссом, заключающимся в том, что культурная среда контекстуально отличается от твердого NGM. WorMotel представляет собой ранее описанное микрофабрикованное многолуночное устройство для культивирования изолированных червей на твердых NGM. Каждый червь содержится в колодце, содержащем твердый NGM, окруженный рвом, заполненным сульфатом меди, контактным репеллентом для C. elegans, позволяющим проводить продольный мониторинг отдельных животных. Мы считаем, что сульфата меди недостаточно, чтобы предотвратить бегство червей при воздействии аверсивных вмешательств, распространенных в исследованиях старения, включая ограничения в питании, патогенные бактерии и химические агенты, вызывающие клеточный стресс. Многолуночные устройства также отлиты из полидиметилсилоксана, который создает артефакты с высоким фоном при флуоресцентной визуализации. Этот протокол описывает новый подход к культивированию изолированных круглых червей на твердых NGM с использованием коммерчески доступных полистирольных микролотков, первоначально разработанных для типирования лейкоцитарного антигена человека (HLA), что позволяет измерять выживаемость, физиологические фенотипы и флуоресценцию на протяжении всей жизни. Барьер пальмитиновой кислоты предотвращает бегство червей даже при наличии аверсивных состояний. Каждая пластина может культивировать до 96 животных и легко адаптируется к различным условиям, включая диетические ограничения, РНКи и химические добавки, и совместима с автоматизированными системами сбора данных о продолжительности жизни и активности.
Introduction
C. elegans являются мощным модельным организмом для исследований в области генетики, клеточной биологии и молекулярной биологии, поскольку они легко культивируются в лаборатории, имеют короткое время генерации и продолжительность жизни, имеют высокую степень гомологии белка с млекопитающими и имеют прозрачную структуру тела, которая позволяет in vivo визуализировать флуоресцентные белки и красители1. В результате многолетнего использования C. elegans в качестве основной модельной системы в ряде областей, включая биологию развития и старение, их рост и развитие хорошо изучены, их геном был полностью секвенирован, и было создано множество мощных генетических инструментов, включая полногеномные библиотеки питания РНК-интерференции и тысячи мутантных и трансгенных штаммов. Исторически сложилось так, что C. elegans культивируются как популяции на твердых агаровых нематодных питательных средах (NGM), а фенотипы оцениваются вручную либо путем прямого наблюдения, либо путем визуализации и последующего анализа. Флуоресцентная микроскопия используется для захвата различных молекулярных фенотипов с использованием красителей или трансгенно экспрессируемых флуоресцентных меток у отдельных C. elegans. Флуоресцентная визуализация обычно включает в себя фиксацию или парализацию животного на предметных стеклах, содержащих тонкие агарозные подушечки, что является инвазивным и часто смертельным. Он также включает использование химических веществ, таких как левамизол или азид натрия, которые потенциально могут вмешиваться в молекулярный процесс, представляющий интерес 2,3. Вместе эти подходы позволяют собирать перекрестные данные на уровне популяции по широкому спектру фенотипов, но не позволяют отслеживать отдельных животных с течением времени.
В последние годы появилось несколько подходов к культивированию изолированных C. elegans, что позволяет исследователям фиксировать динамические изменения физиологических и молекулярных фенотипов животных с течением времени с использованием новых технологий визуализации. Одной из категорий подхода к культуре C. elegans являются микрофлюидные устройства, в том числе WormFarm4, чип Nemalife5 и чип «поведения» Chronis et al.6, а также различные другие 7,8,9. С ними связаны методы культивирования на основе жидкости, в которых используются многолуночные планшеты для характеристики отдельных червей или небольших популяций с течением времени10,11. Микрофлюидика и микропланшетные системы обеспечивают отличные количественные измерения фенотипических реакций у C. elegans вплоть до одного животного, но культуральная среда представляет собой ключевое ограничение. Подавляющее большинство прошлых исследований C. elegans, особенно в области старения, было завершено на твердых средах на основе агара. Жидкая культура заставляет C. elegans непрерывно плавать и представляет собой особый экологический контекст, который может изменить лежащую в основе биологию. Например, у животных, культивируемых в жидких средах, резко изменилось содержание жира и экспрессия генов, особенно генов, участвующих в реакции на стресс, по сравнению с животными, культивируемыми на твердом веществе NGM12,13 на основе агара. Альтернативная категория методов визуализации на одном животном включает устройства из полидиметилсилоксана (PDMS), которые изолируют отдельных животных на твердых средах, чтобы более точно имитировать стандартную среду, в которой находятся черви, культивируемые на твердых NGM в групповой культуре на пластинах Петри. WorMotel - это 240-луночное устройство PDMS, предназначенное для культивирования отдельных животных на твердых средах. Каждая лунка заполняется модифицированным NGM с использованием низкоплавкой агарозы вместо агара и засевается бактериальной пищей, создавая твердую среднюю среду, аналогичную наиболее распространенной системе культивирования с использованием пластин Петри. Стенки колодца круглые, что позволяет визуализировать каждое животное независимо от его местоположения в колодце (избегая визуального затемнения, вызванного животным возле стены в многолуночной пластине). Медный купорос в узком рву, окружающем каждый колодец, используется в качестве отпугивающего фактора для содержания животных в их колодцах14,15. Ограничением этого подхода является то, что сульфат меди неэффективен для предотвращения бегства червей при наличии неблагоприятных условий окружающей среды, включая диетические ограничения, патогенные бактерии или химические вещества, вызывающие клеточный стресс (например, паракват).
Второй системой, в которой используются твердые среды, является загон для червей, в котором используется гидрогель для создания небольшой герметичной среды для каждого червя на предметном стекле, что позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг индивидуально изолированных животных16. Ключевым ограничением является то, что животные должны быть запечатаны в окружающую среду в виде яиц, что требует использования стерильных животных для предотвращения размножения и ограничивает лекарственное лечение одним применением. Испытания многодозовых лекарств могут быть выполнены в WorMotel либо путем проведения нескольких раундов воздействия перед переносом червей в устройство, либо путем местного добавления дополнительных лекарств в лунки во время эксперимента; Однако в последнем случае фактическая доза воздействия после добавления дополнительного лекарственного средства в существующую лунку трудно поддается точному количественному определению и зависит от того, насколько быстро лекарство разлагается. И WorMotel, и Worm Corral отлично подходят для визуализации светлого или темного поля для сбора информации, связанной с активностью и физиологией животных (например, ростом и развитием). Хотя эти системы могут быть использованы для мониторинга флуоресценции, по нашему опыту, PDMS, используемая для создания других технологий визуализации с одним червем, склонна к образованию микропузырьков, улавливанию твердых частиц и другим небольшим аномалиям, которые генерируют нерегулярные флуоресцентные артефакты, которые мешают последовательной визуализации флуоресценции и количественной оценке, особенно в диапазоне излучения для GFP, наиболее распространенного флуорофора, используемого в исследованиях C. elegans. На сегодняшний день живая флуоресцентная визуализация отдельных животных C. elegans в продольном направлении в основном опирается на микрофлюидные устройства17.
Здесь мы описываем новый метод культивирования отдельных C. elegans на твердых средах, который совместим как с аверсивными вмешательствами, так и с прямой флуоресцентной визуализацией. Этот подход аналогичен по концепции другим технологиям визуализации с одним червем, за исключением того, что изготовленный по индивидуальному заказу чип PDMS заменяется коммерчески доступными полистирольными микролотками, первоначально разработанными для анализов микроцитотоксичности (также обычно называемыми лотками Терасаки)18. Эти микролотки имеют лунки, которые могут быть заполнены твердой средой и засеяны бактериальной пищей, точно имитирующей среду, в которой находятся животные в соответствии со стандартной методологией культивирования твердых NGM. Каждая скважина окружена аверсивным барьером из пальмитиновой кислоты, а не медного купороса. Пальмитиновая кислота обычно используется для предотвращения выхода червей из твердых сред, используя стандартную групповую культуру на пластинах Петри в экспериментах, где черви подвергаются воздействию неприятной среды, такой как диетические ограничения или воздействие химического стрессора. Микролотки также создают минимальный и стабильный флуоресцентный фон, что позволяет получать флуоресцентные изображения животных непосредственно в их культурной среде. Эта новая система культивирования на основе твердого агара для одного животного не только позволяет отслеживать отдельных животных на протяжении всей жизни и контролировать рост, развитие, активность и продолжительность жизни, но также совместима с прямой флуоресцентной микроскопией. Поскольку черви могут быть визуализированы без паралича или фиксации, биомаркеры флуоресценции in vivo могут быть количественно количественно определены в продольном направлении у отдельных животных, оставшихся на их питательных средах, что позволяет наблюдать динамические изменения в течение жизни каждого животного. Эта система культивирования также совместима с автоматизированными системами текущего поколения для отслеживания продолжительности жизни и других показателей здоровья14,19. Мы предоставляем подробный протокол культивирования отдельных C. elegans в этой системе на основе микролотков, обсуждаем потенциальные подводные камни и устранение неполадок, а также обсуждаем преимущества и ограничения по сравнению с другими системами и, в частности, обновленный и оптимизированный протокол WorMotel15.
Каждая среда для культивирования одного червя состоит из микролотка, установленного внутри стандартного однолуночного лотка с помощью специального адаптера, напечатанного на 3D-принтере (рис. 1A). Лунки заполнены питательной средой из низкоплавкой агарозной нематоды (lmNGM), засеяны концентрированными бактериями в качестве источника пищи и окружены оболочкой из пальмитиновой кислоты для предотвращения бегства червей (рис. 1B). Пространство между микролотком и стенками однолунковой пластины заполняется насыщенными кристаллами воды для поддержания влажности (рис. 1Б). На крышку лотка наносится моющее покрытие для предотвращения образования конденсата. В каждую лунку добавляется по одному червяку, а однолуночный лоток герметизируется Parafilm для поддержания влажности и обеспечения кислородного обмена. До шести микролотков могут быть подготовлены параллельно одним практикующим исследователем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Рецепты
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте исходные растворы перед началом подготовки пластин для микролотков.
- Исходные растворы для низкоплавких сред для роста агарозных нематод (lmNGM)
- Приготовьте 1 М К 2 ГПО4, растворив 174,18 г К2ХПО4 в1 л стерильной деионизированной воды во флаконе объемом 1 л. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 минут и храните его при комнатной температуре (RT).
- Приготовьте 1 М КПi (рН 6,0), растворив 136,09 г KH2HPO4 в 1 л стерильной деионизированной воды во флаконе объемом 1 л. Титруют раствор 1 М К2HPO4 до достижения рН 6,0. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин и храните его при RT.
- Приготовьте 1 М CaCl 2, растворив 73,5 г CaCl2 в 500 мл стерильной деионизированной воды в бутылке объемом 500 мл. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 минут и храните его при RT
- Приготовьте 1 М MgSO 4, растворив 123,25 г MgSO4 в 500 мл стерильной деионизированной воды во флаконе объемом 500 мл. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин и храните его при RT.
- Приготовьте 3 М NaCl для lmNGM: в чистой бутылке объемом 100 мл смешайте 100 мл сверхчистой воды и 18,20 г NaCl. Автоклав при 121 °C, 15 фунтов/кв. дюйм, в течение 30 мин.
- Приготовьте 5 мг / мл холестерина, смешав 2,5 г холестерина, 275 мл 100% этанола и 25 мл стерильной деионизированной воды в янтарной бутылке объемом 500 мл. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин и храните его при RT.
- Приготовьте 50 мМ фтордезоксиуридина (FUdR), растворив 0,1231 г FUdR в 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Для стерилизации раствора используйте шприц объемом 10 мл и фильтр 0,22 мкм. Аликвотируйте по 1 мл раствора в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 °C.
- Приготовьте 50 мг / мл карбенициллина, растворив 500 мг карбенициллина в 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Для стерилизации раствора используйте шприц объемом 10 мл и фильтр 0,22 мкм. Аликвотируйте по 1 мл раствора в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 °C.
- Приготовьте 1 мМ изопропил ß-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), растворив 2,38 г IPTG в 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Для стерилизации раствора используйте шприц объемом 10 мл и фильтр 0,22 мкм. Аликвотируйте по 1 мл раствора в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 °C.
- Приготовьте 100 мг/мл ампициллина, растворив 1 г ампициллина в 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Для стерилизации раствора используйте шприц объемом 10 мл и фильтр 0,22 мкм. Аликвотируйте 1 мл раствора ампициллина по 100 мг/мл в 10 микроцентрифужных пробирок и храните пробирки при -20 °C.
- Подготовка питательных сред нематод (NGM) для общего содержания C. elegans
- Чтобы сделать 50 тарелок, растворите 10 г агара Bacto, 1,5 г NaCl и 1,25 г пептона Bacto в 486 мл сверхчистой воды в колбе объемом 1 л. Стерилизуйте среду, автоклавируя ее в жидком цикле при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение не менее 30 минут.
- После автоклава дайте среде остыть до 55 °C. Затем добавьте в раствор 12,5 мл 1 М КПi, 500 мкл 1 М MgSO4, 500 мкл 1 М CaCl2 и 500 мкл холестерина 5 мг/мл.
- Используя стерильный метод, налейте 10 мл среды, приготовленной на этапе 1.2.2, в каждую 60-миллиметровую пластину (всего 50). Оставьте пластины со средой не менее чем на 30 минут для застывания. Пипеткой нанесите 300 мкл выращенной на ночь бактериальной культуры на центр планшета и оставьте пластину на скамейке. Дайте культуре высохнуть и загустеть в течение 1-2 дней. Храните эти пластины NGM вместе с бактериями при температуре 4 °C.
- Приготовление пресмеси lmNGM
- В колбе Эрленмейера объемом 250 мл смешайте 2 г легкоплавкой агарозы, 0,25 г пептона, 1 мл 3 М NaCl и 99 мл сверхчистой воды. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин.
- Аликвотируйте 10 мл lmNGM в пробирки и накройте парапленкой, чтобы предотвратить потерю жидкости. Закройте тюбики крышками и дайте им остыть и затвердеть.
- Приготовьте 85 мМ NaCl для бактериальной пищи: во флаконе объемом 100 мл смешайте 515,61 мг NaCl и залейте до 100 мл сверхчистой водой. Автоклав при 121 °C, 15 фунтов/кв. дюйм, в течение 30 мин.
- Приготовьте водопоглощающие кристаллы полиакриламида, растворив 1 г суперабсорбирующего полимера типа S в 150 мл сверхчистой воды в автоклавируемой бутылке для отжима. Отрежьте наконечник, чтобы обеспечить достаточный размер дозирования. Автоклав при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин, накройте фольгой и встряхните, чтобы кристаллы перемешались.
- Приготовьте раствор моющего средства, соединив 3 мл 100% Tween-20 с 7 мл сверхчистой воды в коническом флаконе объемом 15 мл.
- Приготовьте 5 мг / мл холестерина, смешав 2,5 г холестерина, 275 мл 100% EtOH и 25 мл сверхчистой воды в бутылке объемом 500 мл.
- Приготовьте рабочий раствор пальмитиновой кислоты
- Измельчите 500 мг твердой пальмитиновой кислоты в ступке и пестике и соедините ее с 15 мл Tween-20 в коническом флаконе объемом 50 мл. Смешайте путем вихря, растворяя как можно больше кристаллов.
- Добавьте 17,5 мл 100% этанола и встряхните раствор, чтобы растворить как можно больше пальмитиновой кислоты.
- Добавьте 17,5 мл сверхчистой воды и тщательно встряхните. Осторожно нагрейте раствор в ванне с шариками при температуре 80 °C до полного растворения пальмитиновой кислоты. Некоторое количество пальмитиновой кислоты может выпадать в осадок при охлаждении.
- Приготовьте лизогенный бульон (LB), смешав 20 г порошка LB с 1 л деионизированной воды в стакане объемом 1 л или больше. Аликвотируйте 500 мл бульона в два стакана по 500 мл. Автоклавируйте бульон при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин. Храните приготовленный бульон при РТ.
- Приготовление агаровых пластин из лизогенного бульона (LB)
- Смешайте 10 г порошка LB и 7,5 г агара Bacto в 500 мкл деионизированной воды в колбе объемом 1 л. Автоклавируйте раствор в жидкостном цикле при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин.
- При желании добавляют дополнительные антибиотики (500 мкл 100 мкг/мл ампициллина) после охлаждения автоклавной среды до 55 °C. Используя стерильную технику, сделайте агаровые пластины LB, наливая 20 мл среды в каждую 100-миллиметровую пластину (всего 25). Храните пластины при температуре 4 °C.
2. Подготовка популяции синхронизированных по возрасту червей
- Подготовьте популяцию синхронизированных по возрасту червей, готовых к добавлению в микролоток на личиночной стадии 4 (L4). В качестве альтернативы могут быть добавлены черви на любой стадии жизни (FUdR следует исключить из среды микролотка, если черви добавляются на стадии развития раньше, чем L4, чтобы предотвратить остановку развития).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен за 2 дня до добавления червей в микролоток, если целевой стадией жизни в начале эксперимента является L4. Время синхронизации может быть отрегулировано, чтобы позволить червям достичь желаемой стадии жизни. - Температура может повлиять на продолжительность жизни. Для получения стабильных результатов используйте стандартные пластины NGM (см. Раздел 1) для поддержания C. elegans при 20 ° C и переносите червей на свежие тарелки, если у них заканчивается бактериальная пища.
- Из запасных пластин со многими молодыми взрослыми червями используйте стандартный подход для создания популяции, синхронизированной по возрасту, чаще всего обесцвечивая20 или откладывая яйцапо времени 21.
- Изолируйте яйца и добавьте их в тарелку NGM с пятнами бактерий. При использовании C. elegans дикого типа яйца вылупляются и образуют червей, достигая личиночной стадии L4 через 2 дня.
3. Подготовка культуры бактерий
- За день до начала эксперимента привите нужный бактериальный источник пищи. Подготовьте ~ 5 мл бактериальной культуры на тарелку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальная полоса может быть приготовлена за 1 месяц и храниться при температуре 4 ° C для источника пищи E. coli.- Нанесите бактерии на отдельные колонии на агаровую пластину LB из замороженного глицеринового бульона.
- Выращивают культуру при температуре 37 °C в течение ночи.
- Инокулируйте жидкий бульон LB с одной колонией на инокуляцию.
- Встряхивать при ~250 об/мин при 37 °C в течение 12-16 часов.
4. Нанесение покрытия пальмитиновой кислотой на микролоток
ПРИМЕЧАНИЕ: Пальмитиновая кислота служит аверсивным барьером, предотвращающим бегство животных из отдельных лунок. Покрытие наносится на всю нижнюю поверхность микролотка, за исключением внутренних поверхностей лунок. Нистатин добавляют к пальмитиновой кислоте для смягчения грибкового загрязнения. При желании этот шаг можно выполнить за 1 день до начала эксперимента.
- Установите ванну с шариками на 80 °C, чтобы дать время для предварительного нагрева.
- Непосредственно перед использованием аликвотируют 1 мл рабочего раствора пальмитиновой кислоты на микролоток в отдельный стерильный контейнер (обычно конический флакон объемом 15 мл) и добавляют 4 мкл 10 000 ЕД/мл нистатина на 1 мл раствора пальмитиновой кислоты перед нагреванием.
- Распылите внутри и снаружи микролотка этанол (70% или более) до насыщения и стряхните излишки этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный этанол должен испаряться во время обработки в УФ-сшивании (этап 4.4). - Используйте УФ-сшивающий агент для стерилизации микролотка (следующие инструкции относятся к УФ-сшивающему агенту, используемому в этом исследовании):
- Поместите микролоток и крышку в УФ-сшивающий агент отдельно (т. е. не ставьте крышки на пластины, так как ультрафиолетовое излучение не проникает в пластик).
- Закройте дверцу и включите УФ-сшивающий агент.
- Нажмите «Время», введите 20 минут и нажмите «Пуск».
- Через 20 минут переверните тарелку и крышку и повторите шаги 4.2.2-4.2.3.
- Надев перчатки, поместите крышки на микролоток, чтобы предотвратить загрязнение после стерилизации.
- Рабочий раствор пальмитиновой кислоты тщательно перемешать путем вихряния и инвертирования.
- Поместите конический флакон объемом 15 мл с рабочим раствором пальмитиновой кислоты в ванну для шариков и дайте всем видимым кристаллам полностью раствориться перед использованием.
- Поместите микролоток на выступ, окружающий ванну с шариками, с закрытыми крышками на ~ 2 минуты, чтобы он прогрелся.
- Снимите крышку микролотка. Медленно добавьте 200 мкл рабочего раствора пальмитиновой кислоты через заднюю стенку (длинную сторону) микролотка. Закройте крышки и оставьте микролоток на ванну для шариков на 2-3 минуты, чтобы раствор пальмитиновой кислоты осяд на дно микролотка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что все дно микролотка не будет полностью покрыто до шага 4.10, раствор должен равномерно распределяться более чем по половине нижней поверхности. Если раствор пальмитиновой кислоты распределяется неравномерно, включите вихревой или вибрационный двигатель рядом с микролотком. Это обеспечит небольшую вибрацию, которая поможет раствору пальмитиновой кислоты легче распространяться. Держите крышки микролотков на месте, чтобы смягчить загрязнение. - Повторите шаг 4.8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно половина или более дна микролотка должны быть заметно покрыты жидкой пальмитиновой кислотой. - Поверните микролоток на 180° и повторите шаги 4.8 и 4.9 с другой стороны лотка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дно лотка Terasaki будет покрыто тонким слоем раствора пальмитиновой кислоты только после того, как полный объединенный объем будет добавлен с обеих сторон (этапы 4.9 и 4.10). Может потребоваться более или менее смесь пальмитиновой кислоты в зависимости от приготовления смеси, температуры и других факторов. Как правило, от 400 до 800 мкл смеси пальмитиновой кислоты будет достаточно, чтобы покрыть все дно микролотка. Как только дно микролотка будет заметно покрыто, не следует добавлять дополнительную пальмитиновую кислоту, так как это может загрязнить лунки. - Сушите лоток в стерильной сушильной камере или вытяжке с ламинарным потоком не менее 1 часа без крышки. В качестве альтернативы выполните этот шаг за день до загрузки пластин (раздел 5), высушив микролоток с закрытой крышкой при RT в течение не менее 16 часов.
5. Загрузка микролотка средой для роста нематод с низким содержанием расплава (lmNGM)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом методе вместо обычного агара используется стандартный NGM, смешанный с легкоплавкой агарозой. Агар может начать желироваться при 45 ° C. При работе с небольшими объемами, необходимыми для заполнения лунок микролотка, NGM на основе агара часто забивает наконечник пипетки и/или создает неровные поверхности лунок из-за быстрого гелеобразования. NGM, использующий низкоплавкую агарозу, начинает гелеобразить при ~ 28 °C, что позволяет легко пипетировать расплавленную среду и последовательно формировать плоские поверхности скважин. Приготовьте lmNGM в тот же день, когда черви должны быть помещены в микролоток. Если вы готовите микролоток с lmNGM, засеваете бактерии и загружаете C. elegans в течение одного дня, убедитесь, что животные находятся в желаемом возрасте или близки к нему, прежде чем начинать этот набор шагов.
- Поместите таз для пипеток в ванну с шариками при температуре 80 °C, чтобы она согрелась.
- Растопите одну 10 мл пресмеси lmNGM на каждый готовящийся микролоток (шаг 1.1) в микроволновой печи в течение ~30-45 с.
- Поместите пробирки с предварительной смесью lmNGM в стакан объемом 200 мл без крышки, чтобы они не опрокинулись.
- Через ~ 10-15 с или когда предварительная смесь lmNGM только начинает пузыриться, приостановите микроволновую печь, вылейте смесь lmNGM в стерильный стакан объемом 200 мл и возобновите приготовление в микроволновой печи.
- Сделайте паузу по мере необходимости, чтобы он не закипел, и перемешайте.
- Прекратите разогревать в микроволновой печи, как только весь lmNGM превратится в жидкость без кусочков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одной аликвоты объемом 10 мл достаточно, чтобы заполнить в общей сложности 192 лунки (два микролотка).
- Приготовьте lmNGM, добавив следующие компоненты в указанном порядке к теплой агарозе с низким расплавом (объемы указаны на 10 мл низкоплавкой агарозы): 250 мкл 25 мМ KPi (рН 6), 10 мкл 1 М CaCl2, 10 мкл 1 М MgSO4 и 10 мкл 5 мг/мл холестерина
- Если исследователь планирует исследовать взрослых животных с течением времени и ему необходимо предотвратить размножение, также добавьте 10 мкл 50 мМ FUdR.
- При проведении эксперимента по питанию РНК-интерференцией с использованием распространенного штамма HT115 РНКi E. coli и связанных с ним плазмид РНКi также добавьте 5 мкл 50 мг/мл карбенициллина (для выбора плазмиды РНКи) и 12 мкл 1 мМ IPTG (для индукции экспрессии двухцепочечной РНК из плазмиды РНКи).
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные добавки могут быть включены в зависимости от селективных антибиотиков и других химических веществ, необходимых для желаемого источника пищи. На этом этапе к lmNGM также могут быть добавлены лекарства или химические стрессоры. NGM и lmNGM содержат одинаковую конечную концентрацию NaCl, но различаются по способу добавления NaCl в среду. Для NGM весь NaCl добавляется во время подготовки среды (этап 1.2). Для lmNGM часть NaCl добавляют во время подготовки среды (этап 5.3) и порцию с бактериальной пищей (раздел 6). Причина этого изменения связана с небольшим объемом носителя в каждом микролотке. Добавление 5 мкл концентрированных бактерий, взвешенных в LB, в лунку, содержащую 20 мкл среды, существенно изменит питательный состав среды (путем добавления компонентов LB в сопоставимом объеме). Чтобы избежать этого, бактерии вместо этого ресуспендируют в растворе NaCl для удаления компонентов LB, предотвращая осмотический стресс для бактерий. NaCl, добавляемый в среду, соответственно уменьшается, чтобы учесть соль, добавленную к бактериям.
- Налейте lmNGM в подогретый таз для пипеток.
- Положив микролоток на столешницу, введите в каждый микролоток 20 мкл lmNGM. Накрывайте микролоток при заправке пипетки, чтобы свести к минимуму загрязнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг проще с электронной повторяющейся пипеткой.
6. Засеивание лунок микролотков бактериальной пищей
ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мкл 10-кратного концентрированного корма из инокулированной культуры на ночь достаточно, чтобы кормить одного C. elegans в течение всей его жизни.
- Перенесите бактерии из ночной культуры в конический флакон объемом 50 мл.
- Центрифуга при ~ 3 500 x g в течение 20 мин.
- Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируют культуру бактерий в 10-кратной концентрации (1/10 объема исходной культуры) раствором NaCl 85 мМ.
- Перед добавлением бактерий в лунки визуально осмотрите микролоток, чтобы убедиться, что твердый lmNGM полностью содержится в каждой лунке. Если какой-либо lmNGM свисает со стороны колодца, соскребите излишки lmNGM наконечником пипетки. Эта избыточная среда может привести к тому, что пища попадет в пальмитиновую кислоту, если ее не очистить.
- Осторожно нанесите 5 мкл 10-кратной концентрированной бактериальной культуры на поверхность lmNGM в каждой лунке. Старайтесь не допускать, чтобы культура бактерий стекала через стенку колодца и попадала в пальмитиновую кислоту, так как это привлечет червей, покидающих колодец.
- Дайте микролоткам высохнуть в стерильной сушильной камере или вытяжке с ламинарным потоком в течение ~35 минут. Проверяйте каждые ~ 5 минут и следите за тем, чтобы не пересушить. Удаляйте, когда несколько лунок будут заметно слегка влажными, так как лунки будут высыхать дальше, пока добавляются нематоды.
7. Заключение каждого микролотка в однолуночную пластину
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе микролоток устанавливается внутри стандартной однолуночной пластины с помощью специальной вставки, напечатанной на 3D-принтере, и окружен водопоглощающими кристаллами. Затем однолуночная пластина закрывается и герметизируется Parafilm. Это обеспечивает кислородный обмен, предотвращая загрязнение и поддерживая достаточную влажность, чтобы предотвратить высыхание lmNGM в ходе многонедельных экспериментов (эксперименты с продолжительностью жизни червей могут длиться 6-8 недель, если изучать мутации, продлевающие продолжительность жизни, или условия окружающей среды). Во время приготовления обязательно накрывайте тарелку всякий раз, когда что-то не добавляется активно, чтобы свести к минимуму бактериальное или грибковое загрязнение.
- Стерилизуйте однолуночную пластину, адаптер и крышку, напечатанные на 3D-принтере, окунув каждую в 10% раствор отбеливателя. Тщательно смойте стерильной деионизированной водой. Вытрите насухо рабочей салфеткой.
- Опрыскайте однолуночную пластину и адаптер, напечатанный на 3D-принтере, а также крышку раствором этанола 70% или более и протрите рабочей салфеткой. Дайте остаткам этанола высохнуть на воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-излучение также можно использовать после отбеливания и этанола с теми же параметрами, что и микролоток, как описано выше на шаге 4.4. - Поместите стерильный вкладыш, напечатанный на 3D-принтере, в стерильную однолуночную пластину.
- Простерилизуйте подготовленный микролоток снаружи, сбрызнув его 70% этанолом.
- Поместите микролоток в адаптер, напечатанный на 3D-принтере, в однолунковой пластине.
- Откажитесь от крышки микролотка.
- Обильно распределите кристаллы воды поверх 3D-печатной вставки между внешней стенкой микролотка и внутренней стенкой однолуночной пластины.
- Немедленно добавьте червей (раздел 8) или запечатайте микролоток, чтобы использовать его на следующий день. Закройте крышку лотка и используйте один кусок парапленки, чтобы обернуть все четыре стороны, чтобы запечатать микролоток. Повторите этап запечатывания с помощью Parafilm еще два раза, чтобы получить в общей сложности три слоя.
- После запечатывания микролотка оставьте его на стенде при РТ на срок до 4 дней, прежде чем добавлять червей (раздел 8).
8. Добавление червей в микролоток
ПРИМЕЧАНИЕ: Один червь может быть добавлен вручную в каждую лунку путем переноса животных из популяций червей с синхронизацией по возрасту (раздел 2) с помощью платинового пика. Переводите животных только на нужном этапе жизни. Если процесс переноса занимает более 1 часа, lmNGM в лунках микролотка может высохнуть. Перенос групп от 10 до 20 червей за раз может ускорить этот шаг, но требуется некоторая практика, чтобы последовательно выпускать только одно животное в лунку.
- Добавьте по одной нематоде в лунку, как только они достигнут желаемой стадии жизни.
- Наденьте крышку на микролоток при сборе червей с исходной пластины, чтобы свести к минимуму загрязнение.
9. Финишная подготовка культурной среды к длительному использованию
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются для обеспечения того, чтобы среда и черви в микролотке оставались гидратированными в течение всего эксперимента.
- Добавьте ~ 40 мкл раствора моющего средства в крышку однолуничной пластины и используйте рабочую салфетку, чтобы равномерно покрыть крышку. Это покрытие предотвратит образование конденсата с течением времени после герметизации пластины. Используйте дополнительные рабочие салфетки, чтобы распределить раствор моющего средства до тех пор, пока зрение через крышку не исказится (обычно для этого требуется около двух рабочих салфеток).
- Осмотрите кристаллы воды, чтобы убедиться, что они находятся на одном уровне с верхним краем микролотка и не переполняются. При необходимости добавьте или удалите кристаллы воды в тарелку.
- Используя следующий подход, оберните лоток Parafilm (всего три штуки), чтобы гарантировать, что уплотнение Parafilm прослужит долго.
- Слегка растяните первый кусок парапленки, чтобы покрыть две стороны лотка.
- Слегка растяните второй кусок парапленки и накройте остальные стороны лотка.
- Растяните последний кусок Parafilm и полностью оберните все четыре стороны лотка, покрывая первый и второй кусочки Parafilm. Правильно запечатанный микролоток может оставаться гидратированным в течение ~ 2 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте целостность Parafilm каждые 1-2 недели на протяжении всего эксперимента и заменяйте его по мере необходимости. - Протрите верхнюю часть лотка рабочей салфеткой, влажной с 70% этанолом, чтобы удалить отпечатки пальцев.
- Наклейте этикетки на однолуночную пластину с помощью скотча. Теперь микролоток готов к визуализации и долгосрочному хранению для мониторинга червей с течением времени. Между сеансами визуализации держите лоток при температуре 20 °C. Микролоток можно открывать и снова закрывать несколько раз для дозирования лекарств или других процедур, но его следует свести к минимуму, чтобы предотвратить загрязнение и потерю влаги.
10. Визуализация отдельных червей в лунках микролотков
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью данного протокола является подробное описание того, как подготовить среду для культивирования микролотков. После подготовки и заселения червями среды культивирования одного червя в микролотке можно использовать для продольного мониторинга многих фенотипов с использованием методов, установленных для стандартного культивирования на планшетах Петри. В следующем разделе приведены основные инструкции по измерению некоторых распространенных фенотипов. Флуоресцентная визуализация должна выполняться в вертикальном микроскопе. Преломление света через поднос Терасаки сведено к минимуму в темном помещении.
- Продолжительность жизни: Измерьте продолжительность жизни, осторожно постукивая по боковой или верхней части тарелки или светя ярко-синим светом на тарелку и наблюдая за каждым животным. Засчитывайте животное «мертвым», если оно не двигается в течение нескольких секунд. Повторяйте эту задачу каждые 1-3 дня, пока все черви не погибнут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда культивирования микролотков совместима с системами, которые автоматизируют сбор и анализ изображений для оценки продолжительности жизни14,19. - Стандартная микроскопия: Выполняйте визуализацию светлого поля (или темного поля) на отдельных лунках или на всем лотке с помощью камеры или сканера высокого разрешения. Эти данные визуализации могут быть использованы для различных фенотипов, включая размер животного 22,23,24, развитие 25, активность 14,19 и продолжительность жизни.
- Флуоресцентная микроскопия: Выполняйте флуоресцентную визуализацию на отдельных лунках вручную или с помощью моторизованной платформенной системы. Однолуночные лотки совместимы со стандартными многолуночными пластинчатыми адаптерами. Соотношение сигнал/шум сводится к минимуму, если аппарат помещен в коробку с черными стенками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку черви визуализируются, оставаясь свободными для ползания, эта культуральная система хорошо подходит для визуализации с низким разрешением, чтобы захватить флуоресценцию всего тела и локализацию флуорофоров в грубых тканях. Визуализация с высоким разрешением и большим увеличением обычно требует, чтобы животные были обездвижены, чтобы предотвратить движение. Несмотря на то, что должна быть возможность местного применения парализующего агента (например, азида натрия или левамизола) к каждой лунке и продолжения визуализации с более высоким разрешением, это исключило бы повторные измерения одного и того же червя в более поздние моменты времени. Культуральная система, как описано, также не предназначена для инвертирования, что препятствует использованию систем инвертированного микроскопа.- Если светлое поле не используется для измерения продолжительности жизни, а улавливается только флуоресценция, измерьте продолжительность жизни вручную. Оставление синего света (используемого для возбуждения GFP) на черве в течение 5 с побудит животное двигаться. Если животное не двигалось в течение 5 с, считайте животное мертвым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанная здесь среда культивирования одного червя на основе микролотка может быть использована для мониторинга различных фенотипов, включая продолжительность жизни и продолжительность здоровья, активность и движение, форму тела и геометрию ползания, а также экспрессию трансгенно экспрессированных флуоресцентных биомаркеров у отдельных животных с течением времени. Система культивирования микролотков совместима с анализом продолжительности жизни с помощью ручного подсчета очков или сбора изображений и последующего анализа изображений. Как и в случае со стандартной культурой на пластинахПетри 21, черви могут быть вручную оценены как мертвые или живые на основе движения после стимула (например, постукивание по тарелке или воздействие синего света). Для анализа продолжительности жизни на основе изображений используется сравнение покадровых различий между изображениями, сделанными после применения стимула, чтобы определить, когда каждый червь перестает двигаться. Это совместимо с автоматизированными системами сбора и анализа изображений и предоставляет дополнительные данные в виде уровня активности отдельных животных в каждый момент времени. Затем эта информация может быть использована не только для оценки продолжительности жизни (прекращение движения), но и продолжительности здоровья (порог пониженной активности; было предложено несколько определений). Дополнительные параметры (размер тела, форма и осанка) также могут быть измерены по этим изображениям.
Ключевыми особенностями этой системы культивирования микролотков являются (1) способность отслеживать отдельных животных с течением времени, (2) совместимость между системой культивирования и аверсивными вмешательствами, такими как диетические ограничения или химические стрессовые агенты, и (3) способность измерять флуоресценцию непосредственно в среде культивирования. Чтобы продемонстрировать эти особенности, мы подвергли червей воздействию сульфата меди 250 мкМ (CuSO4), чтобы вызвать стресс тяжелых металлов, или 10 мМ дитиотреитола (DTT), чтобы вызвать стресс, связанный с неправильным сворачиванием белка, и измерили ежедневную активность, продолжительность жизни и продолжительность здоровья. Как CuSO4, так и DTT значительно сократили продолжительность жизни червей (рис. 2A). Мониторинг ежедневной активности позволил нам оценить индивидуальную продолжительность здоровья каждого червя, определяемую здесь как возраст, в котором червь больше не может двигаться на всю длину тела в ответ на раздражитель. CuSO4 и DTT сократили продолжительность здоровья по сравнению с необработанными контрольными группами (рис. 2B). Напротив, CuSO4 уменьшил долю жизни, проведенной в добром здравии, в то время как DTT этого не сделал (рис. 2C). CuSO4 также снижал среднюю активность среди особей в популяции в большей степени, чем DTT во всех возрастах (рис. 2D), а также кумулятивную активность для каждого животного на протяжении всей жизни (рассчитывается как площадь под кривой активности [AUC]; Рисунок 2Е). Важным преимуществом этой микролотковой установки является ее способность коррелировать фенотипы, измеренные в разные моменты времени у отдельных животных в популяции. В этом случае мы обнаружили, что кумулятивная активность для отдельных животных до 10-го дня коррелирует с продолжительностью жизни животных с DTT, но не для необработанных контрольных групп или животных с CuSO4 (рис. 2F).
Чтобы продемонстрировать способность контролировать флуоресцентные биомаркеры на протяжении всей жизни, мы использовали систему культивирования микролотков для мониторинга экспрессии трансгена mScarlet, слитого с С-концом гена kynu-1, кодирующего фермент кинурениназу в метаболическом пути кинуренина в его эндогенном локусе. Ранее мы обнаружили, что экспрессия кинурениназы человека, кодируемой Kynu, увеличивается с возрастом вкрови 26, и что нокдаун kynu-1 у C. elegans достаточен для продления продолжительности жизни27. KYNU-1 отображает возрастную экспрессию; он почти не обнаруживается на личиночной стадии L4 и достигает пика на 9-й день взрослой жизни. Резкое увеличение экспрессии наблюдается между 3 и 8 днями взрослой жизни, и после этого наблюдается прогрессирующее снижение с возрастом (рис. 3А, дополнительный рисунок 1). Чтобы оценить взаимосвязь между старением KYNU-1 и C. elegans, мы количественно оценили кумулятивную численность KYNU-1 до 14-го дня взрослой жизни (возраст, в котором большинство животных были еще живы) и обнаружили значительную корреляцию с продолжительностью жизни (рис. 3B). Поскольку экспрессия KYNU1 является динамической в течение всей жизни, мы сравнили экспрессию KYNU-1 в разном возрасте с общей выживаемостью отдельных животных. Ни в один момент времени экспрессия KYNU-1 не коррелировала с выживаемостью (рис. 3C-F), демонстрируя, что пожизненная экспрессия является лучшим показателем воздействия продолжительности жизни, чем оценки за один момент времени.
В совокупности эти эксперименты предоставляют репрезентативные данные, которые подчеркивают возможности системы культивирования одного червя на основе микролотка, позволяющей фиксировать и сравнивать динамические изменения активности червей, здоровья, продолжительности жизни и флуоресцентных биомаркеров в разных возрастах у отдельных животных. В частности, способность наблюдать за людьми в несколько моментов времени позволяет отслеживать динамические изменения как физиологических, так и молекулярных фенотипов in vivo, что позволяет обнаруживать закономерности, которые не были бы очевидны при использовании измерений поперечного сечения в популяциях.
Рисунок 1: Среда культивирования одного червя в микролотке. (A) 3D-рендеринг микролотка, установленного в однолуночной пластине, с использованием специального адаптера, напечатанного на 3D-принтере. (B) Схема системы культивирования с одним червяком, показывающая взаимное расположение микролотка с питательной средой (NGM) из легкоплавких агарозных нематод (NGM), бактериальной пищей, изолированным C. elegans, аверсивным покрытием пальмитиновой кислоты, адаптером, напечатанным на 3D-принтере, кристаллами воды и однолуночным планшетом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Корреляция фенотипов у отдельных животных в популяциях с использованием сред Microtray с одним червем. На всех панелях представлены данные эксперимента, в котором сравнивались три группы C. elegans дикого типа (N2), не подвергавшихся воздействию добавок (контроль; N = 55), 250 мкМ сульфат меди (CuS04; N = 38), или 10 мМ дитиотреитол (DTT; N = 34), начиная со 2-го дня взрослой жизни. Продолжительность жизни (А) и продолжительность здоровья (В) умеренно сокращаются при хроническом воздействии либо CuSO4, либо DTT. Продолжительность здоровья определяется как последний день, когда животное может двигаться, по крайней мере, на одну полную длину тела на тарелке. Попарная значимость вычисляется с помощью логарифмического критерия (функция R survdiff). (C) Продолжительность здоровья и средняя продолжительность жизни в каждой популяции (вверху: абсолютные значения; внизу: нормализуется к средней продолжительности жизни каждой группы). (D) Средняя активность червей (3-дневное скользящее среднее значение суточной активности) в каждой группе на протяжении всей продолжительности жизни и (E) средняя популяция отдельного животного по кривой активности в течение жизни (AUC) существенно ухудшаются CuSO4 или DTT. Значимость определяется U-критерием Манна-Уитни для сравнения AUC для отдельных животных между группами. (F) Кумулятивная активность для отдельных животных до 10-го дня (нижнего) коррелирует с продолжительностью жизни животных, подвергшихся воздействию DTT, но не для контрольных животных или животных, подвергшихся воздействию CuSO4, что определяется линейной регрессией (функция lm в R). н.с. = не значимый, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Метод Бонферрони был использован для корректировки всех p-значений для многократных сравнений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Динамическое количественное определение KYNU-1 у отдельных C. elegans на протяжении всей жизни. C. elegans с трансгенным слиянием mScarlet в кадре с С-концом гена kynu-1 (KYNU-1::mScarlet) визуализировали с помощью флуоресцентного стереомикроскопа, оснащенного монохромной камерой, каждые 1-4 дня в течение 36 дней, пока все животные не умрут. (A) KYNU-1, измеренный путем ежедневного количественного определения флуоресценции KYNU-1::mScarlet, демонстрирует отчетливый возрастной паттерн экспрессии на протяжении всей жизни (среднее значение для червей показано в каждом возрасте). (B) Кумулятивная экспрессия KYNU-1::mScarlet до 14-го дня взрослой жизни коррелирует с продолжительностью жизни у отдельных животных. Экспрессия KYNU1::mScarlet на личиночной стадии (C) L4 (0-й день взрослой жизни), (D) 4-й день взрослой жизни, (E) 9-й день взрослой жизни и (F) 15-й день взрослой жизни не коррелировала с продолжительностью жизни у отдельных животных. Корреляции, рассчитанные методом линейной регрессии (функция регрессии анализа данных в Microsoft Excel). н.с. = незначимый, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Все p-значения были скорректированы для многократных сравнений с использованием метода Бонферрони. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Одиночный KYNU-1::mScarlet C. elegans, изображенный на протяжении всей жизни под красным каналом. Одиночная лунка сборного микролотка, содержащего одного C. elegans с меченым mScarlet KYNU-1, живущего на концентрированном источнике пищи E. coli. Животное было сначала изображено на личиночной стадии L4, а затем с шагом 1-5 дней до конца его жизни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Сравнение фона и артефакта Terasaki с фоном и артефактом WorMotel при флуоресцентной микроскопии. Лунки сборных микролотков (вверху) или формованных PDMS WorMotels (внизу) визуализировали под флуоресцентными каналами GFP (A), RFP (B) и DAPI (C) с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, оснащенного монохромной камерой. Изображения отображаются в ложном цвете, а тепловая карта используется для выделения точек насыщенности. Обе системы культуры имеют низкоуровневый фон во всех каналах. Пластины WorMotel подвержены спорадическим артефактам с высоким сигналом, которые, вероятно, представляют собой либо микропузырьки, либо пыль, либо другие твердые частицы, случайно захваченные в процессе формования PDMS14,15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. Файл стереолитографии (STL) для 3D-печатной вставки, на которую помещается микролоток в однолуночную пластину. Этот файл содержит полную версию со сплошным дном и лучше всего подходит для использования в системе, где источник света находится над пластиной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. Файл стереолитографии (STL) для 3D-печатной вставки, на которую помещается микролоток в однолуночную пластину. Этот файл содержит бездонную версию и лучше всего подходит для использования в системе, где источник света находится ниже пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем новую культуральную систему, которая адаптирует микролотки, первоначально разработанные для анализов типирования тканей на лейкоцитарный антиген человека, чтобы обеспечить изоляцию и характеристику отдельных C. elegans с течением времени в среде твердой среды, которая контекстуально похожа на NGM на основе агара, который является стандартом в исследованиях C. elegans. Эта система совместима с различными вмешательствами, включая диетические ограничения, экзогенное медикаментозное лечение, проблемы с химическими или экологическими стрессорами и РНКи. Кроме того, это позволяет проводить продольный мониторинг флуоресцентных биомаркеров in vivo у отдельных животных. Способность следить за отдельными животными в популяции позволяет оценить внутрииндивидуальную изменчивость в популяции для фенотипов с отчетливым временным компонентом, включая поведение, патогенез, реакцию на стрессовые условия и ухудшение здоровья. Это также позволяет связать черты раннего возраста, которые варьируются в пределах популяции, с результатами в позднем возрасте, включая продолжительность жизни и здоровье. Подобно другим технологиям визуализации с одним червем, эта система культивирования на основе микролотков позволяет контролировать отдельных животных в несколько моментов времени на протяжении всей жизни, избегая при этом потенциальных смешанных факторов, таких как активация путей реакции на стресс, которые возникают, когда черви культивируются в жидкой среде (как в случае со многими микрофлюидными устройствами). Это позволяет более непосредственно сравнивать данные, собранные в этой культурной системе, с большинством прошлых работ C. elegans, проведенных на твердых средах. Последние технологические достижения позволяют автоматизировать многие аспекты характеристики C. elegans, включая рост, развитие и старение28. Эта культуральная система в сочетании с автоматизированной микроскопией и соответствующим программным обеспечением совместима с автоматизированным высокопроизводительным сбором данных о продолжительности жизни, продолжительности здоровья, активности и других физиологических параметрах14,19.
Мы регулярно используем WorMotels14,15 для мониторинга физиологических фенотипов (например, пожизненной активности), продолжительности здоровья и продолжительности жизни отдельных C. elegans в нестрессовых условиях, таких как медикаментозное лечение и РНКи. По нашему опыту, другие технологии визуализации с одним червем предоставляют отличный инструмент для мониторинга индивидуальных вариаций этих фенотипов, но у них есть два ограничения. Во-первых, в контексте флуоресцентной визуализации материал PDMS, используемый для формования чипа, имеет тенденцию образовывать микропузырьки и улавливать мелкие твердые частицы, которые флуоресцируют вблизи длины волны излучения GFP. Это создает визуальные артефакты, когда пластины визуализируются под различными каналами флуоресценции (дополнительный рисунок 2). Второе ограничение заключается в том, что сульфат меди является недостаточным сдерживающим фактором для предотвращения бегства, когда черви подвергаются вмешательствам, которые сами по себе являются неприятными, особенно диетическим ограничениям, патогенным бактериям или вызывающим стресс агентам. Ров других установок с одним червем слишком узкий и гидрофобный, чтобы вместить пальмитиновую кислоту, которая является более сильным аверсивным агентом, обычно используемым для поддержания популяций в диетических ограничениях или других аверсивных условиях на пластинах Петри.
Представленный здесь метод культивирования одного червя в микролотке устраняет оба ограничения. Больший размер рва и гидрофильный материал микролотков, а также применение тепла и включение Tween 20 позволяют применять пальмитиновую кислоту в качестве усиленного аверсивного барьера вокруг каждой скважины, не загрязняя сами прокладки lmNGM. Полистирольная конструкция микролотков генерирует только низкоуровневую, последовательно распределенную автофлуоресценцию, избегая проблемы автофлуоресцентных микропузырьков и твердых включений PDMS (дополнительный рисунок 2). Как фоновый шум, так и артефакты дополнительно уменьшаются за счет использования черной поверхности под лотком и вокруг него, чтобы свести к минимуму дифракцию. Мы включаем файлы 3D-печати как для полого адаптера (обеспечивающего визуализацию светлого поля), так и для сплошного черного адаптера (обеспечивающего темное поле, которое улучшает как темное поле, так и флуоресцентное изображение; см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). В то время как lmNGM сам по себе генерирует некоторую автофлуоресценцию, влияние на качество изображения сводится к минимуму из-за небольшого объема ямы. Эти факторы делают микролотки оптимальными для повторной флуоресцентной визуализации отдельных животных in vivo без удаления их из среды культивирования. Основным недостатком системы микролотков с одним культивированием по сравнению с другими технологиями визуализации с одним червем является размер выборки; каждый микролоток может вместить до 96 индивидуально культивируемых животных, в отличие от 240 животных каждого WorMotelвместимостью 14,15. Оба предлагают способные системы культивирования одного червя, и экспериментальное применение определяет, какая из них является наиболее подходящей.
Существует несколько ограничений для системы культивирования микролотков. Во-первых, система культивирования на основе микролотков является более сложной и трудоемкой в настройке, чем стандартные методы культивирования с использованием планшетов Петри. Во-вторых, C. elegans стимулируются несколькими общими длинами волн возбуждения во флуоресцентной микроскопии. Поскольку животные не обездвиживаются в процессе визуализации, флуоресцентные биомаркеры, требующие длительного времени воздействия, могут быть размыты. Мы обнаружили, что захват нескольких изображений в течение каждого момента времени, как правило, достаточен для точной количественной оценки флуоресцентного сигнала всего животного. Однако из-за этой проблемы система культивирования микролотков несовместима с визуализацией с высоким разрешением, например, с конфокальной микроскопией, и не является оптимальной для визуализации биомаркеров с низким сигналом. Даже в свете этих ограничений этот новый метод дает возможность понять сложные физиологические процессы с зависящей от времени динамикой или высокой индивидуальной изменчивостью в контексте активности и выживания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет каких-либо конфликтов интересов, которые они могли бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R35GM133588 для G.L.S., грантом на обучение NIHT32GM008659 для Лос-Анджелеса, премией Национальной академии медицины США за катализатор для G.L.S. и Фондом технологической и исследовательской инициативы штата Аризона, управляемым Советом регентов штата Аризона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
| AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
| Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
| Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |
References
- Shaham, S.
- Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437 (2014).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
- Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).
- Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
- Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).
