Method Article

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養

DOI:

10.3791/64682

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December 2nd, 2022

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1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

In This Article

Summary

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ここでは、生涯にわたる生理学的パラメータの追跡と蛍光定量のために、単離された個々の線虫を固体培地上で培養するためのプロトコルを紹介します。この培養システムには、動物が逃げるのを防ぐために、シングルワームウェルの周りにパルミチン酸バリアが含まれており、病原菌や化学的ストレッサーなどの嫌悪的介入を使用できます。

Abstract

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カエノラブディティスエレガンスは 、老化生物学の研究に広く使用されています。 C. elegans 老化研究の標準的な方法は、固体線虫増殖培地(NGM)上で線虫のグループを培養し、生存およびその他の生理学的表現型に関する集団レベルのデータの効率的な収集を可能にし、蛍光バイオマーカー定量のための亜集団の定期的なサンプリングを可能にします。このアプローチの限界は、(1)個々の線虫を経時的に追跡して、関心のある表現型の年齢軌跡を開発することができないこと、および(2)培養環境のコンテキストで蛍光バイオマーカーを直接監視できないことです。代替培養アプローチでは、液体培養またはマイクロフルイディクスを使用して、個々の動物を経時的にモニタリングし、場合によっては蛍光定量を含め、培養環境が固体NGMとは文脈的に異なるというトレードオフがあります。WorMotelは、固体NGM上で単離されたワームを培養するための前述の微細加工マルチウェルデバイスです。各ワームは、 C. elegansの接触忌避剤である硫酸銅で満たされた堀に囲まれた固体NGMを含むウェルに維持され、個々の動物の縦方向のモニタリングを可能にします。硫酸銅は、食事制限、病原菌、細胞ストレスを誘発する化学物質など、老化研究で一般的な嫌悪的な介入を受けた場合、ワームの逃げを防ぐには不十分であることがわかりました。マルチウェルデバイスもポリジメチルシロキサンから成形されているため、蛍光イメージングで高いバックグラウンドアーチファクトが発生します。このプロトコルは、もともとヒト白血球抗原(HLA)タイピング用に設計された市販のポリスチレンマイクロトレイを使用して、固形NGM上で単離された回虫を培養するための新しいアプローチを説明し、寿命全体にわたる生存、生理学的表現型、および蛍光の測定を可能にします。パルミチン酸バリアは、嫌悪条件が存在する場合でも、ワームが逃げるのを防ぎます。各プレートは最大96匹の動物を培養でき、食事制限、RNAi、化学添加物などのさまざまな条件に簡単に適応でき、寿命と活動データを収集するための自動システムと互換性があります。

Introduction

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C. elegansは、実験室での培養が容易で、世代時間と寿命が短く、哺乳類と高度なタンパク質相同性を共有し、蛍光タンパク質や色素のin vivo可視化を可能にする透明な体構造を持っているため、遺伝学、細胞生物学、分子生物学の研究のための強力なモデル生物です1。発生生物学や老化を含むさまざまな分野で主要なモデルシステムとしてC.エレガンスが長年使用されてきた結果、その成長と発達はよく理解され、ゲノムは完全に配列決定され、ゲノムワイドRNAiフィードライブラリや数千の変異株やトランスジェニック株など、多くの強力な遺伝ツールが作成されています。歴史的に、C.エレガンスは固体寒天線虫増殖培地(NGM)上の集団として培養され、表現型は直接観察またはイメージングとダウンストリーム分析のいずれかによって手動で評価されています。蛍光顕微鏡は、個々のC.エレガンスの色素または遺伝子組み換え発現蛍光タグを使用して、さまざまな分子表現型をキャプチャするために使用されます。蛍光イメージングは通常、薄いアガロースパッドを含むスライド上で動物を固定または麻痺させることを含み、これは侵襲的であり、しばしば致命的です。また、レバミゾールやアジ化ナトリウムなどの化学物質の使用も含まれており、目的の分子プロセスを妨害する可能性があります2,3

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Protocol

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1. レシピ

注意: マイクロトレイプレートの準備を開始する前に、ストック溶液を準備してください。

  1. 低融点アガロース線虫増殖培地(lmNGM)用のストックソリューション
    1. 1 Lボトル中の1 Lの滅菌脱イオン水に174.18 gのK 2 HPO4を溶解することにより、1 M K2HPO4を調製します。溶液を121°C、15psiで30分間オートクレーブし、室温(RT)で保存します。
    2. 1 Lボトル内の1 Lの滅菌脱イオン水に136.09 gのKH2HPO4を溶解することにより、1 M KPi(pH 6.0)を調製します。溶液を1 M K2HPO4で滴定して、pH 6.0を達成します。溶液を121°C、15psigで30分間オートクレーブし、RTで保存します。
    3. 73.5 gのCaCl2を500 mLの滅菌脱イオン水に500 mLのボトルに溶解することにより、1 M CaCl2を調製します。溶液を121°C、15 psigで30分間オートクレーブし、RTで保存します。
    4. 123.25 gのMgSO 4を500 mLの滅菌脱イオン水に500....

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Results

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ここで説明するマイクロトレイベースのシングルワーム培養環境は、寿命と健康寿命、活動と動き、体型とクロール形状、個々の動物におけるトランスジェニック発現蛍光バイオマーカーの発現など、さまざまな表現型を経時的に監視するために使用できます。マイクロトレイ培養システムは、手動スコアリングまたは画像収集およびダウンストリームイメージング分析のいずれかによる寿命分析と互換性があります。ペトリプレート21上の標準的な培養と同様に、ワームは、刺激(例えば、プレートを叩くか、または青色光への曝露)に続く動きに基づいて、死んでいるか生きているかを手動でスコアリングすることができる。画像ベースの寿命分析では、刺激が適用された後に撮影された画像間のフレーム間の違いの比較を使用して、各ワームがいつ動きを停止するかを決定します。これは、自動画像収集および分析システムと互換性があり、各時点での個々の動物の活動レベルの形で追加データを提供します。この情報は、寿命(運動の停止)だけでなく、健康寿命(活動の低下の閾値、複数の定義が提案されている)を推定するためにも使用できます。これらの画像から、追加のパラメータ(体のサイズ、.......

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Discussion

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ここでは、もともとヒト白血球抗原組織タイピングアッセイ用に開発されたマイクロトレイを適応させ、C.エレガンス研究の標準である寒天ベースのNGMと文脈的に類似した固体培地環境で、単一のC.エレガンスの分離と特性評価を経時的に可能にする新しい培養システムについて説明します。このシステムは、食事制限、外因性薬物治療、化学的または環境的ストレッサーへの挑戦、RNAiなど、さまざまな介入と互換性があります。さらに、個々の動物におけるin vivoでの蛍光バイオマーカーの縦断的モニタリングを可能にします。集団内の個々の動物を追跡する能力により、行動、病因、ストレスの多い状態への反応、健康状態の低下など、明確な時間的要素を持つ表現型について、集団内の個体内変動性を評価できます。また、集団内で異なる幼少期の特徴を、寿命や健康などの晩年期の結果と結びつけることができます。他のシングルワームイメージング技術と同様に、このマイクロトレイベースの培養システムは、ワームが液体環境で培養されるときに発生するストレス応答経路の活性化などの潜在的な交絡因子を回避しながら、個々の動物を生涯を通じて複数の時点で監視する.......

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Disclosures

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著者らは、開示すべき利益相反はないと述べています。

Acknowledgements

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この研究は、NIH R35GM133588からGLS、NIHT32GM008659トレーニング助成金、GLSへの米国医学アカデミー触媒賞、およびアリゾナ州理事会が管理するアリゾナ州技術研究イニシアチブ基金によってサポートされました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3Dプリントテラサキインサートカスタム印刷会社Robot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM印刷、ノズルサイズ0.6 mm、標準PLAプラスフィラメントを使用
AirCleanシステムAC624LF垂直層流ヒュームフードフィッシャーサイエンティフィック36-100-4376
バクトペプトンサーモサイエンティフィック211677
CaCl2Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2野生型株
カルベニシリンGoldbioC-103-25
コレステロールICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50C. elegans
エタノールミリポアex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
ハイドレーティングウォータークリスタル M2 Polymer TechnologiesType SType S 高吸水性ポリマー
Isopropyl ß-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Task
wipes LB Broth, LennoxBD Difco240230
ライカ K5 sCMOS モノクロカメラライカマイクロシステムズ11547112
ライカ M205 FCA 蛍光体顕微鏡ライカマイクロシステムズ10450826
低溶融アガロース研究製品 国際A20070-250.0
MgSO4 フィッシャーケミカルM-8900
NaClフィッシャーバイオ試薬BP358-1
Nunc OmniTray シングルウェルプレートサーモサイエンティフィック264728
ナイスタチンシグマN1538
パルミチン酸アクロス有機物129700010
ペーパータオルコーストワイドプロフェッショナル365374
パラフィルムMパラフィルム16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075UV 架橋機
寺崎トレー(ラムダ)ラムダ151431
1個 サーモリン Dri-bathサーモリンDB28125
Tween サーモサイエンティフィックJ20605-AP
のための標準的な実験室食品

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional....

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Caenorhabditis ElegansSolid Media CultureLongitudinal Fluorescence MonitoringAversive InterventionsIndividual Worm TrackingLifespan MeasurementPalmitic Acid BarrierFluorescent BiomarkersHealth Span AnalysisAutomated Imaging

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