Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נמטודות בודדות על מדיה מוצקה למעקב אחר פרמטרים פיזיולוגיים לכל החיים וכימות פלואורסצנטי. מערכת תרבית זו כוללת מחסום חומצה פלמיטית סביב בארות תולעים בודדות כדי למנוע מבעלי חיים לברוח, ומאפשרת שימוש בהתערבויות מרתיעות, כולל חיידקים פתוגניים וגורמי עקה כימיים.
Abstract
Caenorhabditis elegans נמצאים בשימוש נרחב לחקר ביולוגיה של הזדקנות. הנוהג המקובל במחקרי הזדקנות של C. elegans הוא תרבית קבוצות של תולעים על מצע גידול נמטודות מוצק (NGM), המאפשר איסוף יעיל של נתונים ברמת האוכלוסייה לצורך הישרדות ופנוטיפים פיזיולוגיים אחרים, ודגימה תקופתית של תת-אוכלוסיות לצורך כימות סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים. מגבלות לגישה זו הן חוסר היכולת (1) לעקוב אחר תולעים בודדות לאורך זמן כדי לפתח מסלולי גיל עבור פנוטיפים מעניינים ו-(2) לעקוב אחר סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים ישירות בהקשר של סביבת התרבית. גישות תרבית חלופיות משתמשות בתרבית נוזלית או מיקרופלואידיקה כדי לנטר בעלי חיים בודדים לאורך זמן, במקרים מסוימים כולל כימות פלואורסצנטי, עם הפשרה שסביבת התרבית שונה מבחינה קונטקסטואלית מגז טבעי מוצק. ה-WorMotel הוא מכשיר רב-באר מיקרו-מפוברק שתואר בעבר לגידול תולעים מבודדות על גז טבעי מוצק. כל תולעת נשמרת בבאר המכילה NGM מוצק המוקף בחפיר מלא נחושת גופרתית, דוחה מגע עבור C. elegans, המאפשר ניטור אורכי של בעלי חיים בודדים. אנו מוצאים כי נחושת גופרתית אינה מספיקה כדי למנוע מתולעים לברוח כאשר הן נחשפות להתערבויות מרתיעות הנפוצות במחקר הזדקנות, כולל הגבלה תזונתית, חיידקים פתוגניים וחומרים כימיים הגורמים לעקה תאית. המכשירים מרובי הבארות מעוצבים גם מפולידימתילסילוקסן, המייצר תוצרי רקע גבוהים בהדמיה פלואורסצנטית. פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה לגידול תולעים עגולות מבודדות על גז טבעי טבעי מוצק באמצעות מיקרו-מגשי פוליסטירן הזמינים מסחרית, שתוכננו במקור עבור הקלדת אנטיגן לויקוציטים אנושי (HLA), המאפשרים מדידה של הישרדות, פנוטיפים פיזיולוגיים ופלואורסצנטיות לאורך תוחלת החיים. מחסום חומצה פלמיטית מונע מתולעים לברוח, אפילו בנוכחות תנאים מרתיעים. כל צלחת יכולה לגדל עד 96 בעלי חיים ומתאימה את עצמה בקלות למגוון מצבים, כולל מגבלות תזונתיות, RNAi ותוספים כימיים, והיא תואמת למערכות אוטומטיות לאיסוף נתוני תוחלת חיים ופעילות.
Introduction
C. elegans הם אורגניזם מודל רב עוצמה למחקר בגנטיקה, ביולוגיה תאית וביולוגיה מולקולרית, מכיוון שהם מתורבתים בקלות במעבדה, יש להם זמן ותוחלת חיים קצרים של דור, חולקים רמה גבוהה של הומולוגיה חלבונית עם יונקים, ויש להם מבנה גוף שקוף המאפשר הדמיה in vivo של חלבונים פלואורסצנטיים וצבעים1. כתוצאה מהשימוש ארוך השנים ב-C. elegans כמערכת מודל מרכזית במגוון תחומים, כולל ביולוגיה התפתחותית והזדקנות, גדילתם והתפתחותם מובנים היטב, הגנום שלהם רוצף במלואו, ונוצרו שורה של כלים גנטיים רבי עוצמה, כולל ספריות הזנת RNAi ברחבי הגנום ואלפי זנים מוטנטיים וטרנסגניים. מבחינה היסטורית, C. elegans מעובדים כאוכלוסיות על מצע גידול נמטודות אגר מוצק (NGM), ופנוטיפים מוערכים ידנית על ידי תצפית ישירה או על ידי הדמיה וניתוח במורד הזרם. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש ללכידת מגוון פנוטיפים מולקולריים באמצעות צבעים או תגים פלואורסצנטיים המבוטאים באופן מהונדס ב- C. elegans בודדים. הדמיה פלואורסצנטית כוללת בדרך כלל קיבוע או שיתוק של בעל חיים על מגלשות המכילות רפידות אגרוז דקות, שהן פולשניות ולעתים קרובות קטלניות. זה גם כרוך בשימוש בכימיקלים, כגון levamisole או נתרן azide, אשר עלול להפריע לתהליך המולקולרי של עניין 2,3. יחד, גישות אלה מאפשרות לאסוף נתוני חתך ברמת האוכלוסייה על פני מגוון רחב של פנוטיפים, אך אינן מאפשרות מעקב אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן.
בשנים האחרונות התפתחו מספר גישות לגידול C. elegans מבודדים, המאפשרות לחוקרים ללכוד שינויים דינמיים בפנוטיפים פיזיולוגיים ומולקולריים של בעלי חיים לאורך זמן תוך שימוש בטכנולוגיות הדמיה חדשות. קטגוריה אחת של גישת התרבית של C. elegans היא מכשירי מיקרופלואידיקה, כולל WormFarm4, שבב Nemalife5, ושבב 'התנהגות' של Chronis et al.6, בין היתר 7,8,9. לאלה קשורות שיטות תרבית מבוססות נוזל, המשתמשות בצלחות מרובות בארות כדי לאפיין תולעים בודדות או אוכלוסיות קטנות לאורך זמן10,11. מיקרופלואידיקה ומערכות מיקרו-צלחות מספקות מדידות כמותיות מצוינות של תגובות פנוטיפיות ב-C. elegans עד לחיה אחת, אך סביבת התרבית מהווה מגבלה מרכזית. הרוב המכריע של מחקרי העבר ב- C. elegans, במיוחד בתחום ההזדקנות, הושלם על מדיה מוצקה מבוססת אגר. תרבית נוזלית גורמת ל-C. elegans לשחות ברציפות ומייצגת הקשר סביבתי מובהק שיכול לשנות את הביולוגיה הבסיסית. לדוגמה, בעלי חיים שגודלו בתרבית במדיה נוזלית שינו באופן דרסטי את תכולת השומן ואת ביטוי הגנים – במיוחד עבור גנים המעורבים בתגובת העקה – בהשוואה לבעלי חיים שגודלו בתרבית על NGM מוצקמבוסס אגר 12,13. קטגוריה חלופית של שיטות הדמיה של בעלי חיים בודדים כוללת מכשירי פולידימתילסילוקסאן (PDMS) המבודדים בעלי חיים בודדים על מדיה מוצקה, במאמץ לחקות בצורה קרובה יותר את הסביבה הסטנדרטית שחוו תולעים שגודלו בתרבית על גז טבעי מוצק בתרבית קבוצתית על לוחות פטרי. ה-WorMotel הוא מכשיר PDMS בעל 240 בארות שנועד לגדל בעלי חיים בודדים על מדיה מוצקה. כל באר ממולאת בגז טבעי טבעי שעבר שינוי באמצעות אגרוז נמס נמוך במקום אגר ונזרע במזון חיידקי, מה שיוצר סביבת מדיה מוצקה הדומה למערכת התרבית הנפוצה ביותר באמצעות צלחות פטרי. קירות הבאר עגולים, ומאפשרים לצלם כל בעל חיים ללא קשר למיקומו בבאר (תוך הימנעות מטשטוש חזותי שנגרם על ידי בעל חיים ליד קיר בצלחת מרובת בארות). נחושת גופרתית בחפיר צר המקיף כל באר משמשת כגורם מרתיע להחזקת בעלי חיים בבארות שלהם14,15. מגבלה של גישה זו היא שהנחושת הגופרתית אינה יעילה במניעת בריחת תולעים כאשר קיימים תנאים סביבתיים מרתיעים, כולל הגבלה תזונתית, חיידקים פתוגניים או כימיקלים הגורמים לעקה תאית (למשל, פרקוואט).
מערכת שנייה המשתמשת במדיה מוצקה היא Worm Corral, המשתמשת בהידרוג'ל כדי ליצור סביבה אטומה קטנה לכל תולעת במגלשה, ומאפשרת ניטור ארוך טווח של בעלי חיים מבודדיםבנפרד 16. מגבלה מרכזית היא שבעלי חיים חייבים להיות אטומים לסביבה כביצים, מה שמחייב שימוש בבעלי חיים סטריליים כדי למנוע רבייה, והגבלת טיפולים תרופתיים ליישום יחיד. ניסויים בתרופות מרובות מינונים יכולים להתבצע בוורמוטל על ידי ביצוע סבבי חשיפה מרובים לפני העברת תולעים למכשיר או על ידי הוספה מקומית של תרופות נוספות לבארות במהלך הניסוי; עם זאת, במקרה האחרון, מנת החשיפה בפועל לאחר הוספת תרופה נוספת לבאר קיימת קשה לכימות מדויק ותלויה במהירות שבה התרופה מתפרקת. גם ה-WorMotel וגם ה-Worm Corral מצוינים להדמיית שדה בהיר או שדה אפל כדי ללכוד מידע הקשור לפעילות ולפיזיולוגיה של בעלי חיים (למשל, גדילה והתפתחות). בעוד שניתן להשתמש במערכות אלה כדי לנטר פלואורסצנטיות, מניסיוננו, PDMS המשמש ליצירת טכנולוגיות הדמיה אחרות של תולעת יחידה נוטה ליצור מיקרו-בועות, לכידת חלקיקים וחריגות קטנות אחרות היוצרות ממצאים פלואורסצנטיים לא סדירים המפריעים להדמיה וכימות פלואורסצנטיים עקביים, במיוחד בטווח הפליטה של GFP, הפלואורופור הנפוץ ביותר המשמש במחקר C. elegans. נכון להיום, הדמיה פלואורסצנטית חיה של בעלי חיים בודדים של C. elegans באופן אורכי מסתמכת בעיקר על התקנים מיקרופלואידים17.
כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית לגידול C. elegans בודדים על מדיה מוצקה התואמת הן התערבויות מרתיעות והן הדמיה פלואורסצנטית ישירה. גישה זו דומה בקונספט שלה לטכנולוגיות הדמיה אחרות של תולעת יחידה, פרט לכך ששבב PDMS יצוק בהתאמה אישית מוחלף במיקרו-מגשי פוליסטירן הזמינים מסחרית שפותחו במקור עבור מבחני ציטוטוקסיות מיקרו (הנקראים גם מגשי טרסאקי)18. מיקרו-מגשים אלה כוללים בארות שניתן למלא במצע מוצק ולזרוע במזון חיידקי, המחקות באופן הדוק את הסביבה שחווים בעלי חיים תחת מתודולוגיית תרבית NGM מוצקה סטנדרטית. כל באר מוקפת במחסום מרתיע של חומצה פלמיטית ולא נחושת גופרתית. חומצה פלמיטית משמשת בדרך כלל למניעת בריחת תולעים ממדיה מוצקה, תוך שימוש בתרבית קבוצתית סטנדרטית על צלחות פטרי בניסויים שבהם תולעים מאותגרות עם סביבה מרתיעה כמו הגבלה תזונתית או חשיפה לגורם עקה כימי. המגשים הזעירים מייצרים גם רקע פלואורסצנטי מינימלי ועקבי, המאפשר הדמיה פלואורסצנטית של בעלי חיים ישירות בסביבת התרבית שלהם. מערכת תרבית חדשה זו המבוססת על אגר מוצק בעל חיים יחיד לא רק מאפשרת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך החיים ולנטר גדילה, התפתחות, פעילות ותוחלת חיים, אלא גם תואמת למיקרוסקופ פלואורסצנטי ישיר. מכיוון שניתן לצלם את התולעים ללא שיתוק או קיבוע, ניתן לכמת סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים in vivo בבעלי חיים בודדים שנותרו במצע התרבית שלהם, מה שמאפשר תצפית על שינויים דינמיים לאורך החיים של כל חיה. מערכת תרבות זו תואמת גם למערכות אוטומטיות מהדור הנוכחי למעקב אחר תוחלת חיים ומדדי בריאות אחרים14,19. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לטיפוח C. elegans בודדים במערכת מבוססת מיקרו-מגש זו, דנים במלכודות פוטנציאליות ובפתרון בעיות, ודנים ביתרונות ובמגבלות ביחס למערכות אחרות, ובפרט, פרוטוקול WorMotel15 מעודכן וממוטב.
כל סביבת תרבית של תולעת יחידה מורכבת ממיקרו-מגש המורכב בתוך מגש סטנדרטי של באר אחת באמצעות מתאם מותאם אישית המודפס בתלת-ממד (איור 1A). הבארות מלאות במצע גידול נמטודות אגרוז (lmNGM) שנמס נמוך, שנזרעו בחיידקים מרוכזים כמקור מזון, ומוקפות בציפוי חומצה פלמיטית כדי למנוע מתולעים לברוח (איור 1B). החלל בין המגש הזעיר לדפנות הצלחת החד-בארית מלא בגבישי מים רוויים כדי לשמור על לחות (איור 1B). ציפוי חומר ניקוי מוחל על מכסה המגש כדי למנוע עיבוי. לכל באר מתווספת תולעת אחת, ומגש הבאר הבודדת אטום בפרפילם כדי לשמור על לחות ולאפשר חילופי חמצן. עד שישה מיקרו-מגשים יכולים להיות מוכנים באופן סביר במקביל על ידי חוקר מנוסה אחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מתכונים
הערה: הכינו תמיסות מלאי לפני שתתחילו בהכנת צלחת מיקרו-מגש.
- פתרונות מלאי עבור מדיה לגידול נמטודות אגרוז נמטודות נמוכות (lmNGM)
- הכן 1 M K 2 HPO4 על ידי המסת 174.18 גרם של K2HPO4 ב 1 ליטר של מים סטריליים deionized בבקבוק 1 L. Autoclave התמיסה ב 121 ° C, 15 psi, במשך 30 דקות ואחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
- הכן 1 M KPi (pH 6.0) על ידי המסת 136.09 גרם של KH2HPO4 ב 1 L של מים סטריליים deionized בבקבוק 1 L. טיטרט את הפתרון עם 1 M K2HPO4 כדי להשיג pH 6.0. Autoclave את הפתרון ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות ואחסן אותו ב RT.
- הכן 1 M CaCl 2 על ידי המסת 73.5 גרם של CaCl2 ב 500 מ"ל של מים סטריליים deionized בבקבוק 500 מ"ל. Autoclave את התמיסה ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות ואחסן אותו ב RT
- הכן 1 M MgSO 4 על ידי המסת 123.25 גרם של MgSO4 ב 500 מ"ל של מים סטריליים deionized בבקבוק 500 מ"ל. Autoclave את הפתרון ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות ואחסן אותו ב RT.
- הכינו 3 M NaCl עבור lmNGM: בבקבוק נקי של 100 מ"ל, ערבבו 100 מ"ל מים טהורים במיוחד ו-18.20 גרם NaCl. Autoclave ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות.
- הכינו 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול על ידי שילוב של 2.5 גרם כולסטרול, 275 מ"ל של 100% אתנול ו-25 מ"ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה בבקבוק ענבר של 500 מ"ל. Autoclave את הפתרון ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות ואחסן אותו ב RT.
- הכן 50 mM fluorodeoxyuridine (FUdR) על ידי המסת 0.1231 גרם של FUdR ב 10 מ"ל של מים סטריליים deionized בצינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן 0.22 מיקרומטר כדי לעקר את התמיסה. Aliquot 1 מ"ל של התמיסה כל אחד לתוך 10 צינורות microcentrifuge ולאחסן אותם ב -20 ° C.
- הכן 50 מ"ג / מ"ל carbenicillin על ידי המסת 500 מ"ג של carbenicillin ב 10 מ"ל של מים סטריליים deionized בצינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן 0.22 מיקרומטר כדי לעקר את התמיסה. Aliquot 1 מ"ל של התמיסה כל אחד לתוך 10 צינורות microcentrifuge ולאחסן אותם ב -20 ° C.
- הכן 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) על ידי המסת 2.38 גרם של IPTG ב 10 מ"ל של מים סטריליים deionized בצינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן 0.22 מיקרומטר כדי לעקר את התמיסה. Aliquot 1 מ"ל של התמיסה כל אחד לתוך 10 צינורות microcentrifuge ולאחסן אותם ב -20 ° C.
- להכין 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין על ידי המסת 1 גרם של ampicillin ב 10 מ"ל של מים סטריליים deionized בצינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן 0.22 מיקרומטר כדי לעקר את התמיסה. Aliquot 1 מ"ל של תמיסת אמפיצילין 100 מ"ג / מ"ל כל אחד לתוך 10 צינורות מיקרוצנטריפוגות ולאחסן את הצינורות ב -20 ° C.
- הכנת מצע גידול נמטודות (NGM) לתחזוקה כללית של C. elegans
- כדי ליצור 50 צלחות, להמיס 10 גרם של אגר Bacto, 1.5 גרם של NaCl, ו 1.25 גרם של פפטון Bacto ב 486 מ"ל של מים טהורים במיוחד בבקבוק 1 L. לעקר את המדיום על ידי autoclaving אותו על מחזור נוזלי ב 121 ° C, 15 psig, לפחות 30 דקות.
- לאחר autoclave, לאפשר את המדיום כדי להתקרר ל 55 ° C. לאחר מכן, הוסף 12.5 מ"ל של 1 M KPi, 500 μL של 1 M MgSO4, 500 μL של 1 M CaCl2, ו 500 μL של 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול לתמיסה.
- באמצעות טכניקה סטרילית, יוצקים 10 מ"ל של המדיום מוכן בשלב 1.2.2 לתוך כל צלחת 60 מ"מ (50 בסך הכל). השאירו את הצלחות עם המדיה למשך 30 דקות לפחות כדי להתמצק. פיפטה 300 μL של תרבית חיידקים שגדלה בלילה למרכז הצלחת ומשאירה את הצלחת על הספסל. הניחו לתרבית להתייבש ולגדול סמיך במשך 1-2 ימים. אחסנו את לוחות הגז הטבעי הנוזלי האלה עם חיידקים בטמפרטורה של 4°C.
- הכנת תערובת קדם-תערובת lmNGM
- בבקבוק Erlenmeyer 250 מ"ל, לשלב 2 גרם של agarose נמס נמוך, 0.25 גרם של peptone, 1 מ"ל של 3 M NaCl, ו 99 מ"ל של מים טהורים במיוחד. Autoclave את הפתרון ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות.
- Aliquot 10 מ"ל של lmNGM לתוך מבחנות לכסות עם Parafilm כדי למנוע אובדן של נוזלים. מכסים את הצינורות ומאפשרים להם להתקרר ולהתמצק.
- הכינו 85 מ"מ NaCl למזון חיידקי: בבקבוק של 100 מ"ל, ערבבו 515.61 מ"ג NaCl ומלאו עד 100 מ"ל במים טהורים במיוחד. Autoclave ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות.
- הכינו גבישי פוליאקרילאמיד סופגי מים על ידי המסת 1 גרם של פולימר סופג במיוחד מסוג S ב-150 מ"ל מים אולטרה-טהורים בבקבוק סחיטה הניתן להרכבה. חתכו את הקצה כדי להבטיח גודל חלוקה מתאים. Autoclave ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות, מכסה עם tinfoil, ולנער כדי לערבב את הגבישים.
- הכינו תמיסת חומרי ניקוי על ידי שילוב של 3 מ"ל של 100% Tween-20 עם 7 מ"ל מים אולטרה-טהורים בבקבוקון חרוטי של 15 מ"ל.
- הכינו 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול על ידי שילוב של 2.5 גרם כולסטרול, 275 מ"ל של 100% EtOH ו-25 מ"ל מים אולטרה-טהורים בבקבוק של 500 מ"ל.
- הכן תמיסת עבודה של חומצה פלמיטית
- טוחנים 500 מ"ג של חומצה פלמיטית מוצקה במכתש ומזיק ומשלבים אותו עם 15 מ"ל של טווין-20 בבקבוקון חרוטי של 50 מ"ל. מערבבים על ידי מערבולת, וממיסים כמה שיותר גבישים.
- מוסיפים 17.5 מ"ל של 100% אתנול ומערבלים את התמיסה כדי להמיס כמה שיותר חומצה פלמיטית.
- מוסיפים 17.5 מ"ל מים טהורים במיוחד ומערבולות בקפדנות. מחממים בעדינות את התמיסה באמבט חרוזים ב 80 מעלות צלזיוס עד שהחומצה הפלמיטית מתמוססת לחלוטין. חומצה פלמיטית מסוימת עשויה לזרז במהלך הקירור.
- הכינו מרק ליזוגני (LB) על ידי ערבוב של 20 גרם אבקת LB ב-1 ליטר מים נטולי יונים, בכוס של 1 ליטר ומעלה. Aliquot 500 מ"ל של המרק לתוך שני 500 מ"ל beakers. Autoclave את המרק ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות. אחסנו את המרק המוכן ב-RT.
- הכנת צלחות אגר מרק ליזוגני (LB)
- יש לערבב 10 גרם אבקת LB ו-7.5 גרם אגר Bacto ב-500 מיקרוליטר מים נטולי יונים, בבקבוק של 1 ליטר. Autoclave את הפתרון על מחזור נוזלי ב 121 ° C, 15 psig, במשך 30 דקות.
- אם תרצה, הוסף אנטיביוטיקה אופציונלית (500 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין) לאחר קירור המדיה autoclaved ל 55 ° C. באמצעות טכניקה סטרילית, להכין לוחות אגר LB על ידי מזיגת 20 מ"ל של מדיה לתוך כל צלחת 100 מ"מ (25 בסך הכל). אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4°C.
2. הכנת אוכלוסיית תולעים מסונכרנות גיל
- הכינו אוכלוסייה של תולעים מסונכרנות גיל שמוכנות להוסיף למיקרו-מגש בשלב הזחל 4 (L4). לחילופין, ניתן להוסיף תולעים בכל שלב בחיים (יש להוציא את FUdR ממצע המיקרו-מגש אם מוסיפים תולעים בשלב התפתחותי מוקדם יותר מ-L4 כדי למנוע מעצר התפתחותי).
הערה: יש להשלים שלב זה יומיים לפני הוספת התולעים למיקרו-מגש אם שלב חיי המטרה בתחילת הניסוי הוא L4. ניתן לכוונן את תזמון הסנכרון כדי לאפשר לתולעים להגיע לשלב החיים הרצוי. - הטמפרטורה יכולה להשפיע על תוחלת החיים. לקבלת תוצאות עקביות, השתמשו בצלחות NGM סטנדרטיות (ראו סעיף 1) כדי לשמור על C. elegans בטמפרטורה של 20°C, והעבירו תולעים לצלחות טריות אם המזון החיידקי שלהן אוזל.
- מצלחות המלאי עם תולעים בוגרות צעירות רבות, השתמשו בגישה סטנדרטית כדי ליצור אוכלוסייה מסונכרנת גיל, לרוב הלבנהשל 20 או הטלת ביצים מתוזמנת21.
- בודדו את הביצים והוסיפו אותן לצלחת NGM מנומרת חיידקים. אם משתמשים בסוג בר C. elegans, הביצים יבקעו וייצרו תולעים, ויגיעו לשלב הזחל L4 תוך יומיים.
3. הכנת תרבית חיידקים
- יום לפני תחילת הניסוי, יש לחסן את מקור המזון החיידקי הרצוי. הכינו ~ 5 מ"ל של תרבית חיידקים לצלחת.
הערה: ניתן להכין את פס החיידקים עד חודש מראש ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C עבור מקור מזון E. coli.- פזרו חיידקים למושבות בודדות על צלחת האגר LB ממלאי גליצרול קפוא.
- הגדל את התרבית ב 37 ° C בן לילה.
- חסן מרק LB נוזלי עם מושבה אחת לכל חיסון.
- יש לנער ב~250 סל"ד ב-37°C למשך 12-16 שעות.
4. מריחת ציפוי חומצה פלמיטית על מגש מיקרו
הערה: חומצה פלמיטית משמשת כמחסום מרתיע למניעת בריחת בעלי חיים מהבארות הבודדות. הציפוי מוחל על כל המשטח התחתון של המגש, למעט המשטחים הפנימיים של הבארות. Nystatin מתווסף חומצה palmitic כדי להקל על זיהום פטרייתי. שלב זה יכול להסתיים יום אחד לפני תחילת הניסוי אם תרצה.
- כוונו את אמבט החרוזים ל-80°C כדי לאפשר זמן להתחמם מראש.
- מיד לפני השימוש, aliquot 1 מ"ל של תמיסת עבודה חומצה palmitic לכל microtray לתוך מיכל סטרילי נפרד (בדרך כלל בקבוקון חרוטי 15 מ"ל) ולהוסיף 4 μL של 10,000 יחידות / מ"ל nystatin לכל 1 מ"ל של תמיסת חומצה palmitic לפני חימום.
- רססו בתוך מגש המיקרו ומחוצה לו אתנול (70% ומעלה) לרוויה ונערו את עודפי האתנול.
הערה: שאריות אתנול אמורות להתאדות במהלך הטיפול בקרוסלינקינג UV (שלב 4.4). - השתמש crosslinker UV כדי לעקר את microtray (ההוראות הבאות הן עבור crosslinker UV המשמש במחקר זה):
- הניחו את מגש המיקרו והמכסה בקרוסלינקר UV בנפרד (כלומר, אל תניחו את המכסים על הלוחות, מכיוון ש- UV אינו חודר לפלסטיק).
- סגור את הדלת והפעל את קרוסלינקר UV.
- הקש זמן, הזן 20 דקות ולאחר מכן הקש התחל.
- לאחר 20 דקות, הפוך את הצלחת והמכסה וחזור על שלבים 4.2.2-4.2.3.
- בעת לבישת כפפות, הניחו את העפעפיים על מגש המיקרו כדי למנוע זיהום לאחר עיקור.
- מערבבים היטב את תמיסת העבודה של חומצה פלמיטית על ידי ערבול והפוך.
- מניחים את בקבוקון החרוט 15 מ"ל עם תמיסת העבודה חומצה פלמיטית באמבט החרוזים ומאפשרים לכל הגבישים הנראים לעין להתמוסס לחלוטין לפני השימוש.
- הניחו את מגש המיקרו על המדף המקיף את אמבט החרוזים עם המכסים למשך ~2 דקות להתחמם.
- הסר את מכסה מגש המיקרו. הוסף באיטיות 200 μL של תמיסת עבודה חומצה פלמיטית על פני הקיר האחורי (הצד הארוך) של מגש המיקרו. החלף את המכסים ותן למגש המיקרו לשבת על אמבט החרוזים למשך 2-3 דקות כדי לאפשר לתמיסת החומצה הפלמיטית לשקוע על פני תחתית המגש.
הערה: בעוד החלק התחתון המלא של מגש המיקרו לא יהיה מצופה לחלוטין עד שלב 4.10, התמיסה צריכה להתפשט באופן שווה על פני יותר ממחצית המשטח התחתון. אם תמיסת החומצה הפלמיטית אינה מתפשטת באופן שווה, הפעל מערבולת או מנוע רוטט ליד המגש. זה יספק כמות קטנה של רטט שיכול לעזור לאפשר לתמיסת החומצה הפלמיטית להתפשט ביתר קלות. שמור את מכסי המגש הזעיר במקומם כדי להפחית את הזיהום. - חזור על שלב 4.8.
הערה: כמחצית או יותר מתחתית מגש המיקרו צריכה להיות מכוסה באופן גלוי בחומצה פלמיטית נוזלית. - סובב את מגש המיקרו ב- 180° וחזור על שלבים 4.8 ו- 4.9 בצד השני של המגש.
הערה: תחתית מגש Terasaki תכוסה רק בשכבה דקה של תמיסת חומצה פלמיטית לאחר הוספת הנפח המשולב המלא לשני הצדדים (שלבים 4.9 ו-4.10). תערובת חומצה פלמיטית פחות או יותר עשויה להידרש בהתאם להכנת התערובת, הטמפרטורה וגורמים אחרים. בדרך כלל, בין 400 ל 800 μL של תערובת חומצה palmitic יהיה מספיק כדי לצפות את כל החלק התחתון של microtray. ברגע שתחתית המגש מכוסה באופן גלוי, אין להוסיף חומצה פלמיטית נוספת, מכיוון שהדבר עלול לזהם את הבארות. - יבשו את המגש בקופסת ייבוש סטרילית או במכסה מנוע זרימה למינרית למשך שעה לפחות ללא כיסוי. לחלופין, השלימו שלב זה יום לפני טעינת הצלחות (סעיף 5), וייבשו את מגש המיקרו עם המכסה על RT למשך 16 שעות לפחות.
5. טעינת המגש במצע גידול נמטודות נמזה נמוכה (lmNGM)
הערה: שיטה זו משתמשת ב-NGM סטנדרטי מעורבב עם אגרוז בעל המסה נמוכה במקום האגר הרגיל. אגר יכול להתחיל ג'ל ב 45 מעלות צלזיוס. כאשר עובדים עם הנפחים הקטנים הדרושים למילוי בארות המגש, ה-NGM מבוסס האגר סותם לעתים קרובות את קצה הפיפטה ו/או מייצר משטחי באר לא אחידים עקב ג'לינג מהיר. NGM באמצעות אגרוז נמס נמוך מתחיל ג'ל ב ~ 28 ° C, המאפשר את המדיה המותכת להיות pipeted בקלות וליצור באופן עקבי משטחי באר שטוחים. הכינו lmNGM באותו יום שבו יש להניח את התולעים על מגש המיקרו. אם תכינו את מגש המיקרו עם lmNGM, זריעה עם חיידקים ותעמיסו את ה-C. elegans באותו היום, ודאו שבעלי החיים נמצאים בגיל הרצוי או קרוב אליו לפני תחילת סדרת השלבים הזו.
- הניחו כיור פיפטה באמבט חרוזים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס כדי להתחמם.
- יש להמיס תערובת אחת של 10 מ"ל lmNGM לכל מגש מיקרו מוכן (שלב 1.1) במיקרוגל למשך ~30-45 שניות.
- הניחו את המבחנות לערבוב מקדים lmNGM בכד של 200 מ"ל, חשופות כדי שלא יתהפכו.
- לאחר ~10-15 שניות, או כאשר התערובת המקדימה lmNGM רק מתחילה לבעבע, עצרו את המיקרוגל, מזגו את התערובת המקדימה lmNGM לתוך סטרילית של 200 מ"ל, והמשיכו במיקרוגל.
- יש להשהות לפי הצורך כדי למנוע ממנו לרתוח, ולערבב.
- הפסיקו להשתמש במיקרו ברגע שכל ה-lmNGM הפך לנוזל ללא גושים.
הערה: aliquot אחד 10 מ"ל מספיק כדי למלא סך של 192 בארות (שני microtrays).
- הכן lmNGM על ידי הוספת הרכיבים הבאים בסדר המפורט לאגרוז החם הנמס נמוך (נפחים הם לכל 10 מ"ל של אגרוז נמס נמוך): 250 μL של 25 mM KPi (pH 6), 10 μL של 1 M CaCl2, 10 μL של 1 M MgSO4, ו 10 μL של 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול
- אם החוקר מתכנן לבחון בעלי חיים בוגרים לאורך זמן וצריך למנוע רבייה, להוסיף גם 10 μL של 50 mM FUdR.
- אם אתם עורכים ניסוי הזנת RNAi באמצעות זן HT115 RNAi E. coli הנפוץ ופלסמידים RNAi הקשורים אליו, הוסיפו גם 5 μL של 50 mg/mL carbenicillin (כדי לבחור את פלסמיד RNAi) ו-12 μL של 1 mM IPTG (כדי לגרום לביטוי של RNA דו-גדילי מפלסמיד RNAi).
הערה: ניתן לכלול תוספים נוספים בהתאם לאנטיביוטיקה הסלקטיבית וכימיקלים אחרים הדרושים למקור המזון הרצוי. תרופות או גורמי עקה כימיים יכולים גם להיות מתווספים lmNGM בשלב זה. NGM ו-lmNGM מכילים את אותו ריכוז סופי של NaCl אך נבדלים באופן שבו NaCl מתווסף למדיה. עבור NGM, כל NaCl מתווסף במהלך הכנת המדיה (שלב 1.2). עבור lmNGM, חלק של NaCl מתווסף במהלך הכנת מדיה (שלב 5.3) וחלק עם מזון חיידקי (סעיף 6). הסיבה לשינוי זה נובעת מנפח המדיה הקטן בכל מגש מיקרו. הוספת 5 μL של חיידקים מרוכזים המרחפים ב- LB לבאר המכילה 20 μL של מדיה תשנה באופן משמעותי את ההרכב התזונתי של המדיה (על ידי הוספת רכיבי LB בנפח דומה). כדי להימנע מכך, החיידק מושהה מחדש בתמיסה של NaCl כדי להסיר את רכיבי LB תוך מניעת לחץ אוסמוטי על החיידקים. ה-NaCl שמוסיפים למדיה מצטמצם בהתאם כדי להסביר את המלח שמוסיפים לחיידקים.
- יוצקים lmNGM לתוך אגן פיפטה מחומם.
- עם מגש המיקרו על ספסל, פיפטה 20 μL של lmNGM לתוך כל מגש מיקרו. כסו את מגש המיקרו בעת מילוי פיפטה כדי למזער את הזיהום.
הערה: שלב זה קל יותר עם פיפטה חוזרת אלקטרונית.
6. זריעת בארות microtray עם מזון חיידקי
הערה: 5 מיקרוליטר של מזון מרוכז פי 10 מתרבית מחוסנת לילה מספיקים כדי להאכיל C. elegans אחד במשך כל תוחלת החיים שלו.
- מעבירים את החיידקים מתרבית הלילה לבקבוקון חרוטי של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה ב~3,500 x גרם למשך 20 דקות.
- הסר את supernatant. להשהות מחדש את תרבית החיידקים בריכוז של פי 10 (1/10 נפח מהתרבית המקורית) עם תמיסת NaCl של 85 mM.
- לפני הוספת חיידקים לבארות, בדקו ויזואלית את מגש המיקרו כדי לוודא שה-lmNGM המוצק מוכל במלואו בתוך כל באר. אם lmNGM כלשהו תלוי בצד של באר, לגרד את lmNGM עודף עם קצה פיפטה. מדיה עודפת זו עלולה לגרום למזון להיתקל בחומצה פלמיטית אם לא מסולקים.
- יש למרוח בזהירות פיפטה 5 μL של תרבית חיידקים מרוכזת פי 10 על פני השטח של lmNGM בכל באר. נסו להימנע מלאפשר לתרבית החיידקים לדרוס את צד הבאר אל תוך החומצה הפלמיטית, שכן הדבר ימשוך תולעים לעזוב את הבאר.
- הניחו למגשי המיקרו להתייבש בקופסת ייבוש סטרילית או במכסה מנוע זרימה למינרית למשך ~35 דקות. בדוק כל ~ 5 דקות והיזהר לא לייבש יתר על המידה. הסר כאשר כמה בארות רטובות מעט באופן גלוי, מכיוון שהבארות יתייבשו עוד יותר בזמן הוספת הנמטודות.
7. סוגרים כל מגש מיקרו בתוך צלחת בעלת באר אחת
הערה: בחלק זה, מגש המיקרו מותקן בתוך לוח סטנדרטי בעל באר אחת באמצעות תוספת מותאמת אישית המודפסת בתלת-ממד ומוקף בגבישים סופגי מים. הצלחת בעלת הבאר הבודדת נסגרת ונאטמת באמצעות Parafilm. זה מאפשר חילופי חמצן תוך מניעת זיהום ושמירה על לחות מספקת כדי למנוע את התייבשות lmNGM במהלך ניסויים של מספר שבועות (ניסויים בתולעים יכולים להימשך 6-8 שבועות אם בוחנים מוטציות מאריכות חיים או תנאים סביבתיים). במהלך ההכנה, הקפד לכסות את הצלחת בכל פעם שמשהו לא נוסף באופן פעיל כדי למזער זיהום חיידקי או פטרייתי.
- יש לעקר לוח בעל באר אחת ומתאם ומכסה מודפסים בתלת-ממד על-ידי טבילת כל אחד מהם בתמיסת אקונומיקה של 10%. יש לשטוף היטב במים סטריליים DI. נגבו לייבוש במגבון משימה.
- רסס את הצלחת בעלת הבאר היחידה ואת המתאם המודפס בתלת-ממד ואת המכסה בתמיסת אתנול של 70% או יותר ונגב באמצעות מגבון משימה. הניחו לכל שאריות אתנול באוויר להתייבש.
הערה: ניתן להשתמש בקרינת UV גם לאחר אקונומיקה ואתנול עם אותם פרמטרים כמו מגש המיקרו, כמתואר לעיל בשלב 4.4. - הניחו את העלון הסטרילי המודפס בתלת-ממד בתוך צלחת סטרילית בעלת באר אחת.
- לעקר את החלק החיצוני של microtray מוכן על ידי ריסוס אותו עם 70% אתנול.
- הנח את מגש המיקרו במתאם המודפס בתלת-ממד בלוח הבאר היחידה.
- יש להשליך את מכסה מגש המיקרו.
- יש לפזר גבישי מים בנדיבות על גבי התוספת המודפסת בתלת-ממד בין הדופן החיצונית של המגש לבין הדופן הפנימית של הצלחת בעלת הבאר היחידה.
- מיד להוסיף את התולעים (סעיף 8) או לאטום את microtray לשימוש למחרת. סגור את מכסה המגש והשתמש בחתיכה אחת של Parafilm כדי לעטוף את כל ארבעת הצדדים כדי לאטום את מגש המיקרו. חזור על שלב האיטום עם Parafilm פעמיים נוספות לקבלת שלוש שכבות בסך הכל.
- לאחר איטום מגש המיקרו, השאירו אותו על הספסל ב- RT עד 4 ימים לפני הוספת התולעים (סעיף 8).
8. הוספת תולעים למגש המיקרו
הערה: ניתן להוסיף תולעת אחת באופן ידני לכל באר על ידי העברת בעלי חיים מאוכלוסיות התולעים המסונכרנות לגיל (סעיף 2) באמצעות קוטף פלטינה. העבר בעלי חיים רק בשלב החיים הרצוי. אם תהליך ההעברה לוקח יותר מ 1 שעות, lmNGM בבארות microtray יכול להתייבש. העברת קבוצות של 10 עד 20 תולעים בכל פעם יכולה לזרז את הצעד הזה, אבל נדרש קצת תרגול כדי לשחרר באופן עקבי רק חיה אחת לכל באר.
- מוסיפים נמטודה אחת לכל באר ברגע שהם מגיעים לשלב החיים הרצוי.
- הניחו את המכסה בחזרה מעל מגש המיקרו בעת בחירת תולעים מצלחת המקור כדי למזער את הזיהום.
9. סיום הכנת סביבת התרבות לשימוש ארוך טווח
הערה: השלבים הבאים מבוצעים כדי להבטיח שהמדיה והתולעים במגש המיקרו יישארו רוויות לחות למשך הניסוי.
- הוסף ~ 40 μL של תמיסת חומר הניקוי למכסה של צלחת בעלת באר אחת והשתמש במגבון משימה כדי לצפות את המכסה באופן שווה. ציפוי זה ימנע עיבוי לאורך זמן לאחר אטימת הצלחת. השתמשו במגבוני משימה נוספים כדי לפזר את תמיסת חומרי הניקוי עד שהראייה דרך המכסה אינה מעוותת (זה בדרך כלל לוקח בערך שני מגבוני משימה).
- בדקו את גבישי המים כדי לוודא ששניהם ישרים עם הקצה העליון של מגש המיקרו ולא עולים על גדותיהם. במידת הצורך, הוסיפו או הסירו גבישי מים לצלחת.
- באמצעות הגישה הבאה, עטוף את המגש עם Parafilm (שלושה חלקים בסך הכל) כדי להבטיח כי חותם Parafilm יחזיק מעמד לטווח ארוך.
- מתחו מעט את החתיכה הראשונה של Parafilm כדי לכסות שני צדדים של המגש.
- מותחים מעט את החתיכה השנייה של Parafilm ומכסים את הצדדים הנותרים של המגש.
- מתחו את החתיכה האחרונה של Parafilm ועטפו לחלוטין את כל ארבעת הצדדים של המגש, תוך כיסוי החתיכות הראשונה והשנייה של Parafilm. מגש מיקרו אטום כראוי יכול להישאר hydrated במשך ~ 2 חודשים.
הערה: יש לעקוב אחר תקינות הפרפילם כל שבוע-שבועיים במהלך הניסוי, ולהחליף לפי הצורך. - נגבו את החלק העליון של המגש במגבון משימה, לח עם 70% אתנול, כדי להסיר טביעות אצבע.
- תייגו את הצלחת בעלת הבאר הבודדת באמצעות סרט הדבקה. מגש המיקרו מוכן כעת להדמיה ולאחסון לטווח ארוך כדי לנטר תולעים לאורך זמן. בין הפעלות הדמיה, שמור על המגש בטמפרטורה של 20°C. ניתן לפתוח ולאטום מחדש את מגש המיקרו מספר פעמים לצורך מינון תרופות או הליכים אחרים, אך יש למזער אותו כדי למנוע זיהום ואובדן לחות.
10. הדמיה של תולעים בודדות בבארות מיקרוטרייד
הערה: מטרת פרוטוקול זה היא לספק תיאור מפורט של אופן הכנת סביבת תרבית המיקרו-מגש. לאחר שהוכנו ואוכלסו בתולעים, ניתן להשתמש בסביבות תרבית התולעים הבודדות של מיקרו-מגש כדי לנטר לאורך פנוטיפים רבים באמצעות טכניקות שנקבעו לתרבית סטנדרטית על לוחות פטרי. הסעיף הבא מספק הוראות בסיסיות למדידת כמה פנוטיפים נפוצים. הדמיה פלואורסצנטית חייבת להתבצע במיקרוסקופ זקוף. שבירת האור דרך מגש Terasaki ממוזערת בחדר חשוך.
- תוחלת חיים: מדדו את תוחלת החיים על ידי הקשה עדינה על הצד או החלק העליון של הצלחת או הקרנת אור כחול בוהק על הצלחת והתבוננות בכל חיה. ציון בעל חיים "מת" אם הוא לא זז בתוך כמה שניות. חזור על משימה זו כל 1-3 ימים עד שכל התולעים מתו.
הערה: סביבת תרבית המגש הזעיר תואמת למערכות שהופכות איסוף וניתוח תמונות לאוטומטיים לצורך הערכת תוחלת חיים14,19. - מיקרוסקופיה סטנדרטית: בצע הדמיה בשדה בהיר (או שדה כהה) על בארות בודדות או על המגש כולו באמצעות מצלמה או סורק ברזולוציה גבוהה. נתוני הדמיה אלה יכולים לשמש למגוון פנוטיפים, כולל גודל בעלי חיים 22,23,24, התפתחות 25, פעילות14,19 ותוחלת חיים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית: בצע הדמיה פלואורסצנטית על בארות בודדות באופן ידני או באמצעות מערכת פלטפורמה ממונעת. מגשי הבאר הבודדת תואמים למתאמי צלחת מרובי בארות סטנדרטיים. אות לרעש ממוזער אם המכשיר ממוקם בתיבה עם קירות שחורים.
הערה: מכיוון שהתולעים מצולמות תוך שמירה על חופשיות לזחילה, מערכת תרבית זו מתאימה היטב להדמיה ברזולוציה נמוכה כדי ללכוד פלואורסצנטיות של כל הגוף ולוקליזציה של רקמות גסות של פלואורופורים. הדמיה ברזולוציה גבוהה ובהגדלה גבוהה דורשת בדרך כלל לשתק את בעלי החיים כדי למנוע תנועה. בעוד שניתן יהיה למרוח באופן מקומי חומר משתק (למשל, נתרן אזיד או לבמיסול) על כל באר ולהמשיך בהדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, זה ימנע מדידות חוזרות ונשנות של אותה תולעת בנקודות זמן מאוחרות יותר. גם מערכת התרבית, כמתואר, אינה מיועדת להיות הפוכה, מה שמונע שימוש במערכות מיקרוסקופ הפוך.- אם שדה בהיר אינו מנוצל למדידת תוחלת החיים ורק פלואורסצנטיות נלכדת, מדוד את תוחלת החיים באופן ידני. השארת האור הכחול (המשמש לעירור GFP) על התולעת למשך 5 שניות תנחה את החיה לזוז. אם בעל החיים לא זז בתוך 5 שניות, לשקול את החיה כמתה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סביבת תרבית התולעת הבודדת המבוססת על מיקרו-מגש המתוארת כאן יכולה לשמש לניטור מגוון פנוטיפים, כולל תוחלת חיים ותוחלת בריאות, פעילות ותנועה, צורת גוף וגיאומטריית זחילה, וביטוי של סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים המתבטאים באופן טרנסגני בבעלי חיים בודדים לאורך זמן. מערכת תרבית המגש הזעיר תואמת לניתוח תוחלת חיים באמצעות ניקוד ידני או איסוף תמונות וניתוח הדמיה במורד הזרם. בדומה לתרבית סטנדרטית על לוחות פטרי21, ניתן לדרג תולעים באופן ידני כמתות או חיות בהתבסס על תנועה בעקבות גירוי (למשל, הקשה על הצלחת או חשיפה לאור כחול). עבור ניתוח תוחלת חיים מבוסס תמונה, השוואה של הבדלים בין מסגרת למסגרת בין תמונות שצולמו לאחר הפעלת הגירוי משמשת כדי לקבוע מתי כל תולעת מפסיקה לנוע. זה תואם למערכות אוטומטיות לאיסוף וניתוח תמונות ומספק נתונים נוספים בצורה של רמת הפעילות של בעלי חיים בודדים בכל נקודת זמן. מידע זה יכול לשמש לא רק כדי להעריך את תוחלת החיים (הפסקת תנועה), אלא גם את תוחלת הבריאות (סף של פעילות מופחתת; הוצעו הגדרות מרובות). פרמטרים נוספים (גודל גוף, צורה ויציבה) ניתן למדוד גם מתמונות אלה.
המאפיינים העיקריים של מערכת תרביות מיקרו-מגש זו הם: (1) היכולת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן, (2) התאימות בין מערכת התרבית לבין התערבויות מרתיעות כמו הגבלה תזונתית או גורמי עקה כימיים, ו-(3) היכולת למדוד פלואורסצנטיות ישירות בסביבת התרבית. כדי להדגים את התכונות האלה, חשפנו תולעים ל-250 מיקרומטר נחושת גופרתית (CuSO4) כדי לגרום לעקה של מתכות כבדות, או לדיתיותרייטול (DTT) של 10 מילימטר כדי לגרום לעקה של קיפול שגוי של חלבונים, ומדדנו את הפעילות היומיומית, את תוחלת החיים ואת תוחלת הבריאות. גם CuSO4וגם DTT הפחיתו באופן משמעותי את תוחלת החיים של התולעים (איור 2A). ניטור הפעילות היומיומית איפשר לנו להעריך את תוחלת הבריאות האישית של כל תולעת, המוגדרת כאן כגיל שבו התולעת כבר לא יכולה להזיז אורך גוף מלא בתגובה לגירוי. CuSO4 ו-DTT הפחיתו את תוחלת הבריאות בהשוואה לבקרות שלא טופלו (איור 2B). לעומת זאת, CuSO4 הפחית את שיעור החיים בבריאות טובה, בעוד DTT לא (איור 2C). CuSO4 גם הפחית את הפעילות הממוצעת בין פרטים באוכלוסייה במידה רבה יותר מאשר DTT בכל הגילאים (איור 2D), כמו גם פעילות מצטברת עבור כל חיה לאורך תוחלת החיים (מחושב כשטח מתחת לעקומת הפעילות [AUC]; איור 2E). יתרון חשוב של מערך מיקרו-מגש זה הוא יכולתו לתאם פנוטיפים שנמדדו בנקודות זמן שונות בין בעלי חיים בודדים בתוך אוכלוסייה. במקרה הזה, אנו מוצאים שהפעילות המצטברת של חיות בודדות עד היום ה-10 נמצאת בקורלציה עם תוחלת החיים של חיות מאותגרות DTT, אולם לא עבור קבוצת ביקורת לא מטופלת או חיות מאותגרות CuSO4 (איור 2F).
כדי להדגים את היכולת לנטר סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים לאורך תוחלת החיים, השתמשנו במערכת תרבית מיקרו-מגש כדי לנטר את הביטוי של טרנסגן mScarlet המאוחה למסוף C של הגן kynu-1, המקודד את האנזים kynureninase במסלול המטבולי של קינורנין, בלוקוס האנדוגני שלו. בעבר מצאנו כי ביטוי של kynureninase אנושי, המקודד על ידי Kynu, עולה עם הגיל בדם26, וכי הפלת kynu-1 ב C. elegans מספיקה כדי להאריך את תוחלת החיים27. KYNU-1 מציג ביטוי תלוי גיל; הוא כמעט בלתי ניתן לגילוי בשלב הזחל L4 ומגיע לשיאו ביום ה-9 לבגרות. נצפתה עלייה דרסטית בביטוי בין הימים 3 ל-8 של הבגרות, ויש ירידה הדרגתית עם הגיל לאחר מכן (איור 3A, תרשים משלים 1). כדי להעריך את הקשר בין הזדקנות KYNU-1 ו-C. elegans, כימתנו את השפע המצטבר של KYNU-1 עד ליום ה-14 לבגרות (גיל שבו רוב החיות היו עדיין בחיים) ומצאנו מתאם מובהק עם תוחלת החיים (איור 3B). מכיוון שביטוי KYNU1 הוא דינמי לאורך תוחלת חיים, השווינו את ביטוי KYNU-1 בגילאים שונים להישרדות הכוללת בקרב בעלי חיים בודדים. בשום נקודת זמן בודדת לא נמצא מתאם משמעותי בין ביטוי KYNU-1 להישרדות (איור 3C-F), מה שמוכיח שביטוי לאורך החיים הוא אינדיקציה טובה יותר להשפעה על תוחלת החיים מאשר הערכות של נקודת זמן בודדת.
יחד, ניסויים אלה מספקים נתונים מייצגים המדגישים את היכולות של מערכת תרבית תולעת בודדת מבוססת מיקרו-מגש לאפשר ללכוד ולהשוות שינויים דינמיים בפעילות התולעים, בבריאות, בתוחלת החיים ובסמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים לאורך גילאים בבעלי חיים בודדים. בפרט, היכולת לעקוב אחר פרטים בנקודות זמן מרובות מאפשרת לעקוב אחר שינויים דינמיים בפנוטיפים פיזיולוגיים ומולקולריים in vivo, ומאפשרת זיהוי דפוסים שלא היו נראים לעין באמצעות מדידות חתך בין אוכלוסיות.
איור 1: סביבת תרבית של מיקרו-מגש תולעת יחידה . (A) עיבוד תלת-ממדי של מיקרו-מגש המותקן בתוך לוח בעל באר אחת באמצעות מתאם מותאם אישית המודפס בתלת-ממד. (B) סכמה של מערכת תרבית תולעת בודדת המראה את המיקום היחסי של באר מיקרו-מגש עם מצע גידול נמטודות אגרוז נמזה נמס נמוך (NGM), מזון חיידקי, C. elegans מבודדים, ציפוי חומצה פלמיטית מרתיעה, מתאם מודפס בתלת-ממד, גבישי מים ולוח באר יחידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מתאם של פנוטיפים בחיות בודדות בין אוכלוסיות באמצעות סביבות של תולעת יחידה של מיקרוטריי. כל הפאנלים מספקים נתונים מניסוי שהשווה שלוש קבוצות של C. elegans מסוג פרא (N2) שנחשפו ללא תוספים (בקרה; N = 55), 250 מיקרומטר נחושת גופרתית (CuS04; N = 38), או 10 mM dithiothreitol (DTT; N = 34) החל מהיום השני לבגרות. תוחלת החיים (A) ותוחלת הבריאות (B) מופחתות שתיהן באופן מתון על ידי חשיפה כרונית ל- CuSO4 או DTT. תוחלת בריאות מוגדרת כיום האחרון שבו בעל חיים יכול להזיז לפחות אורך גוף מלא אחד על הצלחת. המשמעות הזוגית מחושבת באמצעות מבחן log-rank (הפונקציה R survdiff). (C) תוחלת הבריאות ותוחלת החיים הממוצעת בכל אוכלוסייה (למעלה: ערכים מוחלטים; למטה: מנורמל לתוחלת החיים הממוצעת של כל קבוצה). (D) פעילות תולעים ממוצעת (ממוצע מתגלגל של 3 ימים של פעילות יומית) בתוך כל קבוצה לאורך תוחלת החיים, ו-(E) ממוצע האוכלוסייה של אזור בעלי החיים הבודדים תחת עקומת פעילות החיים (AUC) שניהם נפגעים באופן משמעותי על ידי CuSO4 או DTT. משמעות שנקבעה על ידי מבחן Mann-Whitney U להשוואת AUC עבור בעלי חיים בודדים בין קבוצות. (F) פעילות מצטברת של בעלי חיים בודדים עד היום ה-10 (למטה) מתואמת עם תוחלת החיים של בעלי חיים שנחשפו ל-DTT, אך לא עבור חיות ביקורת או בעלי חיים שנחשפו ל-CuSO4, כפי שנקבע על ידי רגרסיה ליניארית (פונקציית lm ב-R). n.s. = לא משמעותי, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. שיטת בונפרוני שימשה להתאמת כל ערכי p להשוואות מרובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות דינמי של KYNU-1 ב-C. elegans בודדים לאורך תוחלת החיים. C. elegans עם mScarlet שהתמזגו באופן טרנסגני בתוך הפריים ל-C-terminus של הגן kynu-1 (KYNU-1::mScarlet) צולמו באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המצויד במצלמה מונוכרומטית כל 1-4 ימים במשך 36 ימים עד שכל בעלי החיים מתו. (A) KYNU-1, כפי שנמדד על ידי כימות יומי של KYNU-1::mScarlet fluorescence, מראה דפוס ביטוי תלוי גיל מובהק לאורך תוחלת החיים (ערך ממוצע על פני תולעים מוצג בכל גיל). (B) הביטוי המצטבר של KYNU-1::mScarlet עד היום ה-14 של הבגרות נמצא בקורלציה עם תוחלת החיים של בעלי חיים בודדים. KYNU1::mביטוי ארגמן בשלב (C) L4 של הזחל (יום 0 של בגרות), (D) יום 4 של בגרות, (E) יום 9 של בגרות, ו (F) יום 15 של בגרות לא היה בקורלציה עם תוחלת החיים של בעלי חיים בודדים. מתאמים המחושבים על-ידי רגרסיה ליניארית (פונקציית רגרסיה של ניתוח נתונים ב- Microsoft Excel). n.s. = לא משמעותי, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. כל ערכי ה-p הותאמו להשוואות מרובות בשיטת בונפרוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: סינגל KYNU-1::mScarlet C. elegans שצולם לאורך תוחלת החיים תחת ערוץ אדום. באר בודדת של מגש מיקרו טרומי המכיל C. elegans יחיד עם mScarlet מתויג KYNU-1 חי על מקור מזון מרוכז E. coli. החיה צולמה תחילה בשלב הזחל L4 ולאחר מכן צולמה במרווחים של 1-5 ימים למשך שארית חייה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: מגש טרסאקי לעומת רקע וורמוטל והשוואת ממצאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בארות של מיקרו-מגשים טרומיים (למעלה) או PDMS WorMotels יצוקים (למטה) צולמו תחת תעלות פלואורסצנטיות GFP (A), RFP (B) ו-DAPI (C) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי המצויד במצלמה מונוכרומטית. תמונות מוצגות בצבע מזויף, ומפת חום משמשת להדגשת נקודות רוויה. לשתי מערכות התרבות יש רקע ברמה נמוכה בכל הערוצים. לוחות WorMotel מועדים לממצאים ספורדיים בעלי אותות גבוהים, שהם ככל הנראה מיקרו-בועות או אבק או חלקיקים אחרים שנלכדו בשוגג במהלך תהליך יציקת PDMS14,15. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: Microtray_adapter_2021-10-20.STL. קובץ סטריאוליתוגרפיה (STL) עבור העלון המודפס בתלת-ממד שעליו מונח מגש המיקרו בלוח הבאר היחידה. קובץ זה מכיל את הגרסה המלאה עם תחתית מוצקה והוא מתאים ביותר לשימוש במערכת שבה מקור האור נמצא מעל הצלחת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: Microtray_adapter_bottomless_2021-10-20.STL. קובץ סטריאוליתוגרפיה (STL) עבור העלון המודפס בתלת-ממד שעליו מונח מגש המיקרו בלוח הבאר היחידה. קובץ זה מכיל את הגרסה ללא תחתית והוא המתאים ביותר לשימוש במערכת שבה מקור האור נמצא מתחת ללוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים מערכת תרבית חדשנית המתאימה מיקרו-מגשים, שפותחה במקור עבור בדיקות הקלדת רקמות אנטיגן לויקוציטים אנושיים, כדי לאפשר בידוד ואפיון של C. elegans בודדים לאורך זמן בסביבת מדיה מוצקה הדומה מבחינה קונטקסטואלית ל- NGM מבוסס אגר שהוא הסטנדרט במחקר C. elegans. מערכת זו תואמת למגוון התערבויות, כולל הגבלה תזונתית, טיפול תרופתי אקסוגני, אתגר עם גורמי עקה כימיים או סביבתיים ו-RNAi. זה גם מאפשר ניטור אורך של סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים in vivo בבעלי חיים בודדים. היכולת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים בתוך אוכלוסייה מאפשרת להעריך שונות תוך-אינדיבידואלית בתוך אוכלוסייה עבור פנוטיפים עם מרכיב זמני מובהק, כולל התנהגות, פתוגנזה, תגובה לתנאי עקה וירידה בבריאות. זה גם מאפשר תכונות חיים מוקדמים המשתנות בתוך האוכלוסייה להיות קשורות עם תוצאות החיים מאוחר, כולל תוחלת חיים ובריאות. בדומה לטכנולוגיות הדמיה אחרות של תולעת יחידה, מערכת תרבית מבוססת מיקרו-מגש זו מאפשרת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים בנקודות זמן מרובות במהלך החיים תוך הימנעות מגורמים מבלבלים פוטנציאליים, כגון הפעלת מסלולי תגובת עקה המתרחשים כאשר תולעים מתורבתות בסביבות נוזליות (כפי שקורה במכשירי מיקרופלואידיקה רבים). זה מאפשר לנתונים שנאספו במערכת תרבות זו להיות מושווים באופן ישיר יותר עם רוב עבודות העבר של C. elegans שנערכו על מדיה מוצקה. ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה מאפשרת אוטומציה של היבטים רבים של אפיון C. elegans, כולל גדילה, התפתחות והזדקנות28. מערכת תרבית זו, בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית ותוכנה נלווית, תואמת לאוסף אוטומטי בתפוקה גבוהה של תוחלת חיים, תוחלת בריאות, פעילות ופרמטרים פיזיולוגיים אחרים14,19.
אנו משתמשים באופן שגרתי ב- WorMotels14,15 כדי לנטר פנוטיפים פיזיולוגיים (למשל, פעילות לכל החיים), תוחלת בריאות ואריכות ימים עבור C. elegans בודדים בתנאים שאינם מלחיצים כגון טיפולים תרופתיים ו- RNAi. מניסיוננו, טכנולוגיות הדמיה אחרות של תולעת בודדת מספקות כלי מצוין לניטור שונות אינדיבידואלית בפנוטיפים אלה, אך יש להן שתי מגבלות. ראשית, בהקשר של דימות פלואורסצנטי, חומר ה-PDMS המשמש לעיצוב השבב נוטה ליצור מיקרו-בועות וללכוד חומר חלקיקי קטן, שניהם פלואורסקיים בסמוך לאורך גל הפליטה של GFP. זה יוצר ממצאים חזותיים כאשר לוחות מוצגים באופן חזותי תחת תעלות פלואורסצנטיות שונות (איור משלים 2). מגבלה שנייה היא שנחושת גופרתית אינה גורם מרתיע מספיק כדי למנוע בריחה כאשר תולעים נתונות להתערבויות שהן עצמן מרתיעות, במיוחד הגבלות תזונתיות, חיידקים פתוגניים או גורמים הגורמים ללחץ. החפיר של תצורות אחרות של תולעים בודדות צר והידרופובי מכדי להכיל חומצה פלמיטית, שהיא חומר מרתיע חזק יותר המשמש בדרך כלל לשמירה על אוכלוסיות תחת מגבלות תזונתיות או תנאים מרתיעים אחרים על צלחות פטרי.
טכניקת תרבית התולעת הבודדת המוצגת כאן מתייחסת לשתי המגבלות. גודל החפיר הגדול יותר והחומר ההידרופילי של המגשים, יחד עם יישום החום והכללת Tween 20, מאפשרים ליישם חומצה פלמיטית כמחסום מרתיע משופר סביב כל באר מבלי לזהם את רפידות lmNGM עצמן. מבנה הפוליסטירן של המגשים הזעירים מייצר רק אוטופלואורסצנטיות ברמה נמוכה ומפוזרת באופן עקבי, ונמנע מהבעיה של מיקרו-בועות אוטופלואורסצנטיות ותכלילי חלקיקים של PDMS (איור משלים 2). הן רעשי רקע והן חפצים מופחתים עוד יותר על ידי שימוש במשטח שחור מתחת ומסביב למגש כדי למזער עקיפה. אנו כוללים קובצי הדפסה תלת-ממדית הן עבור מתאם חלול (המאפשר הדמיה של שדה בהיר) והן עבור מתאם שחור מלא (המספק שדה כהה המשפר הן את השדה הכהה והן את ההדמיה הפלואורסצנטית; ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). בעוד שה-lmNGM עצמו אכן מייצר אוטופלואורסצנטיות מסוימת, ההשפעה על איכות התמונה ממוזערת על ידי נפח הבאר הקטן. גורמים אלה הופכים מיקרו-מגשים לאופטימליים להדמיה פלואורסצנטית חוזרת ונשנית של בעלי חיים בודדים in vivo מבלי להסיר אותם מסביבת התרבית שלהם. החיסרון העיקרי של מערכת תרבית אחת מיקרו-מגש ביחס לטכנולוגיות הדמיה אחרות של תולעת יחידה הוא גודל המדגם; כל מיקרו-מגש יכול להכיל עד 96 בעלי חיים בתרבית נפרדת, בניגוד לקיבולת של 240 בעלי חיים בכל WorMotel14,15. שתיהן מציעות מערכות תרבית תולעים בודדות מסוגלות, והיישום הניסיוני קובע איזו מהן מתאימה ביותר.
ישנן מספר מגבלות למערכת תרבית המיקרו-מגש. ראשית, מערכת התרביות המבוססת על מיקרו-מגשים היא גם קשה יותר וגם גוזלת זמן רב יותר להתקנה מאשר שיטות תרבית סטנדרטיות המשתמשות בצלחות פטרי. שנית, C. elegans מגורים על ידי מספר אורכי גל עירור נפוצים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. מכיוון שבעלי חיים אינם משותקים בתהליך ההדמיה, ניתן לטשטש סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים הדורשים זמני חשיפה ארוכים. אנו מוצאים כי לכידת תמונות מרובות במהלך כל נקודת זמן מספיקה בדרך כלל כדי לאפשר כימות מדויק של אות פלואורסצנטי לכל בעלי החיים. עם זאת, בשל בעיה זו, מערכת תרבית המגש אינה תואמת לדימות ברזולוציה גבוהה, כגון במיקרוסקופ קונפוקלי, ואינה אופטימלית להדמיית סמנים ביולוגיים בעלי אות נמוך. גם לאור מגבלות אלה, שיטה חדשה זו מספקת את הפוטנציאל להבין תהליכים פיזיולוגיים מורכבים עם דינמיקה תלוית זמן או שונות גבוהה מאדם לאדם בהקשר של פעילות והישרדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R35GM133588 ל- G.L.S., מענק הכשרה NIHT32GM008659 ל- L.E., פרס Catalyst של האקדמיה הלאומית לרפואה של ארצות הברית ל- G.L.S., וקרן יוזמת הטכנולוגיה והמחקר של מדינת אריזונה המנוהלת על ידי מועצת העוצרים של אריזונה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
| AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
| Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
| Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |
References
- Shaham, S.
- Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437 (2014).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
- Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).
- Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
- Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).
