Summary
ここでは、原発性月経困難症のラットを対象に、超高速液体クロマトグラフィー-高分解能タンデム質量分析(UPLC-MS/MS)を使用して、生および処理されたCyperi根腫(CR)サンプルの比較分析を示します。CR処理ラットと酢処理CR(CRV)ラットの血中濃度および試料成分の変化を調べた。
Abstract
サイペリ根腫(CR)は婦人科で広く使用されており、中国の女性の病気を治療するための一般薬です。酢で処理するとCRの鎮痛効果が高まるため、酢で処理したCR(CRV)が臨床で使用されるのが一般的です。しかし、酢加工によって鎮痛効果が高まるメカニズムは不明である。本研究では、超高圧液体クロマトグラフィータンデム質量分析(UPLC-MS/MS)技術を用いて、月経困難症のCR治療ラットとCRV治療ラットの外因性成分および代謝物の血中濃度の変化を調べました。結果は、これらのラットの血液中の15の成分と2つの代謝産物の異なるレベルを明らかにしました。なかでもCRV群の(-)-ミルテノールと[(1R,2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-1,4,7,7-テトラメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-イル]酢酸のレベルはCRV群よりもかなり高かった。CRVは、炎症促進性、血小板凝集性、血管収縮性を有する2系列プロスタノイドおよび4系列ロイコトリエンのレベルを低下させ、アラキドン酸およびリノール酸代謝および不飽和脂肪酸の生合成を調節することにより鎮痛効果をもたらした。本研究により、酢加工がCRの鎮痛効果を高めることが明らかになり、CRVの作用機序の理解に貢献できることが明らかになりました。
Introduction
原発性月経困難症(PD)は、臨床婦人科で最も一般的な状態です。それは、生殖器系における骨盤病理を伴わない月経前または月経中の腰痛、腫脹、腹痛、または不快感を特徴とする1。その有病率に関する報告は、学生の85.7%がPD2に苦しんでいることを示しました。低用量経口避妊薬が標準治療ですが、深部静脈血栓症などの副作用への悪影響が注目されています3。経口避妊薬使用者の深部静脈血栓症の有病率は女性1,000人あたり>1人であり、リスクは最初の6〜12か月と40歳以上のユーザーで最も高くなります4。
伝統的な漢方薬(TCM)で長い間使用されているCyperi根腫(CR)は、カヤツリグサ科のCyperus rotundus L.の乾燥した根茎に由来します。CRは月経障害を調節し、うつ病や痛みを和らげます5。CRは婦人科で広く使用されており、女性の病気を治療するための一般薬と見なされています6。酢で処理されたCR(CRV)は、通常、臨床的に使用されます。CRと比較して、CRVは月経の調節と痛みの緩和の増強を示します。現代の研究は、CRがシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)およびそれに続くプロスタグランジン(PG)の合成を阻害し、したがって抗炎症効果を達成することを示した。一方、CRは副作用のない鎮痛効果を示し7、月経困難症患者に適しています。しかし、CRVによる月経調節や疼痛緩和のメカニズムは不明である。CRの研究は、主にその活性化学成分の変化と、抗炎症、抗うつ、鎮痛効果などの薬理学的活性に焦点を当てています8,9,10,11,12。
TCMの成分は複雑ですが、血液に吸収され、効果を発揮するには特定の血中濃度に達する必要があります13。TCMの有効成分をスクリーニングする範囲は、血液中の成分決定の戦略を利用することによって狭めることができる。失明はin vitroで化学成分を研究することで回避することができ、個々の成分を研究することで一方的なことを避けることができます14。血液中のCRとCRVの組成を比較することにより、処理されたCRの有効成分の変化を効果的かつ迅速に検出することができる。薬効は、薬が体に影響を与えるプロセスです。薬物の作用機序に関連している可能性のある、体の代謝反応による薬物成分の変化は、メタボノミクスで決定することができます。メタボノミクスは、全体的かつ動的な代謝反応を測定することを目的としており、これは伝統的な漢方薬の全体的な有効性を決定することと一致しています15。さらに、代謝産物は遺伝子発現の最終産物であり、表現型16と最も密接に関連しています。したがって、メタボノミクスは、PDの治療におけるCRとCRVの間の代謝経路の違いを探索するのに適している可能性があります。 液体クロマトグラフィー-高分解能タンデム質量分析(LC-MS/MS)ベースの非標的メタボロミクスは、ハイスループット、高感度、高分解能を特徴とし、多くの異なる低分子成分の測定に使用できます17,18.この方法は、血液中に吸収される内因性代謝物および外因性成分を同時に決定することができる。メタボノミクスは、TCM19、薬物毒性学20、健康管理21、スポーツ22、食品23などの分野で広く使用されています。
本研究では、CR治療とCRV治療の月経困難症モデルラットで、血中に吸収される外因性成分と内因性代謝物の違いをLC-MS/MSベースのノンターゲットメタボロミクスを用いて測定し、CRVの鎮痛効果のメカニズムを明らかにしました。
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Protocol
すべての動物関連実験は、重慶中医薬研究所の実験倫理委員会の承認を得て実施した。この実験では、8〜10週齢で体重200 g±20 gの24匹の雌のSprague Dawleyラット(SD)を使用しました。
1.抽出の準備
- 計算
- CRまたはCRV抽出物を6匹の治療グループに投与することを計画します スプレイグ・ドーリーラット (10 g /[kg∙日])3日間。1 g / mLのCRまたはCRV抽出物濃度を使用してください(抽出物の1 mLは1 gのハーブから得られます)。
注:CRの投与量は6〜10 gです。この研究では、投与量として最大用量10 gを使用しました。.成人の平均体重は60kgであるため、成人の投与量は0.1667g / kgです。体重変換アルゴリズム24によれば、ヒトとラットとの間の用量変換係数が6.3であるので、ラットに対する投与量は1.05g/kgである。ラットの投与量は10倍の10.5 g / kgに増加しました。.投与量は、計算と実際の実験の便宜のために10 g / kgに設定されました。たとえば、計算では、合計36 gのCRまたはCRVが必要な場合は、漢方薬を少なくとも2回準備する必要があります。したがって、200gのCRが必要であり、CRとして100gのCRを使用し、100gのCRをCRVに加工した。 - 式 (1) を使用して、ラットあたりに適用されるCRまたはCRVの体積を計算します。
V = 10 g/(kg∙day) × 200 g/(1 g/mL) = 2 mL (1)
- CRまたはCRV抽出物を6匹の治療グループに投与することを計画します スプレイグ・ドーリーラット (10 g /[kg∙日])3日間。1 g / mLのCRまたはCRV抽出物濃度を使用してください(抽出物の1 mLは1 gのハーブから得られます)。
- CRVの処理
- CR100 gと酢20 g(酢酸>5.5 g / 100 mL)を完全に混合し、12時間インキュベートします。
注:12時間後にCRの内部が酢で湿らされるように、CRと酢を混合し、よく攪拌してから、内部が湿るまで再度攪拌しました。 - 混合物を鉄鍋で110〜120°Cで10分間炒めます。 次に、混合物を取り出し、室温で冷まします。
注意: CRの焦げ付きを防ぐために、加熱しながら継続的に攪拌する必要があります。処理されたCRVが湿りすぎている場合は、60°Cで乾燥させることができます。 CRの表面がセピア色の場合、炒め物を止めることができます。
- CR100 gと酢20 g(酢酸>5.5 g / 100 mL)を完全に混合し、12時間インキュベートします。
- 抽出
- CR抽出物
- CRに10倍(CR量)の純水を加え、2時間浸漬します。浸すときは、薬用材料が液面より下にあることを確認してください。
注:CRは、抽出する前に半分にカットするだけで済みます。浸漬の目的は、有効成分をより効果的に抽出することです。浸漬のプロセスは不可欠です。 - 水と薬の混合物を強火で沸騰させ、弱火で20分間沸騰させます。ろ布(100メッシュ)で濾過し、濾液を回収する。
注:デココクするときは、沸騰する前に高熱を使用し、沸騰を維持するために弱火を使用しました。 - ステップ1.3.1.2を1回繰り返し、ろ液を混ぜ合わせます。
- ロータリーエバポレーターで抽出物を1 g / mLまで濃縮します(元の薬に基づいて、濃縮温度は60°C未満でなければなりません)。
注意: CRの有効成分は揮発性であるため、濃縮温度は60°Cを超えてはなりません。
- CRに10倍(CR量)の純水を加え、2時間浸漬します。浸すときは、薬用材料が液面より下にあることを確認してください。
- CRV抽出物
- CR 抽出方法と同じ手順 (1.3.1.1-1.3.1.3) を実行します。
- テスト用のCR抽出物
- 500 μLのCR抽出物と500 μLのメタノールを1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットで入れ、30秒間ボルテックスして混合します。
注:メタノールと水の混合物は、活性成分をよりよく抽出します。抽出は、テストのために直接フィルタリングしないでください。 - 各サンプルを4°Cで1,6502 × g で15分間遠心分離します。 上清をろ過し、テストのためにサンプルバイアルに移します。
注:メタノールと抽出物の混合物を高速遠心分離した後、上清をサンプルボトルに直接移して、ろ過せずに測定することができます。遠心分離工程で発生する熱があるため、極低温遠心分離機を用いることが好ましい。
- 500 μLのCR抽出物と500 μLのメタノールを1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットで入れ、30秒間ボルテックスして混合します。
- テスト用のCRV抽出物
- 手順 1.3.3.1-1.3.3.2 を実行して、テスト用の CRV 抽出を準備します。
- CR抽出物
2.動物
- 計算
- 安息香酸エストラジオール50 mgを取り、それをオリーブオイル50 mLに加えて1 mg / mL溶液を調製します。50 mgのオキシトシンを取り、50 mLの生理食塩水に加えて1 mg / mL溶液を調製します。
注:安息香酸エストラジオールとオキシトシンの腹腔内注射の用量は10 mg /(kg∙day)です。.安息香酸エストラジオールはオリーブオイルに溶解し、オキシトシンは通常の生理食塩水に溶解します。安息香酸エストラジオールはオリーブオイルに溶解することが容易ではなく、溶解を促進するために超音波で治療することができます。エストラジオールベンゾエートとオキシトシンの両方の溶液を毎日調製する必要があります。 - ラットごとに適用されるエストラジオール安息香酸溶液の量を計算します(つまり、V = 10 mg / [kg∙day] × 200 g / [1 g / mL] = 2 mL)。.ラットごとに適用されるオキシトシン溶液の量を計算します(つまり、V = 10 mg / [kg∙day] × 200 g / [1 g / mL] = 2 mL)。.
- 安息香酸エストラジオール50 mgを取り、それをオリーブオイル50 mLに加えて1 mg / mL溶液を調製します。50 mgのオキシトシンを取り、50 mLの生理食塩水に加えて1 mg / mL溶液を調製します。
- 動物のグループ化と投与
注:管理25,26には10日が割り当てられました。治療中、ラットは標準的な飼料と水に無制限にアクセスできました。オキシトシン投与から30分以内に、各ラットの身もだえ活動を追跡した。PDラットモデルは、子宮収縮、片肢回転、後肢伸展、中空幹、腹部収縮を含むモデルラットのねじれ反応によって証明されるように、首尾よく開発されました26。- 24匹の雌のSprague-Dawleyラット(SDラット、8〜10週齢、体重200 g±20 g)をランダムコントロール、モデル、CR、CRVの4つのグループに割り当て、7日間給餌します。
- 動物投与
- モデル群、CR群、CRV群のラットに2mLのエストラジオールベンゾエート溶液を毎日腹腔内注射します。対照群のラットに2mLの生理食塩水を腹腔内注射する。
- 8 日目から、ステップ 2.2.2.1 を完了します。次いで、CRV群のラットにCRV抽出物2 mL、CR群のラットにCR抽出物2 mL、対照群およびモデル群のラットに2 mLの生理食塩水を胃内投与する。
- 10 日目に、ステップ 2.2.2.2 を完了します。次に、モデル群のラット、CR、およびCRV群に2mLのオキシトシン溶液を腹腔内注射し、対照群のラットに2mLの生理食塩水を注射します。
- オキシトシン注射から30分以内のラットの身もだえ時間を記録します。
- サンプル収集
- 腹部大動脈の血液サンプルを収集し、子宮を迅速かつ完全に切除し、子宮壁に付着している結合組織と脂肪を注意深く分離します。
注:血液は最終投与後1時間以内に採取されました。 - 微量遠心チューブを使用して子宮組織を保存し、液体窒素に移します。組織サンプルは-80°Cで保存します。
- 血液サンプルを4,125 × gで10分間遠心分離します。血清含有上清を除去し、16,502 × g で4°Cで10分間遠心分離する。 血清を遠心分離し、チューブに入れて-80°Cで保存します。
注:血液サンプルは、再処理のために室温で1時間放置する必要があります。
- 腹部大動脈の血液サンプルを収集し、子宮を迅速かつ完全に切除し、子宮壁に付着している結合組織と脂肪を注意深く分離します。
- サンプル処理
- 血清サンプル
- 400μLのメタノールと200μLの血清をマイクロ遠心チューブに入れ、30秒間ボルテックスして混合します。各サンプルを4°Cで16,502 × g で15分間遠心分離します。 サンプルボトルに回収・ろ過後の上清を充填します。各サンプルのすべての上清を同じ容量で混合して、テスト用の品質管理サンプルを準備します。
- 子宮組織サンプル
- 同側セグメントから100 mgの子宮組織を取り出し、9倍の量の生理食塩水で粉砕します。ホモジネートを4,125 × gで10分間遠心分離し、上清を回収します。上清を冷蔵庫に入れます 4°C テストの場合は、または同じ日にテストしない場合は-80°Cで。
- 通常の生理食塩水、組織、および鋼球を2 mLの微量遠心チューブに入れ、微量遠心管を液体窒素に3〜5秒間入れてから、組織をティッシュグラインダーに入れて粉砕します。
- 血清サンプル
- サンプルテスト
- 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、ラットサンプルの子宮組織中のPGF2α およびPGE2 含有量を測定します。
注:ラットPGE 2 ELISAキットを使用してPGE2含有量を測定し、ラットPGF 2α ELISAキットを使用してPGF2αレベルを測定しました。詳細な手順は、製造元の指示に記載されています。キットの詳細は、材料表に記載されています。 - UPLC-MS/MSを使用して、血清サンプル、CR抽出物、およびCRV抽出物を評価します。
- UPLC には、C18 カラム (2.6 μm、2.1 mm x 100 mm) を使用し、0.1% ギ酸を含む移動相 A とアセトニトリルを含む移動相 B のバイナリ グラジエント法を使用します。溶出勾配を次のように設定します:0分から1分、15%B;1分から8.5分、15%から85%B。8.5分から11.5分、85%B;11.5分から11.6分、99%から1%B。11.6分から15分まで、15%B.流量を0.35 mL/分、注入量を2 μLに設定します。
- MSの場合、温度を600°C、カーテンガス(CUR)流量を0.17MPa、シースと補助ガスの両方の流量を0.38MPaに設定します。正イオンモードとマイナスイオンモードのイオンスプレー電圧をそれぞれ5.5kVと−4.5kVに、デクラスタリング電位(DP)電圧を80Vまたは−80Vに、衝突エネルギー(CE)を40eVまたは−25eVに、衝突エネルギー重ね合わせ(CES)を35eV±15eVに設定する。
- UPLC-MS/MSを使用してメーカーのプロトコルに従ってテストを実行します。 50〜1,000 m / zの質量範囲でMSを実行します。
- マッチングワークステーションプログラムと、検出モードの情報依存型集録、複数の質量欠陥フィルタ、ダイナミックバックグラウンド控除を組み合わせて、UPLC-MS/MSの結果を取得します。プール血清の品質管理サンプルを使用して、UPLC-MS/MS装置の再現性と安定性をテストし、従来のアプローチを検証します。研究サンプルの前に、品質管理サンプルを4回連続して注入し、5つの血清サンプルごとに注入します。
- 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、ラットサンプルの子宮組織中のPGF2α およびPGE2 含有量を測定します。
3. データ処理
- データ準備
- 変換ソフトウェアを使用して、生データをmzXML形式に変換します。各サンプルの総イオン電流(TIC)データを正規化します。
注:XCMS上に構築された内部Rベースのアプリケーション(www.lims2.com)を使用して、統合、アライメント、抽出、およびピーク検出のための情報を分析しました27。 - 独自のMS2 データベースを使用して代謝物アノテーションを実行します(www.lims2.com)。アノテーションのしきい値を 0.328 に設定します。
注:内因性代謝産物は各グループで同定されました。.
- 変換ソフトウェアを使用して、生データをmzXML形式に変換します。各サンプルの総イオン電流(TIC)データを正規化します。
- 主成分分析と直交偏最小二乗判別分析
- 解析ソフトウェアを使用して、主成分分析(PCA)とモデリングを実行します。代謝物の標準化データを解析ソフトウェアにインポートします。次に、 自動調整 を使用して解析モデルを構築します。最後に、スコアを使用してPCAの スコア 散布図を取得します。
注:各グループのクラスタリングは、PCAのスコア散布図を使用して取得されました。PCAは、介入なしで寸法削減によってサンプルを主にグループ化する教師なし分析モードです。 - 解析ソフトウェアを使用して、直交偏最小二乗判別分析(OPLS-DA)を実行します。
- CRおよびCRVグループの代謝物に関する標準化データを分析ソフトウェアにインポートします。
- CRグループから作成したCRグループにデータをインポートし、CRVグループのデータを作成したCRVグループにインポートします。
注:OPLS-DAは教師あり分析モードであり、サンプルのグループ化が必要です。 - 次に、 自動調整 を使用して分析モデルを構築し、スコアを使用してOPLS-DAの スコア 散布図を取得します。最後に、 VIP を使用して、OPLS-DA の射影 (VIP) 値の変数有意性を取得します。
注:CRおよびCRVグループの代謝物の予測(VIP)値の可変有意性は、OPLS-DAを通じて取得されました。
- 解析ソフトウェアを使用して、主成分分析(PCA)とモデリングを実行します。代謝物の標準化データを解析ソフトウェアにインポートします。次に、 自動調整 を使用して解析モデルを構築します。最後に、スコアを使用してPCAの スコア 散布図を取得します。
- 潜在的な代謝差のある同定
- ステップ3.2.2.3でVIP値が1より大きい代謝物を選別します。
- 統計ソフトウェアを使用して、ステップ3.3.1でスチューデントのt検定によって選別された代謝物のP値を計算します。
注:CRグループとCRVグループの潜在的な差別的代謝物の有意差は、スチューデントの t検定によって決定されました。潜在的な差次的代謝物は、スチューデント のt検定 p値が0.05<、投影(VIP)の変動有意性が1より大きい代謝物でした。表現は火山プロットを使用して達成されました。
- 代謝差のある同定
- ステップ3.3で潜在的な差別的代謝物を選別します。ステップ3.1.2の結果を使用して、これらの異なる代謝物を特定します。
注:少数の潜在的な分化代謝物が同定され、それらは候補の差動代謝物になりました。 - KEGGデータベースで照合する差分代謝物をスクリーニングします。ヒートマップを描画して、CRおよびCRVグループの異なる代謝物の変化を示します。
注:少数の候補の差分代謝物がマッチングされ、それらは差分代謝物になりました。
- ステップ3.3で潜在的な差別的代謝物を選別します。ステップ3.1.2の結果を使用して、これらの異なる代謝物を特定します。
- 潜在的な代謝経路の検討
- さまざまな代謝物をメタボアナリスト(www.metaboanalyst.ca)データベースにアップロードします。
- 経路 分析 を使用して、潜在的な代謝経路を取得します。
注:潜在的な代謝経路は、CRおよびCRVグループで得られました。 P 値とインパクト値は、クリティカルパスの選択において非常に重要な2つの指標でした。 P 値は衝撃値よりも重要でした。有意性は0.05< P 値で定義した。影響値が大きいほど、相関関係が良好でした。 - さまざまな代謝物をKEGG(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)データベースにアップロードして、潜在的な代謝経路を分析します。
注:代謝経路の機能とPDの関係も考慮する必要があります。重要な代謝経路が得られた。
- 血液に吸収された成分の同定
- 社内のMS2 データベース(www.lims2.com)、ヒトメタボロームデータベース(HMDB)、およびマスバンクおよびケムスパイダーデータベースを使用して、CRおよびCRV抽出物の化学成分を特定します。
- CR群とCRV群の血液に吸収された成分を決定し、CR群とCRV群の成分を比較します。
注:血液に吸収された成分は、CRまたはCRVグループで検出する必要がありますが、コントロールグループでは検出できません。
- 統計解析
- 単変量分析(UVA)と分散分析(ANOVA)やスチューデント のt検定などの多変量統計手法を使用してデータを分析します。
注:実験情報は、統計ソフトウェアを使用して平均±標準偏差(±SD)として提示されました。 P < 0.01は非常に有意な差と見なされ、 P < 0.05は有意差を表しました28。
- 単変量分析(UVA)と分散分析(ANOVA)やスチューデント のt検定などの多変量統計手法を使用してデータを分析します。
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Representative Results
月経困難症モデル実験の解析
対照群では、これらのラットにオキシトシンと安息香酸エストラジオールを腹腔内注射して痛みを引き起こしなかったため、30分以内に身もだえする反応はありませんでした。.モデル群、CR群、CRV群のラットは、オキシトシン注射後に実質的な身もだえ反応を示した。これらの結果は、月経困難症を誘発するためのエストラジオール安息香酸塩とオキシトシンの組み合わせの有効性を示しています。モデル群と対照群の間のPGF 2α、PGE 2、およびPGF2α/PGE2レベルの差は有意であり(P < 0.001、P < 0.05)、モデルの有効性を実証しました(図1)。
図1:子宮組織中のPGF2αとPGE2含有量、および各グループの身もだえ数。 (a)各群における子宮組織中のPGF2α含量。(b)各群における子宮組織中のPGE2含量。(C)各群の子宮組織中のPGF2α/PGE2含量。(D)各グループの身もだえ番号。列は、4つのグループ(グループあたり6匹のマウス)からのSEMの平均±を表す。* P < 0.05または** P < 0.01はモデル群と比較して有意差を表し、ΔP < 0.05またはΔΔP < 0.01はCR群と比較して有意差を表す。 モデル群、CR群、CRV群のラットは、オキシトシン注射後に実質的な身もだえ反応を示した。略語:PG =プロスタグランジン;CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
PGF2αおよびPGF2α/PGE2の濃度はCRV群およびCR群で低下し、この減少はCRV群でより顕著であった。また、CRV群とCR群の間でPGF2αおよびPGF2α/PGE2の濃度に有意差(P < 0.001およびP < 0.05)があった。 モデル群と比較して、PGE2濃度はCRV群とCR群で有意に高く(P < 0.001)、CRV群で最もレベルが増加しました。
品質管理
BPCクロマトグラフィーピークの保持時間と品質管理サンプルのシグナル強度の間に良好な対応が観察され、高いレベルの機器の安定性と非常に一貫したデータ品質が実証されました(補足ファイル1-補足図1および補足図2)。さらに、すべての品質管理サンプルは±2標準偏差以内であり(図2A、B)、品質管理サンプル間の相関は0.7を超えていました(図2C、D)。これらの結果は、手順が信頼でき、結果が信頼できることを示唆しています。
図2:品質管理サンプルのPCA-X1次元分布。 (A)ポジティブモード、(B)ネガティブモード;(C)ポジティブモードと(D)ネガティブモードにおける精度管理サンプルの相関分析。すべての品質管理サンプルは±2標準偏差以内であり、品質管理サンプル間の相関は0.7を超えていました。これらの結果は、手順が信頼でき、情報が信頼できることを示唆しました。略語:PC =主成分。PCA = 主成分分析;品質管理;CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
主成分分析
図3に示すように、横軸PC(1)は第1主成分の得点を示し、縦軸PC(2)は第2主成分の得点を示した。図中、緑の丸は対照群、赤丸はモデル群、青丸はCR群、白丸はCRV群、ピンク円は品質管理群を示す。
図3:PCAのスコア散布図。 (A)ポジティブモードと(B)ネガティブモード。品質管理サンプルは重なり合っており、機器が非常に安定していたことを示しています。各グループは独自の領域に分散され、CRグループとCRVグループのみがパスを交差することがあります。略語:PC =主成分。PCA = 主成分分析;QC =品質管理;CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
PCA解析の結果、CR群とモデル群のクラスターは正イオンモードと負イオンモードの両方で有意に分離されていることが示されました。クラスターは、正イオンモードと負イオンモードでCRVグループとモデルグループの間で有意に分離されました。品質管理群、モデル群、および対照群は、他の治療群(CR、CRV)から分離されました。CR基とCRV基は、陽イオンモードで時折重なり合った。マイナスイオンモードでは、各基は有意に分離した。
直交偏最小二乗法判別分析
OPLS-DAは、代謝の違いをスクリーニングするために使用されました。OPLS-DA散布図は、すべてのサンプルが95%信頼区間(ホテリングのT平方楕円)内にあることを示しました。図4A,Cは、CR群とCRV群が分離されていることを示しています。モデルの過学習は順列検定(n = 200)を使用してテストされ、モデルの統計的有意性が評価されました。図4B、Dにおいて、縦軸はR2Yの値またはQ2値を示し、横軸は置換保持を示す。R2Yは緑色の点で表され、Q2は青色の四角点で表され、2本の破線はそれらに対応する回帰直線を表す。正モードおよび負モードでは、R2Y値は0.8および0.84であり、Q2値はそれぞれ−0.59および−0.57であった。これは、モデルの高い信頼性とオーバーフィッティングがないことを示しています。
図4:CRグループとCRVグループのOPLS-DAモデル。 (A)ポジティブモードと(C)ネガティブモードでのスコア散布図。CRグループとCRVグループのOPLS-DAモデルの順列検定(B)ポジティブモードおよび(D)ネガティブモード。R2Yは正モードと負モードでそれぞれ0.8と0.84であり、Q2 はそれぞれ-0.59と-0.57でした。これは、モデルの高い信頼性とオーバーフィッティング動作がないことを示しています。略語: OPLS-DA = 直交偏最小二乗判別分析;CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
単変量統計解析
代謝変動を特定するために単変量統計解析を実施した。VIP > 1およびP < 0.05の標準スクリーニングでは、339および394の電位差代謝物がそれぞれ正イオンモードおよび負イオンモードで検出された。火山プロットを図5に示し、各点は異なる代謝物に対応しています。縦軸はスチューデントのt検定のP値を示し、横軸はグループ内の各分子のレベルの複数の変化を反映しています。散布サイズは、OPLS-DA モデルの VIP 値を表します。VIP値は、スキャッターのサイズとともに増加します。赤い点は増加を示し、青い点は減少を示し、灰色は有意差がないことを示します。
候補の示差的代謝産物の定性分析は、二次質量分析を用いて行った。陽性モードの63の代謝物(補足ファイル1-補足表1)およびネガティブモードの30の代謝物(補足ファイル1-補足表2)で有意な変化が観察されました。.異なる代謝物は、KEGGおよびHDMBデータベースを使用して決定されました。正確に一致した化合物は、示差代謝産物として同定され、これらは表3および表4に列挙されている。
図5:CRグループとCRVグループの火山プロット。 (A)ポジティブモードと(B)ネガティブモード。で表される火山グラフにおいて、各点は異なる代謝物に対応する。縦軸はスチューデントのt検定のP値を示し、横軸はグループ内の各物質の複数の変化を反映しています。散布サイズは、OPLS-DA モデルの VIP 値を表します。VIP 値は、スキャッターのサイズとともに増加します。赤い点は増加を示し、青い点は減少を示し、灰色は有意差がないことを示します。略語: OPLS-DA = 直交偏最小二乗判別分析;VIP =投影における可変有意性。CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
代謝物の比較
CR群とCRV群の差分代謝物の定量値のユークリッド距離行列を計算し、網羅的相関アプローチを用いて分化代謝物をクラスタリングした。
横軸は異なる実験群を表し、縦軸は 図6の相対レベルを表す。カラーパッチの配置は、各代謝物が他の代謝物と比較してどのように表現されるかを示します。正イオンモードでは、CR群と比較して、CRV群の4つの異なる代謝産物のレベルが増加し、11の異なる代謝産物のレベルが減少した。マイナスイオンモードでは、CR群と比較して、CRV群の4つの差動代謝産物のレベルが増加し、7つの差動代謝物のレベルが減少した。
図6:CRVグループとCRグループのヒートマップ分析 。 (A)ポジティブモードと(B)ネガティブモード。横軸は異なる実験群を表し、縦軸は相対発現レベルを表す。カラーパッチの配置は、各代謝物が他の代謝物と比較してどのように表現されるかを示します。略語:CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
CRV群と比較して増加した代謝物は、スフィンゴシン1-リン酸、ノビレチン、グリセロホスホコリン、lysopc(18:1(9z))、2-ヒドロキシ-6-ペンタデシル安息香酸、9,10-エポキシオクタデセン酸、13s-ヒドロキシオクタデカジエン酸、2-メトキシエストロン、減少した代謝物は、コルチコステロン、インドール酢酸、グリココール酸、ベルベリン、フタル酸ジブチル、レチノール、ロイコトリエンB4、プロスタグランジンJ2、21-ヒドロキシプレグネノロン、ゼラノール、ホモシステイン、プロピニン酸、 ステアリン酸、ドコサヘキサエン酸、フェニルアセチルグリシン、L-フェニルアラニン、エストロングルクロニド、クエン酸などです(図7)。
図7:CRV群とCR群の潜在的代謝物の相対的なレベル傾向。 (A)ポジティブモードと(B)ネガティブモード。ポジティブモードでは、CR群と比較して、CRV群では4つの異なる代謝産物のレベルが増加し、11のレベルが減少した。ネガティブモードでは、CRV群で4つの異なる代謝産物のレベルが増加し、7つの異なる代謝産物のレベルが減少しました。列は、4つのグループ(グループあたり6匹のマウス)からのSEMの平均±を表す。* P < 0.05、** P < 0.01、または *** P < 0.01は、CRV群とCR群の有意差を表す。 略語:CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
KEGGパスウェイ解析
異なる代謝物に注釈を付け、KEGG経路を分析しました。結果は、異なる代謝産物がそれぞれポジティブモードとネガティブモードで9つの経路に関連していることを示しました(表1 および 表2)。 図8では、代謝経路はそれぞれバブルチャートのバブルで表されており、より有意なスケールはより大きな効果因子を示しています。トポロジー分析の因子に影響を与えるパスのサイズは、バブル チャートの横座標とバブル サイズで表されます。バブル チャートの縦軸とバブルの色は、エンリッチメント解析の P 値を示します (負の自然対数、つまり −ln (p)) を使用します)。濃縮度はより重要であり、 P 値はより小さく、縦座標値はより顕著であり、そして色はより暗くなる。 P 値とインパクト値は、クリティカルパスの選択において非常に重要な2つの指標です。一般に、 P 値は衝撃値よりも重要です。
図8:CRVグループとCRグループのパスウェイ分析 。 (A)ポジティブモードと(B)ネガティブモード。代謝経路は、バブルチャートのバブルでそれぞれ表されます。バブル チャートの横座標とバブル サイズは、トポロジー分析における経路影響因子のサイズを示します。バブル チャートの縦軸とバブルの色は、情報付加解析の P 値を示します。重要な代謝経路には、不飽和脂肪酸の生合成とリノール酸代謝が含まれます。略語:CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表3および表4は、フェニルアラニン代謝およびリノール酸代謝、ならびに不飽和脂肪酸、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンの生合成に有意差のある代謝経路を示す。代謝経路にはステロイドホルモン生合成、スフィンゴ脂質およびアラキドン酸代謝が含まれていましたが、月経困難症に関連する有意差はありませんでした。結果は、リノール酸代謝と不飽和脂肪酸の生合成がCRVの有効性の増強に関連する重要な代謝経路であることを示しました。
血液に吸収された成分
CRVおよびCR抽出物からの15の成分および2つの代謝産物が、CRおよびCRV群のラット血清中に検出された(表5)。17の成分すべてが陽イオンモードで見出された。
2つのグループの血液サンプルの相対構成レベルは、スチューデント のt検定を使用して比較されました。 図9 の横軸は、さまざまな実験グループを示しています。縦軸はマススペクトルの応答値を表す。大きな違いがある2つのコンポーネントがありました。分析の結果、これら2つの成分のレベルはCRグループと比較してCRVグループで上昇しましたが、15要素のレベルは有意な変化を示さなかった。
図9:CRV群とCR群の血液中に吸収された成分。 CRおよびCRV群のラット血清中のCRVおよびCR抽出物からの代謝産物は15成分および2であった。解析の結果、CRV群ではCRV群と比較して2成分の血中濃度が上昇したが、15成分の血中濃度は有意な変化を示さなかった。なかでも,CRV群の(-)-ミルテノールと[(1R,2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-1,4,7,7-テトラメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-イル]酢酸のレベルはCRV群よりもかなり高かった。* P < 0.05または** P < 0.01は、CRV群とCR群の有意差を表す。略語:CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:ポジティブモードでの代謝の違い。 略語:KEGG=京都遺伝子ゲノム百科事典;VIP =投影における可変有意性。RT = 保持時間。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:ネガティブモードでの代謝の違い。 略語:KEGG=京都遺伝子ゲノム百科事典;VIP =投影における可変有意性。RT = 保持時間。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:ポジティブモードでの代謝経路解析。 略称:KEGG=京都遺伝子・ゲノム大百科事典。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4ネガティブモードでの代謝経路分析。 略称:KEGG=京都遺伝子・ゲノム大百科事典。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表5:ラット血清中のプロトタイプ成分および代謝産物の同定。 注:M1とM2は代謝物です。その他の成分は試作品です。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:ヌードマウスの血液中に吸収された成分のBPC図およびMS2 クロマトグラム。 ポジティブモードとネガティブモードのすべての品質管理サンプルのBPC図。ラットの血液に吸収された17成分のMS2 クロマトグラム:D-カンフェン、(-)-ミルテノール、エチルパラベン、カラメネン、α-シペロン、(+)-ヌートカトン、(1R,2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-1,4,7,7-テトラメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-イル]酢酸、4-(2-(2.2.1)-ビシクロヘプチルメチル)安息香酸、10,12-ペルオキシカラメネン、(1aS,10aR)-1a,5,9-トリメチル-1a,3,6,10a-テトラヒドロオキシレノ[4,5]シクロデカ[1,2-b]フラン-10(2H)-オン、プテロシンD、過環状酸、 酢酸スジオニル、3−アセチル−13−デオキシホメノーム、イソクルクメノール、リグシペロノール、プロクルクマジオール。二次質量分析によって同定された示差的代謝物、ならびに正イオンモードおよび負イオンモードにおけるHDMBおよびKEGGデータベースも含まれる。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
TCMの多種多様で性質が異なるため、これらのハーブは臨床診療で機能しないことがあり、これはTCMの不適切な処理とデコッキングが原因である可能性があります。TCMのメカニズムは、現代の科学技術の使用により明らかになりつつあります29,30。この研究は、CRとCRVの両方がPDモデルラットで治療効果があり、CRVの治療効果がより重要であることを示しています。CRVの作用機序は、酢処理が血液に吸収されるCRの成分に影響を与え、リノール酸代謝と不飽和脂肪酸の生合成に関連している可能性があるという事実に関連している可能性があります。図10は、疼痛緩和におけるCRVの作用の潜在的な経路を示しています。
図10:CRVの鎮痛効果増強のメカニズム。 結果は、15の成分と2つの代謝産物が血中に見つかったことを示しました。なかでも, CRV群の(-)-ミルテノールと[(1R,2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-1,4,7,7-テトラメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-イル]酢酸はCRV群よりもかなり高かった。CRVは、ARAから作られた2系列プロスタノイドおよび4系列ロイコトリエンのレベルを低下させ、アラキドン酸代謝、不飽和脂肪酸の生合成、およびリノール酸代謝 の調節を介して 鎮痛効果を達成することができます。略語:ARA =アラキドン酸;COX =シクロオキシゲナーゼ;LA =リノール酸;PUFA = 多価不飽和脂肪酸;GLA = γ-リノレン酸;DGLA = ジホモγリノレン酸;PD =原発性月経困難症;PG =プロスタグランジン;LT = ロイコトリエン;TX = トロンボキサン;SDA = ステアリドン酸;ETA = エイコサテトラエン酸;EPA = エイコサペンタエン酸;CR =シペリ根茎;CRV = 酢で処理されたCR。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
実験中の注意事項
CRの有効成分の油は揮発性であるため、CRを抽出する時間は20分を超えてはならず、沸騰するときは濃縮中60°Cを超えない温度で弱火にする必要があります。効果的な成分の抽出を成功させるには、煎じ薬の前に少なくとも2時間ハーブを水に浸して、浸漬が完了したときにハーブが濡れるようにする必要があります。CR処理中、酢が完全にハーブに浸透できるように、酢をハーブとよく混ぜる必要があります。酢の量が少なすぎてハーブを完全に濡らすことができない場合は、少量の水を加えて酢を希釈し、酢をハーブと完全に混ぜることができます。混合が完了すると、ハーブはすべての酢を吸収します。酢には酢酸が含まれているため、化学反応を避けるために混合物が鉄と接触しないでください。
ラット実験では、10日目に安息香酸エストラジオールの最初の腹腔内注射が行われ、次にCRまたはCRVの抽出物の胃内投与が行われ、そして最後にオキシトシンの腹腔内注射が投与される。オキシトシンの腹腔内注射後、動物を30分間観察し、そして直ちに血液を採取する。通常、血中濃度は胃内投与後1時間以内にピークに達し13、これは採血するのに最適な時期です。
LC-MS/MSで抽出物サンプルと血清サンプルを測定する場合、異なるサンプル中の同じ成分の保持時間が一貫していることを確認するために、それらを同じバッチで測定する必要があります。この実験では、成分の同定が難しい点でした。内因性代謝物には比較的成熟したデータベースが利用できるが、血液に吸収された成分を特定するためのマッチングデータベースはなかったため、同定にはさらに注意が必要である。
CR群とCRV群の血液中に吸収される成分の違い
CRの有効成分を決定するために、この実験は月経困難症モデルラットの血液に吸収される成分を調べました。この実験では、血液中の15の成分と2つの代謝産物がCR群とCRV群で異なることがわかりました。その中で、CRV群の(-)-ミルテノールと[(1R,2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-1,4,7,7-テトラメチルビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-イル]酢酸のレベルはCR群よりもかなり高かったが、他の成分のレベルは有意差はなかった。(-)-ミルテノールと[(1R,2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-1,4,7,7-テトラメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-イル]酢酸はテルペノイドであり、CRVの有効成分と考えられています。
リグシペロノールとプロクルクマジオールは、それぞれα-シペロンとイソクルクメノールの酸化によって生成され、α-シペロンは強い鎮痛効果があります。提案された作用機序は、NF-kBシグナル伝達の負の調節を介してLPS誘導性COX-2発現およびPGE2合成を減少させ得る31。(+)-ヌートカトンはまた、COX-2活性を阻害する32,33。イソクルクメノールは月経困難症の治療におけるウコン根腫のコア成分です 3、そしてその代謝産物プロクルクマジオールは鎮痛効果があるかもしれません。CR群と比較して、CRV群は鎮痛効果を有する( - )-ミルテノールのレベルがかなり高かった34。考えられる作用機序は、COX-235の発現の変化が抗炎症性サイトカイン(IL-10、IFN-γ)のレベルを増加させ、炎症誘発性サイトカイン(TNF-α、IL-1β)のレベルを低下させることです36。酢で処理すると、血中の有効成分のレベルが改善されるため、酢で製造された製品がより効果的になる可能性があります。
CR群とCRV群の代謝経路の違い
パスウェイ解析の結果、CR群とCRV群では、フェニルアラニン代謝、不飽和脂肪酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン生合成の生合成、リノール酸代謝など、代謝経路が大きく異なっていた。ただし、フェニルアラニン代謝とフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン生合成の代謝経路はPDとは関係ありません。これらの結果は、CRVの効力増強に関連する代謝経路がリノール酸代謝および不飽和脂肪酸の生合成であることを示している。
不飽和脂肪酸には、オメガ3とオメガ6の2種類があります37。エイコサペンタエン酸を含むメディエーターの3つの前駆体(20:5ω3;EPA)、ドコサヘキサエン酸(22:5ω3;DHA)、およびアラキドン酸(20:5ω6;ARA)は、不飽和脂肪酸経路37、38の生合成に関与している。EPAおよびARA代謝は、COXの作用下でプロスタグランジンおよびロイコトリエンを産生する。ARAは、PGF 2 α、PGE 2、PGI 2、トロンボキサン(TXA 2、TXB 2)を含む2系列プロスタノイドと、ロイコトリエンA 4(LTA 4)ロイコトリエンB 4(LTB 4)、ロイコトリエンC 4(LTC 4)、ロイコトリエンD 4(LTD 4)などの4シリーズロイコトリエンを生成します。3直列プロスタノイドには、プロスタグランジンE3(PGE3)、プロスタサイクリンI3(PGI3)、トロンボキサンA2(TXA3)が含まれ、5直列ロイコトリエンには、ロイコトリエンA5(LTA5)、ロイコトリエンB5(LTB5)、ロイコトリエンC5(LTC5)、およびロイコトリエンD5(LTD5)が含まれ、これらは主にEPAによって生成されます。
EPAの形質転換プロセスはARAのそれと同じであり、類似の酵素によって媒介される39。2系列プロスタノイドおよび4系列ロイコトリエンは、主に炎症誘発性、血小板凝集、および血管収縮作用を有する。対照的に、3系列プロスタノイドおよび5系列ロイコトリエンは、抗炎症作用、抗血小板作用、および血管拡張作用を示す38。TXA2とTXB2はARAから産生され、血管を狭くします。EPA由来のPGI3、PGE3、およびTXA3は、血管拡張薬としてのみ作用する38,40。EPAとARAは、COX酵素によるPGへの変換を競います。膜EPA/AA比が増加すると、凝集を促進するエイコサノイドPGI2およびTXA2は、抗凝集を促進するTXA3およびPGI3に変換され、抗炎症および抗凝集効果をもたらす40。さらに、EPA、DHA、およびリノール酸の併用(C18:2ω6;LIN)は、ウシ子宮内膜および栄養膜におけるPGF2 αおよびPGE2放出を減少させることができる41、42。
PDは、PGおよびロイコトリエン43、44、45、特にPG46の産生によって引き起こされる可能性が高い。一方、バソプレッシン、βエンドルフィン、エストロゲン、プロゲステロン、神経伝達物質、IL、ET-1、およびNOの不均衡も月経困難症に関連している可能性があります47。ELISAの結果によると、CRV群ではPGF2αおよびPGF2α/PGE2レベルが減少したが、PGE2レベルはCR群と比較して増加した。さらに、ロイコトリエンB4(C02165)およびプロスタグランジンJ2(C05957)はCRV群で低かった。これは、CRV群では、月経困難症の最も重要な因子であるPGF2αを含む、ARAから作られた2系列プロスタノイドのレベルが低かったことを示しています。高濃度のPGE 2による治療は血管を拡張し、PGE2は低濃度で血管収縮を引き起こす48。したがって、子宮は血管拡張で弛緩し、月経困難症は軽減されます。
人体は十分な量のC18不飽和脂肪酸を合成できないため、C18不飽和脂肪酸の唯一の供給源であるリノール酸とα-リノレン酸は非常に重要です38。リノール酸とα-リノレン酸は、それぞれオメガ6とオメガ3不飽和脂肪酸代謝の源です。特に、プロスタグランジン合成の前駆体はARAであり、ARAはリノール酸49から合成される。リノール酸は前駆体であり、ARA、プロスタグランジン(PGF 2 α、PGE 2)、プロスタサイクリン(PGI 2)、トロンボキサン(TXA 2)50を含む一連の代謝産物がそれから合成される。リノール酸は、CRVの鎮痛効果の増強と密接に関連しています。さらに、ステロイドホルモン生合成の代謝経路は、スフィンゴ脂質代謝の代謝経路によって産生されるプロゲステロン51,52,53およびスフィンゴシン-1-リン酸(C06124)を生成し、COX-2を誘導し、TNF54,55,56,57を介してPGE2を産生することができる。これらはPDにも関連している可能性があります。
プロトコルにはいくつかの制限があります。成分の相対レベルのみを比較し、標準サンプルはハーブの成分と血液に吸収された成分を定量化するために使用しませんでした。動物実験ではラットの糞便や尿を採取しなかったため、 生体内での CRの代謝物が少なくなりました。検証実験では、メタボノミクス解析によって発見されたメカニズムをさらに確認する必要があります。
この研究で使用された戦略とプロトコルは、 in vitro での化学成分の研究と in vivoでの個々の成分の一方的な研究における失明を回避しました。そのため、メカニズム探索に非常に適していました。この戦略は、多くの時間と作業を節約し、治療効果の重要な構成要素とメカニズムを正確に特定できます。
この研究では、血液中に15の成分と2つの代謝物があることがわかりました。その中で、(-)-ミルテノールと[(1R,2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-1,4,7,7-テトラメチルビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-イル]酢酸のレベルはCR群と比較してCRV群で有意に増加し、酢で処理すると血中の有効成分のレベルが上昇する可能性があることが示されました。CRを酢で処理した後、PGF2α、ロイコトリエンB 4、およびプロスタグランジンJ 2を含む、炎症誘発性、血小板凝集性、および血管収縮性を有する2系列プロスタノイドおよび4系列ロイコトリエンのレベルが低下した。これは、CRVが増強鎮痛効果を発揮するメカニズムである可能性があります。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
この作業は、重慶市健康家族計画委員会中国医学科学技術プロジェクト(プロジェクト番号:ZY201802297)、重慶自然科学財団の一般プロジェクト(プロジェクト番号:cstc2019jcyj-msxmX065)、重慶近代山岳地域特性高効率農業技術システムイノベーションチーム構築計画2022 [10]、および重慶市衛生健康委員会中国マテリアの主要規律建設プロジェクトによって支援されました。 メディカ処理。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 197164 | |
| BECKMAN COULTER Microfuge 20 | Beckman Coulter, Inc. | MRZ15K047 | |
| Estradiol benzoate | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | C10042616 | |
| formic acid | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 177799 | |
| LC 30A system | Shimadzu, Kyoto, Japan | 228-45162-46 | |
| Olive oil | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd | H25A11P111909 | |
| Oxytocin synthetic | Zhejiang peptide biology Co., Ltd | 2019092001 | |
| Rat PGF2α ELISA kit | Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd | 202101 | |
| Rat PGFE2 ELISA kit | Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd | EDL202006217 | |
| SPF Sprague-Dawley rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd | Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004 | |
| Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
| Triple TOF 4600 system | SCIEX, Framingham, MA, USA | BK20641402 | |
| water | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 152720 |
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