Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Анализ сырых и обработанных образцов корневища ципери методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии у крыс с первичной дисменореей

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Здесь представлен сравнительный анализ сырых и обработанных образцов корневища Cyperi (CR) с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения (UPLC-MS/MS) у крыс с первичной дисменореей. Изменения уровня метаболитов в крови и компонентов образца были исследованы между крысами, получавшими CR, и CR, обработанным уксусом (CRV).

Abstract

Корневище ципери (КР) широко используется в гинекологии и является общим лекарством для лечения женских заболеваний в Китае. Поскольку обезболивающий эффект CR усиливается после обработки уксусом, CR, обработанный уксусом (CRV), обычно используется клинически. Однако механизм, с помощью которого обезболивающий эффект усиливается при обработке уксусом, неясен. В этом исследовании метод жидкостной хроматографии сверхвысокого давления тандемной масс-спектрометрии (UPLC-MS / MS) использовался для изучения изменений в уровнях экзогенных компонентов и метаболитов в крови между крысами, получавшими CR, и крысами, получавшими CRV, с дисменореей. Результаты показали различные уровни 15 компонентов и двух метаболитов в крови этих крыс. Среди них уровни (-)-миртенола и [(1R,2S,3R,4R)-3-гидрокси-1,4,7,7-тетраметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил]уксусной кислоты в группе CRV были значительно выше, чем в группе CR. CRV снижал уровень простаноидов 2-й серии и лейкотриенов 4-й серии с провоспалительной, агрегационной и вазоконстрикционной активностью и обеспечивал анальгезирующий эффект за счет модуляции метаболизма арахидоновой кислоты и линолевой кислоты и биосинтеза ненасыщенных жирных кислот. Это исследование показало, что обработка уксусом усиливает обезболивающий эффект CR и способствует нашему пониманию механизма действия CRV.

Introduction

Первичная дисменорея (БП) является наиболее распространенным заболеванием в клинической гинекологии. Он характеризуется болью в спине, отеком, болью в животе или дискомфортом до или во время менструации без патологии органов малого таза в репродуктивной системе1. Отчет о его распространенности показал, что 85,7% студентов страдают от БП2. Низкие дозы оральных контрацептивов являются стандартной терапией, но их неблагоприятные побочные эффекты, такие как тромбоз глубоких вен, привлекают все большее внимание3. Распространенность тромбоза глубоких вен среди пользователей оральных контрацептивов составляет >1 на 1000 женщин, и риск наиболее высок в течение первых 6-12 месяцев и у пользователей старше 40 лет4.

Давно используемая в традиционной китайской медицине (ТКМ), корневище ципери (CR) получают из высушенного корневища Cyperus rotundus L. семейства Cyperaceae. CR регулирует нарушения менструального цикла и снимает депрессию и боль5. КР широко применяется в гинекологии и считается общим лекарством для лечения женскихболезней6. CR, обработанный уксусом (CRV), обычно используется клинически. По сравнению с CR, CRV показывает усиленную регуляцию менструации и облегчение боли. Современные исследования показали, что CR ингибирует циклооксигеназу-2 (ЦОГ-2) и последующий синтез простагландинов (ПГ), достигая таким образом противовоспалительного эффекта. Между тем, CR проявляет обезболивающий эффект без побочных эффектов7, что делает CR хорошим выбором для пациентов с дисменореей. Однако механизм, лежащий в основе регуляции менструации и обезболивания с помощью CRV, неясен. Исследования CR в основном были сосредоточены на изменениях в его активных химических компонентах и фармакологической активности, таких как его противовоспалительное, антидепрессивное и обезболивающее действие 8,9,10,11,12.

Хотя ингредиенты ТКМ сложны, они всасываются в кровь и должны достигать определенной концентрации в крови, чтобы быть эффективными13. Область скрининга активных ингредиентов ТКМ может быть сужена за счет использования стратегии определения компонентов в крови. Слепоты можно избежать при изучении химических компонентов in vitro, а односторонности можно избежать при изучении отдельных компонентов14. Сравнивая составы CR и CRV в крови, можно эффективно и быстро обнаружить изменения в активных ингредиентах обработанного CR. Эффективность лекарства - это процесс, посредством которого лекарство влияет на организм. Изменения компонентов препарата, обусловленные метаболическим ответом организма, которые могут быть связаны с механизмом действия препарата, могут быть определены с помощью метабономики. Метабономика направлена на измерение общих и динамических метаболических реакций, что согласуется с определением общей эффективности традиционной китайской медицины15. Кроме того, метаболиты являются конечным продуктом экспрессии генов, которая наиболее тесно связана с фенотипами16. Таким образом, метабономика может быть пригодна для изучения различий в метаболических путях между CR и CRV при лечении БП. Нецелевая метаболомика на основе жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения (ЖХ-МС/МС) характеризуется высокой пропускной способностью, высокой чувствительностью и высоким разрешением и может использоваться для измерения множества различных низкомолекулярных компонентов17,18 . Этот метод позволяет одновременно определять эндогенные метаболиты и экзогенные составляющие, всасываемые в кровь. Метабономика широко используется в исследованиях ТКМ19, токсикологиилекарств 20, управления здоровьем21, спорта22, продуктов питания23 и других областях.

В этом исследовании различия в экзогенных компонентах, всасываемых в кровь, и эндогенных метаболитов были измерены между крысами-дисменореей, обработанными CR, и крысами, обработанными CRV, с использованием нецелевой метаболомики на основе LC-MS / MS, чтобы выявить механизмы анальгетических эффектов CRV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты, связанные с животными, проводились с одобрения Комитета по этике экспериментов Чунцинского института ТКМ. В этом эксперименте использовались двадцать четыре самки крыс Sprague Dawley (SD) в возрасте 8-10 недель и весом 200 г ± 20 г.

1. Подготовка экстракции

  1. Вычисление
    1. Запланируйте введение экстракта CR или CRV группе лечения из шести крыс Sprague-Dawley (10 г / [кг ∙ день]) в течение 3 дней. Используйте концентрацию экстракта CR или CRV 1 г / мл (1 мл экстракта получают из 1 г трав).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дозировка CR составляет 6-10 г. В этом исследовании в качестве дозировки использовалась максимальная доза 10 г. Поскольку средний вес взрослого человека составляет 60 кг, доза для взрослого человека составляет 0,1667 г / кг. Согласно алгоритмупреобразования веса 24, поскольку коэффициент преобразования дозы между человеком и крысами составляет 6,3, дозировка для крыс составляет 1,05 г / кг. Дозировка препарата была увеличена в 10 раз до 10,5 г/кг для крыс. Дозировка была установлена равной 10 г/кг для удобства расчета и фактического эксперимента. Например, по расчету, если необходимо в общей сложности 36 г CR или CRV, китайская фитотерапия должна быть приготовлена как минимум дважды. Таким образом, требовалось 200 г CR - 100 г CR использовали в качестве CR, а 100 г CR перерабатывали в CRV.
    2. Рассчитайте объем CR или CRV, который должен быть применен для одной крысы, используя уравнение (1):
      V = 10 г/(кг∙сут) × 200 г/(1 г/мл) = 2 мл (1)
  2. Обработка CRV
    1. Тщательно смешать 100 г CR и 20 г уксуса (>5,5 г уксусной кислоты/100 мл) и выдержать 12 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что внутренняя часть CR была увлажнена уксусом через 12 часов, CR и уксус смешивали, хорошо перемешивали, а затем снова перемешивали до тех пор, пока внутренняя часть не стала влажной.
    2. Обжарьте смесь на железной сковороде в течение 10 минут при температуре 110-120 °C. Затем выньте смесь и дайте ей остыть при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы CR не подгорел, необходимо постоянно помешивать во время нагрева. Если обработанный CRV слишком влажный, его можно высушить при 60 °C. Когда поверхность CR станет сепией, жарку можно прекратить.
  3. Извлечение
    1. Экстракт CR
      1. Добавьте 10 раз (количество CR) чистой воды в CR и замочите на 2 часа. Следите за тем, чтобы лекарственные материалы были ниже уровня жидкости при замачивании.
        ПРИМЕЧАНИЕ: CR нужно разрезать только пополам перед экстракцией. Целью замачивания является более эффективное извлечение активных компонентов. Процесс замачивания имеет важное значение.
      2. Доведите смесь воды и лекарства до кипения на сильном огне и держите ее кипящей на слабом огне в течение 20 минут. Отфильтруйте фильтровальной тканью (100 меш) и соберите фильтрат.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При отваривании перед кипячением использовался сильный огонь, а для поддержания кипения - слабый огонь.
      3. Повторите шаг 1.3.1.2 один раз и смешайте фильтраты.
      4. Концентратируют экстракт с помощью ротационного испарителя до 1 г/мл (исходя из оригинального препарата, температура концентрации должна быть ниже 60 °C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Активные компоненты CR летучи, поэтому температура концентрации не должна быть выше 60 °C.
    2. Экстракт CRV
      1. Выполните те же действия (1.3.1.1-1.3.1.3), что и для метода извлечения CR.
    3. Экстракт CR для тестирования
      1. Пипетку 500 мкл экстракта CR и 500 мкл метанола в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и перемешивают в течение 30 с.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь метанола и воды лучше извлекает активные компоненты. Экстракт не следует напрямую фильтровать для тестирования.
      2. Центрифугу каждого образца в течение 15 мин при 1,6502 × г при 4 °C. Отфильтруйте надосадочную жидкость, а затем перенесите ее во флакон с образцом для тестирования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После высокоскоростного центрифугирования смеси метанола и экстракта надосадочную жидкость можно непосредственно перенести в бутылку с образцом для определения без фильтрации. Из-за тепла, выделяемого в процессе центрифугирования, предпочтительно использовать криогенную центрифугу.
    4. Экстракт CRV для тестирования
      1. Выполните шаги 1.3.3.1-1.3.3.2, чтобы подготовить выписку CRV к тестированию.

2. Животные

  1. Вычисление
    1. Возьмите 50 мг бензоата эстрадиола и добавьте его к 50 мл оливкового масла, чтобы приготовить раствор 1 мг / мл. Возьмите 50 мг окситоцина и добавьте его к 50 мл физиологического раствора, чтобы приготовить раствор 1 мг / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доза внутрибрюшинной инъекции эстрадиола бензоата и окситоцина составляет 10 мг / (кг ∙ день). Эстрадиол бензоат растворяется в оливковом масле, а окситоцин растворяется в обычном физиологическом растворе. Бензоат эстрадиола нелегко растворить в оливковом масле, и его можно лечить ультразвуком для ускорения растворения. Растворы эстрадиола бензоата и окситоцина необходимо готовить ежедневно.
    2. Рассчитайте объем раствора эстрадиола бензоата, который будет применяться на одну крысу (т.е. V = 10 мг / [кг ∙ день] × 200 г / [1 г / мл] = 2 мл). Рассчитайте объем раствора окситоцина, который будет применяться на одну крысу (т.е. V = 10 мг / [кг ∙ день] × 200 г / [1 г / мл] = 2 мл).
  2. Группировка и введение животных
    ПРИМЕЧАНИЕ: Десять дней было отведено на администрирование25,26. Во время лечения крысы имели неограниченный доступ к стандартному корму и воде. В течение 30 минут после введения окситоцина отслеживалась извивающаяся активность каждой крысы. Модель крыс с болезнью Паркинсона была успешно разработана, о чем свидетельствуют скручивающие реакции модельных крыс, которые включали сокращение матки, вращение одной конечности, разгибание задней конечности, полое туловище и сокращение брюшной полости26.
    1. Распределите 24 самки крыс Sprague-Dawley (SD крысы, 8-10-недельный возраст, весом 200 г ± 20 г) на четыре группы случайного контроля, модельные, CR и CRV - и кормите их в течение 7 дней.
    2. Введение животных
      1. Внутрибрюшинно вводят крысам в группах модели, CR и CRV 2 мл раствора эстрадиола бензоата каждый день. Внутрибрюшинно вводят крысам контрольной группы 2 мл физиологического раствора.
      2. Начиная с 8-го дня, выполните шаг 2.2.2.1. Затем внутрижелудочно вводят 2 мл экстракта CRV крысам в группе CRV, 2 мл экстракта CR крысам в группе CR и 2 мл физиологического раствора крысам в контрольной и модельной группах.
      3. На 10-й день выполните шаг 2.2.2.2. Затем внутрибрюшинно вводят крысам в группах модели, CR и CRV 2 мл раствора окситоцина, а крысам в контрольной группе - 2 мл физиологического раствора.
    3. Запишите время извивания крыс в течение 30 минут после инъекции окситоцина.
  3. Сбор образцов
    1. Соберите образцы крови брюшной аорты, быстро и полностью иссеките матку и аккуратно отделите соединительную ткань и жир, прилипший к стенке матки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь собирали в течение 1 часа после приема последней дозы.
    2. Используйте микроцентрифужные пробирки для сохранения и перевода тканей матки на жидкий азот. Храните образцы тканей при температуре −80 °C.
    3. Центрифугируют образцы крови в течение 10 мин при дозе 4 125 × г. Удалить надосадочную жидкость, содержащую сыворотку, и центрифугу при 16 502 × г в течение 10 мин при 4 °C. Центрифугируйте сыворотку, а затем храните ее в пробирке при температуре -80 °C для хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы крови необходимо оставить при комнатной температуре на 1 час для повторной обработки.
  4. Обработка образцов
    1. Образцы сыворотки
      1. Поместите 400 мкл метанола и 200 мкл сыворотки в микроцентрифужную пробирку и перемешивайте в течение 30 с. Центрифугу каждого образца в течение 15 мин при 16 502 × г при 4 °C. Наполните бутылки с пробами надосадочной жидкостью после сбора и фильтрации. Смешайте все надосадочные жидкости из каждого образца с одинаковым объемом, чтобы подготовить образцы контроля качества для тестирования.
    2. Образцы тканей матки
      1. Возьмите 100 мг ткани матки из ипсилатерального сегмента и измельчите ее девятикратным объемом физиологического раствора. Центрифугируют гомогенат в течение 10 мин при концентрации 4,125 × г и собирают надосадочную жидкость. Поместите надосадочную жидкость в холодильник при температуре 4°С для проведения испытаний или при температуре -80°С, если она не будет проверена в тот же день.
      2. Поместите нормальный физиологический раствор, ткань и стальные шарики в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, поместите микроцентрифужную пробирку в жидкий азот на 3-5 с, а затем поместите ткань в измельчитель тканей для измельчения.
  5. Тестирование образцов
    1. Используйте иммуноферментный анализ (ИФА) для измерения содержания PGF2α и PGE2 в тканях матки образцов крыс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Набор для ИФА PGE 2 крысы использовался для измерения содержания PGE 2, а набор для ИФА PGF 2α крысы использовался для измерения уровня PGF2α. Подробные инструкции можно найти в инструкциях производителя. Подробная информация о комплекте приведена в Таблице материалов.
    2. Оцените образец сыворотки, экстракт CR и экстракт CRV, используя UPLC-MS / MS.
      1. Для ЭЖХ используйте колонку C18 (2,6 мкм, 2,1 мм x 100 мм) и метод бинарного градиента с подвижной фазой A, содержащей 0,1% муравьиной кислоты, и подвижной фазой B, содержащей ацетонитрил. Установите градиент элюирования следующим образом: от 0 мин до 1 мин, 15% B; от 1 мин до 8,5 мин, от 15% до 85% В; от 8,5 мин до 11,5 мин, 85% В; от 11,5 мин до 11,6 мин, от 99% до 1% В; и от 11,6 мин до 15 мин, 15% B. Установите скорость потока 0,35 мл / мин и объем впрыска 2 мкл.
      2. Для MS установите температуру 600 °C, расход завесного газа (CUR) на 0,17 МПа, а расход оболочки и вспомогательного газа на 0,38 МПа. Установите напряжение ионного распыления в режиме положительных ионов и режиме отрицательных ионов на 5,5 кВ и -4,5 кВ соответственно, напряжение потенциала декластеризации (DP) на 80 В или -80 В, энергию столкновения (CE) на 40 эВ или -25 эВ, а суперпозицию энергии столкновения (CES) на 35 эВ ± 15 эВ.
      3. Выполните испытание в соответствии с протоколом производителя с использованием UPLC-MS/MS. Выполните MS для диапазона масс 50-1,000 м/з.
      4. Получение результатов UPLC-MS/MS с помощью программы согласования рабочих станций в сочетании с информационно-зависимым сбором режима обнаружения, фильтром множественных массовых дефектов и динамическим фоновым выводом. Используйте образцы контроля качества объединенной сыворотки для проверки повторяемости и стабильности оборудования UPLC-MS/MS для проверки традиционного подхода. Перед исследуемыми образцами вводят образцы контроля качества в течение четырех последовательных запусков, а затем вводят их после каждых пяти образцов сыворотки.

3. Обработка данных

  1. Подготовка данных
    1. Используйте программное обеспечение для преобразования необработанных данных в формат mzXML. Нормализуйте данные об общем ионном токе (TIC) каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутреннее приложение на основе R (www.lims2.com), построенное на XCMS, использовалось для анализа информации для интеграции, выравнивания, извлечения и обнаружения пиков27.
    2. Выполняйте аннотации метаболитов с использованием собственной базы данных MS2 (www.lims2.com). Установите порог аннотации на 0,328.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эндогенные метаболиты были идентифицированы в каждой группе.
  2. Анализ главных компонент и ортогональный частичный дискриминантный анализ наименьших квадратов
    1. Используйте программное обеспечение для анализа для выполнения анализа главных компонент (PCA) и моделирования. Импортируйте стандартизированные данные о метаболитах в программное обеспечение для анализа. Затем используйте автоподбор для построения расчетной модели. Наконец, используйте score , чтобы получить точечную диаграмму оценки PCA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеризация каждой группы была получена с помощью диаграммы рассеяния баллов PCA. PCA - это неконтролируемый режим анализа, который в основном группирует образцы путем уменьшения размеров без вмешательства.
    2. Используйте программное обеспечение для анализа для выполнения ортогонального частичного дискриминантного анализа наименьших квадратов (OPLS-DA).
      1. Импортируйте стандартизированные данные о метаболитах в группах CR и CRV в программное обеспечение для анализа.
      2. Импортируйте данные из группы CR в созданную группу CR и импортируйте данные из группы CRV в созданную группу CRV.
        ПРИМЕЧАНИЕ: OPLS-DA - это контролируемый режим анализа, и необходима группировка образцов.
      3. Затем используйте автоподбор для построения расчетной модели и используйте оценку для получения точечной диаграммы оценок OPLS-DA. Наконец, используйте VIP для получения переменной значимости в значении проекции (VIP) в OPLS-DA.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Переменная значимость в проекционных (VIP) значениях метаболитов в группах CR и CRV была получена с помощью OPLS-DA.
  3. Идентификация метаболитов дифференциала потенциала
    1. Отсеивайте метаболиты со значениями VIP больше 1 на шаге 3.2.2.3.
    2. Используйте статистическое программное обеспечение для расчета значения P метаболитов, которые были отсеяны на шаге 3.3.1 с помощью t-критерия Стьюдента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значимые различия в потенциальном дифференциале метаболитов в группах CR и CRV были определены с помощью t-критерия Стьюдента. Потенциальными дифференциальными метаболитами были метаболиты с p-значением t-критерия Стьюдента < 0,05 и переменной значимостью в проекции (VIP) более 1. Представление было выполнено с использованием вулканического графика.
  4. Идентификация дифференциальных метаболитов
    1. Отсеивайте метаболиты с дифференциалом потенциалов на шаге 3.3. Используйте результаты шага 3.1.2 для идентификации этих дифференциальных метаболитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было идентифицировано небольшое количество потенциальных дифференциальных метаболитов, и они стали кандидатами в дифференциальные метаболиты.
    2. Отсеивайте дифференциальные метаболиты, которые должны быть сопоставлены в базе данных KEGG. Покажите изменения дифференциальных метаболитов в группах CR и CRV, нарисовав тепловую карту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество дифференциальных метаболитов-кандидатов было сопоставлено, и они стали дифференциальными метаболитами.
  5. Изучение потенциальных метаболических путей
    1. Загрузите различные метаболиты в базу данных Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Используйте анализ путей для получения потенциальных метаболических путей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Потенциальные метаболические пути были получены в группах CR и CRV. Значение P и значение воздействия были двумя очень важными показателями при выборе критических путей. Значение P было более важным, чем значение воздействия. Значимость определялась значением P < 0,05; Более высокие значения воздействия были связаны с лучшими корреляциями.
    3. Проанализируйте потенциальные метаболические пути, загрузив различные метаболиты в базу данных KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также следует учитывать взаимосвязь между функцией метаболического пути и болезнью Паркинсона. Получены критические метаболические пути.
  6. Идентификация составляющих, всасываемых в кровь
    1. Определите химические компоненты в экстрактах CR и CRV, используя собственную базу данных MS2 (www.lims2.com), базу данных метаболома человека (HMDB), а также базы данных Massbank и Chemspider.
    2. Определите компоненты, всасываемые в кровь в группах CR и CRV, и сравните компоненты между группами CR и CRV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты, всасываемые в кровь, должны быть обнаружены в группах CR или CRV, но не могут быть обнаружены в контрольной группе.
  7. Статистический анализ
    1. Анализируйте данные с помощью одномерного анализа (UVA) и многомерных статистических методов, включая дисперсионный анализ (ANOVA) и t-критерий Стьюдента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная информация была представлена с использованием статистического программного обеспечения в виде среднего ± стандартного отклонения (±SD). P < 0,01 считался очень значимой разницей, а P < 0,05 представлял собой значимую разницу28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализ модельного эксперимента по дисменорее
В контрольной группе в течение 30 минут не было кривого ответа, потому что этим крысам не вводили внутрибрюшинно окситоцин и бензоат эстрадиола, чтобы вызвать боль. Крысы в группах модели, CR и CRV показали значительные извивающиеся реакции после инъекции окситоцина. Эти результаты демонстрируют эффективность комбинации эстрадиола, бензоата и окситоцина для индукции дисменореи. Различия в уровнях PGF 2α, PGE 2 и PGF2α / PGE 2 между моделью и контрольной группой были значительными (P < 0,001, P < 0,05), что свидетельствует об эффективности модели (рис. 1).

Figure 1
Рисунок 1: Содержание PGF 2α и PGE 2 в тканях матки и число извивающихся в каждой группе. (A) Содержание PGF 2 α в тканях матки в каждой группе. (B) Содержание PGE2 в тканях матки в каждой группе. (C) Содержание PGF 2 α / PGE2 в тканях матки в каждой группе. (D) Извивающееся число в каждой группе. Столбцы представляют среднее значение ± SEM из четырех групп (шесть мышей в группе). * P < 0,05 или ** P < 0,01 представляют собой достоверную разницу по сравнению с модельной группой, а Δ P < 0,05 или ΔΔ P < 0,01 представляют собой достоверную разницу по сравнению с группой CR. Крысы в модельных, CR и CRV группах показали существенную извивающуюся реакцию после инъекции окситоцина. Сокращения: PG = простагландин; CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Концентрации PGF 2α и PGF2α / PGE2 были снижены в группах CRV и CR, и это снижение было более заметным в группе CRV. Также были выявлены значимые (P < 0,001 и P < 0,05) различия в концентрациях PGF 2α и PGF2α/PGE2 между группами CRV и CR. По сравнению с модельной группой концентрация PGE2 была значительно выше в группах CRV и CR (P < 0,001), при этом уровень больше всего увеличивался в группе CRV.

Контроль качества
Наблюдалось хорошее соответствие между временем удержания хроматографических пиков BPC и интенсивностью сигнала в образцах контроля качества, демонстрируя высокий уровень стабильности прибора и удивительно стабильное качество данных (дополнительный файл 1 - дополнительный рисунок 1 и дополнительный рисунок 2). Кроме того, все контрольные образцы находились в пределах ±2 стандартных отклонений (рис. 2A, B), а корреляция между контрольными образцами качества была больше 0,7 (рис. 2C, D). Эти результаты свидетельствуют о том, что процедура была надежной и что результаты были достоверными.

Figure 2
Рисунок 2: Одномерное распределение образцов контроля качества PCA-X. А) положительная мода, (В) отрицательная мода; корреляционный анализ контрольных образцов качества в (С) положительном режиме и (D) отрицательном режиме. Все образцы контроля качества находились в пределах ±2 стандартных отклонений, а корреляции между образцами контроля качества превышали 0,7. Эти результаты свидетельствуют о том, что процедура была надежной, а информация заслуживающей доверия. Сокращения: ПК = главный компонент; PCA = анализ главных компонент; контроль качества; CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ главных компонент
Как показано на рисунке 3, абсцисс ПК (1) указывал баллы по первым основным компонентам, а ординат ПК (2) указывал на баллы по вторым основным компонентам. На рисунке зеленый круг обозначает контрольную группу, красный круг представляет модельную группу, синий круг обозначает группу CR, белый круг обозначает группу CRV, а розовый кружок указывает группу контроля качества.

Figure 3
Рисунок 3: Точечная диаграмма оценки PCA . (A) Положительная мода и (B) отрицательная мода. Образцы контроля качества перекрываются, что указывает на то, что прибор был очень стабильным. Каждая группа распределена по своей области, и только группа CR и группа CRV иногда пересекаются. Сокращения: ПК = главный компонент; PCA = анализ главных компонент; QC = контроль качества; CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты анализа PCA показали, что кластеры CR и модельных групп были достоверно разделены как в положительной, так и в отрицательной ионной модах. Кластеры были значительно разделены между CRV и модельными группами в режимах положительных и отрицательных ионов. Группы контроля качества, модели и контроля были отделены от других групп лечения (CR, CRV). Группы CR и CRV иногда перекрывались в режиме положительных ионов. В режиме отрицательных ионов каждая группа была значительно разделена.

Дискриминантный анализ методом ортогональных частичных наименьших квадратов
OPLS-DA использовался для скрининга метаболических различий. Диаграмма рассеяния OPLS-DA показала, что все образцы находились в пределах 95% доверительного интервала (эллипс Т-квадрата Хотеллинга). На рисунке 4A,C показано, что группы CR и CRV были разделены. Переоснащение модели было протестировано с помощью теста перестановки (n = 200) и оценена статистическая значимость модели. На рисунке 4B,D ордината изображает значение R 2 Y или значение Q2, а абсцисс указывает на замещающее удержание. R 2Y представлен зеленой точкой, Q2 представлен синей квадратной точкой, а две пунктирные линии представляют соответствующие им линии регрессии. В положительном и отрицательном режимах значения R2 Y составляли 0,8 и 0,84, а значения Q2 — −0,59 и −0,57 соответственно. Это демонстрирует высокую надежность модели и отсутствие переобучения.

Figure 4
Рисунок 4: Модели OPLS-DA для группы CR по сравнению с группой CRV. Оценка диаграммы рассеяния в (A) положительном режиме и (C) отрицательном режиме. Тест перестановок модели OPLS-DA для группы CR по сравнению с группой CRV в (B) положительном режиме и (D) отрицательном режиме. R 2Y составил 0,8 и 0,84, а Q2 — −0,59 и −0,57 в положительном и отрицательном режимах соответственно. Это демонстрирует высокую надежность модели и отсутствие переобучения. Сокращения: OPLS-DA = ортогональный частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов; CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Одномерный статистический анализ
Для выявления метаболических изменений был проведен одномерный статистический анализ. При стандартном скрининге VIP > 1 и P < 0,05 было обнаружено 339 и 394 потенциальных дифференциальных метаболитов в режиме положительных и отрицательных ионов соответственно. График вулкана показан на рисунке 5, где каждая точка соответствует отдельному метаболиту. Ордината показывает значение P t-критерия Стьюдента, а абсцисса отражает множественные изменения уровня каждой молекулы в группе. Размер разброса представляет собой значение VIP модели OPLS-DA; значение VIP увеличивается с размером скаттера. Красные точки указывают на увеличение, синие точки указывают на уменьшение, а серые указывают на отсутствие существенной разницы.

Качественный анализ дифференциальных метаболитов-кандидатов проводили с помощью вторичной масс-спектрометрии. Значительные изменения наблюдались в 63 метаболитах в положительном режиме (Дополнительный файл 1-Дополнительная таблица 1) и в 30 метаболитах в отрицательном режиме (Дополнительный файл 1-Дополнительная таблица 2). Дифференциальные метаболиты определяли с использованием баз данных KEGG и HDMB. Точно подобранные соединения были идентифицированы как дифференциальные метаболиты, и они перечислены в Таблице 3 и Таблице 4.

Figure 5
Рисунок 5: График вулкана для группы CR по сравнению с группой CRV. (A) Положительная мода и (B) отрицательная мода. На представленном графике вулкана каждая точка соответствует отдельному метаболиту. Ордината показывает значение P t-критерия Стьюдента, а абсцисс отражает множественные изменения в каждом веществе в группе. Размер разброса представляет собой значение VIP модели OPLS-DA. Значение VIP увеличивается с размером скаттера. Красные точки указывают на увеличение, синие точки указывают на уменьшение, а серые указывают на отсутствие существенных различий. Сокращения: OPLS-DA = ортогональный частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов; VIP = переменная значимость в проекции; CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сравнение метаболитов
Была рассчитана евклидова матрица расстояний количественных значений дифференциальных метаболитов между группами CR и CRV, и дифференциальные метаболиты были сгруппированы с использованием комплексного корреляционного подхода.

Абсциссы представляют различные экспериментальные группы, в то время как ордината представляет относительный уровень на рисунке 6. Расположение цветовых пятен показывает, как каждый метаболит экспрессируется по отношению к другим. В режиме положительных ионов, по сравнению с группой CR, уровни четырех дифференциальных метаболитов в группе CRV увеличились, в то время как уровни 11 дифференциальных метаболитов снизились. В режиме отрицательных ионов, по сравнению с группой CR, уровни четырех дифференциальных метаболитов в группе CRV увеличивались, а уровни 7 дифференциальных метаболитов снижались.

Figure 6
Рисунок 6: Анализ тепловой карты для группы CRV по сравнению с группой CR . (A) Положительный режим и (B) отрицательный режим. Абсцисс представляет различные экспериментальные группы, а ордината представляет относительные уровни экспрессии. Расположение цветовых пятен показывает, как каждый метаболит экспрессируется по отношению к другим. Сокращения: CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

По сравнению с группой CR метаболитами, которые увеличились в группе CRV, были сфингозин-1-фосфат, нобилетин, глицерофосфохолин, лизопк (18: 1 (9z)), 2-гидрокси-6-пентадецилбензойная кислота, 9,10-эпоксиоктадеценовая кислота, 13s-гидроксиоктадекадиеновая кислота и 2-метоксиэстрон, в то время как те, которые уменьшились, были кортикостероном, индолуксусной кислотой, гликохолевой кислотой, берберином, дибутилфталатом, ретинолом, лейкотриеном B4, простагландином J2, 21-гидроксипрегненолоном, зеранолом, гомоцистеином, пропиновой кислотой, стеариновая кислота, докозагексаеновая кислота, фенилацетилглицин, L-фенилаланин, эстрон-глюкуронид и лимонная кислота (рис. 7).

Figure 7
Рисунок 7: Тенденции относительного уровня потенциальных метаболитов в группах CRV и CR . (A) Положительная мода и (B) отрицательная мода. В положительном режиме, по сравнению с группой CR, уровни четырех дифференциальных метаболитов увеличились в группе CRV, а уровни 11 снизились. В отрицательном режиме уровни четырех дифференциальных метаболитов увеличились в группе CRV, а уровни семи дифференциальных метаболитов снизились. Столбцы представляют среднее значение ± SEM из четырех групп (шесть мышей в группе). * P < 0,05, ** P < 0,01 или *** P < 0,01 представляют собой достоверную разницу между группами CRV и CR. Сокращения: CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ пути KEGG
Дифференциальные метаболиты были аннотированы, а пути KEGG были проанализированы. Результаты показали, что дифференциальные метаболиты были связаны с девятью путями в положительном и отрицательном режимах соответственно (таблица 1 и таблица 2). На рисунке 8 каждый метаболический путь представлен пузырьком на пузырьковой диаграмме, причем более значимая шкала указывает на больший фактор воздействия. Размер пути, влияющего на факторы в топологическом анализе, представлен абсциссой пузырьковой диаграммы и размером пузырька. Ордината пузырьковой диаграммы и цвет пузырька указывают на значение P анализа обогащения (принимая отрицательный натуральный логарифм, т. е. −ln (p)). Степень обогащения более значительна, значение P меньше, значение ординат более заметно, а цвет темнее. Значение P и значение воздействия являются двумя очень важными показателями при выборе критических путей. Как правило, значение P более важно, чем значение воздействия.

Figure 8
Рисунок 8: Анализ путей для группы CRV по сравнению с группой CR . (A) Положительный режим и (B) отрицательный режим. Каждый метаболический путь представлен пузырьком на пузырьковой диаграмме. Абсцисс пузырьковой диаграммы и размер пузырька указывают на размер факторов, влияющих на траекторию в топологическом анализе. Ордината пузырьковой диаграммы и цвет пузырьков указывают на значение P анализа обогащения. Ключевые метаболические пути включают биосинтез ненасыщенных жирных кислот и метаболизм линолевой кислоты. Сокращения: CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В таблицах 3 и 4 показаны метаболические пути со значительными различиями - метаболизм фенилаланина и метаболизм линолевой кислоты, а также биосинтез ненасыщенных жирных кислот, фенилаланина, тирозина и триптофана. Хотя метаболические пути включали биосинтез стероидных гормонов, метаболизм сфинголипидов и арахидоновой кислоты, не было существенных различий, которые были связаны с дисменореей. Результаты показали, что метаболизм линолевой кислоты и биосинтез ненасыщенных жирных кислот являются критическими метаболическими путями, связанными с повышенной эффективностью CRV.

Компоненты, всасываемые в кровь
Пятнадцать составляющих и два продукта метаболизма из экстрактов CRV и CR были обнаружены в сыворотке крови крыс в группах CR и CRV (табл. 5). Все 17 компонентов были обнаружены в режиме положительных ионов.

Относительные составляющие уровни в образцах крови двух групп сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента. Абсцисс на рисунке 9 отображает различные экспериментальные группы; Ордината представляет собой значение отклика масс-спектра. Было два компонента с существенными различиями. Анализ показал, что уровни этих двух компонентов были повышены в группе CRV по сравнению с группой CR, в то время как уровни 15 элементов не показали существенных изменений.

Figure 9
Рисунок 9: Компоненты, всасываемые в кровь для группы CRV по сравнению с группой CR . В сыворотке крови крыс в группах CR и CRV было обнаружено 15 компонентов и два продукта метаболизма из экстрактов CRV и CR. Анализ показал, что уровни двух компонентов в крови были повышены в группе CRV по сравнению с группой CR, в то время как уровни в крови 15 компонентов не показали существенных изменений. Среди них уровень (-)-миртенола и [(1R,2S,3R,4R)-3-гидрокси-1,4,7,7-тетраметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил]уксусной кислоты в группе CRV был значительно выше, чем в группе CR. * P < 0,05 или ** P < 0,01 представляют собой достоверную разницу между группой CRV и группой CR. Сокращения: CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Метаболические различия в положительном режиме. Сокращения: KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; VIP = переменная значимость в проекции; RT = время хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Метаболические различия в отрицательном режиме. Сокращения: KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; VIP = переменная значимость в проекции; RT = время хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Анализ метаболических путей в положительном режиме. Аббревиатура: KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4 Анализ метаболических путей в отрицательном режиме. Аббревиатура: KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 5: Идентификация прототипов ингредиентов и метаболитов в сыворотке крови крыс. Примечание: М1 и М2 являются метаболитами; Другие составляющие являются прототипами ингредиентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Диаграммы BPC и хроматограмма MS2 компонентов, всасываемых в кровь голых мышей. БПК-диаграммы всех образцов контроля качества в положительном и отрицательном режимах; MS2 хроматограмма 17 компонентов, всасываемых в кровь крыс: D-камфен, (-)-миртенол, этилпарабен, каламенен, α-циперон, (+)-нооткатон, (1R,2S,3R,4R)-3-гидрокси-1,4,7,7-тетраметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил]уксусная кислота, 4-(2-(2.2.1)-бициклогептильметил)бензойная кислота, 10,12-пероксикаламенен, (1aS,10aR)-1a,5,9-триметил-1a,3,6,10a-тетрагидрооксирено[4,5]циклодека[1,2-b]фуран-10(2H)-он, птерозин D, террецикловая кислота, сугеонилацетат, 3-ацетил-13-дезоксифоменом, изокуркуменол, лигуциперонол, прокуркумадиол. Также включены дифференциальные метаболиты, идентифицированные с помощью вторичной масс-спектрометрии, а также баз данных HDMB и KEGG в режимах положительных и отрицательных ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Из-за большого разнообразия и разной природы ТКМ эти травы иногда не работают в клинической практике, и это может быть связано с неправильной обработкой и отваром ТКМ. Механизмы ТКМ становятся все более очевидными с использованием современной науки и техники29,30. Это исследование показывает, что как CR, так и CRV оказывают терапевтическое действие на крыс модели БП и что терапевтический эффект CRV является более существенным. Механизм действия CRV может быть связан с тем фактом, что обработка уксусом может влиять на компоненты CR, которые всасываются в кровь, и может быть связан с метаболизмом линолевой кислоты и биосинтезом ненасыщенных жирных кислот. На рисунке 10 показаны потенциальные пути действия CRV в облегчении боли.

Figure 10
Рисунок 10: Механизмы усиления анальгетического эффекта КРВ. Результаты показали, что в крови было обнаружено 15 компонентов и два метаболита. Среди них уровни (-)-миртенола и [(1R,2S,3R,4R)-3-гидрокси-1,4,7,7-тетраметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил]уксусной кислоты в группе CRV были значительно выше, чем в группе CR. CRV может снижать уровень простаноидов 2-й серии и лейкотриенов 4-й серии, полученных из АРА, и достигать обезболивающего эффекта за счет модуляции метаболизма арахидоновой кислоты, биосинтеза ненасыщенных жирных кислот и метаболизма линолевой кислоты. Сокращения: ARA = арахидоновая кислота; ЦОГ = циклооксигеназа; LA = линолевая кислота; ПНЖК = полиненасыщенные жирные кислоты; ГЛК =γ-линоленовая кислота; DGLA = дигомо-γ-линоленовая; БП = первичная дисменорея; PG = простагландин; LT = лейкотриены; ТХ = тромбоксан; SDA = стеаридоновая кислота; ETA = эйкозатетраеновая кислота; EPA = эйкозапентаеновая кислота; CR = корневище ципери; CRV = CR, обработанный уксусом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Меры предосторожности во время эксперимента
Поскольку масло эффективного компонента КР является летучим, время извлечения КР не должно превышать 20 мин, а при закипании оно должно находиться на слабом огне с температурой не выше 60°С при концентрировании. Чтобы обеспечить успешное извлечение эффективных ингредиентов, травы должны быть замочены в воде не менее чем за 2 часа до отвара, чтобы травы были влажными после завершения замачивания. Во время обработки CR уксус необходимо хорошо перемешать с травами, чтобы уксус смог полностью проникнуть в них. Если объем уксуса слишком мал, чтобы тщательно смочить травы, можно добавить небольшое количество воды, чтобы разбавить уксус, а затем уксус можно полностью смешать с травами. Когда перемешивание будет завершено, травы впитают в себя весь уксус. Поскольку уксус содержит уксусную кислоту, смесь не должна вступать в контакт с железом, чтобы избежать химической реакции.

В эксперименте на крысах первая внутрибрюшинная инъекция эстрадиола бензоата делается на 10-й день, затем дается внутрижелудочное введение экстракта CR или CRV и, наконец, внутрибрюшинная инъекция окситоцина. После внутрибрюшинного введения окситоцина за животным наблюдают в течение 30 мин, и сразу же берут кровь. Обычно концентрация в крови достигает пика в течение 1 ч после внутрижелудочного введения13, что является лучшим временем для взятия крови.

При определении образцов экстракта и сыворотки с помощью ЖХ-МС/МС их следует определять в одной и той же партии, чтобы обеспечить согласованность времени удержания одного и того же компонента в разных образцах. В этом эксперименте идентификация компонентов была трудным моментом. Хотя относительно зрелая база данных может быть использована для эндогенных метаболитов, не было соответствующей базы данных для идентификации компонентов, всасываемых в кровь, поэтому следует проявлять большую осторожность при идентификации.

Различия в компонентах, всасываемых в кровь, между группами CR и CRV
Чтобы определить действующее вещество CR, в этом эксперименте исследовали компоненты, всасываемые в кровь у крыс-моделей дисменореи. В этом эксперименте было обнаружено, что 15 компонентов и два метаболита в крови различались между группами CR и CRV. Среди них уровни (-)-миртенола и [(1R,2S,3R,4R)-3-гидрокси-1,4,7,7-тетраметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил]уксусной кислоты в группе CRV были значительно выше, чем в группе CR, но уровни других компонентов существенно не отличались. (-)-миртенол и [(1R,2S,3R,4R)-3-гидрокси-1,4,7,7-тетраметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил]уксусная кислота являются терпеноидами и считаются эффективными компонентами CRV.

Лигуциперонол и прокуркумадиол получают путем окисления α-циперона и изокуркуменола соответственно, а α-циперон обладает сильным анальгезирующим действием. Предложенный механизм действия может снижать индуцированную ЛПС экспрессию ЦОГ-2 и синтезПГЕ2 за счет отрицательной регуляции передачи сигналов NF-kB31. (+)-Нуткатон также ингибирует активность ЦОГ-232,33. Изокуркуменол является основным компонентом корневища куркумы при лечении дисменореи3, а его метаболит прокуркумадиол может оказывать обезболивающее действие. По сравнению с группой CR, группа CRV показала значительно более высокие уровни (-)-миртенола, который обладает обезболивающим эффектом34. Возможный механизм действия может заключаться в том, что изменения экспрессии ЦОГ-235 повышают уровни противовоспалительного цитокина (ИЛ-10, ИФН-γ) и снижают уровни провоспалительных цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1β)36. Обработка уксусом улучшает уровень активных ингредиентов в крови, возможно, поэтому продукты, произведенные с уксусом, более эффективны.

Различия в метаболических путях между группами CR и CRV
Анализ путей показал значительно различающиеся метаболические пути между группами CR и CRV, в том числе с точки зрения метаболизма фенилаланина, биосинтеза ненасыщенных жирных кислот, биосинтеза фенилаланина, тирозина и триптофана и метаболизма линолевой кислоты. Однако метаболические пути метаболизма фенилаланина и биосинтеза фенилаланина, тирозина и триптофана не связаны с болезнью Паркинсона. Эти результаты показывают, что метаболическими путями, связанными с повышенной эффективностью CRV, являются метаболизм линолевой кислоты и биосинтез ненасыщенных жирных кислот.

Ненасыщенные жирные кислоты включают два типа: омега-3 и омега-637. Три предшественника медиаторов, включая эйкозапентаеновую кислоту (20:5ω3; EPA), докозагексаеновая кислота (22:5ω3; ДГК) и арахидоновая кислота (20:5ω6; ARA), участвуют в биосинтезе ненасыщенных жирных кислот путем37,38. Метаболизм EPA и ARA продуцирует простагландины и лейкотриены под действием ЦОГ. ARA продуцирует простаноиды 2-й серии, включая PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 и тромбоксан (TXA 2, TXB 2), а также лейкотриены 4-й серии, включая лейкотриен A 4 (LTA 4), лейкотриен B 4 (LTB 4), лейкотриен C 4 (LTC 4) и лейкотриен D 4 (LTD 4). Простаноиды 3-й серии включают простагландин Е 3 (ПГЕ 3), простациклин I 3 (ПГИ 3) и тромбоксан А2 (ТХА 3), а лейкотриены 5-й серии включают лейкотриен А 5 (ЛТА 5), лейкотриен В 5 (ЛТБ 5), лейкотриен С 5 (ЛТК 5) и лейкотриен D 5 (ЛТД 5), которые в основном вырабатываются АООС.

Процесс трансформации ЭПК такой же, как и у АРА, и опосредован аналогичными ферментами39. Простаноиды 2-й серии и лейкотриены 4-й серии в основном обладают провоспалительным, агрегационным и сосудосуживающим эффектами. Напротив, простаноиды 3-го ряда и лейкотриены 5-го ряда проявляют противовоспалительное, антиагрегантное и сосудорасширяющее действие38. TXA 2 и TXB2 вырабатываются из ARA, вызывая сужение кровеносных сосудов. PGI 3, PGE3 и TXA3, полученные из EPA, действуют только как вазодилататоры 38,40. EPA и ARA конкурируют за превращение в PG ферментом ЦОГ. Когда мембранное соотношение ЭПК/АА увеличивается, эйкозаноиды PGI 2 и TXA2, которые способствуют агрегации, могут трансформироваться в TXA 3 и PGI3, которые способствуют антиагрегации, что приводит к противовоспалительному и антиагрегационному эффектам40. Кроме того, комбинированное использование ЭПК, ДГК и линолевой кислоты (C18: 2ω6; LIN) может снижать высвобождениеPGF 2 α и PGE2 в эндометрии крупного рогатого скота и трофобластах41,42.

БП, вероятно, вызвана продукцией ПГ и лейкотриенов 43,44,45, особенно ПГ 46. Между тем, дисбаланс вазопрессина, β-эндорфинов, эстрогена, прогестерона, нейротрансмиттеров, IL, ET-1 и NO также может быть связан с дисменореей47. По результатам ИФА уровни PGF2α и PGF2α/PGE 2 в группе CRV снизились, в то время как уровень PGE2 увеличился относительно группы CR. Кроме того, лейкотриенB4 (C02165) и простагландинJ2 (C05957) были ниже в группе CRV. Это указывает на то, что в группе CRV были более низкие уровни простаноидов 2-го ряда, изготовленных из ARA, включая PGF2α, который является наиболее важным фактором дисменореи. Терапия ПГЕ 2 в высоких концентрациях расширяет кровеносные сосуды, а ПГЕ2 вызывает вазоконстрикцию при низких концентрациях48. Поэтому матка расслабляется с расширением сосудов, и дисменорея снимается.

Поскольку организм человека не может синтезировать достаточное количество ненасыщенных жирных кислот С18, очень важны линолевая кислота и α-линоленовая кислота, которые являются единственным источником ненасыщенных жирных кислот С1838. Линолевая кислота и α-линоленовая кислота являются источником метаболизма ненасыщенных жирных кислот омега-6 и омега-3 соответственно. В частности, предшественником синтеза простагландинов является АРА, а АРА синтезируется из линолевой кислоты49. Линолевая кислота является предшественником, и из нее синтезируется ряд метаболитов, включая АРА, простагландины (PGF 2 α, PGE 2), простациклин (PGI 2) и тромбоксан (TXA 2)50. Линолевая кислота тесно связана с усилением обезболивающего эффекта CRV. Кроме того, метаболический путь биосинтеза стероидных гормонов может продуцировать прогестерон 51,52,53 и сфингозин-1-фосфат (C06124), которые продуцируются метаболическим путем метаболизма сфинголипидов, индуцируют ЦОГ-2 и продуцируют PGE2 через TNF54,55,56,57. Они также могут быть связаны с ПД.

У протокола есть некоторые ограничения. Сравнивались только относительные уровни компонентов, и стандартная выборка не использовалась для количественной оценки компонентов в траве и тех, которые всасываются в кровь. Фекалии и моча крыс не собирались в экспериментах на животных, что привело к обнаружению меньшего количества метаболитов CR in vivo. Валидационные эксперименты должны дополнительно подтвердить механизм, обнаруженный метабономическим анализом.

Стратегия и протокол, использованные в этом исследовании, позволили избежать слепоты при изучении химических компонентов in vitro и одностороннего изучения отдельных компонентов in vivo. Поэтому он очень подходил для исследования механизмов. Стратегия может сэкономить много времени и работы, а также может точно определить критические компоненты и механизм терапевтической эффективности.

В этом исследовании было обнаружено, что в крови было 15 составляющих и два метаболита. Среди них уровни (-)-миртенола и [(1R,2S,3R,4R)-3-гидрокси-1,4,7,7-тетраметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил]уксусной кислоты были значительно увеличены в группе CRV по сравнению с группой CR, показывая, что обработка уксусом может повысить уровень активных ингредиентов в крови. После обработки CR уксусом снижались уровни простаноидов 2-го ряда и лейкотриенов 4-й серии с провоспалительными, агрегационными и сосудосуживающими свойствами, включая PGF2α, лейкотриен B4 и простагландинJ2. Это может быть механизмом, с помощью которого CRV демонстрирует усиленный обезболивающий эффект.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Научно-техническим проектом китайской медицины Комиссии по здравоохранению и планированию семьи Чунцина (номер проекта: ZY201802297), Общим проектом Чунцинского фонда естественных наук (номер проекта: cstc2019jcyj-msxmX065), Характерным планом создания команды высокоэффективной системы инноваций в области сельскохозяйственных технологий для современной горной местности Чунцина на 2022 год [10] и Проектом строительства ключевой дисциплины Китайской материи муниципальной комиссии по здравоохранению Чунцина Медикаментозная обработка.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Tags

Опровержение выпуск 190
Анализ сырых и обработанных образцов корневища ципери методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии у крыс с первичной дисменореей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter