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Análisis de muestras crudas y procesadas de rizoma de Cyperi utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem en ratas con dismenorrea primaria

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Aquí, se presenta un análisis comparativo de muestras crudas y procesadas de rizoma de Cyperi (CR) utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas en tándem de alta resolución (UPLC-MS / MS) en ratas con dismenorrea primaria. Los cambios en los niveles sanguíneos de los metabolitos y los componentes de la muestra se examinaron entre ratas tratadas con RC y RC procesadas con vinagre (CRV).

Abstract

El rizoma Cyperi (CR) es ampliamente utilizado en ginecología y es una medicina general para tratar enfermedades de las mujeres en China. Dado que el efecto analgésico de la RC se mejora después del procesamiento con vinagre, la RC procesada con vinagre (CRV) generalmente se usa clínicamente. Sin embargo, el mecanismo por el cual el efecto analgésico se ve reforzado por el procesamiento del vinagre no está claro. En este estudio, se utilizó la técnica de cromatografía líquida de ultra alta presión espectrometría de masas en tándem (UPLC-MS / MS) para examinar los cambios en los niveles sanguíneos de los constituyentes exógenos y metabolitos entre ratas tratadas con CR y tratadas con CRV con dismenorrea. Los resultados revelaron diferentes niveles de 15 componentes y dos metabolitos en la sangre de estas ratas. Entre ellos, los niveles de (-)-mirtenol y ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético en el grupo de VCR fueron considerablemente más altos que en el grupo de RC. CRV redujo el nivel de prostanoides de la serie 2 y leucotrienos de la serie 4 con actividades proinflamatorias, de agregación plaquetaria y vasoconstricción y proporcionó efectos analgésicos al modular el metabolismo del ácido araquidónico y el ácido linoleico y la biosíntesis de ácidos grasos insaturados. Este estudio reveló que el procesamiento del vinagre mejora el efecto analgésico de la RC y contribuye a nuestra comprensión del mecanismo de acción de la RCV.

Introduction

La dismenorrea primaria (EP) es la afección más prevalente en ginecología clínica. Se caracteriza por dolor de espalda, hinchazón, dolor abdominal o molestias antes o durante la menstruación sin patología pélvica en el aparato reproductor1. Un informe sobre su prevalencia mostró que el 85,7% de los estudiantes sufren de DP2. Los anticonceptivos orales de dosis bajas son la terapia estándar, pero sus efectos secundarios adversos, como la trombosis venosa profunda, han llamado cada vez más la atención3. La prevalencia de trombosis venosa profunda entre las usuarias de anticonceptivos orales es de >1 por cada 1.000 mujeres, y el riesgo es mayor durante los primeros 6-12 meses y en usuarias mayores de 40 años4.

Utilizado durante mucho tiempo en la medicina tradicional china (MTC), el rizoma Cyperi (CR) se deriva del rizoma seco del Cyperus rotundus L. de la familia Cyperaceae. La RC regula los trastornos menstruales y alivia la depresión y el dolor5. La RC es ampliamente utilizada en ginecología y es considerada una medicina general para tratar las enfermedades de la mujer6. La RC procesada con vinagre (CRV) se usa típicamente clínicamente. En comparación con la RC, la VCR muestra una mejor regulación de la menstruación y el alivio del dolor. Estudios modernos han demostrado que la RC inhibe la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y la posterior síntesis de prostaglandinas (PGs), logrando así un efecto antiinflamatorio. Mientras tanto, la RC exhibe un efecto analgésico sin efectos secundarios7, haciendo de la RC una buena opción para los pacientes con dismenorrea. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la regulación de la menstruación y la provisión de alivio del dolor por CRV no está claro. La investigación de la RC se ha centrado principalmente en los cambios en sus componentes químicos activos y actividades farmacológicas, como sus efectos antiinflamatorios, antidepresivos y analgésicos 8,9,10,11,12.

Aunque los ingredientes de la MTC son complejos, son absorbidos por la sangre y deben alcanzar una concentración sanguínea específica para ser efectivos13. El alcance de la detección de los ingredientes activos de la MTC se puede reducir utilizando la estrategia de determinación de constituyentes en la sangre. La ceguera puede evitarse en el estudio de los componentes químicos in vitro, y la unilateralidad puede evitarse en el estudio de los constituyentes individuales14. Al comparar las composiciones de RC y CRV en la sangre, los cambios en los ingredientes activos de la RC procesada se pueden detectar de manera efectiva y rápida. La eficacia del fármaco es el proceso por el cual un fármaco influye en el cuerpo. Los cambios en los componentes del fármaco debido a la respuesta metabólica del cuerpo, que pueden estar relacionados con el mecanismo de acción del fármaco, se pueden determinar con metabonómica. La metabonómica tiene como objetivo medir las respuestas metabólicas globales y dinámicas, lo que es consistente con la determinación de la eficacia general de la medicina tradicional china15. Además, los metabolitos son el producto final de la expresión génica, que está más estrechamente relacionada con los fenotipos16. Por lo tanto, la metabonómica puede ser adecuada para explorar las diferencias en las vías metabólicas entre la RC y la VRC en el tratamiento de la EP. La cromatografía líquida y la espectrometría de masas en tándem de alta resolución (LC-MS/MS) basada en la metabolómica no dirigida se caracteriza por un alto rendimiento, alta sensibilidad y alta resolución y se puede utilizar para medir muchos componentes moleculares pequeños diferentes17,18 . Este método puede determinar simultáneamente los metabolitos endógenos y los componentes exógenos absorbidos en la sangre. La metabonómica ha sido ampliamente utilizada en estudios sobre MTC19, toxicología de drogas20, manejo de la salud 21, deportes22, alimentos23 y otros campos.

En este estudio, las diferencias en los componentes exógenos absorbidos en la sangre y los metabolitos endógenos se midieron entre ratas modelo de dismenorrea tratadas con RC y tratadas con CRV utilizando metabolómica no dirigida basada en LC-MS / MS para revelar los mecanismos de los efectos analgésicos de CRV.

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Protocol

Todos los experimentos relacionados con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética de Experimentos del Instituto de MTC de Chongqing. En este experimento se utilizaron veinticuatro ratas hembras Sprague Dawley (SD) que tenían entre 8 y 10 semanas de edad y pesaban 200 g ± 20 g.

1. Preparación de la extracción

  1. Cálculo
    1. Planifique administrar el extracto de RC o CRV a un grupo de tratamiento de seis ratas Sprague-Dawley (10 g/[kg∙día]) durante 3 días. Use una concentración de extracto de CR o CRV de 1 g / ml (1 ml del extracto se obtiene de 1 g de hierbas).
      NOTA: La dosis de CR es de 6-10 g. En este estudio, la dosis máxima de 10 g se utilizó como dosis. Como el peso promedio de una persona adulta es de 60 kg, la dosis para adultos es de 0,1667 g / kg. Según el algoritmo de conversión de peso24, como el coeficiente de conversión de dosis entre humanos y ratas es de 6,3, la dosis para ratas es de 1,05 g/kg. La dosis del fármaco se incrementó 10 veces a 10,5 g/kg para ratas. La dosis se fijó en 10 g/kg para la conveniencia del cálculo y el experimento real. Por ejemplo, según el cálculo, si se necesita un total de 36 g de CR o CRV, la medicina herbal china debe prepararse al menos dos veces. Por lo tanto, se requirieron 200 g de RC: se utilizaron 100 g de RC como RC y 100 g de RC se procesaron en CRV.
    2. Calcule el volumen de RC o CRV a aplicar por rata utilizando la ecuación (1):
      V = 10 g/(kg∙día) × 200 g/(1 g/ml) = 2 ml (1)
  2. Tramitación del CRV
    1. Mezclar bien 100 g de CR y 20 g de vinagre (>5,5 g de ácido acético/100 mL) e incubar durante 12 h.
      NOTA: Para asegurarse de que el interior del CR se humedezca con vinagre después de 12 h, el CR y el vinagre se mezclaron, se agitaron bien y luego se agitaron nuevamente hasta que la porción interna estuviera húmeda.
    2. Saltear la mezcla en una sartén durante 10 min a 110-120 °C. Luego, saca la mezcla y déjala enfriar a temperatura ambiente.
      NOTA: Para evitar que el CR se queme, es necesario agitar continuamente mientras se calienta. Si el CRV procesado está demasiado húmedo, se puede secar a 60 °C. Cuando la superficie del CR es sepia, se puede detener el salteado.
  3. Extracción
    1. Extracto de CR
      1. Agregue 10 veces (la cantidad de CR) agua pura al CR y remoje durante 2 h. Asegúrese de que los materiales medicinales estén por debajo del nivel de líquido al remojar.
        NOTA: El CR solo necesita cortarse por la mitad antes de la extracción. El propósito del remojo es extraer los componentes activos de manera más efectiva. El proceso de remojo es esencial.
      2. Lleve la mezcla de agua y medicina a ebullición a fuego alto, y manténgala hirviendo a fuego lento durante 20 minutos. Filtrar con un paño filtrante (malla 100), y recoger el filtrado.
        NOTA: Al decoctar, se usó un calor alto antes de hervir y un calor bajo para mantener la ebullición.
      3. Repita el paso 1.3.1.2 una vez y combine los filtrados.
      4. Concentrar el extracto con un evaporador rotativo a 1 g/ml (según el medicamento original, la temperatura de concentración debe ser inferior a 60 °C).
        NOTA: Los componentes activos en CR son volátiles, por lo que la temperatura de concentración no debe ser superior a 60 ° C.
    2. Extracto de CRV
      1. Realice los mismos pasos (1.3.1.1-1.3.1.3) que para el método de extracción de RC.
    3. Extracto de CR para pruebas
      1. Pipetear 500 μL del extracto de CR y 500 μL de metanol en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y vórtice durante 30 s para mezclar.
        NOTA: Una mezcla de metanol y agua extrae mejor los componentes activos. El extracto no debe filtrarse directamente para su análisis.
      2. Centrifugar cada muestra durante 15 min a 1,6502 × g a 4 °C. Filtre el sobrenadante y, a continuación, transfiéralo al vial de muestra para su análisis.
        NOTA: Después de la centrifugación a alta velocidad de la mezcla de metanol y extracto, el sobrenadante se puede transferir directamente a la botella de muestra para su determinación sin filtración. Debido al calor generado por el proceso de centrifugación, es preferible utilizar una centrífuga criogénica.
    4. Extracto de CRV para pruebas
      1. Realice los pasos 1.3.3.1-1.3.3.2 para preparar el extracto de CRV para la prueba.

2. Animales

  1. Cálculo
    1. Tome 50 mg de benzoato de estradiol y agréguelo a 50 ml de aceite de oliva para preparar una solución de 1 mg / ml. Tome 50 mg de oxitocina y agréguela a 50 ml de solución salina normal para preparar una solución de 1 mg / ml.
      NOTA: La dosis de la inyección intraperitoneal de benzoato de estradiol y oxitocina es de 10 mg/(kg∙día). El benzoato de estradiol se disuelve en el aceite de oliva y la oxitocina se disuelve en la solución salina normal. El benzoato de estradiol no es fácil de disolver en aceite de oliva y se puede tratar con ultrasonido para acelerar la disolución. Tanto el benzoato de estradiol como las soluciones de oxitocina deben prepararse diariamente.
    2. Calcular el volumen de solución de benzoato de estradiol que se aplicará por rata (es decir, V = 10 mg/[kg∙día] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Calcular el volumen de solución de oxitocina a aplicar por rata (es decir, V = 10 mg/[kg∙día] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Agrupación y administración de animales
    NOTA: Se asignaron diez días para la administración25,26. Durante el tratamiento, las ratas tuvieron acceso sin restricciones a comida y agua estándar. Dentro de los 30 minutos de la administración de oxitocina, se rastreó la actividad de retorcimiento de cada rata. El modelo de rata PD fue desarrollado con éxito, como lo demuestran las respuestas de torsión de las ratas modelo, que incluyeron contracción uterina, rotación de una extremidad, extensión de extremidades posteriores, tronco hueco y contracción abdominal26.
    1. Asigne 24 ratas Sprague-Dawley hembras (ratas SD, de 8 a 10 semanas de edad, con un peso de 200 g ± 20 g) en cuatro grupos al azar -control, modelo, CR y CRV- y aliméntelas durante 7 días.
    2. Administración de animales
      1. Inyectar intraperitonealmente ratas en los grupos modelo, CR y CRV con 2 ml de solución de benzoato de estradiol todos los días. Inyectar intraperitonealmente a las ratas en el grupo control con 2 ml de solución salina normal.
      2. A partir del día 8, complete el paso 2.2.2.1. Luego, administre por vía intragástrica 2 ml de extracto de CRV a las ratas en el grupo CRV, 2 ml de extracto de CR a las ratas en el grupo CR y 2 ml de solución salina normal a las ratas en los grupos control y modelo.
      3. El día 10, complete el paso 2.2.2.2. Luego, inyecte por vía intraperitoneal a las ratas en los grupos modelo, CR y CRV con 2 ml de solución de oxitocina y a las ratas en el grupo control con 2 ml de solución salina normal.
    3. Registre los tiempos de retorcimiento de las ratas dentro de los 30 minutos posteriores a la inyección de oxitocina.
  3. Recogida de muestras
    1. Recoja muestras de sangre de la aorta abdominal, extirpe el útero rápida y completamente, y separe cuidadosamente el tejido conectivo y la grasa que se adhieren a la pared uterina.
      NOTA: La sangre se recolectó tan cerca como dentro de 1 h después de la dosis final.
    2. Use tubos de microcentrífuga para preservar y transferir el tejido uterino a nitrógeno líquido. Conservar las muestras de tejido a -80 °C.
    3. Centrifugar las muestras de sangre durante 10 min a 4.125 × g. Retirar el sobrenadante que contiene suero y centrifugar a 16.502 × g durante 10 min a 4 °C. Centrifugar el suero y luego mantenerlo en el tubo a -80 °C para su almacenamiento.
      NOTA: Las muestras de sangre deben dejarse a temperatura ambiente durante 1 h para su reprocesamiento.
  4. Procesamiento de muestras
    1. Muestras de suero
      1. Poner 400 μL de metanol y 200 μL de suero en un tubo de microcentrífuga, y el vórtice durante 30 s para mezclar. Centrifugar cada muestra durante 15 min a 16.502 × g a 4 °C. Llene las botellas de muestra con el sobrenadante después de la recolección y filtración. Mezcle todos los sobrenadantes de cada muestra con el mismo volumen para preparar muestras de control de calidad para la prueba.
    2. Muestras de tejido uterino
      1. Tome 100 mg de tejido uterino del segmento ipsilateral y muélalo con un volumen nueve veces mayor de solución salina normal. Centrifugar el homogeneizado durante 10 min a 4.125 × g y recoger el sobrenadante. Coloque el sobrenadante en nevera a 4 °C para la prueba o a -80 °C si no se va a probar el mismo día.
      2. Coloque las bolas normales de solución salina, tejido y acero en un tubo de microcentrífuga de 2 ml, coloque el tubo de microcentrífuga en nitrógeno líquido durante 3-5 s y luego coloque el tejido en un molinillo de tejido para molerlo.
  5. Pruebas de muestra
    1. Utilice un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para medir el contenido de PGF2α y PGE2 en los tejidos uterinos de las muestras de rata.
      NOTA: El kit ELISA PGE 2 para ratas se utilizó para medir el contenido de PGE 2, y el kit ELISA PGF 2α de rata se utilizó para medir el nivel de PGF 2α. Los pasos detallados se pueden encontrar en las instrucciones del fabricante. Los detalles del kit se dan en la Tabla de materiales.
    2. Evalúe la muestra de suero, el extracto de CR y el extracto de CRV utilizando UPLC-MS / MS.
      1. Para UPLC, use una columna C18 (2.6 μm, 2.1 mm x 100 mm) y un método de gradiente binario con fase móvil A que contiene 0.1% de ácido fórmico y fase móvil B que contiene acetonitrilo. Establezca el gradiente de elución de la siguiente manera: de 0 min a 1 min, 15% B; de 1 min a 8.5 min, 15% a 85% B; de 8,5 min a 11,5 min, 85% B; de 11,5 min a 11,6 min, 99% a 1% B; y de 11,6 min a 15 min, 15% B. Ajuste el caudal a 0,35 mL/min y el volumen de inyección a 2 μL.
      2. Para MS, ajuste la temperatura a 600 °C, el caudal de gas cortina (CUR) a 0,17 MPa y los caudales de gas auxiliar y de cubierta a 0,38 MPa. Ajuste el voltaje de pulverización iónica del modo de iones positivos y el modo de iones negativos a 5.5 kV y −4.5 kV, respectivamente, el voltaje de potencial de desagrupamiento (DP) a 80 V o −80 V, la energía de colisión (CE) a 40 eV o −25 eV, y la superposición de energía de colisión (CES) a 35 eV ± 15 eV.
      3. Realice la prueba siguiendo el protocolo del fabricante utilizando UPLC-MS/MS. Realice MS para un rango de masa de 50-1,000 m/z.
      4. Obtenga los resultados de UPLC-MS/MS utilizando el programa de estación de trabajo correspondiente junto con la adquisición dependiente de la información del modo de detección, el filtro de defectos de masa múltiple y la deducción dinámica de fondo. Utilice las muestras de control de calidad de suero combinado para probar la repetibilidad y estabilidad del equipo UPLC-MS / MS para verificar el enfoque convencional. Antes de las muestras de investigación, inyecte las muestras de control de calidad durante cuatro series sucesivas y luego inyéctelas después de cada cinco muestras de suero.

3. Tratamiento de datos

  1. Preparación de datos
    1. Utilice software de conversión para convertir los datos sin procesar al formato mzXML. Normalizar los datos de corriente iónica total (TIC) de cada muestra.
      NOTA: Se utilizó una aplicación interna basada en R (www.lims2.com) basada en XCMS para analizar la información para la integración, alineación, extracción y detección de picos27.
    2. Realice anotaciones de metabolitos utilizando una base de datos MS2 patentada (www.lims2.com). Establezca el umbral de anotación en 0,328.
      NOTA: Los metabolitos endógenos fueron identificados en cada grupo.
  2. Análisis de componentes principales y análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales
    1. Utilice software de análisis para realizar el análisis de componentes principales (PCA) y el modelado. Importe los datos estandarizados de los metabolitos al software de análisis. A continuación, utilice el ajuste automático para crear el modelo de análisis. Finalmente, use la puntuación para obtener el gráfico de dispersión de puntuación de la PCA.
      NOTA: El agrupamiento de cada grupo se obtuvo con el diagrama de dispersión de puntuación del ACP. PCA es un modo de análisis no supervisado que agrupa principalmente las muestras a través de la reducción de dimensiones sin intervención.
    2. Utilice el software de análisis para realizar el análisis discriminante mínimo cuadrático parcial ortogonal (OPLS-DA).
      1. Importe los datos estandarizados sobre los metabolitos en los grupos CR y CRV en el software de análisis.
      2. Importe los datos del grupo CR al grupo CR creado e importe los datos del grupo CRV al grupo CRV creado.
        NOTA: OPLS-DA es un modo de análisis supervisado y es necesario agrupar las muestras.
      3. A continuación, utilice el ajuste automático para crear el modelo de análisis y utilice la puntuación para obtener la gráfica de dispersión de puntuaciones de la OPLS-DA. Finalmente, use VIP para obtener la significación variable en el valor de proyección (VIP) en el OPLS-DA.
        NOTA: La significación variable en los valores de proyección (VIP) de los metabolitos en los grupos CR y CRV se obtuvo a través del OPLS-DA.
  3. Identificación de los metabolitos diferenciales potenciales
    1. Descartar los metabolitos con valores VIP superiores a 1 en el paso 3.2.2.3.
    2. Utilice software estadístico para calcular el valor de p de los metabolitos que fueron eliminados en el paso 3.3.1 por la prueba t de Student.
      NOTA: Las diferencias significativas en los metabolitos diferenciales potenciales en los grupos de RC y CRV se determinaron mediante una prueba t de Student. Los metabolitos diferenciales potenciales fueron aquellos con un valor p de la prueba t de Student < 0,05 y una significación variable en la proyección (VIP) mayor que 1. La representación se logró utilizando una parcela volcánica.
  4. Identificación de los metabolitos diferenciales
    1. Eliminar los metabolitos diferenciales potenciales en el paso 3.3. Utilice los resultados del paso 3.1.2 para identificar estos metabolitos diferenciales.
      NOTA: Se identificó un pequeño número de metabolitos diferenciales potenciales, y se convirtieron en los metabolitos diferenciales candidatos.
    2. Descartar los metabolitos diferenciales para que coincidan en la base de datos KEGG. Muestre los cambios en los metabolitos diferenciales en los grupos CR y CRV dibujando un mapa de calor.
      NOTA: Se emparejó un pequeño número de metabolitos diferenciales candidatos y se convirtieron en los metabolitos diferenciales.
  5. Examen de las posibles vías metabólicas
    1. Cargue los diferentes metabolitos en la base de datos de Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Utilice el análisis de vías para obtener las posibles vías metabólicas.
      NOTA: Las vías metabólicas potenciales se obtuvieron en los grupos RC y CRV. El valor de p y el valor de impacto fueron dos indicadores muy importantes en la selección de las vías críticas. El valor de P fue más importante que el valor de impacto. La significancia fue definida por un valor de p < 0,05; Los valores de impacto más grandes se asociaron con mejores correlaciones.
    3. Analizar las posibles vías metabólicas cargando los diferentes metabolitos a la base de datos KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      NOTA: También se debe considerar la relación entre la función de la vía metabólica y la EP. Se obtuvieron las vías metabólicas críticas.
  6. Identificación de los componentes absorbidos en la sangre
    1. Identifique los componentes químicos en los extractos de CR y CRV utilizando la base de datos interna MS2 (www.lims2.com), la base de datos de metaboloma humano (HMDB) y las bases de datos Massbank y Chemspider.
    2. Determinar los componentes absorbidos en la sangre en los grupos CR y CRV, y comparar los constituyentes entre los grupos CR y CRV.
      NOTA: Los componentes absorbidos en la sangre deben detectarse en los grupos CR o CRV, pero no pueden detectarse en el grupo control.
  7. Análisis estadístico
    1. Analizar los datos utilizando análisis univariado (UVA) y métodos estadísticos multivariados, incluyendo el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba t de Student.
      NOTA: La información experimental se presentó utilizando software estadístico como media ± desviación estándar (±DE). P < 0,01 fue considerada una diferencia altamente significativa, y P < 0,05 representó una diferencia significativa28.

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Representative Results

Análisis del experimento del modelo de dismenorrea
No hubo respuesta de retorcimiento dentro de los 30 minutos en el grupo de control porque estas ratas no fueron inyectadas intraperitonealmente con oxitocina y benzoato de estradiol para causar dolor. Las ratas en los grupos modelo, CR y CRV mostraron reacciones de retorcimiento sustanciales después de la inyección de oxitocina. Estos resultados demuestran la eficacia de la combinación de benzoato de estradiol y oxitocina para inducir dismenorrea. Las diferencias en los niveles de PGF 2α, PGE 2 y PGF2α/PGE 2 entre el modelo y los grupos control fueron significativas (P < 0,001, P < 0,05), lo que demuestra la eficacia del modelo (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: El contenido de PGF 2 α y PGE2 en el tejido uterino y el número de retorcimiento en cada grupo. (A) El PGF2α contenido en el tejido uterino en cada grupo. (B) El contenido de PGE2 en el tejido uterino en cada grupo. (C) El contenido de PGF 2 α/PGE2 en el tejido uterino de cada grupo. (D) El número de retorcimiento en cada grupo. Las columnas representan la media ± SEM de cuatro grupos (seis ratones por grupo). * P < 0,05 o ** P < 0,01 representan una diferencia significativa en comparación con el grupo modelo, y Δ P < 0,05 o ΔΔ P < 0,01 representan una diferencia significativa en comparación con el grupo CR. Las ratas en los grupos modelo, CR y CRV mostraron una reacción de retorcimiento sustancial después de la inyección de oxitocina. Abreviaturas: PG = prostaglandina; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las concentraciones de PGF 2α y PGF2α/PGE2 se redujeron en los grupos de VCR y RC, y esta reducción fue más marcada en el grupo de VCR. También hubo diferencias significativas (P < 0,001 y P < 0,05) en las concentraciones de PGF 2α y PGF2α/PGE2 entre los grupos CRV y CR. En comparación con el grupo modelo, la concentración de PGE2 fue significativamente mayor en los grupos CRV y CR (P < 0,001), siendo el nivel el que más aumentó en el grupo CRV.

Control de calidad
Se observó una buena correspondencia entre los tiempos de retención de los picos cromatográficos BPC y las intensidades de señal en las muestras de control de calidad, lo que demuestra un alto nivel de estabilidad del instrumento y una calidad de datos notablemente consistente (Archivo Suplementario 1-Figura Suplementaria 1 y Figura Suplementaria 2). Además, todas las muestras de control de calidad estaban dentro de ±2 desviaciones estándar (Figura 2A, B), y la correlación entre las muestras de control de calidad fue mayor que 0.7 (Figura 2C, D). Estos resultados sugieren que el procedimiento fue confiable y que los resultados fueron creíbles.

Figure 2
Figura 2: Distribución unidimensional PCA-X de las muestras de control de calidad. (A) Modo positivo, (B) modo negativo; análisis de correlación de las muestras de control de calidad en (C) modo positivo y (D) modo negativo. Todas las muestras de control de calidad estaban dentro de ±2 desviaciones estándar, y las correlaciones entre las muestras de control de calidad fueron mayores que 0,7. Estos resultados sugirieron que el procedimiento era confiable y la información era creíble. Abreviaturas: PC = componente principal; ACP = análisis de componentes principales; control de calidad; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de componentes principales
Como se muestra en la Figura 3, la abscisa PC (1) indicó las puntuaciones de los primeros componentes principales, mientras que la ordenada PC (2) indicó las puntuaciones de los segundos componentes principales. En la figura, el círculo verde indica el grupo de control, el círculo rojo representa el grupo modelo, el círculo azul indica el grupo CR, el círculo blanco denota el grupo CRV y el círculo rosa indica el grupo de control de calidad.

Figure 3
Figura 3: Diagrama de dispersión de puntuación del PCA . (A) Modo positivo y (B) modo negativo. Las muestras de control de calidad se superponen, lo que indica que el instrumento era muy estable. Cada grupo se distribuye en su propia área, con solo el grupo CR y el grupo CRV ocasionalmente cruzando caminos. Abreviaturas: PC = componente principal; ACP = análisis de componentes principales; QC = control de calidad; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados del análisis PCA demostraron que los grupos de los grupos CR y modelo se separaron significativamente en los modos de iones positivos y negativos. Los grupos se separaron significativamente entre los grupos CRV y modelo en los modos de iones positivos y negativos. Los grupos de control de calidad, modelo y control fueron separados de los otros grupos de tratamiento (RC, CRV). Los grupos CR y CRV ocasionalmente se superpusieron en el modo de iones positivos. En el modo de iones negativos, cada grupo se separó significativamente.

Análisis discriminante del método ortogonal de mínimos cuadrados parciales
OPLS-DA se utilizó para detectar diferencias metabólicas. El gráfico de dispersión OPLS-DA mostró que todas las muestras estaban dentro del intervalo de confianza del 95% (elipse T-cuadrado de Hotelling). La Figura 4A,C demuestra que los grupos RC y CRV estaban separados. El sobreajuste del modelo se probó mediante la prueba de permutación (n = 200) y se evaluó la significación estadística del modelo. En la figura 4B,D, la ordenada representa el valor de R 2 Y oel valor Q2, y la abscisa indica la retención de reemplazo. R 2Y está representado por el punto verde, Q2 está representado por el punto cuadrado azul y las dos líneas discontinuas representan sus líneas de regresión correspondientes. En los modos positivo y negativo, los valores de R2 Y fueron 0,8 y 0,84, y los valores de Q2 fueron −0,59 y −0,57, respectivamente. Esto demuestra la alta fiabilidad del modelo y la ausencia de sobreajuste.

Figure 4
Figura 4: Modelos OPLS-DA para el grupo CR versus el grupo CRV. Diagrama de dispersión de puntuación en (A) modo positivo y (C) modo negativo. Prueba de permutación del modelo OPLS-DA para el grupo CR versus el grupo CRV en (B) modo positivo y (D) modo negativo. R 2Y fue 0.8 y 0.84, y Q2 fue −0.59 y −0.57 en los modos positivo y negativo, respectivamente. Esto demuestra la alta fiabilidad del modelo y la ausencia de comportamiento de sobreajuste. Abreviaturas: OPLS-DA = análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis estadístico univariado
Se realizaron análisis estadísticos univariados para identificar variaciones metabólicas. Bajo el cribado estándar de VIP > 1 y P < se detectaron 0,05, 339 y 394 metabolitos diferenciales potenciales en los modos de iones positivos y negativos, respectivamente. En la Figura 5 se muestra un diagrama de volcán, en el que cada punto corresponde a un metabolito diferente. La ordenada muestra el valor P de la prueba t de Student, y la abscisa refleja múltiples cambios en el nivel de cada molécula en el grupo. El tamaño de dispersión representa el valor VIP del modelo OPLS-DA; el valor VIP aumenta con el tamaño de la dispersión. Los puntos rojos indican un aumento, los puntos azules indican una disminución y el gris no indica ninguna diferencia significativa.

Se realizó un análisis cualitativo de los metabolitos diferenciales candidatos mediante espectrometría de masas secundaria. Se observaron cambios significativos en 63 metabolitos en modo positivo (Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria 1) y en 30 metabolitos en modo negativo (Archivo Suplementario 1-Tabla Suplementaria 2). Los metabolitos diferenciales se determinaron utilizando las bases de datos KEGG y HDMB. Los compuestos emparejados con precisión se identificaron como metabolitos diferenciales, y estos se enumeran en la Tabla 3 y la Tabla 4.

Figure 5
Figura 5: Diagrama de volcanes para el grupo CR versus el grupo CRV . (A) Modo positivo y (B) modo negativo. En el gráfico del volcán representado, cada punto corresponde a un metabolito diferente. La ordenada muestra el valor P de la prueba t de Student, y la abscisa refleja los múltiples cambios en cada sustancia del grupo. El tamaño de dispersión representa el valor VIP del modelo OPLS-DA. El valor VIP aumenta con el tamaño de la dispersión. Los puntos rojos indican aumentos, los puntos azules indican disminuciones y el gris indica que no hay diferencias significativas. Abreviaturas: OPLS-DA = análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales; VIP = significación variable en la proyección; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Comparaciones de metabolitos
Se calculó la matriz de distancia euclidiana de los valores cuantitativos de los metabolitos diferenciales entre los grupos CR y CRV, y los metabolitos diferenciales se agruparon utilizando un enfoque de correlación integral.

La abscisa representa diferentes grupos experimentales, mientras que la ordenada representa el nivel relativo en la Figura 6. La colocación de los parches de color indica cómo se expresa cada metabolito en relación con los demás. En el modo de iones positivos, en comparación con el grupo CR, los niveles de cuatro metabolitos diferenciales en el grupo de CRV aumentaron, mientras que los niveles de 11 metabolitos diferenciales disminuyeron. En el modo de iones negativos, en comparación con el grupo CR, los niveles de cuatro metabolitos diferenciales en el grupo CRV aumentaron, y los niveles de 7 metabolitos diferenciales disminuyeron.

Figure 6
Figura 6: Análisis de mapas de calor para el grupo CRV versus el grupo CR . (A) Modo positivo y (B) modo negativo. La abscisa representa los diferentes grupos experimentales, y la ordenada representa los niveles de expresión relativos. La colocación de los parches de color indica cómo se expresa cada metabolito en relación con los demás. Abreviaturas: CR = rizoma Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En comparación con el grupo de RC, los metabolitos que aumentaron en el grupo de VRC fueron esfingosina 1-fosfato, nobiletina, glicerofosfocolina, lysopc(18:1(9z)), ácido 2-hidroxi-6-pentadecilbenzoico, ácido 9,10-epoxioctadecenoico, ácido 13s-hidroxioctadecadienoico y 2-metoxiestrona, mientras que los que disminuyeron fueron corticosterona, ácido indolacético, ácido glicocólico, berberina, ftalato de dibutilo, retinol, leucotrieno B4, prostaglandina J2, 21-hidroxipregnenolona, zeranol, homocisteína, ácido propinoico, ácido esteárico, ácido docosahexaenoico, fenilacetilglicina, L-fenilalanina, glucurónido de estrona y ácido cítrico (Figura 7).

Figure 7
Figura 7: Tendencias a nivel relativo de los metabolitos potenciales en los grupos de VRC y RC. (A) Modo positivo y (B) modo negativo. En el modo positivo, en comparación con el grupo CR, los niveles de cuatro metabolitos diferenciales aumentaron en el grupo CRV, y los niveles de 11 disminuyeron. En el modo negativo, los niveles de cuatro metabolitos diferenciales aumentaron en el grupo CRV, y los niveles de siete metabolitos diferenciales disminuyeron. Las columnas representan la media ± SEM de cuatro grupos (seis ratones por grupo). * P < 0,05, ** P < 0,01 o *** P < 0,01 representan una diferencia significativa entre los grupos CRV y CR. Abreviaturas: CR = rizoma Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de la vía KEGG
Se anotaron los metabolitos diferenciales y se analizaron las vías KEGG. Los resultados mostraron que los metabolitos diferenciales se asociaron con nueve vías en los modos positivo y negativo, respectivamente (Tabla 1 y Tabla 2). En la Figura 8, las vías metabólicas están representadas por una burbuja en el gráfico de burbujas, con una escala más significativa que indica un mayor factor de efecto. El tamaño de la ruta que influye en los factores en el análisis de topología está representado por la abscisa del gráfico de burbujas y el tamaño de la burbuja. La ordenada del gráfico de burbujas y el color de la burbuja indican el valor P del análisis de enriquecimiento (tomando el logaritmo natural negativo, es decir, −ln (p)). El grado de enriquecimiento es más significativo, el valor de P es más pequeño, el valor de ordenadas es más prominente y el color es más oscuro. El valor de P y el valor de impacto son dos indicadores muy importantes en la selección de vías críticas. Generalmente, el valor P es más importante que el valor de impacto.

Figure 8
Figura 8: Análisis de la vía para el grupo de VCR frente al grupo de RC . (A) Modo positivo y (B) Modo negativo. Las vías metabólicas están representadas por una burbuja en el gráfico de burbujas. La abscisa del gráfico de burbujas y el tamaño de la burbuja indican el tamaño de los factores que influyen en la trayectoria en el análisis de topología. La ordenada del gráfico de burbujas y el color de la burbuja indican el valor P del análisis de enriquecimiento. Las vías metabólicas clave incluyen la biosíntesis de ácidos grasos insaturados y el metabolismo del ácido linoleico. Abreviaturas: CR = rizoma Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Tabla 3 y la Tabla 4 muestran vías metabólicas con diferencias significativas: metabolismo de la fenilalanina y metabolismo del ácido linoleico, así como la biosíntesis de ácidos grasos insaturados, fenilalanina, tirosina y triptófano. Aunque las vías metabólicas incluyeron la biosíntesis de hormonas esteroides, el metabolismo de los esfingolípidos y el ácido araquidónico, no hubo diferencias significativas, que se relacionaron con la dismenorrea. Los resultados mostraron que el metabolismo del ácido linoleico y la biosíntesis de ácidos grasos insaturados fueron las vías metabólicas críticas asociadas con la eficacia mejorada de CRV.

Componentes absorbidos en la sangre
Se detectaron quince constituyentes y dos productos del metabolismo de los extractos de CRV y CR en el suero de rata en los grupos CR y CRV (Tabla 5). Los 17 componentes se encontraron en modo de iones positivos.

Los niveles constituyentes relativos en las muestras de sangre de los dos grupos se compararon utilizando la prueba t de Student. La abscisa en la Figura 9 muestra varios grupos experimentales; La ordenada representa el valor de respuesta del espectro de masas. Hubo dos componentes con diferencias significativas. El análisis mostró que los niveles de estos dos componentes fueron elevados en el grupo CRV en comparación con el grupo CR, mientras que los niveles de 15 elementos no mostraron cambios significativos.

Figure 9
Figura 9: Componentes absorbidos en la sangre para el grupo de VCR versus el grupo de RC. Hubo 15 constituyentes y dos productos del metabolismo de los extractos de CRV y CR en el suero de rata en los grupos de CR y CRV. El análisis mostró que los niveles sanguíneos de dos componentes aumentaron en el grupo de CRV en comparación con el grupo de RC, mientras que los niveles sanguíneos de 15 componentes no mostraron cambios significativos. Entre ellos, el nivel de (-)-mirtenol y ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético en el grupo de VCR fue considerablemente mayor que en el grupo de RC. * P < 0,05 o ** P < 0,01 representan una diferencia significativa entre el grupo CRV y el grupo CR. Abreviaturas: CR = rizoma Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Diferencias metabólicas en modo positivo. Abreviaturas: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = significación variable en la proyección; RT = tiempo de retención. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Diferencias metabólicas en modo negativo. Abreviaturas: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = significación variable en la proyección; RT = tiempo de retención. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Análisis de la vía metabólica en modo positivo. Abreviatura: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4 Análisis de la vía metabólica en modo negativo. Abreviatura: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Identificación de los ingredientes y metabolitos prototipo en suero de rata. Nota: M1 y M2 son metabolitos; Otros componentes son ingredientes prototipo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Diagramas BPC y cromatograma MS2 de los constituyentes absorbidos en la sangre de ratones desnudos. Diagramas BPC de todas las muestras de control de calidad en modos positivo y negativo; Cromatograma MS 2 de los 17 constituyentes absorbidos en la sangre de las ratas: D-canfeno, (-)-mirtenol, etilparabeno, calameneno, α-ciperona, (+)-nootkatona, (1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ácido hept-2-il]acético, ácido 4-(2-(2.2.1)-bicicloheptilmetil)benzoico, 10,12-peroxicalameneno, (1aS,10aR)-1a,5,9-trimetil-1a,3,6,10a-tetrahidrooxireno[4,5]ciclodeca[1,2-b ]furan-10(2H)-ona, pterosina D, ácido terrecíclico, acetato de sugeonil, 3-acetil-13-desoxiphomenomoma, isocurcumenol, ligucyperonol, procurcumadiol. También se incluyen los metabolitos diferenciales identificados por espectrometría de masas secundaria, así como las bases de datos HDMB y KEGG, en los modos de iones positivos y negativos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Debido a la amplia variedad y naturaleza diferente de las MTC, estas hierbas a veces no funcionan en la práctica clínica, y esto puede deberse al procesamiento y decocción inapropiados de las MTC. Los mecanismos de la MTC son cada vez más evidentes con el uso de la ciencia y la tecnología contemporáneas29,30. Este estudio muestra que tanto la RC como la CRV tienen efectos terapéuticos en ratas modelo de EP y que el efecto terapéutico de la CRV es más sustancial. El mecanismo de acción del CRV podría estar relacionado con el hecho de que el procesamiento del vinagre puede influir en los componentes de la RC que se absorben en la sangre y podría estar asociado con el metabolismo del ácido linoleico y la biosíntesis de ácidos grasos insaturados. La Figura 10 muestra las vías potenciales de la acción de CRV en el alivio del dolor.

Figure 10
Figura 10: Mecanismos del efecto analgésico potenciado de la VRC. Los resultados mostraron que se encontraron 15 constituyentes y dos metabolitos en la sangre. Entre ellos, los niveles de (-)-mirtenol y ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético en el grupo de CRV fueron considerablemente más altos que en el grupo de RC. CRV puede reducir el nivel de prostanoides de la serie 2 y leucotrienos de la serie 4 hechos de ARA y lograr efectos analgésicos a través de la modulación del metabolismo del ácido araquidónico, la biosíntesis de ácidos grasos insaturados y el metabolismo del ácido linoleico. Abreviaturas: ARA = ácido araquidónico; COX = ciclooxigenasa; LA = ácido linoleico; AGPI = ácidos grasos poliinsaturados; GLA = ácido γ-linolénico; DGLA = dihomo-γ-linolénico; DP = dismenorrea primaria; PG = prostaglandina; LT = leucotrienos; TX = tromboxano; SDA = ácido estearidónico; ETA = ácido eicosatetraenoico; EPA = ácido eicosapentaenoico; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR procesado con vinagre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Precauciones durante el experimento
Dado que el aceite del componente efectivo de CR es volátil, el tiempo para extraer el CR no debe exceder los 20 minutos, y cuando hierva, debe estar a fuego lento con una temperatura que no exceda los 60 ° C durante la concentración. Para garantizar la extracción exitosa de los ingredientes efectivos, las hierbas deben remojarse en agua durante al menos 2 horas antes de la decocción para que las hierbas estén húmedas cuando se complete el remojo. Durante el procesamiento de CR, el vinagre debe mezclarse bien con las hierbas para que el vinagre pueda penetrar completamente en ellas. Si el volumen de vinagre es demasiado bajo para humedecer bien las hierbas, se puede agregar una pequeña cantidad de agua para diluir el vinagre, y luego el vinagre se puede mezclar completamente con las hierbas. Cuando se completa la mezcla, las hierbas absorberán todo el vinagre. Dado que el vinagre contiene ácido acético, la mezcla no debe entrar en contacto con el hierro para evitar una reacción química.

En el experimento con ratas, la primera inyección intraperitoneal de benzoato de estradiol se administra el día 10, luego se administra la administración intragástrica del extracto de RC o CRV y, finalmente, se administra la inyección intraperitoneal de oxitocina. Después de la inyección intraperitoneal de oxitocina, el animal se observa durante 30 minutos y se extrae sangre inmediatamente. Por lo general, la concentración sanguínea alcanza un pico dentro de 1 h después de la administración intragástrica13, que es el mejor momento para tomar sangre.

Al determinar el extracto y las muestras de suero por LC-MS/MS, deben determinarse en el mismo lote para garantizar que el tiempo de retención del mismo componente en diferentes muestras sea consistente. En este experimento, la identificación de los componentes fue un punto difícil. Aunque se puede utilizar una base de datos relativamente madura para los metabolitos endógenos, no había una base de datos coincidente para identificar los componentes absorbidos en la sangre, por lo que se debe tener más cuidado en la identificación.

Diferencias en los componentes absorbidos en la sangre entre los grupos RC y CRV
Para determinar el ingrediente activo de la RC, este experimento investigó los componentes absorbidos en la sangre en ratas modelo de dismenorrea. En este experimento, se encontró que 15 constituyentes y dos metabolitos en la sangre diferían entre los grupos CR y CRV. Entre ellos, los niveles de (-)-mirtenol y ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético en el grupo de CRV fueron considerablemente más altos que en el grupo de RC, pero los niveles de otros componentes no fueron significativamente diferentes. El (-)-mirtenol y el ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético son terpenoides y se consideran los componentes efectivos del VRC.

Ligucyperonol y procurcumadiol se producen por la oxidación de α-ciperona e isocurcumenol, respectivamente, y la α-ciperona tiene un fuerte efecto analgésico. El mecanismo de acción propuesto puede reducir la expresión de COX-2 inducida por LPS y la síntesis de PGE2 a través de la regulación negativa de la señalización de NF-kB31. (+)-Nootkatone también inhibe la actividad de la COX-232,33. El isocurcumenol es el componente central del rizoma de cúrcuma en el tratamiento de la dismenorrea3, y su metabolito procurcumadiol puede tener un efecto analgésico. En comparación con el grupo RC, el grupo CRV mostró niveles considerablemente más altos de (-)-mirtenol, que tiene un efecto analgésico34. El posible mecanismo de acción puede ser que los cambios en la expresión de COX-235 aumenten los niveles de citoquinas antiinflamatorias (IL-10, IFN-γ) y reduzcan los niveles de citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β)36. El procesamiento con vinagre mejora los niveles de los ingredientes activos en la sangre, lo que puede ser la razón por la cual los productos producidos con vinagre son más efectivos.

Diferencias en las vías metabólicas entre los grupos RC y CRV
El análisis de la vía mostró vías metabólicas significativamente diferentes entre los grupos CR y CRV, incluso en términos de metabolismo de la fenilalanina, la biosíntesis de ácidos grasos insaturados, la biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano, y el metabolismo del ácido linoleico. Sin embargo, las vías metabólicas del metabolismo de la fenilalanina y la biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano no están relacionadas con la EP. Estos resultados muestran que las vías metabólicas asociadas con la eficacia mejorada de CRV son el metabolismo del ácido linoleico y la biosíntesis de ácidos grasos insaturados.

Los ácidos grasos insaturados incluyen dos tipos: omega-3 y omega-637. Tres precursores de mediadores, incluyendo el ácido eicosapentaenoico (20:5ω3; EPA), ácido docosahexaenoico (22:5ω3; DHA), y ácido araquidónico (20:5ω6; ARA), están implicados en la vía de la biosíntesis de ácidos grasos insaturados37,38. El metabolismo de EPA y ARA produce prostaglandinas y leucotrienos bajo la acción de la COX. ARA produce prostanoides de la serie 2, incluidos PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 y tromboxano (TXA 2, TXB 2), y leucotrienos de la serie 4, incluidos leucotrienos A 4 (LTA 4), leucotrienos B 4 (LTB 4), leucotrienos C 4 (LTC 4) y leucotrienos D 4 (LTD 4). Los prostanoides de la serie 3 incluyen prostaglandina E 3 (PGE 3), prostaciclina I 3 (PGI 3) y tromboxano A2 (TXA 3), y los leucotrienos de la serie 5 incluyen leucotrieno A 5 (LTA 5), leucotrieno B 5 (LTB 5), leucotrieno C 5 (LTC 5) y leucotrieno D 5 (LTD 5), que son producidos en gran parte por EPA.

El proceso de transformación del EPA es el mismo que el del ARA y está mediado por enzimas similares39. Los prostanoides de la serie 2 y los leucotrienos de la serie 4 tienen principalmente efectos proinflamatorios, de agregación plaquetaria y vasoconstricción. En contraste, los prostanoides de la serie 3 y los leucotrienos de la serie 5 muestran efectos antiinflamatorios, antiplaquetarios y vasodilatadores38. TXA 2 y TXB2 se producen a partir de ARA, lo que hace que los vasos sanguíneos se estrechen. Las IGP 3, PGE3 y TXA3 derivadas de EPA actúan sólo como vasodilatadores38,40. EPA y ARA compiten por la conversión en PGs por la enzima COX. Cuando aumenta la relación EPA/AA de membrana, los eicosanoides IGP 2 y TXA2, que promueven la agregación, pueden transformarse en TXA 3 e IGP 3, que promueven la antiagregación, lo que resulta en efectos antiinflamatorios y antiagregantes40. Además, el uso combinado de EPA, DHA y ácido linoleico (C18: 2ω6; LIN) puede reducir la liberación de PGF 2 α y PGE 2 en endometrio bovino y trofoblastos41,42.

La EP es probablemente causada por la producción de PGs y leucotrienos 43,44,45, particularmente PGs 46. Mientras tanto, un desequilibrio en vasopresina, β-endorfinas, estrógeno, progesterona, neurotransmisores, IL, ET-1 y NO también puede estar relacionado con la dismenorrea47. De acuerdo con los resultados de ELISA, los niveles de PGF 2α y PGF2α / PGE 2 en el grupo CRV disminuyeron, mientras que el nivel de PGE 2 aumentó en relación con el grupo CR. Además, el leucotrieno B4 (C02165) y la prostaglandina J2 (C05957) fueron más bajos en el grupo de VCR. Esto indica que, en el grupo de CRV, hubo niveles más bajos de prostanoides de la serie 2 hechos de ARA, incluido PGF2α, que es el factor más importante para la dismenorrea. La terapia con PGE 2 a altas concentraciones dilata los vasos sanguíneos, y PGE2 causa vasoconstricción a bajas concentraciones48. Por lo tanto, el útero se relaja con vasodilatación y se alivia la dismenorrea.

Como el cuerpo humano no puede sintetizar una cantidad suficiente de ácidos grasos insaturados C18, el ácido linoleico y el ácido α-linolénico, que son la única fuente de ácidos grasos insaturados C18, son muy importantes38. El ácido linoleico y el ácido α-linolénico son la fuente del metabolismo de los ácidos grasos insaturados omega-6 y omega-3, respectivamente. En particular, el precursor de la síntesis de prostaglandinas es ARA, y ARA se sintetiza a partir del ácido linoleico49. El ácido linoleico es un precursor, y una serie de metabolitos se sintetizan a partir de él, incluyendo ARA, prostaglandinas (PGF 2 α, PGE 2), prostaciclina (PGI 2) y tromboxano (TXA 2) 50. El ácido linoleico está estrechamente relacionado con el efecto analgésico mejorado de CRV. Además, la vía metabólica de la biosíntesis de hormonas esteroides puede producir progesterona 51,52,53 y esfingosina-1-fosfato (C06124), que son producidos por la vía metabólica del metabolismo de los esfingolípidos, inducir COX-2 y producir PGE2 a través de TNF54,55,56,57. Estos también pueden estar relacionados con la EP.

Hay algunas limitaciones en el protocolo. Solo se compararon los niveles relativos de los constituyentes, y la muestra estándar no se utilizó para cuantificar los componentes de la hierba y los absorbidos en la sangre. Las heces y la orina de las ratas no se recogieron en los experimentos con animales, lo que resultó en el descubrimiento de menos metabolitos de CR in vivo. Los experimentos de validación deberían confirmar aún más el mecanismo descubierto por el análisis metabonómico.

La estrategia y el protocolo utilizados en este estudio evitaron la ceguera en el estudio de componentes químicos in vitro y el estudio unilateral de componentes individuales in vivo. Por lo tanto, era muy adecuado para la exploración de mecanismos. La estrategia puede ahorrar mucho tiempo y trabajo y puede identificar con precisión los componentes críticos y el mecanismo para la eficacia terapéutica.

En este estudio, se encontró que había 15 constituyentes y dos metabolitos en la sangre. Entre ellos, los niveles de ácido (-)-mirtenol y [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético aumentaron significativamente en el grupo CRV en comparación con el grupo CR, mostrando que el procesamiento con vinagre puede aumentar los niveles de los ingredientes activos en la sangre. Después de que la RC se procesó con vinagre, los niveles de prostanoides de la serie 2 y leucotrienos de la serie 4 con propiedades proinflamatorias, de agregación plaquetaria y vasoconstricción disminuyeron, incluyendo PGF2α, leucotrieno B4 y prostaglandina J2. Este puede ser el mecanismo por el cual CRV demuestra un efecto analgésico mejorado.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Medicina China de la Comisión Municipal de Salud y Planificación Familiar de Chongqing (Número de proyecto: ZY201802297), Proyecto general de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (Número de proyecto: cstc2019jcyj-msxmX065), Característica del área montañosa moderna de Chongqing Plan de construcción de equipos de innovación del sistema de tecnología agrícola de alta eficiencia 2022 [10], y el Proyecto de construcción de disciplina clave de la Comisión Municipal de Salud de Chongqing de materia china Procesamiento de medicamentos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

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Retractación Número 190
Análisis de muestras crudas y procesadas de rizoma de Cyperi utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem en ratas con dismenorrea primaria
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Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

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