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Medicine

使用液相色谱-串联质谱分析原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi Rhizoma样品

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

在这里，使用超高效液相色谱-高分辨率串联质谱（UPLC-MS/MS）对原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi rhizoma（CR）样品进行了比较分析。检查CR处理的大鼠和醋处理的CR（CRV）大鼠之间代谢物和样品成分的血液水平变化。

Abstract

根瘤（CR）广泛用于妇科，是我国治疗妇女疾病的全科药物。由于用醋加工后CR的镇痛作用增强，因此临床上一般采用醋处理的CR（CRV）。然而，醋加工增强镇痛作用的机制尚不清楚。本研究采用超高压液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术检测CR处理和CRV处理痛经大鼠外源成分和代谢物血液水平的变化。结果显示，这些大鼠血液中的15种成分和两种代谢物含量不同。其中，CRV组的（-）-肉豆蔻醇和[（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸水平明显高于CR组。CRV降低具有促炎、血小板聚集和血管收缩活性的2系列前列腺素和4系列白三烯的水平，并通过调节花生四烯酸和亚油酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成提供镇痛作用。本研究表明，醋加工增强了CR的镇痛作用，有助于我们了解CRV的作用机制。

Introduction

原发性痛经（PD）是临床妇科中最普遍的疾病。它的特征是月经前或月经期间背痛、肿胀、腹痛或不适，生殖系统中没有盆腔病变1.一份关于其患病率的报告显示，85.7%的学生患有PD2。低剂量口服避孕药是标准疗法，但其不良副作用，如深静脉血栓形成，引起了越来越多的关注3。口服避孕药使用者深静脉血栓形成的患病率为每 1，000 名妇女 >1 例，在最初 6-12 个月和 40 岁以上的使用者中风险最高4。

长期用于传统中药（TCM），Cyperi rhizoma（CR）来源于Cyperaceae家族Cyperus rotundus L.的干燥根茎。CR调节月经紊乱，缓解抑郁和疼痛5.CR广泛用于妇科，被认为是治疗女性疾病的普通药物6。用醋（CRV）加工的CR通常用于临床。与CR相比，CRV显示出对月经和疼痛缓解的增强调节。现代研究表明，CR抑制环氧合酶-2（COX-2）和随后前列腺素（PGs）的合成，从而达到抗炎作用。同时，CR表现出无副作用的镇痛作用7，使CR成为痛经患者的不错选择。然而，CRV调节月经和缓解疼痛的机制尚不清楚。CR研究主要集中在其活性化学成分和药理活性的变化，如其抗炎，抗抑郁和镇痛作用8，9，10，11，12。

虽然中医的成分很复杂，但它们被吸收到血液中，必须达到特定的血液浓度才能有效13。通过利用血液中成分测定的策略，可以缩小中药活性成分的筛选范围。在体外研究化学成分时可以避免盲目，在研究单个成分时可以避免片面性14。通过比较血液中CR和CRV的组成，可以有效，快速地检测处理后的CR活性成分的变化。药物功效是药物影响身体的过程。由于身体的代谢反应引起的药物成分的变化，可能与药物的作用机制有关，可以用代谢组学来确定。代谢组学旨在测量整体和动态代谢反应，这与确定中药的整体疗效一致15。此外，代谢物是基因表达的最终产物，与表型16最密切相关。因此，代谢组学可能适用于探索CR和CRV在PD治疗中的代谢途径的差异。 基于液相色谱-高分辨率串联质谱（LC-MS/MS）的非靶向代谢组学具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，可用于测量许多不同的小分子成分17，18.该方法可以同时测定吸收到血液中的内源性代谢物和外源性成分。代谢组学已广泛应用于中医19、药物毒理学20、健康管理21、运动22、食品23等领域。

本研究采用基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学，测定CR处理和CRV治疗痛经模型大鼠血液中吸收的外源成分和内源性代谢物的差异，揭示CRV镇痛作用的机制。

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Protocol

所有与动物有关的实验均经重庆中医药研究院实验伦理委员会批准进行。本实验使用了24只8-10周龄，体重200克±20克的雌性Sprague Dawley大鼠（SD）。

1. 提取的准备

  1. 计算
    1. 计划将CR或CRV提取物施用于六只Sprague-Dawley大鼠（10g / [kg∙day]）的治疗组3天。使用浓度为 1 g/mL 的 CR 或 CRV 提取物（1 mL 提取物来自 1 g 草药）。
      注意：CR的剂量为6-10克。在这项研究中，使用最大剂量10g作为剂量。由于成年人的平均体重为60公斤，成人剂量为0.1667克/公斤。根据重量转换算法24，由于人与大鼠之间的剂量转换系数为6.3，因此大鼠的剂量为1.05 g/kg。大鼠用药剂量增加10倍至10.5g/kg。为方便计算和实际实验，剂量设定为10 g/kg。例如，通过计算，如果总共需要36克CR或CRV，则应至少制备两次中草药。因此，需要200 g CR - 使用100 g CR作为CR，并将100 g CR加工成CRV。
    2. 使用公式（1）计算每只大鼠要施加的CR或CRV的体积：
      V = 10 克/（公斤∙天） × 200 克/（1 克/毫升） = 2 毫升 （1）
  2. CRV 的处理
    1. 彻底混合100gCR和20g醋（>5.5g乙酸/ 100mL）并孵育12小时。
      注意：为确保CR的内部在12小时后被醋润湿，将CR和醋混合，充分搅拌，然后再次搅拌直至内部湿润。
    2. 将混合物在110-120°C的铁锅中翻炒10分钟。 然后，取出混合物，让它在室温下冷却。
      注意：为防止CR烧焦，必须在加热时不断搅拌。如果处理后的CRV太湿，可以在60°C下干燥。 当CR表面为棕褐色时，可以停止炒菜。
  3. 萃取
    1. CR提取物
      1. 向CR中加入10倍（CR量）纯水，浸泡2h。浸泡时确保药材低于液位。
        注意：CR只需要在提取前切成两半。浸泡的目的是更有效地提取活性成分。浸泡过程是必不可少的。
      2. 将水和药物的混合物用大火煮沸，并在小火下煮沸20分钟。用滤布（100目）过滤，并收集滤液。
        注意：煎煮时，煮沸前使用高温，并使用低火保持沸腾。
      3. 重复步骤1.3.1.2一次，并合并滤液。
      4. 用旋转蒸发器将提取物浓缩至1 g / mL（基于原始药物，浓缩温度必须低于60°C）。
        注意：CR中的活性成分是挥发性的，因此浓度温度不应高于60°C。
    2. CRV 提取物
      1. 执行与 CR 提取方法相同的步骤 （1.3.1.1-1.3.1.3）。
    3. 用于测试的 CR 提取物
      1. 将 500 μL CR 提取物和 500 μL 甲醇移液到 1.5 mL 微量离心管中，涡旋 30 秒混合。
        注意：甲醇和水的混合物可以更好地提取活性成分。不应直接过滤数据提取进行测试。
      2. 将每个样品在4°C下以1，6502 ×g 离心15分钟。 过滤上清液，然后将其转移到样品瓶中进行测试。
        注意：甲醇和提取物混合物高速离心后，上清液可直接转移到样品瓶中进行测定，无需过滤。由于离心过程产生的热量，最好使用低温离心机。
    4. 用于测试的 CRV 提取物
      1. 执行步骤 1.3.3.1-1.3.3.2 以准备用于测试的 CRV 数据提取。

2. 动物

  1. 计算
    1. 取50毫克苯甲酸雌二醇，加入50毫升橄榄油中，制备1毫克/毫升溶液。取50mg催产素，加入50mL生理盐水中，制备1mg/mL溶液。
      注意：腹腔注射苯甲酸雌二醇和催产素的剂量为10mg /（kg∙天）。苯甲酸雌二醇溶于橄榄油，催产素溶于生理盐水。苯甲酸雌二醇不易溶于橄榄油，可以用超声波处理以加速溶解。苯甲酸雌二醇和催产素溶液必须每天制备。
    2. 计算每只大鼠施用的苯甲酸雌二醇溶液的体积（即V = 10mg / [kg∙day]×200g / [1g / mL] = 2mL）。计算每只大鼠要施用的催产素溶液的体积（即V = 10mg / [kg∙day] × 200g / [1g / mL] = 2mL）。
  2. 动物分组和管理
    注：为管理分配了十天25，26。在治疗期间，大鼠可以不受限制地获得标准食物和水。在催产素给药后30分钟内，跟踪每只大鼠的扭动活动。PD大鼠模型开发成功，模型大鼠的扭转反应包括子宫收缩、单肢旋转、后肢伸展、空心躯干和腹部收缩26。
    1. 将24只雌性Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠，8-10周龄，体重200g±20g）随机对照，模型，CR和CRV分为四组，并喂养它们7天。
    2. 动物管理
      1. 每天腹膜内注射模型，CR和CRV组中的大鼠2mL苯甲酸雌二醇溶液。腹膜内向对照组的大鼠注射2mL生理盐水。
      2. 从第 8 天开始，完成步骤 2.2.2.1。然后，向CRV组的大鼠胃内施用2mL CRV提取物，向CR组大鼠施用2mL CR提取物，向对照组和模型组的大鼠施用2mL生理盐水。
      3. 在第 10 天，完成步骤 2.2.2.2。然后，腹膜内向模型，CR和CRV组中的大鼠注射2mL催产素溶液，对照组中的大鼠注射2mL生理盐水。
    3. 记录催产素注射后30分钟内大鼠的扭动时间。
  3. 样品采集
    1. 收集腹主动脉血样，快速彻底切除子宫，并小心分离粘附在子宫壁上的结缔组织和脂肪。
      注意：在最终剂量后1小时内收集血液。
    2. 使用微量离心管保存子宫组织并将其转移到液氮中。将组织样品储存在-80°C。
    3. 将血液样品以4，125× g离心10分钟。除去含血清的上清液，并在4°C下以16，502× g 离心10分钟。 离心血清，然后将其保存在-80°C的管中储存。
      注意：血液样本必须在室温下放置1小时以进行再处理。
  4. 来样加工
    1. 血清样本
      1. 将 400 μL 甲醇和 200 μL 血清放入微量离心管中，涡旋 30 秒混合。将每个样品在4°C下以16，502× g 离心15分钟。 收集并过滤后，用上清液填充样品瓶。将每个样品中的所有上清液与相同体积混合，以制备用于测试的质量控制样品。
    2. 子宫组织样本
      1. 从同侧段取100毫克子宫组织，并用9倍体积的生理盐水研磨。将匀浆以4，125× g离心10分钟，并收集上清液。将上清液置于4°C的冰箱中进行测试，如果不在同一天测试，则置于-80°C的冰箱中。
      2. 将生理盐水，纸巾和钢球放入2mL微量离心管中，将微量离心管放入液氮中3-5秒，然后将组织放入组织粉碎机中进行研磨。
  5. 样品测试
    1. 使用酶联免疫吸附测定（ELISA）测量大鼠样品子宫组织中的PGF2α 和PGE2 含量。
      注意：大鼠PGE 2 ELISA试剂盒用于测量PGE2含量，大鼠PGF 2α ELISA试剂盒用于测量PGF2α水平。详细步骤可以在制造商的说明中找到。材料表中给出了套件的详细信息。
    2. 使用UPLC-MS/MS评估血清样本、CR提取物和CRV提取物。
      1. 对于UPLC，使用C18色谱柱（2.6 μm，2.1 mm x 100 mm）和二元梯度法，流动相A含有0.1%甲酸，流动相B含有乙腈。洗脱梯度设置如下：从0分钟到1分钟，15%B;从1分钟到8.5分钟，15%到85%B;从8.5分钟到11.5分钟，85%B;从11.5分钟到11.6分钟，99%到1%B;从11.6分钟到15分钟，15%B.将流速设置为0.35mL / min，进样体积设置为2μL。
      2. 对于MS，将温度设置为600°C，帘式气体（CUR）流量设置为0.17MPa，护套和辅助气体流量设置为0.38MPa。将正离子模式和负离子模式的离子喷雾电压分别设置为5.5 kV和-4.5 kV，将去簇电位（DP）电压设置为80 V或-80 V，将碰撞能量（CE）设置为40 eV或-25 eV，将碰撞能量叠加（CES）设置为35 eV±15 eV。
      3. 使用UPLC-MS/MS按照制造商的方案进行测试，对50-1，000 m/z的质量范围进行MS。
      4. 使用匹配工作站程序结合检测模式的信息相关采集、多质量数缺陷过滤器和动态背景推断，获取UPLC-MS/MS结果。使用混合血清的质控样品测试UPLC-MS/MS设备的重复性和稳定性，以验证常规方法。在研究样品之前，连续四次注射质控样品，然后在每五个血清样品后注射。

3. 数据处理

  1. 数据准备
    1. 使用转换软件将原始数据转换为 mzXML 格式。归一化每个样品的总离子电流 （TIC） 数据。
      注意：基于XCMS构建的基于R的内部应用程序（www.lims2.com）用于分析积分，对齐，提取和峰检测的信息27。
    2. 使用专有的 MS2 数据库 （www.lims2.com） 进行代谢物注释。将注释阈值设置为 0.328。
      注意：在每组中鉴定内源性代谢物。
  2. 主成分分析和正交偏最小二乘判别分析
    1. 使用分析软件执行主成分分析 （PCA） 和建模。将代谢物的标准化数据导入分析软件。然后，使用 自动调整 来构建分析模型。最后，使用分数得到PCA的 分数 散点图。
      注意：每个组的聚类是用 PCA 的分数散点图获得的。PCA是一种无监督分析模式，主要通过降维对样品进行分组，无需干预。
    2. 使用分析软件执行正交偏最小二乘判别分析 （OPLS-DA）。
      1. 将CR和CRV组中代谢物的标准化数据导入分析软件。
      2. 将CR组的数据导入到创建的CR组中，并将CRV组的数据导入到创建的CRV组中。
        注意：OPLS-DA是一种监督分析模式，需要对样品进行分组。
      3. 然后，使用 自动拟合 构建分析模型，并使用分数获得OPLS-DA的 分数 散点图。最后，使用VIP获取OPLS-DA中投影（ VIP ）值中的可变显著性。
        注意：CR和CRV组中代谢物的投影（VIP）值的可变意义是通过OPLS-DA获得的。
  3. 鉴定潜在的差异代谢物
    1. 筛选出步骤3.2.2.3中VIP值大于1的代谢物。
    2. 使用统计软件计算在步骤3.3.1中通过学生t检验筛选出的代谢物的P值。
      注意：CR组和CRV组中潜在差异代谢物的显着差异由学生t检验确定。潜在的差异代谢物是学生的t检验p值<0.05且投影（VIP）中的可变显著性大于1的代谢物。该表示是使用火山图完成的。
  4. 鉴别鉴别代谢物
    1. 筛选出步骤3.3中潜在的差异代谢物。使用步骤3.1.2的结果来鉴定这些差异代谢物。
      注意：鉴定了少量潜在的差异代谢物，它们成为候选的差异代谢物。
    2. 筛选出要在KEGG数据库中匹配的差异代谢物。通过绘制热图显示CR和CRV组中差异代谢物的变化。
      注意：少数候选差异代谢物被匹配，它们成为差异代谢物。
  5. 检查潜在的代谢途径
    1. 将不同的代谢物上传到代谢分析师（www.metaboanalyst.ca）数据库。
    2. 使用通路分析获得潜在的代谢 通路 。
      注意：在CR和CRV组中获得了潜在的代谢途径。 P 值和影响值是关键路径选择的两个非常重要的指标。 P 值比影响值更重要。显著性由 P 值定义 < 0.05;更大的影响值与更好的相关性相关。
    3. 通过将不同的代谢物上传到KEGG（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）数据库来分析潜在的代谢途径。
      注意：还应考虑代谢途径的功能与PD之间的关系。获得关键的代谢途径。
  6. 识别吸收到血液中的成分
    1. 使用内部 MS2 数据库 （www.lims2.com）、人类代谢组数据库 （HMDB） 以及 Massbank 和 Chemspider 数据库鉴定 CR 和 CRV 提取物中的化学成分。
    2. 确定CR和CRV组中吸收到血液中的成分，并比较CR和CRV组之间的成分。
      注意：吸收到血液中的成分必须在CR或CRV组中检测到，但在对照组中无法检测到。
  7. 统计分析
    1. 使用单变量分析 （UVA） 和多变量统计方法分析数据，包括方差分析 （ANOVA） 和学生 t 检验。
      注意：实验信息使用统计软件作为平均±标准差（±SD）表示。 P < 0.01 被认为是非常显著的差异， P < 0.05 代表显著差异28。

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Representative Results

痛经模型实验分析
对照组30分钟内无扭动反应，因为这些大鼠未腹腔注射催产素和苯甲酸雌二醇引起疼痛。模型组、CR组和CRV组的大鼠在注射催产素后表现出大量的扭动反应。这些结果证明了苯甲酸雌二醇和催产素联合用药诱导痛经的疗效。模型组和对照组之间PGF 2α、PGE 2和PGF2α/PGE2水平的差异显著（P < 0.001，P < 0.05），证明了 模型的有效性（图1）。

Figure 1
图1：子宫组织中的PGF 2 α和PGE2含量以及每组中的扭动数。 （A）PGF2 α每组子宫组织中的含量。（B）每组子宫组织中PGE2的含量。（C）每组子宫组织中PGF 2 α/PGE2含量。（D）每组中扭动的数字。这些列表示四组（每组六只小鼠）的平均±SEM。* P < 0.05 或 ** P < 0.01 表示与模型组相比有显著差异，Δ P < 0.05 或 ΔΔ P < 0.01 表示与 CR 组相比有显著差异。模型、CR和CRV组中的大鼠在注射催产素后表现出实质性的扭动反应。缩写：PG =前列腺素;CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。请点击此处查看此图的大图。

CRV组和CR组PGF2α和PGF2α/PGE2浓度降低，CRV组降低更为明显。CRV组和CR组之间PGF2α和PGF2α/PGE 2的浓度也存在显著差异（P < 0.001和P < 0.05）。 与模型组相比，CRV组和CR组PGE2浓度显著较高（P < 0.001），CRV组增加最多。

质量管理
在质量控制样品中，BPC色谱峰的保留时间与信号强度之间具有良好的对应关系，显示出高水平的仪器稳定性和数据质量的一致性（补充文件1-补充图1和补充图2）。此外，所有质控样品均在±2个标准差以内（图2A，B），质控样品之间的相关性大于0.7（图2C，D）。这些结果表明该程序是可靠的，并且结果是可信的。

Figure 2
图2：质量控制样品的PCA-X一维分布。 （A）正模式，（B）负模式;（C）阳性模式和（D）阴性模式下质量控制样品的相关性分析。所有质控样品均在±2个标准差以内，质控样品间相关性均大于0.7。这些结果表明，该程序是可靠的，信息是可信的。缩写：PC = 主成分;PCA = 主成分分析;质量管理;CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。 请点击此处查看此图的大图。

主成分分析
如图 3 所示，横坐标 PC （1） 表示第一主成分的分数，而纵坐标 PC （2） 表示第二主成分的分数。图中，绿色圆圈表示对照组，红色圆圈表示模型组，蓝色圆圈表示CR组，白色圆圈表示CRV组，粉色圆圈表示质控组。

Figure 3
图 3：PCA 的分数散点图。 （A） 正模式和 （B） 负模式。质量控制样品重叠，这表明仪器非常稳定。每个组都分布在自己的区域内，只有CR组和CRV组偶尔交叉路径。缩写：PC = 主成分;PCA = 主成分分析;质量控制 = 质量控制;CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。请点击此处查看此图的大图。

PCA分析结果表明，CR组和模型组的团簇在正负离子模式下均有显著分离。CRV组和模型组在正负离子模式下的团簇均显著分离。将质控组、模型组和对照组与其他治疗组（CR、CRV）分开。CR和CRV基团偶尔在正离子模式下重叠。在负离子模式下，各组均显著分离。

正交偏最小二乘法判别分析
OPLS-DA用于筛查代谢差异。OPLS-DA 散点图显示所有样本都在 95% 置信区间内（Hotelling 的 T 方椭圆）。图4A，C表明CR组和CRV组是分开的。使用排列检验（n = 200）测试模型过拟合，并评估模型的统计显著性。在图 4B，D 中，纵坐标表示 R 2 Y 或 Q2值的值，横坐标表示替换保留。R2 Y 由绿点表示，Q2 由蓝色方点表示，两条虚线表示其对应的回归线。在正和负模式下，R 2 Y值分别为0.8和0.84，Q2值分别为-0.59和-0.57。这证明了该模型的高可靠性和不存在过度拟合。

Figure 4
图 4：CR 组与 CRV 组的 OPLS-DA 模型。（A） 正模式和 （C） 负模式下的分数散点图。在 （B） 阳性模式和 （D） 阴性模式下，CR 组与 CRV 组的 OPLS-DA 模型的置换检验。在正负模式下，R 2 Y分别为0.8和0.84，Q2分别为-0.59和-0.57。这证明了该模型的高可靠性和不存在过度拟合行为。缩写：OPLS-DA = 正交偏最小二乘判别分析;CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。请点击此处查看此图的大图。

单变量统计分析
进行单变量统计分析以确定代谢变化。在VIP>1和P <0.05的标准筛选下，正离子和负离子模式下分别检测到339和394种电位差异代谢物。火山图如图5所示，其中每个点对应于不同的代谢物。纵坐标显示学生 t 检验的 P 值，横坐标反映组中每个分子水平的多个变化。散点大小表示 OPLS-DA 模型的 VIP 值;VIP 值随着散点的大小而增加。红点表示增加，蓝点表示减少，灰色表示无显著差异。

使用二次质谱对候选差异代谢物进行定性分析。在阳性模式下观察到63种代谢物（补充文件1-补充表1）和30种阴性模式的代谢物（补充文件1-补充表2）的显着变化。使用KEGG和HDMB数据库测定差异代谢物。精确匹配的化合物被鉴定为差异代谢物，这些代谢物列于表3和表4中。

Figure 5
图 5：CR 组与 CRV 组的火山图。 （A） 正模式和 （B） 负模式。在所代表的火山图中，每个点对应于不同的代谢物。纵坐标显示学生 t 检验的 P 值，横坐标反映组中每种物质的多重变化。散点大小表示 OPLS-DA 模型的 VIP 值。VIP 值随着散点的大小而增加。红点表示增加，蓝点表示减少，灰色表示无显著差异。缩写：OPLS-DA = 正交偏最小二乘判别分析;VIP = 投影中的可变显著性;CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。请点击此处查看此图的大图。

代谢物比较
计算CR组和CRV组差异代谢物定量值的欧氏距离矩阵，采用综合相关方法对差异代谢物进行聚类。

横坐标表示不同的实验组，而纵坐标表示 图 6 中的相对水平。色块的位置表明每种代谢物相对于其他代谢物的表达方式。在正离子模式下，与CR组相比，CRV组中4种差异代谢物水平升高，而11种差异代谢物水平下降。在负离子模式下，与CR组相比，CRV组中4种差异代谢物水平升高，7种差异代谢物水平降低。

Figure 6
图 6：CRV 组与 CR 组的热图分析。 （A） 正模式和 （B） 负模式。横坐标代表不同的实验组，纵坐标代表相对表达水平。色块的位置表明每种代谢物相对于其他代谢物的表达方式。缩写：CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。请点击此处查看此图的大图。

与CR组相比，CRV组增加的代谢产物为1-磷酸鞘氨醇、川芷素、甘油磷酸胆碱、溶血（18：1（9z））、2-羟基-6-十五烷基苯甲酸、9，10-环氧十八烯酸、13s-羟基十八碳二烯酸和2-甲氧基雌酮，降低的代谢产物为皮质酮、吲哚乙酸、甘胆酸、小檗碱、邻苯二甲酸二丁酯、视黄醇、白三烯B4、前列腺素J2、21-羟基孕烯醇酮、泽拉醇、同型半胱氨酸、丙炔酸、 硬脂酸，二十二碳六烯酸，苯乙酰甘氨酸，L-苯丙氨酸，雌酮葡糖苷酸和柠檬酸（图7）。

Figure 7
图 7：CRV 和 CR 组中潜在代谢物的相对水平趋势。 （A） 正模式和 （B） 负模式。阳性模式下，与CR组相比，CRV组4种差异代谢物水平升高，11种水平下降。阴性模式下，CRV组4种差异代谢物水平升高，7种差异代谢物水平下降。这些列表示四组（每组六只小鼠）的平均±SEM。* P < 0.05、** P < 0.01 或 *** P < 0.01 代表 CRV 和 CR 组之间的显著差异。 缩写：CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。请点击此处查看此图的大图。

凯格通路分析
注释差异代谢物，并分析KEGG途径。结果表明，差异代谢物分别与阳性和阴性模式下的9种途径相关（表1 和 表2）。 在图8中，每个代谢途径在气泡图中由一个气泡表示，更显着的尺度表示更大的影响因子。在拓扑分析中影响因子的路径大小由气泡图的横坐标和气泡大小表示。气泡图的纵坐标和气泡颜色表示富集分析的 P 值（取负自然对数，即 −ln （p））。富集程度更显著， P 值越小，纵坐标值越突出，颜色越深。 P 值和影响值是关键途径选择的两个非常重要的指标。通常， P 值比影响值更重要。

Figure 8
图 8：CRV 组与 CR 组的通路分析 。 （A） 正模式和 （B） 负模式。每个代谢途径都由气泡图中的气泡表示。气泡图的横坐标和气泡大小表示拓扑分析中路径影响因素的大小。气泡图的纵坐标和气泡颜色表示富集分析的 P 值。关键的代谢途径包括不饱和脂肪酸的生物合成和亚油酸代谢。缩写：CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。 请点击此处查看此图的大图。

表3和表4显示了具有显着差异的代谢途径 - 苯丙氨酸代谢和亚油酸代谢，以及不饱和脂肪酸，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成。虽然代谢途径包括类固醇激素生物合成、鞘脂和花生四烯酸代谢，但无显著差异，与痛经有关。结果表明，亚油酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成是CRV功效增强的关键代谢途径。

吸收到血液中的成分
在CR和CRV组的大鼠血清中检测到来自CRV和CR提取物的15种成分和两种代谢产物（表5）。所有17种组分均处于正离子模式。

使用学生t检验比较两组血液样本中的相对成分水平。图 9 中的横坐标显示了各种实验组;纵坐标表示质谱的响应值。有两个组件存在显着差异。分析表明，CRV组的这两种成分水平均高于CR组，而15种成分的水平没有显著变化。

Figure 9
图 9：CRV 组与 CR 组吸收到血液中的成分。 CR组和CRV组大鼠血清中CRV和CR提取物含有15种成分和2种代谢产物。分析表明，与CR组相比，CRV组两种成分的血液水平升高，而15种成分的血液水平没有明显变化。其中，CRV组的（-）-肉豆蔻醇和[（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸水平明显高于CR组。* P < 0.05 或 ** P < 0.01 表示 CRV 组和 CR 组之间的显著差异。缩写：CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。 请点击此处查看此图的大图。

表1：阳性模式下的代谢差异。 缩写：KEGG = 京都基因和基因组百科全书;VIP = 投影中的可变显著性;RT = 保留时间。 请按此下载此表格。

表2：阴性模式下的代谢差异。 缩写：KEGG = 京都基因和基因组百科全书;VIP = 投影中的可变显著性;RT = 保留时间。 请按此下载此表格。

表3：阳性模式下的代谢途径分析。 缩写：KEGG = 京都基因和基因组百科全书。 请按此下载此表格。

表4 阴性模式下的代谢途径分析。 缩写：KEGG = 京都基因和基因组百科全书。 请按此下载此表格。

表5：大鼠血清中原型成分和代谢物的鉴定。 注意：M1和M2是代谢物;其他成分是原型成分。 请按此下载此表格。

补充文件1：吸收到裸鼠血液中的成分的BPC图和MS2 色谱图。 正负模式下所有质量控制样品的BPC图;吸收到大鼠血液中的17种成分的MS2 色谱图：D-莰烯，（-）-肉豆蔻醇，对羟基苯甲酸乙酯，炉甘烯，α-环哌酮，（+）-nootkatone，（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸， 4-（2-（2.2.1）-双环庚基甲基）苯甲酸， 10，12-过氧菖蒲烯， （1aS，10aR）-1a，5，9-三甲基-1a，3，6，10a-四氢氧基氮[4，5]环癸[1，2-b]呋喃-10（2H）-酮， 紫檀素D， 特环酸， 乙酸杉金酯，3-乙酰基-13-脱氧磷酰胺，异姜黄烯醇，甘哌醇，普罗库二醇。还包括通过二次质谱法鉴定的正离子和负离子模式下的差异代谢物以及HDMB和KEGG数据库。 请点击此处下载此文件。

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Discussion

由于中药种类繁多，性质各异，这些中药材有时在临床上不起作用，这可能是由于中药加工和煎煮不当造成的。随着当代科学技术的使用，中医的机制变得越来越明显29，30.本研究表明，CR和CRV均对PD模型大鼠具有治疗效果，且CRV的治疗效果更为显著。CRV的作用机制可能与醋加工可能影响被吸收到血液中的CR成分有关，并且可能与亚油酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成有关。 图 10 描述了 CRV 在缓解疼痛方面的作用的潜在途径。

Figure 10
图10：CRV增强镇痛作用的机制。 结果显示，血液中发现了15种成分和两种代谢物。其中，CRV组的（-）-肉豆蔻醇和[（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸水平显著高于CR组。CRV可以通过调节花生四烯代谢、不饱和脂肪酸的生物合成和亚油酸代谢，降低ARA制成的2系前列腺素和4系白三烯的含量 ， 达到镇痛作用。缩写：ARA = 花生四烯酸;COX = 环加氧酶;LA = 亚油酸;多不饱和脂肪酸 = 多不饱和脂肪酸;GLA =γ-亚麻酸;DGLA = 二同γ亚麻酸;PD = 原发性痛经;PG = 前列腺素;LT = 白三烯;TX = 血栓素;SDA = 硬脂酸;ETA = 二十碳四烯酸;EPA = 二十碳五烯酸;CR = 根茎;CRV = 用醋处理的 CR。 请点击此处查看此图的大图。

实验期间的注意事项
由于CR有效成分的油是挥发性的，因此提取CR的时间不应超过20 min，当它沸腾时，应在浓缩过程中温度不超过60°C的低温下加热。为确保有效成分的成功提取，草药必须在煎煮前在水中浸泡至少2小时，以便在浸泡完成后使草药变湿。在CR加工过程中，醋必须与草药充分混合，以便醋可以完全渗透到其中。如果醋量太低而无法彻底润湿草药，可以加入少量的水稀释醋，然后将醋与草药充分混合。混合完成后，草药将吸收所有的醋。由于醋含有乙酸，因此混合物不应与铁接触，以免发生化学反应。

在大鼠实验中，在第10天给予第一次腹腔注射苯甲酸雌二醇，然后胃内施用CR或CRV提取物，最后腹腔注射催产素。腹腔注射催产素后，观察动物30分钟，并立即采血。通常，血药浓度在胃内给药13后1小时内达到峰值，这是取血的最佳时间。

采用LC-MS/MS测定提取物和血清样品时，应在同一批次中测定，以确保同一组分在不同样品中的保留时间一致。在这个实验中，组件的识别是一个困难点。虽然内源性代谢物可以使用相对成熟的数据库，但没有匹配的数据库来鉴定吸收到血液中的成分，因此在鉴定时应更加小心。

CR组和CRV组之间吸收到血液中的成分的差异
为了确定CR的活性成分，该实验研究了痛经模型大鼠吸收到血液中的成分。在该实验中，发现CR组和CRV组血液中的15种成分和两种代谢物存在差异。其中，CRV组的（-）-肉豆蔻醇和[（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸水平明显高于CR组，但其他组分水平差异不显著。（-）-肉豆蔻醇和[（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸是萜类化合物，被认为是CRV的有效成分。

甘哌酮醇和普罗哌二醇分别由α-氯哌酮和异姜黄烯醇氧化产生，α-氯哌酮具有很强的镇痛作用。所提出的作用机制可能通过NF-kB信号传导的负调节来降低LPS诱导的COX-2表达和PGE2合成31。（+）-Nootkatone还抑制COX-2活性32，33。异姜黄烯醇是姜黄治疗痛经3的核心成分，其代谢产物procurcumadiol可能具有镇痛作用。与CR组相比，CRV组显示出相当高水平的（-）-肉豆蔻醇，其具有镇痛作用34。可能的作用机制可能是COX-235表达的变化增加抗炎细胞因子（IL-10，IFN-γ）的水平并降低促炎细胞因子（TNF-α，IL-1β）水平36。用醋加工可以提高血液中活性成分的水平，这可能就是为什么用醋生产的产品更有效的原因。

CR组和CRV组之间代谢途径的差异
通路分析显示，CR组和CRV组之间的代谢途径存在显著差异，包括苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及亚油酸代谢。然而，苯丙氨酸代谢和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的代谢途径与PD无关。这些结果表明，与CRV功效增强相关的代谢途径是亚油酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成。

不饱和脂肪酸包括两种类型：欧米茄-3和欧米茄-637。介质的三种前体，包括二十碳五烯酸（20：5ω3;EPA）、二十二碳六烯酸（22：5ω3;DHA）和花生四烯酸（20：5ω6;ARA），参与不饱和脂肪酸途径37，38的生物合成。EPA和ARA代谢在COX的作用下均产生前列腺素和白三烯。ARA 生产 2 系列前列腺素类化合物，包括 PGF 2 α、PGE 2、PGI 2 和血栓素（TXA 2、TXB 2）和 4 系列白三烯，包括白三烯 A 4 （LTA 4）、白三烯 B 4 （LTB 4）、白三烯 C 4 （LTC 4） 和白三烯 D 4 （LTD 4）。3 系列前列腺素类化合物包括前列腺素 E 3 （PGE 3）、前列环素 I 3 （PGI 3） 和血栓素 A2 （TXA 3），5 系列白三烯包括白三烯 A 5 （LTA 5）、白三烯 B 5 （LTB 5）、白三烯 C 5 （LTC 5） 和白三烯 D 5 （LTD 5），它们主要由 EPA 生产。

EPA的转化过程与ARA相同，由相似的酶介导39。2系列前列腺素类和4系列白三烯主要具有促炎、血小板聚集和血管收缩作用。相比之下，3 系列前列腺素类化合物和 5 系列白三烯具有抗炎、抗血小板和血管舒张作用38。TXA 2 和 TXB2 由 ARA 产生，导致血管变窄。EPA 衍生的 PGI 3、PGE 3 和 TXA3 仅作为血管扩张剂38，40。EPA和ARA竞争通过COX酶转化为PG。当膜EPA/AA比值增加时，促进聚集的类花生酸PGI 2和TXA2可以转化为促进抗聚集的TXA 3和PGI 3，从而产生抗炎和抗聚集作用40。此外，EPA、DHA和亚油酸（C18：2ω6;LIN）可以减少牛子宫内膜和滋养层中PGF2α和PGE2释放41，42。

PD可能是由PGs和白三烯43，44，45，特别是PGs46的产生引起的。同时，加压素、β-内啡肽、雌激素、孕酮、神经递质、IL、ET-1 和 NO 的不平衡也可能与痛经有关47。根据ELISA结果，CRV组PGF 2α和PGF 2α/PGE 2水平下降，而PGE 2水平相对CR组升高。此外，CRV 组中白三烯 B4 （C02165） 和前列腺素 J2 （C05957） 较低。这表明，在CRV组中，由ARA制成的2系列前列腺素类药物水平较低，包括PGF2α，这是痛经的最重要因素。高浓度的PGE 2治疗会扩张血管，PGE2在低浓度下引起血管收缩48。因此，通过血管舒张使子宫松弛，痛经得到缓解。

由于人体不能合成足量的C18不饱和脂肪酸，亚油酸和α-亚麻酸是C18不饱和脂肪酸的唯一来源，非常重要38。亚油酸和α-亚麻酸分别是ω-6和ω-3不饱和脂肪酸代谢的来源。特别是前列腺素合成的前体是ARA，ARA是由亚油酸49合成的。亚油酸是前体，由其合成一系列代谢产物，包括ARA、前列腺素（PGF 2 α、PGE 2）、前列环素（PGI 2）和血栓素（TXA 2）50。亚油酸与CRV增强的镇痛作用密切相关。此外，类固醇激素生物合成的代谢途径可产生由鞘脂代谢途径产生的黄体酮51，52，53和鞘氨醇-1-磷酸（C06124），诱导COX-2，并通过TNF 54，55，56，57产生PGE2。这些也可能与PD有关。

该协议存在一些限制。仅比较成分的相对水平，标准样品未用于量化草药中的成分和吸收到血液中的成分。动物实验中未收集大鼠的粪便和尿液，导致体内CR代谢物的发现较少 。 验证实验应进一步证实代谢组学分析发现的机制。

本研究中使用的策略和方案避免了 体外 化学成分研究和 体内单个组分的片面研究的失明。因此，它非常适合机制探索。该策略可以节省大量的时间和工作，并且可以准确识别治疗效果的关键成分和机制。

在这项研究中，发现血液中有15种成分和两种代谢物。其中，CRV组的（-）-肉豆蔻醇和[（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸水平明显高于CR组，表明用醋处理可以提高血液中有效成分的水平。醋处理CR后，具有促炎、血小板聚集和血管收缩特性的2系列前列腺素类和4系列白三烯水平下降，包括PGF2α、白三烯B4和前列腺素J2。这可能是CRV表现出增强镇痛作用的机制。

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Disclosures

提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作得到了重庆市卫生和计划生育委员会中医药科技项目（项目编号：ZY201802297）、重庆市自然科学基金面上项目（项目编号：cstc2019jcyj-msxmX065）、重庆市现代山区特色高效农业科技体系创新团队建设规划2022[10]、重庆市卫生健康委员会中药重点学科建设项目的支持。 医药加工。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

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撤稿，第 190 期，
使用液相色谱-串联质谱分析原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi Rhizoma样品
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Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

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