Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحليل عينات جذمور Cyperi الخام والمعالجة باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة في الفئران المصابة بعسر الطمث الأولي

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

هنا ، يتم تقديم تحليل مقارن لعينات جذمور Cyperi الخام والمعالجة (CR) باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي الترادفي عالي الدقة للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (UPLC-MS / MS) في الفئران المصابة بعسر الطمث الأولي. تم فحص التغيرات في مستويات الدم من المستقلبات ومكونات العينة بين الفئران المعالجة ب CR و CR المعالجة بالخل (CRV).

Abstract

يستخدم Cyperi rhizoma (CR) على نطاق واسع في أمراض النساء وهو دواء عام لعلاج أمراض النساء في الصين. نظرا لأن التأثير المسكن ل CR يتم تعزيزه بعد المعالجة بالخل ، فإن CR المعالج بالخل (CRV) يستخدم بشكل عام سريريا. ومع ذلك ، فإن الآلية التي يتم من خلالها تعزيز التأثير المسكن عن طريق معالجة الخل غير واضحة. في هذه الدراسة ، تم استخدام تقنية قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط العالي للغاية (UPLC-MS / MS) لفحص التغيرات في مستويات الدم للمكونات الخارجية والمستقلبات بين الفئران المعالجة ب CR والمعالجة ب CRV المصابة بعسر الطمث. كشفت النتائج عن مستويات مختلفة من 15 مكونا واثنين من المستقلبات في دم هذه الفئران. من بينها ، كانت مستويات (-) -myrtenol و [(1R ، 2S ، 3R ، 4R) -3-hydroxy-1،4،7،7-tetramethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl] حمض الخليك في مجموعة CRV أعلى بكثير منها في مجموعة CR. خفضت CRV مستوى البروستانويدات من السلسلة 2 و 4 من الليكوترينات مع أنشطة الالتهاب وتراكم الصفائح الدموية وتضيق الأوعية وقدمت تأثيرات مسكنة عن طريق تعديل حمض الأراكيدونيك واستقلاب حمض اللينوليك والتخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة. كشفت هذه الدراسة أن معالجة الخل تعزز التأثير المسكن ل CR وتساهم في فهمنا لآلية عمل CRV.

Introduction

عسر الطمث الأولي (PD) هو الحالة الأكثر انتشارا في أمراض النساء السريرية. يتميز بألم الظهر أو التورم أو آلام البطن أو عدم الراحة قبل أو أثناء الحيض دون أمراض الحوض في الجهاز التناسلي1. أظهر تقرير عن انتشاره أن 85.7٪ من الطلاب يعانون من PD2. موانع الحمل الفموية منخفضة الجرعة هي العلاج القياسي ، لكن آثارها الجانبية الضارة ، مثل تجلط الأوردة العميقة ، جذبت اهتماما متزايدا3. يبلغ معدل انتشار تجلط الأوردة العميقة بين مستخدمي وسائل منع الحمل عن طريق الفم >1 لكل 1000 امرأة ، ويكون الخطر أعلى خلال الأشهر 6-12 الأولى وفي المستخدمين الذين تزيد أعمارهم عن 40 عاما4.

يستخدم Cyperi rhizoma (CR) منذ فترة طويلة في الطب الصيني التقليدي (TCM) ، وهو مشتق من جذمور مجفف من Cyperus rotundus L. من عائلة Cyperaceae. ينظم CR اضطرابات الدورة الشهرية ويخفف من الاكتئاب والألم5. يستخدم CR على نطاق واسع في أمراض النساء ويعتبر دواء عام لعلاج أمراض النساء6. عادة ما يتم استخدام CR المعالج بالخل (CRV) سريريا. بالمقارنة مع CR ، يظهر CRV تنظيما معززا للحيض وتخفيف الآلام. أظهرت الدراسات الحديثة أن CR يثبط انزيمات الأكسدة الحلقية -2 (COX-2) والتوليف اللاحق للبروستاجلاندين (PGs) ، وبالتالي تحقيق تأثير مضاد للالتهابات. وفي الوقت نفسه ، يظهر CR تأثيرا مسكنا بدون آثار جانبية7 ، مما يجعل CR خيارا جيدا لمرضى عسر الطمث. ومع ذلك ، فإن الآلية الكامنة وراء تنظيم الحيض وتوفير تخفيف الآلام بواسطة CRV غير واضحة. ركزت أبحاث CR بشكل أساسي على التغيرات في مكوناتها الكيميائية النشطة وأنشطتها الدوائية ، مثل آثارها المضادة للالتهابات ومضادات الاكتئاب والمسكنات8،9،10،11،12.

على الرغم من أن مكونات الطب الصيني التقليدي معقدة ، إلا أنها تمتص في الدم ويجب أن تصل إلى تركيز دم معين لتكون فعالة13. يمكن تضييق نطاق فحص المكونات النشطة للطب الصيني التقليدي من خلال استخدام استراتيجية تحديد المكونات في الدم. يمكن تجنب العمى في دراسة المكونات الكيميائية في المختبر ، ويمكن تجنب جانب واحد في دراسة المكونات الفردية14. من خلال مقارنة تركيبات CR و CRV في الدم ، يمكن اكتشاف التغييرات في المكونات النشطة ل CR المعالج بشكل فعال وسريع. فعالية الدواء هي العملية التي يؤثر بها الدواء على الجسم. يمكن تحديد التغييرات في مكونات الدواء بسبب الاستجابة الأيضية للجسم ، والتي قد تكون مرتبطة بآلية عمل الدواء ، باستخدام الأيض. يهدف الأيض إلى قياس الاستجابات الأيضية الشاملة والديناميكية ، والتي تتوافق مع تحديد الفعالية الكلية للطب الصيني التقليدي15. علاوة على ذلك ، فإن المستقلبات هي المنتج النهائي للتعبير الجيني ، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا بالأنماط الظاهرية16. وبالتالي ، قد تكون الأيضات مناسبة لاستكشاف الاختلافات في المسارات الأيضية بين CR و CRV في علاج مرض باركنسون. تتميز الأيضات غير المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي الترادفي عالي الدقة (LC-MS / MS) القائمة على الكروماتوغرافيا السائلة بالإنتاجية العالية والحساسية العالية والدقة العالية ويمكن استخدامها لقياس العديد من المكونات الجزيئية الصغيرة المختلفة17,18 . يمكن لهذه الطريقة تحديد المستقلبات الداخلية والمكونات الخارجية التي يتم امتصاصها في الدم في وقت واحد. تم استخدام الأيض على نطاق واسع في الدراسات التي أجريت على الطب الصيني التقليدي19 ، وعلم السمومالدوائية 20 ، والإدارة الصحية 21 ، والرياضة22 ، والغذاء23 ، وغيرها من المجالات.

في هذه الدراسة ، تم قياس الاختلافات في المكونات الخارجية الممتصة في الدم والمستقلبات الداخلية بين الفئران النموذجية لعسر الطمث المعالجة ب CR والمعالجة ب CRV باستخدام الأيض غير المستهدف القائم على LC-MS / MS للكشف عن آليات التأثيرات المسكنة ل CRV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب المتعلقة بالحيوان بموافقة من لجنة أخلاقيات التجارب في معهد تشونغتشينغ للطب الصيني التقليدي. تم استخدام أربعة وعشرين أنثى من فأر Sprague Dawley (SD) التي كان عمرها 8-10 أسابيع ووزنها 200 جم ± 20 جم في هذه التجربة.

1. إعداد الاستخراج

  1. حساب
    1. خطط لإدارة مستخلص CR أو CRV لمجموعة علاج مكونة من ستة فئران Sprague-Dawley (10 جم / [كجم ∙day]) لمدة 3 أيام. استخدم مستخلص CR أو CRV بتركيز 1 جم / مل (يتم الحصول على 1 مل من المستخلص من 1 جم من الأعشاب).
      ملاحظة: جرعة CR هي 6-10 جم. في هذه الدراسة ، تم استخدام الجرعة القصوى من 10 غرام كجرعة. نظرا لأن متوسط وزن الشخص البالغ هو 60 كجم ، فإن جرعة البالغين هي 0.1667 جم / كجم. وفقا لخوارزمية تحويل الوزن24 ، حيث أن معامل تحويل الجرعة بين البشر والجرذان هو 6.3 ، فإن جرعة الفئران هي 1.05 جم / كجم. تمت زيادة جرعة الدواء بمقدار 10 مرات إلى 10.5 جم / كجم للفئران. تم تحديد الجرعة على أنها 10 جم / كجم لتسهيل الحساب والتجربة الفعلية. على سبيل المثال ، من خلال الحساب ، إذا كانت هناك حاجة إلى ما مجموعه 36 جم من CR أو CRV ، فيجب تحضير الأدوية العشبية الصينية مرتين على الأقل. وبالتالي ، كان مطلوبا 200 غرام من CR - تم استخدام 100 غرام من CR كسجل تجاري ، وتم معالجة 100 غرام من CR في CRV.
    2. احسب حجم CR أو CRV المراد تطبيقه لكل فأر باستخدام المعادلة (1):
      V = 10 جم / (كجم ∙ يوم) × 200 جم / (1 جم / مل) = 2 مل (1)
  2. معالجة CRV
    1. امزج 100 جم من CR و 20 جم من الخل (>5.5 جم حمض الأسيتيك / 100 مل) جيدا واحتضنها لمدة 12 ساعة.
      ملاحظة: للتأكد من ترطيب الجزء الداخلي من CR بالخل بعد 12 ساعة ، تم خلط CR والخل ، وتقليبه جيدا ، ثم تقليبه مرة أخرى حتى يصبح الجزء الداخلي رطبا.
    2. يقلب المزيج في مقلاة حديدية لمدة 10 دقائق على حرارة 110-120 درجة مئوية. ثم أخرجي الخليط واتركيه يبرد في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: لمنع احتراق CR ، من الضروري التقليب باستمرار أثناء التسخين. إذا كان CRV المعالج رطبا جدا ، فيمكن تجفيفه عند 60 درجة مئوية. عندما يكون سطح CR بني داكن ، يمكن إيقاف القلي السريع.
  3. إستخلاص
    1. استخراج CR
      1. أضف 10 مرات (كمية CR) من الماء النقي إلى CR ، وانقعها لمدة 2 ساعة. تأكد من أن المواد الطبية أقل من مستوى السائل عند النقع.
        ملاحظة: يجب قطع CR إلى النصف فقط قبل الاستخراج. الغرض من النقع هو استخراج المكونات النشطة بشكل أكثر فعالية. عملية النقع ضرورية.
      2. يغلى مزيج الماء والدواء على نار عالية ، ويترك يغلي على نار خفيفة لمدة 20 دقيقة. تصفية مع قطعة قماش مرشح (100 شبكة) ، وجمع المرشح.
        ملاحظة: عند الفك ، تم استخدام حرارة عالية قبل الغليان ، وتم استخدام حرارة منخفضة للحفاظ على الغليان.
      3. كرر الخطوة 1.3.1.2 مرة واحدة ، وادمج المرشحات.
      4. ركز المستخلص بمبخر دوار إلى 1 جم / مل (بناء على الدواء الأصلي ، يجب أن تكون درجة حرارة التركيز أقل من 60 درجة مئوية).
        ملاحظة: المكونات النشطة في CR متطايرة ، لذلك يجب ألا تزيد درجة حرارة التركيز عن 60 درجة مئوية.
    2. مستخلص CRV
      1. نفذ نفس الخطوات (1.3.1.1-1.3.1.3) لطريقة استخراج CR.
    3. استخراج CR للاختبار
      1. ماصة 500 ميكرولتر من مستخلص CR و 500 ميكرولتر من الميثانول في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، ودوامة لمدة 30 ثانية للخلط.
        ملاحظة: مزيج من الميثانول والماء يستخرج المكونات النشطة بشكل أفضل. لا ينبغي تصفية المستخلص مباشرة للاختبار.
      2. أجهزة الطرد المركزي كل عينة لمدة 15 دقيقة عند 16502 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بتصفية المادة الطافية ، ثم انقلها إلى قارورة العينة للاختبار.
        ملاحظة: بعد الطرد المركزي عالي السرعة لخليط الميثانول والمستخلص ، يمكن نقل المادة الطافية مباشرة إلى زجاجة العينة لتحديدها دون ترشيح. بسبب الحرارة الناتجة عن عملية الطرد المركزي ، يفضل استخدام جهاز طرد مركزي مبرد.
    4. مستخلص CRV للاختبار
      1. نفذ الخطوات 1.3.3.1-1.3.3.2 لتحضير مستخلص CRV للاختبار.

2. الحيوانات

  1. حساب
    1. خذ 50 ملغ من بنزوات استراديول ، وأضفه إلى 50 مل من زيت الزيتون لتحضير محلول 1 ملغ / مل. تناول 50 ملغ من الأوكسيتوسين ، وأضفه إلى 50 مل من المحلول الملحي العادي لتحضير محلول 1 ملغ / مل.
      ملاحظة: جرعة الحقن داخل الصفاق من بنزوات استراديول والأوكسيتوسين هي 10 ملغ / (كجم ∙ يوم). يذوب بنزوات استراديول في زيت الزيتون ، ويذوب الأوكسيتوسين في محلول ملحي عادي. ليس من السهل إذابة استراديول بنزوات في زيت الزيتون ويمكن علاجه بالموجات فوق الصوتية لتسريع الذوبان. يجب تحضير كل من محاليل استراديول بنزوات والأوكسيتوسين يوميا.
    2. احسب حجم محلول بنزوات استراديول المراد تطبيقه لكل فأر (على سبيل المثال ، V = 10 مجم / [كجم ∙ يوم] × 200 جم / [1 جم / مل] = 2 مل). احسب حجم محلول الأوكسيتوسين المراد تطبيقه لكل فأر (على سبيل المثال ، V = 10 مجم / [كجم ∙ يوم] × 200 جم / [1 جم / مل] = 2 مل).
  2. تجميع الحيوانات وإدارتها
    ملاحظة: تم تخصيص عشرة أيام للإدارة25,26. أثناء العلاج ، كان لدى الفئران وصول غير مقيد إلى الطعام القياسي والماء. في غضون 30 دقيقة من إعطاء الأوكسيتوسين ، تم تتبع نشاط كل فأر يتلوى. تم تطوير نموذج الفئران PD بنجاح ، كما يتضح من استجابات التواء الفئران النموذجية ، والتي تضمنت تقلص الرحم ، ودوران طرف واحد ، وتمديد الطرف الخلفي ، وجذع مجوف ، وتقلص البطن26.
    1. قم بتعيين 24 أنثى من فأر Sprague-Dawley (فئران SD ، عمرها 8-10 أسابيع ، ويزن 200 جم ± 20 جم) في أربع مجموعات في التحكم العشوائي ، والنموذج ، و CR ، و CRV - وإطعامهم لمدة 7 أيام.
    2. إدارة الحيوان
      1. حقن الفئران داخل الصفاق في مجموعات النموذج و CR و CRV مع 2 مل من محلول بنزوات استراديول كل يوم. حقن الفئران داخل الصفاق في المجموعة الضابطة مع 2 مل من المياه المالحة العادية.
      2. من اليوم 8 ، أكمل الخطوة 2.2.2.1. بعد ذلك ، يتم تطبيق 2 مل من مستخلص CRV داخل المعدة للفئران في مجموعة CRV ، و 2 مل من مستخلص CR للفئران في مجموعة CR ، و 2 مل من المحلول الملحي العادي للفئران في مجموعات التحكم والنموذج.
      3. في اليوم 10 ، أكمل الخطوة 2.2.2.2. بعد ذلك ، حقن الفئران داخل الصفاق في مجموعات النموذج ، CR ، و CRV مع 2 مل من محلول الأوكسيتوسين والفئران في المجموعة الضابطة مع 2 مل من المحلول الملحي العادي.
    3. سجل أوقات التلوي للفئران في غضون 30 دقيقة من حقن الأوكسيتوسين.
  3. جمع العينات
    1. جمع عينات دم الشريان الأورطي البطني ، واستئصال الرحم بسرعة وبشكل كامل ، وفصل بعناية النسيج الضام والدهون الملتصقة بجدار الرحم.
      ملاحظة: تم جمع الدم في غضون 1 ساعة بعد الجرعة النهائية.
    2. استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة للحفاظ على أنسجة الرحم ونقلها إلى النيتروجين السائل. قم بتخزين عينات الأنسجة في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    3. أجهزة الطرد المركزي عينات الدم لمدة 10 دقائق في 4125 × غرام. قم بإزالة المادة الطافية المحتوية على المصل وأجهزة الطرد المركزي عند 16502 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بطرد المصل ، ثم احتفظ به في الأنبوب عند -80 درجة مئوية للتخزين.
      ملاحظة: يجب ترك عينات الدم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لإعادة المعالجة.
  4. معالجة العينات
    1. عينات المصل
      1. ضع 400 ميكرولتر من الميثانول و 200 ميكرولتر من المصل في أنبوب طرد مركزي دقيق ، ودوامة لمدة 30 ثانية للخلط. أجهزة الطرد المركزي كل عينة لمدة 15 دقيقة عند 16502 × جم عند 4 درجات مئوية. املأ زجاجات العينات بالمادة الطافية بعد التجميع والترشيح. امزج جميع المواد الطافية من كل عينة بنفس الحجم لإعداد عينات مراقبة الجودة للاختبار.
    2. عينات أنسجة الرحم
      1. خذ 100 ملغ من أنسجة الرحم من الجزء المماثل وطحنها بحجم تسعة أضعاف من المياه المالحة الطبيعية. أجهزة الطرد المركزي المجانسة لمدة 10 دقائق عند 4125 × جم ، وجمع المادة الطافية. ضع المادة الطافية في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية للاختبار أو عند -80 درجة مئوية إذا لم يتم اختبارها في نفس اليوم.
      2. ضع المحلول الملحي العادي والأنسجة والكرات الفولاذية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل ، وضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق في النيتروجين السائل لمدة 3-5 ثوان ، ثم ضع الأنسجة في مطحنة الأنسجة للطحن.
  5. اختبار العينة
    1. استخدم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لقياس محتوى PGF2α و PGE2 في أنسجة الرحم لعينات الفئران.
      ملاحظة: تم استخدام مجموعة الفئران PGE 2 ELISA لقياس محتوى PGE 2 ، وتم استخدام مجموعة الفئران PGF 2α ELISA لقياس مستوى PGF2α. يمكن العثور على الخطوات التفصيلية في تعليمات الشركة المصنعة. وترد تفاصيل المجموعة في جدول المواد.
    2. قم بتقييم عينة المصل ومستخلص CR ومستخلص CRV باستخدام UPLC-MS / MS.
      1. بالنسبة ل UPLC ، استخدم عمود C18 (2.6 ميكرومتر ، 2.1 مم × 100 مم) وطريقة تدرج ثنائي مع المرحلة المتنقلة A التي تحتوي على 0.1٪ من حمض الفورميك والمرحلة المتنقلة B التي تحتوي على الأسيتونيتريل. اضبط تدرج الشطف على النحو التالي: من 0 دقيقة إلى 1 دقيقة ، 15٪ ب ؛ من 1 دقيقة إلى 8.5 دقيقة ، 15٪ إلى 85٪ ب ؛ من 8.5 دقيقة إلى 11.5 دقيقة ، 85٪ ب ؛ من 11.5 دقيقة إلى 11.6 دقيقة ، 99٪ إلى 1٪ ب ؛ ومن 11.6 دقيقة إلى 15 دقيقة ، 15٪ B. اضبط معدل التدفق على 0.35 مل / دقيقة وحجم الحقن على 2 ميكرولتر.
      2. بالنسبة ل MS ، اضبط درجة الحرارة على 600 درجة مئوية ، ومعدل تدفق غاز الستارة (CUR) على 0.17 ميجا باسكال ، ومعدلات تدفق كل من الغمد والغاز الإضافي على 0.38 ميجا باسكال. اضبط جهد الرش الأيوني لوضع الأيونات الموجبة ووضع الأيونات السالبة على 5.5 كيلو فولت و -4.5 كيلو فولت ، على التوالي ، جهد جهد إزالة التجميع (DP) على 80 فولت أو -80 فولت ، وطاقة الاصطدام (CE) على 40 فولت أو -25 فولت ، وتراكب طاقة الاصطدام (CES) على 35 فولت ± 15 فولت.
      3. قم بإجراء الاختبار باتباع بروتوكول الشركة المصنعة باستخدام UPLC-MS / MS. قم بإجراء MS لنطاق كتلة من 50-1000 م / ض.
      4. احصل على نتائج UPLC-MS/MS باستخدام برنامج محطة العمل المطابق جنبا إلى جنب مع اكتساب وضع الكشف المعتمد على المعلومات وعامل تصفية العيوب الجماعية المتعددة وخصم الخلفية الديناميكي. استخدم عينات مراقبة الجودة للمصل المجمع لاختبار قابلية تكرار واستقرار معدات UPLC-MS / MS للتحقق من النهج التقليدي. قبل عينات البحث ، قم بحقن عينات مراقبة الجودة لأربعة أشواط متتالية ، ثم حقنها بعد كل خمس عينات مصل.

3. معالجة البيانات

  1. إعداد البيانات
    1. استخدم برنامج التحويل لتحويل البيانات الأولية إلى تنسيق mzXML. تطبيع إجمالي بيانات التيار الأيوني (TIC) لكل عينة.
      ملاحظة: تم استخدام تطبيق داخلي قائم على R (www.lims2.com) مبني على XCMS لتحليل المعلومات الخاصة بالتكامل والمحاذاة والاستخراج واكتشافالذروة 27.
    2. قم بإجراء التعليق التوضيحي للمستقلب باستخدام قاعدة بيانات MS2 (www.lims2.com). اضبط حد التعليق التوضيحي على 0.328.
      ملاحظة: تم تحديد المستقلبات الداخلية في كل مجموعة.
  2. تحليل المكون الرئيسي والتحليل التمييزي الجزئي المتعامد للمربع الصغرى
    1. استخدم برنامج التحليل لإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) والنمذجة. استيراد البيانات الموحدة للمستقلبات إلى برنامج التحليل. بعد ذلك، استخدم الاحتواء التلقائي لإنشاء نموذج التحليل. أخيرا ، استخدم النتيجة للحصول على مخطط تشتت النتيجة ل PCA.
      ملاحظة: تم الحصول على تجميع كل مجموعة باستخدام مخطط تشتت النتيجة ل PCA. PCA هو وضع تحليل غير خاضع للإشراف يقوم بشكل أساسي بتجميع العينات من خلال تقليل الأبعاد دون تدخل.
    2. استخدم برنامج التحليل لإجراء التحليل التمييزي الجزئي المتعامد للمربع الأصغر (OPLS-DA).
      1. استيراد البيانات الموحدة على المستقلبات في مجموعات CR و CRV إلى برنامج التحليل.
      2. استيراد البيانات من مجموعة CR إلى مجموعة CR التي تم إنشاؤها ، واستيراد البيانات من مجموعة CRV إلى مجموعة CRV التي تم إنشاؤها.
        ملاحظة: OPLS-DA هو وضع تحليل خاضع للإشراف ، وتجميع العينات ضروري.
      3. بعد ذلك ، استخدم الاحتواء التلقائي لإنشاء نموذج التحليل ، واستخدم النتيجة للحصول على مخطط تشتت النتيجة ل OPLS-DA. أخيرا ، استخدم VIP للحصول على الأهمية المتغيرة في قيمة الإسقاط (VIP) في OPLS-DA.
        ملاحظة: تم الحصول على الدلالة المتغيرة في قيم الإسقاط (VIP) للمستقلبات في مجموعتي CR و CRV من خلال OPLS-DA.
  3. تحديد المستقلبات التفاضلية المحتملة
    1. احجب المستقلبات ذات قيم VIP أكبر من 1 في الخطوة 3.2.2.3.
    2. استخدم برنامجا إحصائيا لحساب قيمة P للمستقلبات التي تم فحصها في الخطوة 3.3.1 بواسطة اختبار t للطالب.
      ملاحظة: تم تحديد الاختلافات ذات الدلالة الإحصائية في المستقلبات التفاضلية المحتملة في مجموعتي CR و CRV بواسطة اختبار t للطالب. كانت المستقلبات التفاضلية المحتملة هي تلك التي لها قيمة p لاختبار t للطالب < 0.05 وأهمية متغيرة في الإسقاط (VIP) أكبر من 1. تم إنجاز التمثيل باستخدام مؤامرة بركانية.
  4. تحديد المستقلبات التفاضلية
    1. افحص المستقلبات التفاضلية المحتملة في الخطوة 3.3. استخدم نتائج الخطوة 3.1.2 لتحديد هذه الأيضات التفاضلية.
      ملاحظة: تم تحديد عدد صغير من المستقلبات التفاضلية المحتملة، وأصبحت المستقلبات التفاضلية المرشحة.
    2. قم بفحص المستقلبات التفاضلية المراد مطابقتها في قاعدة بيانات KEGG. أظهر التغييرات في المستقلبات التفاضلية في مجموعات CR و CRV عن طريق رسم خريطة حرارية.
      ملاحظة: تمت مطابقة عدد صغير من المستقلبات التفاضلية المرشحة ، وأصبحت المستقلبات التفاضلية.
  5. فحص المسارات الأيضية المحتملة
    1. قم بتحميل المستقلبات المختلفة إلى قاعدة بيانات Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. استخدم تحليل المسارات للحصول على المسارات الأيضية المحتملة.
      ملاحظة: تم الحصول على المسارات الأيضية المحتملة في مجموعات CR و CRV. كانت قيمة P وقيمة التأثير مؤشرين مهمين للغاية في اختيار المسارات الحرجة. كانت قيمة P أكثر أهمية من قيمة التأثير. تم تعريف الأهمية بقيمة P < 0.05 ؛ ارتبطت قيم التأثير الأكبر بارتباطات أفضل.
    3. تحليل المسارات الأيضية المحتملة عن طريق تحميل المستقلبات المختلفة إلى قاعدة بيانات KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      ملاحظة: يجب أيضا مراعاة العلاقة بين وظيفة المسار الأيضي ومرض باركنسون. تم الحصول على المسارات الأيضية الحرجة.
  6. تحديد المكونات الممتصة في الدم
    1. تحديد المكونات الكيميائية في مستخلصات CR و CRV باستخدام قاعدة بيانات MS2 الداخلية (www.lims2.com) ، وقاعدة بيانات الأيض البشري (HMDB) ، وقواعد بيانات Massbank و Chemspider.
    2. تحديد المكونات الممتصة في الدم في مجموعات CR و CRV ، ومقارنة المكونات بين مجموعات CR و CRV.
      ملاحظة: يجب الكشف عن المكونات الممتصة في الدم في مجموعات CR أو CRV ولكن لا يمكن اكتشافها في المجموعة الضابطة.
  7. التحليل الإحصائي
    1. تحليل البيانات باستخدام التحليل أحادي المتغير (UVA) والأساليب الإحصائية متعددة المتغيرات ، بما في ذلك تحليل التباين (ANOVA) واختبار t للطالب.
      ملاحظة: عرضت المعلومات التجريبية باستخدام برامجيات إحصائية كمتوسط ± الانحراف المعياري (±SD). P < 0.01 اعتبر فرقا ذا دلالة كبيرة ، و P < 0.05 يمثل فرقا كبيرا28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل تجربة نموذج عسر الطمث
لم تكن هناك استجابة متلوية في غضون 30 دقيقة في المجموعة الضابطة لأن هذه الفئران لم يتم حقنها داخل الصفاق بالأوكسيتوسين وبنزوات استراديول لتسبب الألم. أظهرت الفئران في مجموعات النموذج و CR و CRV تفاعلات تلوي كبيرة بعد حقن الأوكسيتوسين. توضح هذه النتائج فعالية تركيبة استراديول بنزوات والأوكسيتوسين لإحداث عسر الطمث. كانت الاختلافات في مستويات PGF 2α و PGE 2 و PGF2α / PGE 2 بين النموذج والمجموعات الضابطة كبيرة (P < 0.001 ، P < 0.05) ، مما يدل على فعالية النموذج (الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1: محتوى PGF 2α و PGE2 في أنسجة الرحم ورقم التلوي في كل مجموعة. أ: α PGF2 محتوى في أنسجة الرحم في كل مجموعة. ب: محتوى PGE2 في نسيج الرحم في كل مجموعة. ج: محتوى PGF 2α/PGE2 في أنسجة الرحم في كل مجموعة. د: العدد المتلوي في كل مجموعة. تمثل الأعمدة متوسط ± SEM من أربع مجموعات (ستة فئران لكل مجموعة). * P < 0.05 أو ** P < 0.01 يمثلان فرقا كبيرا مقارنة بمجموعة النماذج ، ويمثل Δ P < 0.05 أو ΔΔP < 0.01 فرقا كبيرا مقارنة بمجموعة CR. أظهرت الفئران في مجموعات النموذج و CR و CRV تفاعلا كبيرا يتلوى بعد حقن الأوكسيتوسين. الاختصارات: PG = البروستاجلاندين. CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تقليل تركيزات PGF 2α و PGF2α / PGE2 في مجموعات CRV و CR ، وكان هذا الانخفاض أكثر وضوحا في مجموعة CRV. كانت هناك أيضا فروق ذات دلالة إحصائية (P < 0.001 و P < 0.05) في تركيزات PGF2α و PGF2α / PGE2 بين مجموعات CRV و CR. مقارنة بمجموعة النماذج ، كان تركيز PGE2 أكبر بكثير في مجموعات CRV و CR (P < 0.001) ، مع زيادة المستوى أكثر في مجموعة CRV.

مراقبة الجودة
لوحظت تطابق جيد بين أوقات الاحتفاظ بالقمم الكروماتوغرافية BPC وشدة الإشارة في عينات مراقبة الجودة ، مما يدل على مستوى عال من استقرار الأداة وجودة بيانات متسقة بشكل ملحوظ (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2). علاوة على ذلك ، كانت جميع عينات مراقبة الجودة ضمن ±2 انحراف معياري (الشكل 2 أ ، ب) ، وكان الارتباط بين عينات مراقبة الجودة أكبر من 0.7 (الشكل 2 ج ، د). تشير هذه النتائج إلى أن الإجراء كان موثوقا به وأن النتائج كانت ذات مصداقية.

Figure 2
الشكل 2: توزيع PCA-X أحادي البعد لعينات مراقبة الجودة. (أ) الوضع الإيجابي ، (ب) الوضع السلبي ؛ تحليل الارتباط لعينات مراقبة الجودة في الوضع الإيجابي (C) والوضع السلبي (D). كانت جميع عينات مراقبة الجودة ضمن ±2 انحراف معياري ، وكانت الارتباطات بين عينات مراقبة الجودة أكبر من 0.7. تشير هذه النتائج إلى أن الإجراء كان موثوقا به وأن المعلومات كانت ذات مصداقية. الاختصارات: PC = المكون الرئيسي ؛ PCA = تحليل المكون الرئيسي ؛ مراقبة الجودة؛ CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل المكونات الرئيسية
كما هو موضح في الشكل 3 ، أشار جهاز الكمبيوتر الإحداثي (1) إلى درجات المكونات الرئيسية الأولى ، بينما أشار الكمبيوتر الإحداثي (2) إلى درجات المكونات الرئيسية الثانية. في الشكل ، تشير الدائرة الخضراء إلى مجموعة التحكم ، وتمثل الدائرة الحمراء مجموعة النموذج ، وتشير الدائرة الزرقاء إلى مجموعة CR ، وتشير الدائرة البيضاء إلى مجموعة CRV ، وتشير الدائرة الوردية إلى مجموعة مراقبة الجودة.

Figure 3
الشكل 3: مخطط تشتت النتيجة ل PCA . (أ) الوضع الإيجابي و (ب) الوضع السالب. تتداخل عينات مراقبة الجودة ، مما يشير إلى أن الأداة كانت مستقرة للغاية. يتم توزيع كل مجموعة في منطقتها الخاصة ، مع عبور المسارات فقط لمجموعة CR ومجموعة CRV في بعض الأحيان. الاختصارات: PC = المكون الرئيسي ؛ PCA = تحليل المكون الرئيسي ؛ مراقبة الجودة = مراقبة الجودة ؛ CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أظهرت نتائج تحليل PCA أن مجموعات CR ومجموعات النموذج كانت منفصلة بشكل كبير في كل من وضعي الأيونات الموجبة والسالبة. تم فصل المجموعات بشكل كبير بين CRV ومجموعات النماذج في أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة. تم فصل مجموعات مراقبة الجودة والنموذج والتحكم عن مجموعات العلاج الأخرى (CR ، CRV). تتداخل مجموعات CR و CRV أحيانا في وضع الأيونات الموجبة. في وضع الأيونات السالبة ، تم فصل كل مجموعة بشكل كبير.

طريقة المربعات الصغرى الجزئية المتعامدة التحليل التمييزي
تم استخدام OPLS-DA للكشف عن الاختلافات الأيضية. أظهر مخطط التشتت OPLS-DA أن جميع العينات كانت ضمن فترة الثقة 95٪ (القطع الناقص المربع T الخاص ب Hotelling). يوضح الشكل 4A و C أنه تم فصل مجموعتي CR و CRV. تم اختبار التجهيز الزائد للنموذج باستخدام اختبار التقليب (n = 200) ، وتم تقييم الأهمية الإحصائية للنموذج. في الشكل 4B ، D ، يصور الإحداثي قيمة R 2 Y أو قيمة Q2، ويشير الإحداثي إلى الاحتفاظ بالاستبدال. يتمتمثيل R 2 Y بالنقطة الخضراء ، ويتم تمثيل Q2 بالنقطة المربعة الزرقاء ، ويمثل الخطان المتقطعان خطي الانحدار المقابلين لهما. في الوضعين الإيجابي والسلبي ، كانت قيم R2 Y 0.8 و 0.84 ، وكانت قيم Q2 -0.59 و -0.57 على التوالي. هذا يدل على الموثوقية العالية للنموذج وغياب التجهيز الزائد.

Figure 4
الشكل 4: نماذج OPLS-DA لمجموعة CR مقابل مجموعة CRV. سجل مخطط التشتت في الوضع (A) الإيجابي و (C) الوضع السلبي. اختبار التقليب لنموذج OPLS-DA لمجموعة CR مقابل مجموعة CRV في الوضع الإيجابي (B) والوضع السلبي (D). كانR 2 Y 0.8 و 0.84 ، وكان Q2 -0.59 و -0.57 في الوضعين الإيجابي والسلبي ، على التوالي. هذا يدل على الموثوقية العالية للنموذج وغياب سلوك التجهيز الزائد. الاختصارات: OPLS-DA = تحليل تمييزي للمربعات الصغرى الجزئية المتعامدة ؛ CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التحليل الإحصائي أحادي المتغير
تم إجراء تحليلات إحصائية أحادية المتغير لتحديد الاختلافات الأيضية. في إطار الفحص القياسي ل VIP > 1 و P < تم الكشف عن المستقلبات التفاضلية المحتملة 0.05 و 339 و 394 في وضعي الأيونات الموجبة والسالبة ، على التوالي. يظهر مخطط بركان في الشكل 5 ، حيث تتوافق كل نقطة مع مستقلب مختلف. يظهر الإحداثي قيمة P لاختبار t للطالب ، ويعكس الإحداثي تغييرات متعددة في مستوى كل جزيء في المجموعة. يمثل حجم التشتت قيمة VIP لنموذج OPLS-DA ؛ تزداد قيمة VIP مع حجم المبعثر. تشير النقاط الحمراء إلى زيادة ، وتشير النقاط الزرقاء إلى انخفاض ، ويشير اللون الرمادي إلى عدم وجود فرق كبير.

تم إجراء تحليل نوعي للمستقلبات التفاضلية المرشحة باستخدام مطياف الكتلة الثانوي. لوحظت تغييرات كبيرة في 63 مستقلبا في الوضع الإيجابي (الملف التكميلي 1 - الجدول التكميلي 1) وفي 30 مستقلبا في الوضع السلبي (الملف التكميلي 1 - الجدول التكميلي 2). تم تحديد المستقلبات التفاضلية باستخدام قواعد بيانات KEGG و HDMB. تم تحديد المركبات المتطابقة بدقة على أنها مستقلبات تفاضلية ، وهي مدرجة في الجدول 3 والجدول 4.

Figure 5
الشكل 5: مخطط بركان لمجموعة CR مقابل مجموعة CRV . (أ) الوضع الإيجابي و(ب) الوضع السلبي. في الرسم البياني للبركان الممثل ، تتوافق كل نقطة مع مستقلب مختلف. يظهر الإحداثي قيمة P لاختبار t للطالب ، ويعكس الإحداثي التغييرات المتعددة في كل مادة في المجموعة. يمثل حجم التشتت قيمة VIP لنموذج OPLS-DA. تزداد قيمة VIP مع حجم المبعثر. تشير النقاط الحمراء إلى الزيادات ، وتشير النقاط الزرقاء إلى الانخفاضات ، ويشير اللون الرمادي إلى عدم وجود اختلافات كبيرة. الاختصارات: OPLS-DA = تحليل تمييزي للمربعات الصغرى الجزئية المتعامدة ؛ VIP = أهمية متغيرة في الإسقاط ؛ CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مقارنات الأيض
تم حساب مصفوفة المسافة الإقليدية للقيم الكمية للمستقلبات التفاضلية بين مجموعتي CR و CRV ، وتم تجميع المستقلبات التفاضلية باستخدام نهج ارتباط شامل.

يمثل الإحداثي مجموعات تجريبية مختلفة ، بينما يمثل الإحداثي المستوى النسبي في الشكل 6. يشير وضع بقع الألوان إلى كيفية التعبير عن كل مستقلب بالنسبة للآخرين. في وضع الأيونات الموجبة ، مقارنة بمجموعة CR ، زادت مستويات أربعة مستقلبات تفاضلية في مجموعة CRV ، بينما انخفضت مستويات 11 مستقلبا تفاضليا. في وضع الأيونات السالبة ، مقارنة بمجموعة CR ، زادت مستويات أربعة مستقلبات تفاضلية في مجموعة CRV ، وانخفضت مستويات 7 مستقلبات تفاضلية.

Figure 6
الشكل 6: تحليل خريطة التمثيل اللوني لمجموعة CRV مقابل مجموعة CR . (أ) الوضع الإيجابي و (ب) الوضع السلبي. يمثل الإحداثي المجموعات التجريبية المختلفة ، ويمثل الإحداثي مستويات التعبير النسبية. يشير وضع بقع الألوان إلى كيفية التعبير عن كل مستقلب بالنسبة للآخرين. الاختصارات: CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالمقارنة مع مجموعة CR ، كانت المستقلبات التي زادت في مجموعة CRV هي سفينجوسين 1-فوسفات ، نوبيلتين ، جليسروفوسفوكولين ، ليسوبك (18: 1 (9z)) ، حمض 2-هيدروكسي-6-بنتاديسيل بنزويك ، 9،10-حمض إيبوكسي أوكتاديسينويك ، حمض 13s-هيدروكسي أوكتاديكادينويك ، و 2-ميثوكسي إسترون ، في حين أن تلك التي انخفضت كانت كورتيكوستيرون ، حمض الإندول أسيتيك ، حمض الجليكوكوليك ، بربارين ، ثنائي بوتيل فثالات ، ريتينول ، ليكوترين B4 ، بروستاجلاندين J2 ، 21-هيدروكسي بريجنينول ، زيرانول ، هوموسيستين ، حمض البروبينويك ، حامض دهني ، حمض الدوكوساهيكسانويك ، فينيل أسيتيلجليسين ، L- فينيل ألانين ، استرون جلوكورونيد ، وحمض الستريك (الشكل 7).

Figure 7
الشكل 7: اتجاهات المستوى النسبي للمستقلبات المحتملة في مجموعتي CRV و CR. (أ) الوضع الإيجابي و (ب) الوضع السلبي. في الوضع الإيجابي ، مقارنة بمجموعة CR ، زادت مستويات المستقلبات التفاضلية الأربعة في مجموعة CRV ، وانخفضت مستويات 11. في الوضع السلبي ، زادت مستويات المستقلبات التفاضلية الأربعة في مجموعة CRV ، وانخفضت مستويات الأيضات التفاضلية السبعة. تمثل الأعمدة متوسط ± SEM من أربع مجموعات (ستة فئران لكل مجموعة). * P < 0.05 أو ** P < 0.01 أو *** P < 0.01 تمثل فرقا كبيرا بين مجموعات CRV و CR. الاختصارات: CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل مسار KEGG
تم شرح المستقلبات التفاضلية ، وتم تحليل مسارات KEGG. أظهرت النتائج أن المستقلبات التفاضلية كانت مرتبطة بتسعة مسارات في الأنماط الإيجابية والسلبية ، على التوالي (الجدول 1 والجدول 2). في الشكل 8، يمثل كل مسار أيضي فقاعة في المخطط الفقاعي، مع مقياس أكثر أهمية يشير إلى عامل تأثير أكبر. يتم تمثيل حجم المسار الذي يؤثر على العوامل في تحليل الطوبولوجيا بواسطة إيقاعس المخطط الفقاعي وحجم الفقاعة. يشير إحداثي المخطط الفقاعي ولون الفقاعة إلى قيمة P لتحليل التخصيب (مع أخذ اللوغاريتم الطبيعي السلبي ، أي −ln (p)). درجة التخصيب أكثر أهمية ، وقيمة P أصغر ، وقيمة الإحداثيات أكثر بروزا ، واللون أغمق. قيمة P وقيمة التأثير هما مؤشران مهمان للغاية في اختيار المسارات الحرجة. بشكل عام ، قيمة P أكثر أهمية من قيمة التأثير.

Figure 8
الشكل 8: تحليل المسار لمجموعة CRV مقابل مجموعة CR . (أ) الوضع الإيجابي و(ب) الوضع السلبي. يتم تمثيل كل من المسارات الأيضية بفقاعة في المخطط الفقاعي. يشير إيقاعس المخطط الفقاعي وحجم الفقاعة إلى حجم العوامل المؤثرة على المسار في تحليل الطوبولوجيا. يشير إحداثي المخطط الفقاعي ولون الفقاعة إلى قيمة P لتحليل الإثراء. تشمل المسارات الأيضية الرئيسية التخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة واستقلاب حمض اللينوليك. الاختصارات: CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوضح الجدول 3 والجدول 4 المسارات الأيضية مع وجود اختلافات كبيرة - استقلاب الفينيل ألانين واستقلاب حمض اللينوليك ، بالإضافة إلى التخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة ، فينيل ألانين ، التيروزين ، والتريبتوفان. على الرغم من أن المسارات الأيضية شملت التخليق الحيوي لهرمون الستيرويد ، و sphingolipid واستقلاب حمض الأراكيدونيك ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية ، والتي كانت مرتبطة بعسر الطمث. أظهرت النتائج أن استقلاب حمض اللينوليك والتخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة كانت المسارات الأيضية الحرجة المرتبطة بالفعالية المعززة ل CRV.

المكونات الممتصة في الدم
تم الكشف عن خمسة عشر مكونا ومنتجين من الأيض من مستخلصات CRV و CR في مصل الفئران في مجموعات CR و CRV (الجدول 5). تم العثور على جميع المكونات ال 17 في وضع الأيونات الموجبة.

تمت مقارنة المستويات المكونة النسبية في عينات الدم للمجموعتين باستخدام اختبار t للطالب. يعرض الإحداثيات في الشكل 9 مجموعات تجريبية مختلفة. يمثل الإحداثي قيمة استجابة الطيف الكتلي. كان هناك عنصران مع اختلافات كبيرة. أظهر التحليل أن مستويات هذين المكونين كانت مرتفعة في مجموعة CRV مقارنة بمجموعة CR ، بينما لم تظهر مستويات 15 عنصرا أي تغييرات كبيرة.

Figure 9
الشكل 9: المكونات الممتصة في الدم لمجموعة CRV مقابل مجموعة CR. كان هناك 15 مكونا ومنتجين من التمثيل الغذائي من مستخلصات CRV و CR في مصل الفئران في مجموعات CR و CRV. أظهر التحليل أن مستويات الدم لمكونين قد زادت في مجموعة CRV مقارنة بمجموعة CR ، في حين أن مستويات الدم من 15 مكونا لم تظهر أي تغييرات كبيرة. من بينها ، كان مستوى (-) -myrtenol و [(1R ، 2S ، 3R ، 4R) -3-hydroxy-1،4،7،7-tetramethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl] حمض الخليك في مجموعة CRV أعلى بكثير منه في مجموعة CR. * P < 0.05 أو ** P < 0.01 يمثلان فرقا كبيرا بين مجموعة CRV ومجموعة CR. الاختصارات: CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الاختلافات الأيضية في الوضع الإيجابي. الاختصارات: KEGG = موسوعة كيوتو للجينات والجينومات. VIP = أهمية متغيرة في الإسقاط ؛ RT = وقت الاحتفاظ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: الاختلافات الأيضية في الوضع السلبي. الاختصارات: KEGG = موسوعة كيوتو للجينات والجينومات. VIP = أهمية متغيرة في الإسقاط ؛ RT = وقت الاحتفاظ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: تحليل المسار الأيضي في الوضع الإيجابي. اختصار: KEGG = موسوعة كيوتو للجينات والجينومات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4 تحليل المسار الأيضي في الوضع السلبي. اختصار: KEGG = موسوعة كيوتو للجينات والجينومات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: تحديد مكونات النموذج الأولي والمستقلبات في مصل الفئران. ملاحظة: M1 و M2 هي الأيضات. المكونات الأخرى هي مكونات النموذج الأولي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: مخططات BPC وكروماتوجرام MS2 للمكونات الممتصة في دم الفئران العارية. مخططات BPC لجميع عينات مراقبة الجودة في الأوضاع الإيجابية والسلبية ؛ MS2 كروماتوجرام من المكونات ال 17 التي تم امتصاصها في دم الفئران: D-camphene ، (-) -myrtenol ، إيثيل بارابين ، كالامينين ، α-cyperone ، (+) -nootkatone ، (1R ، 2S ، 3R ، 4R) -3-هيدروكسي -1،4،7،7-رباعي ميثيل ثنائي سيكلو [2.2.1] هيب-2-يل] حمض الخليك ، 4- (2- (2.2.1) - ثنائي سيكلوهيبتيل ميثيل) حمض البنزويك ، 10،12-بيروكالامينين ، (1aS ، 10aR) -1a ، 5،9-ثلاثي ميثيل -1a ، 3،6،10a-رباعي هيدروكسيري [4،5] سيكلوديكا [1،2-ب] فوران -10 (2H) -واحد ، التيروسين د ، حمض تيريسيكليك ، أسيتات سوجونيل، 3-أسيتيل-13-ديوكسيفومينوم، إيزوكوركومينول، ليجوسيبيرونول، بروكورماديول. كما يتم تضمين المستقلبات التفاضلية التي تم تحديدها بواسطة مطياف الكتلة الثانوي ، وكذلك قواعد بيانات HDMB و KEGG ، في أوضاع الأيونات الموجبة والسالبة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نظرا للتنوع الواسع والطبيعة المختلفة للطب الصيني التقليدي ، لا تعمل هذه الأعشاب في بعض الأحيان في الممارسة السريرية ، وقد يكون هذا بسبب المعالجة غير المناسبة وتفكيك الطب الصيني التقليدي. أصبحت آليات الطب الصيني التقليدي أكثر وضوحا مع استخدام العلوم والتكنولوجيا المعاصرة29,30. تظهر هذه الدراسة أن كلا من CR و CRV لهما تأثيرات علاجية في الفئران النموذجية PD وأن التأثير العلاجي ل CRV أكثر جوهرية. يمكن أن تكون آلية عمل CRV مرتبطة بحقيقة أن معالجة الخل قد تؤثر على مكونات CR التي يتم امتصاصها في الدم ويمكن أن ترتبط باستقلاب حمض اللينوليك والتخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة. يوضح الشكل 10 المسارات المحتملة لعمل CRV في تخفيف الآلام.

Figure 10
الشكل 10: آليات التأثير المسكن المعزز ل CRV. أظهرت النتائج أنه تم العثور على 15 مكونا واثنين من المستقلبات في الدم. من بينها ، كانت مستويات (-) -myrtenol و [(1R ، 2S ، 3R ، 4R) -3-hydroxy-1،4،7،7-tetramethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl] حمض الخليك في مجموعة CRV أعلى بكثير منها في مجموعة CR. يمكن أن يقلل CRV من مستوى البروستانويدات من السلسلة 2 و 4 سلسلة من الليكوترينات المصنوعة من ARA وتحقيق تأثيرات مسكنة عن طريق تعديل استقلاب حمض الأراكيدونيك ، والتخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة ، واستقلاب حمض اللينوليك. الاختصارات: ARA = حمض الأراكيدونيك. COX = انزيمات الأكسدة الحلقية ؛ LA = حمض اللينوليك ؛ PUFA = الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة ؛ GLA = حمض γ لينولينيك ؛ DGLA = ثنائي هومو γ لينولينيك ؛ PD = عسر الطمث الأولي. PG = البروستاجلاندين. LT = الليكوترينات. TX = الثرموبوكسان. SDA = حمض الستيريدونيك ؛ ETA = حمض إيكوساتيتراينويك ؛ EPA = حمض إيكوسابنتاينويك ؛ CR = سيبيري رهيزومي. CRV = CR معالجتها بالخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الاحتياطات أثناء التجربة
نظرا لأن زيت المكون الفعال ل CR متقلب ، يجب ألا يتجاوز وقت استخراج CR 20 دقيقة ، وعندما يغلي ، يجب أن يكون على نار خفيفة مع درجة حرارة لا تتجاوز 60 درجة مئوية أثناء التركيز. لضمان الاستخراج الناجح للمكونات الفعالة ، يجب نقع الأعشاب في الماء لمدة 2 ساعة على الأقل قبل مغلي حتى تكون الأعشاب مبللة عند اكتمال النقع. أثناء معالجة CR ، يجب خلط الخل جيدا مع الأعشاب حتى يتمكن الخل من اختراقها بالكامل. إذا كان حجم الخل منخفضا جدا بحيث لا يمكن تبليل الأعشاب جيدا ، يمكن إضافة كمية صغيرة من الماء لتخفيف الخل ، ومن ثم يمكن خلط الخل بالكامل مع الأعشاب. عند اكتمال الخلط ، تمتص الأعشاب كل الخل. نظرا لأن الخل يحتوي على حمض الأسيتيك ، يجب ألا يتلامس الخليط مع الحديد لتجنب التفاعل الكيميائي.

في تجربة الفئران ، يتم إعطاء أول حقن داخل الصفاق من بنزوات استراديول في اليوم 10 ، ثم يتم إعطاء الإدارة داخل المعدة لمستخلص CR أو CRV ، وأخيرا ، يتم إعطاء الحقن داخل الصفاق من الأوكسيتوسين. بعد الحقن داخل الصفاق من الأوكسيتوسين ، لوحظ الحيوان لمدة 30 دقيقة ، ويتم أخذ الدم على الفور. عادة ، يصل تركيز الدم إلى ذروته في غضون 1 ساعة بعد تناول13 ، وهو أفضل وقت لأخذ الدم.

عند تحديد عينات المستخلص والمصل بواسطة LC-MS / MS ، يجب تحديدها في نفس الدفعة لضمان اتساق وقت الاحتفاظ بنفس المكون في عينات مختلفة. في هذه التجربة ، كان تحديد المكونات نقطة صعبة. على الرغم من أنه يمكن استخدام قاعدة بيانات ناضجة نسبيا للمستقلبات الداخلية ، إلا أنه لم تكن هناك قاعدة بيانات مطابقة لتحديد المكونات الممتصة في الدم ، لذلك يجب توخي المزيد من الحذر في تحديد الهوية.

الاختلافات في المكونات الممتصة في الدم بين مجموعات CR و CRV
لتحديد العنصر النشط ل CR ، بحثت هذه التجربة في المكونات التي تم امتصاصها في الدم في الفئران النموذجية لعسر الطمث. في هذه التجربة ، وجد أن 15 مكونا واثنين من المستقلبات في الدم تختلف بين مجموعات CR و CRV. من بينها ، كانت مستويات (-) -myrtenol و [(1R ، 2S ، 3R ، 4R) -3-hydroxy-1،4،7،7-tetramethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl] حمض الخليك في مجموعة CRV أعلى بكثير منها في مجموعة CR ، لكن مستويات المكونات الأخرى لم تكن مختلفة بشكل كبير. (-) - ميرتينول و [(1R ، 2S ، 3R ، 4R) -3-هيدروكسي -1،4،7،7-رباعي ميثيل ثنائي سيكلو [2.2.1] هيب-2-يل] حمض الخليك هي تيربينويدات وتعتبر المكونات الفعالة ل CRV.

يتم إنتاج Ligucyperonol و procurcumadiol عن طريق أكسدة α-cyperone و isocurcumenol ، على التوالي ، و α-cyperone له تأثير مسكن قوي. قد تقلل آلية العمل المقترحة من تعبير COX-2 الناجم عن LPS وتوليف PGE2 من خلال التنظيم السلبي لإشارات NF-kB31. (+) - Nootkatone يمنع أيضا نشاط COX-232,33. Isocurcumenol هو المكون الأساسي لجذمور الكركم في علاج عسر الطمث3 ، وقد يكون لمستقلب procurcumadiol تأثير مسكن. بالمقارنة مع مجموعة CR ، أظهرت مجموعة CRV مستويات أعلى بكثير من (-) - myrtenol ، والتي لها تأثير مسكن34. قد تكون آلية العمل المحتملة هي أن التغييرات في التعبير عن COX-2 35 تزيد من مستويات السيتوكين المضاد للالتهابات (IL-10 ، IFN-γ) وتقلل من مستويات السيتوكينات المؤيدة للالتهابات (TNF-α ، IL-1β)مستويات 36. تعمل المعالجة بالخل على تحسين مستويات المكونات النشطة في الدم ، وهذا قد يكون السبب في أن المنتجات المنتجة بالخل أكثر فعالية.

الاختلافات في المسارات الأيضية بين مجموعات CR و CRV
أظهر تحليل المسار مسارات أيضية مختلفة بشكل كبير بين مجموعات CR و CRV ، بما في ذلك من حيث استقلاب الفينيل ألانين ، والتخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة ، والفينيل ألانين ، والتيروزين ، والتخليق الحيوي للتريبتوفان ، واستقلاب حمض اللينوليك. ومع ذلك ، فإن المسارات الأيضية لعملية التمثيل الغذائي للفينيل ألانين والتخليق الحيوي للفينيل ألانين والتيروزين والتريبتوفان لا ترتبط بمرض باركنسون. تظهر هذه النتائج أن المسارات الأيضية المرتبطة بالفعالية المعززة ل CRV هي استقلاب حمض اللينوليك والتخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة.

تشمل الأحماض الدهنية غير المشبعة نوعين: أوميغا 3 وأوميغا 637. ثلاثة سلائف من الوسطاء ، بما في ذلك حمض eicosapentaenoic (20: 5ω3; EPA) ، حمض الدوكوساهيكسانويك (22: 5ω3 ؛ DHA) ، وحمض الأراكيدونيك (20: 5ω6 ؛ ARA) ، تشارك في التخليق الحيوي للأحماض الدهنية غير المشبعة مسار37،38. ينتج كل من استقلاب EPA و ARA البروستاجلاندين والليكوترينات تحت تأثير COX. تنتج ARA بروستانويدات من سلسلتين ، بما في ذلك PGF 2 α و PGE 2 و PGI2 والثرموبوكسان (TXA 2 و TXB 2) والليكوترينات من السلسلة 4 ، بما في ذلك الليكوترين A 4 (LTA 4) الليكوترين B 4 (LTB 4) ، الليكوترين C 4 (LTC 4) ، والليكوترين D 4 (LTD 4). تشمل البروستانويدات من السلسلة 3 البروستاجلاندين E 3 (PGE 3) ، والبروستاسيكلين I 3 (PGI 3) ، والثرموبوكسان A2 (TXA 3) ، وتشمل الليكوترينات من السلسلة 5 الليكوترين A 5 (LTA 5) الليكوترين B 5 (LTB 5) ، الليكوترين C 5 (LTC 5) ، والليكوترين D 5 (LTD 5) ، والتي يتم إنتاجها إلى حد كبير بواسطة وكالة حماية البيئة.

عملية تحويل EPA هي نفس عملية ARA ويتم بوساطتها بواسطة إنزيمات مماثلة39. البروستانويدات من السلسلة 2 و 4 من سلسلة الليكوترينات لها بشكل أساسي تأثيرات مؤيدة للالتهابات وتراكم الصفائح الدموية وتضيق الأوعية. في المقابل ، تظهر البروستانويدات من 3 سلاسل و 5 من الليكوترينات تأثيرات مضادة للالتهابات ومضادة للصفيحات وموسعة للأوعية38. يتم إنتاج TXA 2 و TXB2 من ARA ، مما يتسبب في تضييق الأوعية الدموية. تعمل PGI 3 و PGE 3 و TXA3 المشتقة من وكالة حماية البيئة فقط كموسع للأوعية 38,40. تتنافس EPA و ARA على التحويل إلى PGs بواسطة إنزيم COX. عندما يتم زيادة نسبة غشاء EPA / AA ، يمكن تحويل eicosanoids PGI2 و TXA2 ، التي تعزز التجميع ، إلى TXA 3 و PGI3 ، والتي تعزز مكافحة التجميع ، مما يؤدي إلى تأثيرات مضادة للالتهابات ومضادة للتجميع40. بالإضافة إلى ذلك ، الاستخدام المشترك ل EPA و DHA وحمض اللينوليك (C18: 2ω6; LIN) يمكن أن يقلل من إطلاق PGF 2 α و PGE2 في بطانة الرحم البقري والأرومة الغاذية41,42.

من المحتمل أن يكون سبب مرض باركنسون هو إنتاج PGs والليكوترينات43،44،45 ، وخاصة PGs 46. وفي الوقت نفسه ، قد يكون الخلل في فاسوبريسين ، β الإندورفين ، الإستروجين ، البروجسترون ، الناقلات العصبية ، IL ، ET-1 ، و NO مرتبطا أيضا بعسر الطمث47. وفقا لنتائج ELISA ، انخفضت مستويات PGF 2α و PGF2α / PGE 2 في مجموعة CRV ، بينما زاد مستوى PGE 2 بالنسبة لمجموعة CR. بالإضافة إلى ذلك ، كان الليكوترين B4 (C02165) والبروستاجلاندين J2 (C05957) أقل في مجموعة CRV. يشير هذا إلى أنه في مجموعة CRV ، كانت هناك مستويات أقل من البروستانويدات من السلسلة الثانية المصنوعة من ARA ، بما في ذلك PGF2α ، وهو العامل الأكثر أهمية لعسر الطمث. العلاج باستخدام PGE 2 بتركيزات عالية يوسع الأوعية الدموية ، ويسبب PGE2 تضيق الأوعية بتركيزات منخفضة48. لذلك ، يتم استرخاء الرحم مع توسع الأوعية ، ويتم تخفيف عسر الطمث.

نظرا لأن جسم الإنسان لا يستطيع تصنيع كمية كافية من الأحماض الدهنية غير المشبعة C18 ، فإن حمض اللينوليك وحمض α-linolenic ، وهما المصدر الوحيد للأحماض الدهنية غير المشبعة C18 ، مهمان جدا38. حمض اللينوليك وحمض α لينولينيك هما مصدر استقلاب الأحماض الدهنية غير المشبعة أوميغا 6 وأوميغا 3 ، على التوالي. على وجه الخصوص ، السلائف من تخليق البروستاجلاندين هو ARA ، ويتم تصنيع ARA من حمض اللينوليك49. حمض اللينوليك هو مقدمة ، ويتم تصنيع سلسلة من المستقلبات منه ، بما في ذلك ARA ، البروستاجلاندين (PGF 2 α ، PGE 2) ، البروستاسيكلين (PGI 2) ، والثرومبوكسان (TXA 2) 50. يرتبط حمض اللينوليك ارتباطا وثيقا بالتأثير المسكن المعزز ل CRV. علاوة على ذلك ، يمكن أن ينتج المسار الأيضي للتخليق الحيوي لهرمون الستيرويد البروجسترون51،52،53 و sphingosine-1-phosphate (C06124) ، والتي يتم إنتاجها بواسطة المسار الأيضي لعملية التمثيل الغذائي لاستقلاب sphingolipid ، وتحفيز COX-2 ، وإنتاج PGE2 من خلال TNF 54،55،56،57. قد تكون هذه أيضا مرتبطة ب PD.

هناك بعض القيود على البروتوكول. تمت مقارنة المستويات النسبية للمكونات فقط ، ولم يتم استخدام العينة القياسية لتحديد المكونات في العشب وتلك التي تم امتصاصها في الدم. لم يتم جمع براز وبول الفئران في التجارب على الحيوانات ، مما أدى إلى اكتشاف عدد أقل من مستقلبات CR في الجسم الحي. يجب أن تؤكد تجارب التحقق من الصحة الآلية التي اكتشفها تحليل الأيض.

تجنبت الاستراتيجية والبروتوكول المستخدم في هذه الدراسة العمى في دراسة المكونات الكيميائية في المختبر والدراسة أحادية الجانب للمكونات الفردية في الجسم الحي. لذلك ، كانت مناسبة جدا لاستكشاف الآلية. يمكن أن توفر الاستراتيجية الكثير من الوقت والعمل ويمكنها تحديد المكونات الحاسمة وآلية الفعالية العلاجية بدقة.

في هذه الدراسة ، وجد أن هناك 15 مكونا ومستقلبين في الدم. من بينها ، زادت مستويات (-) -myrtenol و [(1R ، 2S ، 3R ، 4R) -3-hydroxy-1،4،7،7-tetramethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl] حمض الخليك بشكل ملحوظ في مجموعة CRV مقارنة بمجموعة CR ، مما يدل على أن المعالجة بالخل يمكن أن تزيد من مستويات المكونات النشطة في الدم. بعد معالجة CR بالخل ، انخفضت مستويات البروستانويدات من سلسلتين و 4 سلسلة من الليكوترينات مع خصائص مؤيدة للالتهابات وتراكم الصفائح الدموية وتضيق الأوعية ، بما في ذلك PGF2α و leukotriene B4 و prostaglandin J2. قد تكون هذه هي الآلية التي يوضح بها CRV تأثيرا مسكنا معززا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع علوم وتكنولوجيا الطب الصيني التابع للجنة الصحة وتنظيم الأسرة في بلدية تشونغتشينغ (رقم المشروع: ZY201802297) ، والمشروع العام لمؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (رقم المشروع: cstc2019jcyj-msxmX065) ، وخطة بناء فريق ابتكار نظام التكنولوجيا الزراعية عالية الكفاءة المميزة لمنطقة تشونغتشينغ الجبلية الحديثة 2022 [10] ، ومشروع بناء الانضباط الرئيسي للجنة الصحة في بلدية تشونغتشينغ للمواد الصينية معالجة ميديكا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Tags

التراجع، العدد 190،
تحليل عينات جذمور Cyperi الخام والمعالجة باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة في الفئران المصابة بعسر الطمث الأولي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter