Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Analyse af rå og forarbejdede Cyperi rhizoma-prøver ved hjælp af væskekromatografi-tandemmassespektrometri hos rotter med primær dysmenoré

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Her præsenteres en sammenlignende analyse af rå og forarbejdede Cyperi rhizoma (CR) prøver ved hjælp af ultra-højtydende væskekromatografi-tandem massespektrometri med høj opløsning (UPLC-MS / MS) hos rotter med primær dysmenoré. Ændringerne i blodets indhold af metabolitterne og prøvebestanddelene blev undersøgt mellem rotter behandlet med CR og CR behandlet med eddike (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) er meget udbredt i gynækologi og er en generel medicin til behandling af kvinders sygdomme i Kina. Da den smertestillende virkning af CR forbedres efter forarbejdning med eddike, anvendes CR behandlet med eddike (CRV) generelt klinisk. Den mekanisme, hvormed den smertestillende virkning forbedres ved eddikebehandling, er imidlertid uklar. I denne undersøgelse blev teknikken med ultrahøjtryksvæskekromatografitandem massespektrometri (UPLC-MS/MS) anvendt til at undersøge ændringer i blodets indhold af eksogene bestanddele og metabolitter mellem CR-behandlede og CRV-behandlede rotter med dysmenoré. Resultaterne afslørede forskellige niveauer af 15 bestanddele og to metabolitter i blodet hos disse rotter. Blandt dem var niveauerne af (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddikesyre i CRV-gruppen betydeligt højere end i CR-gruppen. CRV reducerede niveauet af 2-serie prostanoider og 4-serie leukotriener med proinflammatoriske, blodpladeaggregering og vasokonstriktionsaktiviteter og tilvejebragte smertestillende virkninger ved at modulere arachidonsyre og linolsyremetabolisme og biosyntese af umættede fedtsyrer. Denne undersøgelse afslørede, at eddikeforarbejdning forbedrer den smertestillende virkning af CR og bidrager til vores forståelse af virkningsmekanismen for CRV.

Introduction

Primær dysmenoré (PD) er den mest udbredte tilstand i klinisk gynækologi. Det er kendetegnet ved rygsmerter, hævelse, mavesmerter eller ubehag før eller under menstruation uden bækkenpatologi i reproduktionssystemet1. En rapport om dens udbredelse viste, at 85,7% af eleverne lider af PD2. Lavdosis orale præventionsmidler er standardbehandlingen, men deres bivirkninger, såsom dyb venetrombose, har tiltrukket stigende opmærksomhed3. Forekomsten af dyb venetrombose blandt orale præventionsbrugere er >1 pr. 1.000 kvinder, og risikoen er højest i de første 6-12 måneder og hos brugere over 40 år4.

Længe brugt i traditionel kinesisk medicin (TCM), Cyperi rhizoma (CR) er afledt af det tørrede rhizom af Cyperus rotundus L. af Cyperaceae familien. CR regulerer menstruationsforstyrrelser og lindrer depression og smerter5. CR er meget udbredt i gynækologi og betragtes som en generel medicin til behandling af kvinders sygdomme6. CR behandlet med eddike (CRV) anvendes typisk klinisk. Sammenlignet med CR viser CRV forbedret regulering af menstruation og smertelindring. Moderne undersøgelser har vist, at CR hæmmer cyclooxygenase-2 (COX-2) og den efterfølgende syntese af prostaglandiner (PG'er) og derved opnår en antiinflammatorisk virkning. I mellemtiden udviser CR en smertestillende effekt uden bivirkninger7, hvilket gør CR til et godt valg for dysmenorépatienter. Imidlertid er mekanismen bag reguleringen af menstruation og tilvejebringelse af smertelindring ved CRV uklar. CR-forskning har primært fokuseret på ændringer i dets aktive kemiske komponenter og farmakologiske aktiviteter, såsom dets antiinflammatoriske, antidepressive og smertestillende virkninger 8,9,10,11,12.

Selvom ingredienserne i TCM er komplekse, absorberes de i blodet og skal nå en bestemt blodkoncentration for at være effektiv13. Omfanget af screening af de aktive ingredienser i TCM kan indsnævres ved at udnytte strategien for bestanddelsbestemmelse i blodet. Blindhed kan undgås ved undersøgelse af de kemiske komponenter in vitro, og ensidighed kan undgås ved undersøgelse af de enkelte bestanddele14. Ved at sammenligne sammensætningerne af CR og CRV i blodet kan ændringer i de aktive ingredienser i den forarbejdede CR detekteres effektivt og hurtigt. Lægemiddeleffektivitet er den proces, hvormed et lægemiddel påvirker kroppen. Ændringer i lægemiddelkomponenterne på grund af kroppens metaboliske respons, som kan være relateret til lægemidlets virkningsmekanisme, kan bestemmes med metabonomics. Metabonomics sigter mod at måle de samlede og dynamiske metaboliske reaktioner, hvilket er i overensstemmelse med bestemmelsen af den samlede effekt af traditionel kinesisk medicin15. Desuden er metabolitter det endelige produkt af genekspression, som er tættest beslægtet med fænotype16. Således kan metabonomics være egnet til at udforske forskellene i de metaboliske veje mellem CR og CRV i behandlingen af PD. Væskekromatografi-tandemmassespektrometri med høj opløsning (LC-MS/MS)-baseret ikke-målrettet metabolomics er kendetegnet ved høj gennemstrømning, høj følsomhed og høj opløsning og kan bruges til at måle mange forskellige små molekylære komponenter17,18 . Denne metode kan samtidig bestemme de endogene metabolitter og eksogene bestanddele, der absorberes i blodet. Metabonomics har været meget udbredt i undersøgelser af TCM19, narkotikatoksikologi 20, sundhedsstyring 21, sport22, mad 23 og andre områder.

I denne undersøgelse blev forskellene i de eksogene bestanddele, der blev absorberet i blodet, og de endogene metabolitter målt mellem CR-behandlede og CRV-behandlede dysmenorémodelrotter ved hjælp af LC-MS / MS-baserede ikke-målrettede metabolomics for at afsløre mekanismerne for de smertestillende virkninger af CRV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrerelaterede eksperimenter blev udført med godkendelse fra Experiment Ethics Committee of Chongqing Institute of TCM. Fireogtyve kvindelige Sprague Dawley rotter (SD), der var 8-10 uger gamle og vejede 200 g ± 20 g, blev brugt i dette forsøg.

1. Forberedelse af ekstraktionen

  1. Beregning
    1. Planlæg at administrere CR- eller CRV-ekstraktet til en behandlingsgruppe på seks Sprague-Dawley-rotter (10 g/[kg∙dag]) i 3 dage. Brug en CR- eller CRV-ekstraktkoncentration på 1 g / ml (1 ml ekstrakt opnås fra 1 g urter).
      BEMÆRK: Doseringen af CR er 6-10 g. I denne undersøgelse blev den maksimale dosis på 10 g anvendt som dosis. Da gennemsnitsvægten af en voksen person er 60 kg, er voksendosis 0,1667 g / kg. Ifølge vægtkonverteringsalgoritmen24, da dosiskonverteringskoefficienten mellem mennesker og rotter er 6,3, er doseringen for rotter 1,05 g / kg. Lægemiddeldosis blev øget med 10 gange til 10,5 g/kg for rotter. Doseringen blev fastsat til 10 g / kg for nemheds skyld ved beregning og det faktiske eksperiment. For eksempel ved beregningen, hvis der er behov for i alt 36 g CR eller CRV, skal den kinesiske urtemedicin fremstilles mindst to gange. Således var 200 g CR påkrævet - 100 g CR blev brugt som CR, og 100 g CR blev forarbejdet til CRV.
    2. Volumen CR eller CRV beregnes pr. rotte ved hjælp af ligning (1):
      V = 10 g/(kg∙dag) × 200 g/(1 g/ml) = 2 ml (1)
  2. Behandling af CRV
    1. 100 g CR og 20 g eddike (>5,5 g eddikesyre/100 ml) blandes grundigt og inkuberes i 12 timer.
      BEMÆRK: For at sikre, at CR'ens indre blev fugtet med eddike efter 12 timer, blev CR og eddike blandet, omrørt godt og derefter omrørt igen, indtil den indre del var fugtig.
    2. Blandingen omrøres i en jernpande i 10 minutter ved 110-120 °C. Tag derefter blandingen ud, og lad den køle af ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: For at forhindre, at CR brænder, er det nødvendigt at røre kontinuerligt under opvarmning. Hvis den forarbejdede CRV er for våd, kan den tørres ved 60 °C. Når CR'ens overflade er sepia, kan omrøringen stoppes.
  3. Ekstraktion
    1. CR ekstrakt
      1. Tilsæt 10 gange (mængden af CR) rent vand til CR, og blød i 2 timer. Sørg for, at de medicinske materialer er under væskeniveauet ved iblødsætning.
        BEMÆRK: CR skal kun skæres i halve inden ekstraktion. Formålet med blødgøring er at ekstrahere de aktive bestanddele mere effektivt. Opblødningsprocessen er afgørende.
      2. Bring blandingen af vand og medicin i kog ved høj varme, og hold det i kog ved svag varme i 20 min. Der filtreres med en filterklud (100 masker), og filtratet opsamles.
        BEMÆRK: Ved decocering blev der brugt en høj varme før kogning, og en lav varme blev brugt til at opretholde kogningen.
      3. Trin 1.3.1.2 gentages én gang, og filtraterne kombineres.
      4. Koncentrer ekstraktet med en rotationsfordamper til 1 g/ml (baseret på det originale lægemiddel skal koncentrationstemperaturen være under 60 °C).
        BEMÆRK: De aktive komponenter i CR er flygtige, så koncentrationstemperaturen bør ikke være højere end 60 °C.
    2. CRV ekstrakt
      1. Der udføres de samme trin (1.3.1.1-1.3.1.3) som for CR-ekstraktionsmetoden.
    3. CR-ekstrakt til test
      1. Der pipetteres 500 μL CR-ekstrakt og 500 μL methanol i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og hvirvel i 30 s for at blande.
        BEMÆRK: En blanding af methanol og vand ekstraherer de aktive komponenter bedre. Ekstraktet bør ikke filtreres direkte til testning.
      2. Hver prøve centrifugeres i 15 minutter ved 1,6502 × g ved 4 °C. Supernatanten filtreres, og den overføres derefter til hætteglasset til testning.
        BEMÆRK: Efter højhastighedscentrifugering af blandingen af methanol og ekstrakt kan supernatanten overføres direkte til prøveflasken til bestemmelse uden filtrering. På grund af den varme, der genereres ved centrifugeringsprocessen, foretrækkes det at anvende en kryogen centrifuge.
    4. CRV-ekstrakt til testning
      1. Udfør trin 1.3.3.1-1.3.3.2 for at forberede CRV-ekstraktet til testning.

2. Dyr

  1. Beregning
    1. Tag 50 mg østradiolbenzoat, og tilsæt det til 50 ml olivenolie for at forberede en 1 mg / ml opløsning. Tag 50 mg oxytocin, og tilsæt det til 50 ml normalt saltvand for at forberede en 1 mg / ml opløsning.
      BEMÆRK: Dosis af intraperitoneal injektion af østradiolbenzoat og oxytocin er 10 mg/(kg∙dag). Estradiolbenzoat opløses i olivenolie, og oxytocin opløses i normalt saltvand. Østradiolbenzoat er ikke let at opløse i olivenolie og kan behandles med ultralyd for at fremskynde opløsningen. Både østradiolbenzoat- og oxytocinopløsningerne skal fremstilles dagligt.
    2. Beregn mængden af østradiolbenzoatopløsning, der skal påføres pr. rotte (dvs. V = 10 mg/[kg∙dag] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Beregn mængden af oxytocinopløsning, der skal påføres pr. rotte (dvs. V = 10 mg/[kg∙dag] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Artsbestemmelse og -administration
    BEMÆRK: Der blev afsat ti dage til administration25,26. Under behandlingen havde rotterne ubegrænset adgang til standard chow og vand. Inden for 30 minutter efter oxytocinadministration blev hver rottes vridende aktivitet sporet. PD-rottemodellen blev udviklet med succes, som det fremgår af modelrotternes vridningsresponser, som omfattede livmoderkontraktion, rotation af et lem, forlængelse af bagben, en hul kuffert og abdominal sammentrækning26.
    1. Tildel 24 hunrotter fra Sprague-Dawley (SD-rotter, 8-10 uger gamle, vejer 200 g ± 20 g) i fire grupper ved tilfældig kontrol, model, CR og CRV - og fodre dem i 7 dage.
    2. Administration af dyr
      1. Intraperitonealt injicere rotter i model-, CR- og CRV-grupperne med 2 ml østradiolbenzoatopløsning hver dag. Intraperitonealt injicere rotterne i kontrolgruppen med 2 ml normalt saltvand.
      2. Fra dag 8 skal du fuldføre trin 2.2.2.1. Derefter administreres intragastrisk 2 ml CRV-ekstrakt til rotterne i CRV-gruppen, 2 ml CR-ekstrakt til rotterne i CR-gruppen og 2 ml normalt saltvand til rotterne i kontrol- og modelgrupperne.
      3. På dag 10 fuldføres trin 2.2.2.2. Derefter injiceres rotterne i model-, CR- og CRV-grupperne intraperitonealt med 2 ml oxytocinopløsning og rotterne i kontrolgruppen med 2 ml normalt saltvand.
    3. Registrer rotternes vridende tider inden for 30 minutter efter oxytocininjektionen.
  3. Prøveindsamling
    1. Saml abdominal aorta blodprøver, punktafgifter livmoderen hurtigt og fuldstændigt, og adskil forsigtigt bindevæv og fedt, der klæber til livmodervæggen.
      BEMÆRK: Blod blev opsamlet så tæt på inden for 1 time efter den sidste dosis.
    2. Brug mikrocentrifugerør til at bevare og overføre livmodervævet til flydende nitrogen. Vævsprøverne opbevares ved -80 °C.
    3. Centrifuger blodprøverne i 10 minutter ved 4.125 × g. Den serumholdige supernatant fjernes og centrifugeres ved 16,502 × g i 10 minutter ved 4 °C. Centrifuger serumet, og opbevar det derefter i glasset ved -80 °C til opbevaring.
      BEMÆRK: Blodprøverne skal efterlades ved stuetemperatur i 1 time til oparbejdning.
  4. Behandling af prøver
    1. Serumprøver
      1. Kom 400 μL methanol og 200 μL serum i et mikrocentrifugerør og hvirvel i 30 s for at blande. Hver prøve centrifugeres i 15 minutter ved 16.502 × g ved 4 °C. Prøveflaskerne fyldes med supernatanten efter opsamling og filtrering. Alle supernatanterne fra hver prøve blandes med samme volumen for at forberede kvalitetskontrolprøver til testning.
    2. Vævsprøver fra livmoderen
      1. Tag 100 mg livmodervæv fra det ipsilaterale segment og slip det med et nifoldigt volumen normalt saltvand. Homogenatet centrifugeres i 10 minutter ved 4,125 × g, og supernatanten opsamles. Supernatanten anbringes i køleskab ved 4 °C til testning eller ved -80 °C, hvis den ikke skal testes samme dag.
      2. Placer normale saltvands-, vævs- og stålkugler i et 2 ml mikrocentrifugerør, sæt mikrocentrifugerøret i flydende nitrogen i 3-5 s, og sæt derefter vævet i en vævsslibemaskine til slibning.
  5. Prøve test
    1. Der anvendes et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) til måling af PGF2a - og PGE2-indholdet i rotteprøvernes livmodervæv.
      BEMÆRK: Rotte PGE 2 ELISA-sættet blev brugt til at måle PGE 2-indholdet, og rotte PGF2α ELISA-sættet blev brugt til at måle PGF2a-niveauet. De detaljerede trin findes i producentens instruktioner. Detaljerne i sættet er angivet i materialetabellen.
    2. Vurder serumprøven, CR-ekstraktet og CRV-ekstraktet ved hjælp af UPLC-MS/MS.
      1. Til UPLC anvendes en C18-kolonne (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) og en binær gradientmetode med mobil fase A indeholdende 0,1 % myresyre og mobil fase B indeholdende acetonitril. Indstil elueringsgradienten som følger: fra 0 min til 1 min, 15% B; fra 1 min til 8,5 min, 15% til 85% B; fra 8,5 min til 11,5 min, 85% B; fra 11,5 min til 11,6 min, 99% til 1% B; og fra 11,6 min til 15 min, 15% B. Indstil flowhastigheden til 0,35 ml/min og injektionsvolumen til 2 μL.
      2. For MS indstilles temperaturen til 600 °C, gardingassens (CUR) strømningshastighed til 0,17 MPa og både kappe- og hjælpegasstrømningshastigheder til 0,38 MPa. Indstil ionsprayspændingen for den positive iontilstand og den negative iontilstand til henholdsvis 5,5 kV og -4,5 kV, declustereringspotentialet (DP) spændingen til 80 V eller -80 V, kollisionsenergien (CE) til 40 eV eller -25 eV og kollisionsenergisuperpositionen (CES) til 35 eV ± 15 eV.
      3. Udfør testen i henhold til producentens protokol ved hjælp af UPLC-MS/MS. Udfør MS for et masseområde på 50-1.000 m/z.
      4. Få UPLC-MS/MS-resultaterne ved hjælp af det matchende arbejdsstationsprogram sammen med registreringstilstandens informationsafhængige anskaffelse, filter for flere massedefekter og dynamisk baggrundsfradrag. Brug kvalitetskontrolprøverne af poolet serum til at teste UPLC-MS/MS-udstyrets repeterbarhed og stabilitet for at verificere den konventionelle tilgang. Før forskningsprøverne injiceres kvalitetskontrolprøverne i fire på hinanden følgende kørsler, og injiceres derefter efter hver femte serumprøve.

3. Databehandling

  1. Forberedelse af data
    1. Brug konverteringssoftware til at konvertere rådata til mzXML-formatet. Normaliser den samlede ionstrøm (TIC) data for hver prøve.
      BEMÆRK: Et internt R-baseret program (www.lims2.com) bygget på XCMS blev brugt til at analysere oplysningerne til integration, justering, udtrækning og topdetektion27.
    2. Udfør metabolitannotation ved hjælp af en proprietær MS2-database (www.lims2.com). Indstil annotationstærsklen til 0,328.
      BEMÆRK: De endogene metabolitter blev identificeret i hver gruppe.
  2. Hovedkomponentanalyse og ortogonal partiel mindste kvadratisk diskriminantanalyse
    1. Brug analysesoftware til at udføre hovedkomponentanalysen (PCA) og modelleringen. Importer de standardiserede data for metabolitterne til analysesoftwaren. Brug derefter autofit til at opbygge analysemodellen. Endelig skal du bruge score til at opnå scorespredningsplottet for PCA.
      BEMÆRK: Grupperingen af hver gruppe blev opnået med scorespredningsplottet for PCA. PCA er en uovervåget analysetilstand, der hovedsageligt grupperer prøverne gennem dimensionsreduktion uden intervention.
    2. Brug analysesoftwaren til at udføre den ortogonale partielle mindste kvadratiske diskriminantanalyse (OPLS-DA).
      1. Importer de standardiserede data om metabolitterne i CR- og CRV-grupperne til analysesoftwaren.
      2. Importér dataene fra CR-gruppen til den oprettede CR-gruppe, og importér dataene fra CRV-gruppen til den oprettede CRV-gruppe.
        BEMÆRK: OPLS-DA er en overvåget analysetilstand, og gruppering af prøverne er nødvendig.
      3. Brug derefter autofit til at opbygge analysemodellen, og brug score til at opnå scorespredningsplottet for OPLS-DA. Til sidst skal du bruge VIP til at opnå den variable signifikans i projektionsværdien ( VIP ) i OPLS-DA.
        BEMÆRK: Den variable signifikans i fremskrivningsværdierne (VIP) for metabolitterne i CR- og CRV-grupperne blev opnået gennem OPLS-DA.
  3. Identifikation af potentielle differentielle metabolitter
    1. Metabolitterne screenes med VIP-værdier større end 1 i trin 3.2.2.3.
    2. Brug statistisk software til at beregne P-værdien af de metabolitter, der blev screenet ud i trin 3.3.1 af elevens t-test.
      BEMÆRK: Signifikante forskelle i de potentielle differentielle metabolitter i CR- og CRV-grupperne blev bestemt af en studerendes t-test. De potentielle differentielle metabolitter var dem med en studerendes t-test p-værdi < 0,05 og en variabel signifikans i fremskrivningen (VIP) større end 1. Repræsentationen blev opnået ved hjælp af et vulkansk plot.
  4. Identifikation af differentielle metabolitter
    1. Screening af de potentielle differentielle metabolitter i trin 3.3. Resultaterne af trin 3.1.2 anvendes til at identificere disse differentielle metabolitter.
      BEMÆRK: Et lille antal potentielle differentialmetabolitter blev identificeret, og de blev kandidatdifferentielle metabolitter.
    2. Frasorter de differentielle metabolitter, der skal matches i KEGG-databasen. Vis ændringerne i differentialmetabolitterne i CR- og CRV-grupperne ved at tegne et varmekort.
      BEMÆRK: Et lille antal kandidatdifferentielle metabolitter blev matchet, og de blev differentielle metabolitter.
  5. Undersøgelse af de potentielle stofskifteveje
    1. Upload de forskellige metabolitter til Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca) databasen.
    2. Brug Pathways Analysis til at opnå de potentielle metaboliske veje.
      BEMÆRK: De potentielle metaboliske veje blev opnået i CR- og CRV-grupperne. P-værdien og påvirkningsværdien var to meget vigtige indikatorer i udvælgelsen af de kritiske veje. P-værdien var vigtigere end påvirkningsværdien. Signifikans blev defineret af en P-værdi < 0,05; Større effektværdier var forbundet med bedre korrelationer.
    3. Analyser de potentielle metaboliske veje ved at uploade de forskellige metabolitter til KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) databasen.
      BEMÆRK: Forholdet mellem metaboliseringsvejens funktion og PD bør også tages i betragtning. De kritiske metaboliske veje blev opnået.
  6. Identifikation af de bestanddele, der absorberes i blodet
    1. Identificer de kemiske bestanddele i CR- og CRV-ekstrakterne ved hjælp af den interne MS2-database (www.lims2.com), Human Metabolome Database (HMDB) og Massbank- og Chemspider-databaserne.
    2. Bestem de bestanddele, der absorberes i blodet i CR- og CRV-grupperne, og sammenlign bestanddelene mellem CR- og CRV-grupperne.
      BEMÆRK: De bestanddele, der absorberes i blodet, skal påvises i CR- eller CRV-gruppen, men kan ikke påvises i kontrolgruppen.
  7. Statistisk analyse
    1. Analyser dataene ved hjælp af univariat analyse (UVA) og multivariate statistiske metoder, herunder variansanalyse (ANOVA) og elevens t-test.
      BEMÆRK: De eksperimentelle oplysninger blev præsenteret ved hjælp af statistisk software som gennemsnit ± standardafvigelse (±SD). P < 0,01 blev betragtet som en meget signifikant forskel, og P < 0,05 repræsenterede en signifikant forskel28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse af dysmenoré model eksperiment
Der var ingen vridende respons inden for 30 minutter i kontrolgruppen, fordi disse rotter ikke blev intraperitonealt injiceret med oxytocin og østradiolbenzoat for at forårsage smerte. Rotterne i model-, CR- og CRV-grupperne udviste betydelige vridende reaktioner efter oxytocininjektionen. Disse resultater viser effekten af østradiolbenzoat- og oxytocinkombinationen til inducering af dysmenoré. Forskellene i PGF 2α, PGE 2 og PGF2α/PGE 2 niveauerne mellem modellen og kontrolgrupperne var signifikante (P < 0,001, P < 0,05), hvilket viser modellens effektivitet (figur 1).

Figure 1
Figur 1: PGF 2 α og PGE2 indholdet i livmodervævet og det vridende antal i hver gruppe. A) PGF 2-α indholdet i livmodervævet i hver gruppe. B) PGE2-indholdet i livmodervævet i hver gruppe. C) PGF 2-α/PGE2-indholdet i livmodervævet i hver gruppe. (D) Det vridende nummer i hver gruppe. Kolonnerne repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM fra fire grupper (seks mus pr. Gruppe). * P < 0,05 eller ** P < 0,01 repræsenterer en signifikant forskel i forhold til modelgruppen, og Δ P < 0,05 eller ΔΔ P < 0,01 repræsenterer en signifikant forskel i forhold til CR-gruppen. Rotterne i model-, CR- og CRV-grupperne viste en betydelig vridende reaktion efter oxytocininjektionen. Forkortelser: PG = prostaglandin; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Koncentrationerne af PGF2α og PGF2a/PGE2 blev reduceret i CRV- og CR-grupperne, og denne reduktion var mere markant i CRV-gruppen. Der var også signifikante (P < 0,001 og P < 0,05) forskelle i koncentrationerne af PGF 2α og PGF2α/PGE2 mellem CRV- og CR-grupperne. Sammenlignet med modelgruppen var PGE2-koncentrationen signifikant større i CRV- og CR-grupperne (P < 0,001), hvor niveauet steg mest i CRV-gruppen.

Kvalitetskontrol
Der blev observeret en god overensstemmelse mellem retentionstiderne for BPC-kromatografiske toppe og signalintensiteterne i kvalitetskontrolprøverne, hvilket viste en høj grad af instrumentstabilitet og bemærkelsesværdig konsistent datakvalitet (supplerende fil 1-supplerende figur 1 og supplerende figur 2). Desuden lå alle kvalitetskontrolprøverne inden for ±2 standardafvigelser (figur 2A,B), og korrelationen mellem kvalitetskontrolprøverne var større end 0,7 (figur 2C,D). Disse resultater tyder på, at proceduren var pålidelig, og at resultaterne var troværdige.

Figure 2
Figur 2: PCA-X endimensionel fordeling af kvalitetskontrolprøverne. (A) Positiv tilstand, (B) negativ tilstand; korrelationsanalyse af kvalitetskontrolprøverne i C-positiv funktionsmåde og D-negativ funktionsmåde. Alle kvalitetskontrolprøverne var inden for ±2 standardafvigelser, og korrelationerne mellem kvalitetskontrolprøverne var større end 0,7. Disse resultater tydede på, at proceduren var pålidelig, og at oplysningerne var troværdige. Forkortelser: PC = hovedkomponent; PCA = analyse af hovedkomponenter kvalitetskontrol; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Analyse af hovedkomponenter
Som vist i figur 3 angav abscissen PC (1) scorerne for de første hovedkomponenter, mens ordinaten PC (2) angav scorerne for den anden hovedkomponent. I figuren angiver den grønne cirkel kontrolgruppen, den røde cirkel repræsenterer modelgruppen, den blå cirkel angiver CR-gruppen, den hvide cirkel angiver CRV-gruppen, og den lyserøde cirkel angiver kvalitetskontrolgruppen.

Figure 3
Figur 3: Scorespredningsplot for PCA . (A) Positiv tilstand og (B) Negativ tilstand. Kvalitetskontrolprøverne overlapper hinanden, hvilket indikerer, at instrumentet var meget stabilt. Hver gruppe er fordelt i sit eget område, hvor kun CR-gruppen og CRV-gruppen lejlighedsvis krydser stier. Forkortelser: PC = hovedkomponent; PCA = analyse af hovedkomponenter QC = kvalitetskontrol; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

PCA-analyseresultaterne viste, at klyngerne af CR- og modelgrupperne var signifikant adskilt i både positive og negative iontilstande. Klyngerne var signifikant adskilt mellem CRV- og modelgrupperne i de positive og negative iontilstande. Kvalitetskontrol-, model- og kontrolgrupperne blev adskilt fra de andre behandlingsgrupper (CR, CRV). CR- og CRV-grupperne overlappede lejlighedsvis hinanden i positiv ion-tilstand. I negativ iontilstand blev hver gruppe adskilt signifikant.

Ortogonal partiel mindste kvadraters metode diskriminant analyse
OPLS-DA blev brugt til at screene for metaboliske forskelle. OPLS-DA-spredningsplottet viste, at alle prøverne var inden for 95% konfidensintervallet (Hotellings T-firkantede ellipse). Figur 4A,C viser, at CR- og CRV-grupperne var adskilt. Model overfitting blev testet ved hjælp af permutationstesten (n = 200), og modellens statistiske signifikans blev vurderet. I figur 4B,D viser ordinaten værdien afR2Y- ellerQ2-værdien, og abscissen angiver erstatningsretentionen. R 2Y er repræsenteret af den grønne prik, Q2 er repræsenteret af den blå firkantede prik, og de to stiplede linjer repræsenterer deres tilsvarende regressionslinjer. I de positive og negative tilstande varR2Y-værdierne0, 8 og 0, 84, ogQ2-værdierne var henholdsvis -0, 59 og -0, 57. Dette demonstrerer modellens høje pålidelighed og fraværet af overmontering.

Figure 4
Figur 4: OPLS-DA-modeller for CR-gruppen versus CRV-gruppen. Score scatter plot i (A) positiv tilstand og (C) negativ tilstand. Permutationstest af OPLS-DA-modellen for CR-gruppen versus CRV-gruppen i (B) positiv tilstand og (D) negativ tilstand. R2Yvar 0,8 og 0,84, ogQ2 var -0,59 og -0,57 i henholdsvis positiv og negativ tilstand. Dette demonstrerer modellens høje pålidelighed og fraværet af overfitting-adfærd. Forkortelser: OPLS-DA = ortogonal partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Univariat statistisk analyse
Univariate statistiske analyser blev udført for at identificere metaboliske variationer. Under standardscreeningen af VIP > 1 og P < 0,05 blev der påvist 339 og 394 potentielle differentialmetabolitter i henholdsvis positive og negative iontilstande. Et vulkanplot er vist i figur 5, hvor hvert punkt svarer til en anden metabolit. Ordinaten viser P-værdien af den studerendes t-test, og abscissen afspejler flere ændringer i niveauet af hvert molekyle i gruppen. Spredningsstørrelsen repræsenterer VIP-værdien af OPLS-DA-modellen; VIP-værdien stiger med størrelsen af scatter. De røde prikker angiver en stigning, de blå prikker angiver et fald, og de grå angiver ingen signifikant forskel.

En kvalitativ analyse af kandidatdifferentielle metabolitter blev udført under anvendelse af sekundær massespektrometri. Der blev observeret signifikante ændringer i 63 metabolitter i positiv tilstand (supplerende fil 1-supplerende tabel 1) og i 30 metabolitter i negativ tilstand (supplerende fil 1-supplerende tabel 2). De differentielle metabolitter blev bestemt ved hjælp af KEGG- og HDMB-databaserne. De nøjagtigt matchede forbindelser blev identificeret som differentielle metabolitter, og disse er anført i tabel 3 og tabel 4.

Figure 5
Figur 5: Vulkanplot for CR-gruppen versus CRV-gruppen . (A) Positiv tilstand og (B) negativ tilstand. I vulkangrafen repræsenteret svarer hvert punkt til en anden metabolit. Ordinaten viser P-værdien af elevens t-test, og abscissen afspejler de mange ændringer i hvert stof i gruppen. Spredningsstørrelsen repræsenterer VIP-værdien af OPLS-DA-modellen. VIP-værdien stiger med størrelsen af scatter. Røde prikker angiver stigninger, blå prikker angiver fald, og grå angiver ingen signifikante forskelle. Forkortelser: OPLS-DA = ortogonal partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse; VIP = variabel betydning i fremskrivningen; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Sammenligninger af metabolitter
Den euklidiske afstandsmatrix for de kvantitative værdier af differentialmetabolitterne mellem CR- og CRV-grupperne blev beregnet, og differentialmetabolitterne blev grupperet ved hjælp af en omfattende korrelationstilgang.

Abscissen repræsenterer forskellige eksperimentelle grupper, mens ordinaten repræsenterer det relative niveau i figur 6. Placeringen af farvepletterne angiver, hvordan hver metabolit udtrykkes i forhold til de andre. I positiv iontilstand steg niveauerne af fire differentielle metabolitter i CRV-gruppen sammenlignet med CR-gruppen, mens niveauerne af 11 differentielle metabolitter faldt. I negativ iontilstand sammenlignet med CR-gruppen steg niveauerne af fire differentielle metabolitter i CRV-gruppen, og niveauerne af 7 differentielle metabolitter faldt.

Figure 6
Figur 6: Heatmap-analyse for CRV-gruppen versus CR-gruppen . (A) Positiv tilstand og (B) negativ tilstand. Abscissen repræsenterer de forskellige eksperimentelle grupper, og ordinaten repræsenterer de relative ekspressionsniveauer. Placeringen af farvepletterne angiver, hvordan hver metabolit udtrykkes i forhold til de andre. Forkortelser: CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Sammenlignet med CR-gruppen var metabolitterne, der steg i CRV-gruppen, sphingosin-1-phosphat, nobiletin, glycerophosphocholin, lysopc (18: 1 (9z)), 2-hydroxy-6-pentadecylbenzoesyre, 9,10-epoxyoctadecensyre, 13s-hydroxyoctadecadienosyre og 2-methoxyestron, mens de, der faldt, var corticosteron, indoleddikesyre, glycocholsyre, berberin, dibutylphthalat, retinol, leukotrien B4, prostaglandin J2, 21-hydroxypregnenolon, zeranol, homocystein, propynosyre, stearinsyre, docosahexaensyre, phenylacetylglycin, L-phenylalanin, østronglucuronid og citronsyre (figur 7).

Figure 7
Figur 7: De relative niveautendenser for de potentielle metabolitter i CRV- og CR-grupperne . (A) Positiv tilstand og (B) Negativ tilstand. I positiv tilstand sammenlignet med CR-gruppen steg niveauerne af fire differentielle metabolitter i CRV-gruppen, og niveauerne på 11 faldt. I negativ tilstand steg niveauerne af fire differentielle metabolitter i CRV-gruppen, og niveauerne af syv differentielle metabolitter faldt. Kolonnerne repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM fra fire grupper (seks mus pr. Gruppe). * P < 0,05, ** P < 0,01 eller *** P < 0,01 repræsenterer en signifikant forskel mellem CRV- og CR-grupperne. Forkortelser: CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Analyse af KEGG-veje
De differentielle metabolitter blev kommenteret, og KEGG-vejene blev analyseret. Resultaterne viste, at differentialmetabolitterne var forbundet med ni veje i henholdsvis positiv og negativ tilstand (tabel 1 og tabel 2). I figur 8 er de metaboliske veje hver repræsenteret af en boble i boblediagrammet, hvor en mere signifikant skala indikerer en større effektfaktor. Størrelsen af stien, der påvirker faktorerne i topologianalysen, er repræsenteret af boblediagrammets abscisse og boblestørrelsen. Boblediagrammets ordinat og boblefarven angiver P-værdien af berigelsesanalysen (idet man tager den negative naturlige logaritme, dvs. -ln (p)). Graden af berigelse er mere signifikant, P-værdien er mindre, ordinatværdien er mere fremtrædende, og farven er mørkere. P-værdien og effektværdien er to meget vigtige indikatorer i udvælgelsen af kritiske veje. Generelt er P-værdien vigtigere end påvirkningsværdien.

Figure 8
Figur 8: Pathway analyse for CRV-gruppen versus CR-gruppen . (A) Positiv tilstand og (B) Negativ tilstand. De metaboliske veje er hver repræsenteret af en boble i boblediagrammet. Abscissen i boblediagrammet og boblestørrelsen angiver størrelsen af de stipåvirkende faktorer i topologianalysen. Boblediagrammets ordinat og boblefarven angiver P-værdien af berigelsesanalysen. De vigtigste metaboliske veje omfatter biosyntese af umættede fedtsyrer og linolsyremetabolisme. Forkortelser: CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 3 og tabel 4 viser metaboliske veje med signifikante forskelle-phenylalaninmetabolisme og linolsyremetabolisme samt biosyntese af umættede fedtsyrer, phenylalanin, tyrosin og tryptophan. Selvom de metaboliske veje omfattede steroidhormonbiosyntese, sphingolipid og arachidonsyremetabolisme, var der ingen signifikante forskelle, som var relateret til dysmenoré. Resultaterne viste, at linolsyremetabolisme og biosyntese af umættede fedtsyrer var de kritiske metaboliske veje forbundet med den forbedrede effektivitet af CRV.

Bestanddele, der absorberes i blodet
Femten bestanddele og to metaboliseringsprodukter fra CRV- og CR-ekstrakterne blev påvist i rotteserumet i CR- og CRV-grupperne (tabel 5). Alle 17 komponenter blev fundet i positiv iontilstand.

De relative bestanddele i blodprøverne fra de to grupper blev sammenlignet ved hjælp af elevens t-test. Abscissen i figur 9 viser forskellige eksperimentelle grupper; Ordinaten repræsenterer responsværdien af massespektret. Der var to komponenter med betydelige forskelle. Analysen viste, at niveauerne af disse to komponenter var forhøjet i CRV-gruppen sammenlignet med CR-gruppen, mens niveauerne for 15 elementer ikke viste nogen signifikante ændringer.

Figure 9
Figur 9: Bestanddele absorberet i blodet for CRV-gruppen versus CR-gruppen. Der var 15 bestanddele og to metaboliseringsprodukter fra CRV- og CR-ekstrakterne i rotteserumet i CR- og CRV-grupperne. Analysen viste, at blodniveauerne af to komponenter blev øget i CRV-gruppen sammenlignet med CR-gruppen, mens blodniveauerne af 15 komponenter ikke viste nogen signifikante ændringer. Blandt dem var niveauet af (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddikesyre i CRV-gruppen betydeligt højere end i CR-gruppen. * P < 0,05 eller ** P < 0,01 repræsenterer en signifikant forskel mellem CRV-gruppen og CR-gruppen. Forkortelser: CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Metaboliske forskelle i positiv tilstand. Forkortelser: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = variabel betydning i fremskrivningen; RT = opbevaringstid. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Metaboliske forskelle i negativ tilstand. Forkortelser: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = variabel betydning i fremskrivningen; RT = opbevaringstid. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Analyse af metabolisk vej i positiv tilstand. Forkortelse: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4 Analyse af metabolisk vej i negativ tilstand. Forkortelse: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Identifikation af prototypens bestanddele og metabolitter i rotteserum. Bemærk: M1 og M2 er metabolitter; Andre bestanddele er prototype ingredienser. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: BPC-diagrammer og MS 2-kromatogram af bestanddele, der absorberes i blodet hos nøgne mus. BPC-diagrammer over alle kvalitetskontrolprøver i positiv og negativ funktionsmåde MS 2-kromatogram af de 17 bestanddele, der absorberes i rotternes blod: D-camphen, (-)-myrtenol, ethylparaben, calamenen, α-cyperon, (+)-nootkaton, (1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddikesyre, 4-(2-(2.2.1)-bicycloheptylmethyl)benzoesyre, 10,12-peroxycalamenen, (1aS,10aR)-1a,5,9-trimethyl-1a,3,6,10a-tetrahydrooxireno[4,5]cyclodeca[1,2-b]furan-10(2H)-on, pterosin D, terrecyklinsyre, sugeonylacetat, 3-acetyl-13-deoxyphomenom, isocurcumenol, ligucyperonol, procurcumadiol. De differentielle metabolitter, der er identificeret ved sekundær massespektrometri, samt HDMB- og KEGG-databaserne i de positive og negative iontilstande er også inkluderet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund af TCM'ernes store variation og forskellige karakter virker disse urter undertiden ikke i klinisk praksis, og det kan skyldes uhensigtsmæssig behandling og decocting af TCM'er. TCM's mekanismer bliver mere tydelige med brugen af nutidig videnskab og teknologi 29,30. Denne undersøgelse viser, at både CR og CRV har terapeutiske virkninger i PD-modelrotter, og at den terapeutiske effekt af CRV er mere omfattende. Virkningsmekanismen for CRV kan være relateret til det faktum, at eddikeforarbejdning kan påvirke bestanddelene af CR, der absorberes i blodet og kan være forbundet med linolsyremetabolisme og biosyntese af umættede fedtsyrer. Figur 10 viser de potentielle veje for CRV's virkning i smertelindring.

Figure 10
Figur 10: Mekanismer for den forbedrede smertestillende virkning af CRV. Resultaterne viste, at der blev fundet 15 bestanddele og to metabolitter i blodet. Blandt dem var niveauerne af (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddikesyre i CRV-gruppen betydeligt højere end i CR-gruppen. CRV kan reducere niveauet af 2-serie prostanoider og 4-serie leukotriener fremstillet af ARA og opnå smertestillende virkninger via modulering af arachidonsyremetabolisme, biosyntese af umættede fedtsyrer og linolsyremetabolisme. Forkortelser: ARA = arachidonsyre; COX = cyclooxygenase; LA = linolsyre; PUFA = flerumættede fedtsyrer; GLA =γ-linolensyre; DGLA = dihomo-γ-linolensyre; PD = primær dysmenoré; PG = prostaglandin; LT = leukotriener; TX = thromboxan; SDA = stearidonsyre; ETA = eicosatetraensyre; EPA = eicosapentaensyre; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR forarbejdet med eddike. Klik her for at se en større version af denne figur.

Forholdsregler under eksperimentet
Da olien i den effektive komponent i CR er flygtig, bør tiden til ekstraktion af CR ikke overstige 20 minutter, og når den koger, bør den være på lav varme med en temperatur på ikke over 60 ° C under koncentrationen. For at sikre en vellykket udvinding af de effektive ingredienser skal urterne gennemblødes i vand i mindst 2 timer før afkogning, så urterne er våde, når blødningen er afsluttet. Under CR-behandlingen skal eddiken blandes godt med urterne, så eddiken fuldt ud kan trænge ind i dem. Hvis eddikevolumenet er for lavt til at vådte urterne grundigt, kan der tilsættes en lille mængde vand for at fortynde eddiken, og derefter kan eddiken blandes fuldt ud med urterne. Når blandingen er færdig, absorberer urterne al eddike. Da eddike indeholder eddikesyre, bør blandingen ikke komme i kontakt med jern for at undgå en kemisk reaktion.

I rotteforsøget gives den første intraperitoneale injektion af østradiolbenzoat på dag 10, derefter gives den intragastriske administration af ekstraktet af CR eller CRV, og endelig administreres den intraperitoneale injektion af oxytocin. Efter intraperitoneal injektion af oxytocin observeres dyret i 30 minutter, og blod tages straks. Normalt når blodkoncentrationen et højdepunkt inden for 1 time efter intragastrisk administration13, hvilket er det bedste tidspunkt at tage blod.

Ved bestemmelse af ekstrakt- og serumprøverne ved hjælp af LC-MS/MS bør de bestemmes i samme batch for at sikre, at retentionstiden for den samme komponent i forskellige prøver er konsistent. I dette eksperiment var identifikationen af komponenterne et vanskeligt punkt. Selvom en relativt moden database kan bruges til endogene metabolitter, var der ingen matchende database til identifikation af de bestanddele, der absorberes i blodet, så der bør udvises større omhu ved identifikation.

Forskelle i bestanddele absorberet i blodet mellem CR- og CRV-grupperne
For at bestemme den aktive ingrediens i CR undersøgte dette eksperiment de bestanddele, der blev absorberet i blodet i dysmenorémodelrotter. I dette eksperiment blev det konstateret, at 15 bestanddele og to metabolitter i blodet var forskellige mellem CR- og CRV-grupperne. Blandt dem var niveauerne af (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddikesyre i CRV-gruppen betydeligt højere end i CR-gruppen, men niveauerne af andre komponenter var ikke signifikant forskellige. (-)-Myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddikesyre er terpenoider og betragtes som de effektive komponenter i CRV.

Ligucyperonol og procurcumadiol fremstilles ved oxidation af henholdsvis α-cyperon og isocurcumenol, og α-cyperon har en stærk smertestillende virkning. Den foreslåede virkningsmekanisme kan reducere LPS-induceret COX-2-ekspression og PGE2-syntese gennem negativ regulering af NF-kB-signalering31. (+)-Nootkaton hæmmer også COX-2 aktivitet32,33. Isocurcumenol er kernekomponenten i Curcumae rhizoma til behandling af dysmenoré3, og dets metabolit procurcumadiol kan have en smertestillende virkning. Sammenlignet med CR-gruppen viste CRV-gruppen betydeligt højere niveauer af (-)-myrtenol, som har en smertestillende effekt34. Den mulige virkningsmekanisme kan være, at ændringer i ekspressionen af COX-2 35 øger niveauerne af antiinflammatorisk cytokin (IL-10, IFN-γ) og reducerer niveauerne af proinflammatoriske cytokiner (TNF-α, IL-1β) niveauer36. Behandling med eddike forbedrer niveauerne af de aktive ingredienser i blodet, hvilket kan være grunden til, at produkter produceret med eddike er mere effektive.

Forskelle i stofskiftevejene mellem CR- og CRV-grupperne
Pathway analyse viste signifikant forskellige metaboliske veje mellem CR og CRV grupper, herunder med hensyn til phenylalanin metabolisme, biosyntese af umættede fedtsyrer, phenylalanin, tyrosin, og tryptophan biosyntese, og linolsyre metabolisme. Men, de metaboliske veje af phenylalanin metabolisme og phenylalanin, tyrosin, og tryptophan biosyntese er ikke relateret til PD. Disse resultater viser, at de metaboliske veje forbundet med den forbedrede effektivitet af CRV er linolsyremetabolisme og biosyntese af umættede fedtsyrer.

Umættede fedtsyrer omfatter to typer: omega-3 og omega-637. Tre forløbere for mediatorer, herunder eicosapentaensyre (20:5ω3; EPA), docosahexaensyre (22:5ω3; DHA) og arachidonsyre (20:5ω6; ARA), er involveret i biosyntesen af umættede fedtsyrer vej37,38. EPA og ARA metabolisme producerer begge prostaglandiner og leukotriener under virkningen af COX. ARA producerer 2-serie prostanoider, herunder PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 og thromboxan (TXA 2, TXB 2) og 4-serie leukotriener, herunder leukotrien A 4 (LTA 4) leukotrien B 4 (LTB 4), leukotrien C 4 (LTC 4) og leukotrien D 4 (LTD 4). 3-seriens prostanoider omfatter prostaglandinE3 (PGE 3), prostacyclin I 3 (BGB 3) og thromboxan A2 (TXA 3), og 5-serien leukotriener omfatter leukotrien A 5 (LTA 5), leukotrien B 5 (LTB 5), leukotrien C 5 (LTC 5) og leukotrien D 5 (LTD 5), som i vid udstrækning produceres af EPA.

Transformationsprocessen af EPA er den samme som ARA og medieres af lignende enzymer39. 2-seriens prostanoider og 4-serie leukotriener har hovedsageligt proinflammatoriske, blodpladeaggregering og vasokonstriktionseffekter. I modsætning hertil viser 3-serie prostanoider og 5-serie leukotriener antiinflammatoriske, antiplatelet og vasodilatoriske virkninger38. TXA 2 og TXB2 produceres fra ARA, hvilket får blodkarrene til at indsnævre. EPA-afledte BGB 3, PGE 3 og TXA3 fungerer kun som vasodilatorer38,40. EPA og ARA konkurrerer om omdannelse til PG'er af COX-enzymet. Når membran EPA / AA-forholdet øges, kan eicosanoiderne PGI 2 og TXA2, som fremmer aggregering, omdannes til TXA 3 og PGI3, hvilket fremmer antiaggregering, hvilket resulterer i antiinflammatoriske og antiaggregatoriske virkninger40. Derudover er den kombinerede anvendelse af EPA, DHA og linolsyre (C18: 2ω6; LIN) kan reducere PGF 2α og PGE2 frigivelse i bovin endometrium og trofoblaster41,42.

PD skyldes sandsynligvis produktionen af PG'er og leukotriener 43,44,45, især PG'er 46. I mellemtiden kan en ubalance i vasopressin, β-endorfiner, østrogen, progesteron, neurotransmittere, IL, ET-1 og NO også være relateret til dysmenoré47. Ifølge ELISA-resultaterne faldt PGF2α- og PGF2a/PGE 2-niveauerne i CRV-gruppen, mens PGE2-niveauet steg i forhold til CR-gruppen. Derudover var leukotrienB4 (C02165) og prostaglandin J2(C05957) lavere i CRV-gruppen. Dette indikerer, at der i CRV-gruppen var lavere niveauer af 2-serie prostanoider fremstillet af ARA, herunder PGF2a, som er den vigtigste faktor for dysmenoré. Behandling med PGE 2 ved høje koncentrationer udvider blodkarrene, og PGE2 forårsager vasokonstriktion ved lave koncentrationer48. Derfor er livmoderen afslappet med vasodilatation, og dysmenoré er lettet.

Da menneskekroppen ikke kan syntetisere en tilstrækkelig mængde C18 umættede fedtsyrer, er linolsyre og α-linolensyre, som er den eneste kilde til C18 umættede fedtsyrer, meget vigtige38. Linolsyre og α-linolensyre er kilden til henholdsvis omega-6 og omega-3 umættet fedtsyremetabolisme. Især er forløberen for prostaglandinsyntese ARA, og ARA syntetiseres fra linolsyre49. Linolsyre er en forløber, og en række metabolitter syntetiseres fra den, herunder ARA, prostaglandiner (PGF 2 α, PGE 2), prostacyclin (PGI 2) og thromboxan (TXA 2) 50. Linolsyre er tæt forbundet med den forbedrede smertestillende virkning af CRV. Desuden kan den metaboliske vej for steroidhormonbiosyntese producere progesteron 51,52,53 og sphingosin-1-phosphat (C06124), som produceres af den metaboliske vej for sphingolipidmetabolisme, inducerer COX-2 og producerer PGE2 gennem TNF54,55,56,57. Disse kan også være relateret til PD.

Der er nogle begrænsninger for protokollen. Kun de relative niveauer af bestanddelene blev sammenlignet, og standardprøven blev ikke brugt til at kvantificere bestanddelene i urten og dem, der blev absorberet i blodet. Afføring og urin fra rotter blev ikke indsamlet i dyreforsøgene, hvilket resulterede i opdagelsen af færre metabolitter af CR in vivo. Valideringseksperimenter bør yderligere bekræfte den mekanisme, der blev opdaget af metabonomics-analysen.

Den strategi og protokol, der blev anvendt i denne undersøgelse, undgik blindhed i undersøgelsen af kemiske komponenter in vitro og den ensidige undersøgelse af individuelle komponenter in vivo. Derfor var det meget velegnet til mekanismeudforskning. Strategien kan spare en masse tid og arbejde og kan præcist identificere de kritiske bestanddele og mekanismen for terapeutisk effekt.

I denne undersøgelse blev det konstateret, at der var 15 bestanddele og to metabolitter i blodet. Blandt dem blev niveauerne af (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddikesyre signifikant forøget i CRV-gruppen sammenlignet med CR-gruppen, hvilket viser, at forarbejdning med eddike kan øge niveauerne af de aktive ingredienser i blodet. Efter CR blev behandlet med eddike, faldt niveauerne af 2-serie prostanoider og 4-serie leukotriener med proinflammatoriske, blodpladeaggregering og vasokonstriktionsegenskaber, herunder PGF2a, leukotrien B4 og prostaglandin J2. Dette kan være den mekanisme, hvormed CRV viser en forbedret smertestillende virkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Chongqing Municipal Health and Family Planning Commission Chinese Medicine Science and Technology Project (projektnummer: ZY201802297), generelt projekt fra Chongqing Natural Science Foundation (projektnummer: cstc2019jcyj-msxmX065), Chongqing Modern Mountain Area Characteristic High-efficiency Agricultural Technology System Innovation Team Building Plan 2022 [10] og Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Medica-behandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Tags

Tilbagetrækning nummer 190
Analyse af rå og forarbejdede Cyperi rhizoma-prøver ved hjælp af væskekromatografi-tandemmassespektrometri hos rotter med primær dysmenoré
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter