Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Analyse av rå og behandlede Cyperi Rhizoma-prøver ved bruk av væskekromatografi-tandemmassespektrometri hos rotter med primær dysmenoré

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Her presenteres en komparativ analyse av rå og bearbeidede Cyperi rhizoma (CR) prøver ved bruk av væskekromatografi-høyoppløselig tandemmassespektrometri (UPLC-MS / MS) hos rotter med primær dysmenoré. Endringene i blodnivåene av metabolittene og prøvebestanddelene ble undersøkt mellom rotter behandlet med CR og CR behandlet med eddik (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) er mye brukt i gynekologi og er en generell medisin for behandling av kvinners sykdommer i Kina. Siden den smertestillende effekten av CR forsterkes etter behandling med eddik, brukes CR behandlet med eddik (CRV) vanligvis klinisk. Imidlertid er mekanismen der den smertestillende effekten forbedres ved eddikbehandling uklar. I denne studien ble ultrahøytrykksvæskekromatografitandemmassespektrometri (UPLC-MS / MS) -teknikken brukt til å undersøke endringer i blodnivåene av eksogene bestanddeler og metabolitter mellom CR-behandlede og CRV-behandlede rotter med dysmenoré. Resultatene viste forskjellige nivåer av 15 bestanddeler og to metabolitter i blodet til disse rottene. Blant dem var nivåene av (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroksy-1,4,7,7-tetrametylbisyklo[2.2.1]hept-2-yl]eddiksyre i CRV-gruppen betydelig høyere enn i CR-gruppen. CRV reduserte nivået av 2-serie prostanoider og 4-serie leukotriener med proinflammatoriske, blodplateaggregerings- og vasokonstriksjonsaktiviteter og ga smertestillende effekter ved å modulere arakidonsyre- og linolsyremetabolisme og biosyntese av umettede fettsyrer. Denne studien viste at eddikbehandling forbedrer den smertestillende effekten av CR og bidrar til vår forståelse av virkningsmekanismen til CRV.

Introduction

Primær dysmenoré (PD) er den mest utbredte tilstanden i klinisk gynekologi. Det er preget av ryggsmerter, hevelse, magesmerter eller ubehag før eller under menstruasjon uten bekkenpatologi i reproduktive systemet1. En rapport om utbredelsen viste at 85,7% av elevene lider av PD2. Lavdose p-piller er standardbehandlingen, men deres uønskede bivirkninger, som dyp venetrombose, har fått økende oppmerksomhet3. Prevalensen av dyp venetrombose blant brukere av orale prevensjonsmidler er >1 per 1000 kvinner, og risikoen er høyest i løpet av de første 6-12 månedene og hos brukere over 40 år4.

Lenge brukt i tradisjonell kinesisk medisin (TCM), er Cyperi rhizoma (CR) avledet fra det tørkede rhizomet av Cyperus rotundus L. av Cyperaceae-familien. CR regulerer menstruasjonsforstyrrelser og lindrer depresjon og smerte5. CR er mye brukt i gynekologi og regnes som en generell medisin for å behandle kvinners sykdommer6. CR behandlet med eddik (CRV) brukes vanligvis klinisk. Sammenlignet med CR viser CRV forbedret regulering av menstruasjon og smertelindring. Moderne studier har vist at CR hemmer cyklooksygenase-2 (COX-2) og den påfølgende syntesen av prostaglandiner (PG), og dermed oppnår en antiinflammatorisk effekt. I mellomtiden viser CR en smertestillende effekt uten bivirkninger7, noe som gjør CR til et godt valg for dysmenorépasienter. Imidlertid er mekanismen som ligger til grunn for regulering av menstruasjon og smertelindring ved CRV uklar. CR-forskning har hovedsakelig fokusert på endringer i dets aktive kjemiske komponenter og farmakologiske aktiviteter, for eksempel dets antiinflammatoriske, antidepressive og smertestillende effekter 8,9,10,11,12.

Selv om ingrediensene i TCM er komplekse, absorberes de i blodet og må nå en bestemt blodkonsentrasjon for å være effektiv13. Omfanget av screening av de aktive ingrediensene i TCM kan innsnevres ved å benytte strategien for bestemmelse av bestanddeler i blodet. Blindhet kan unngås ved å studere de kjemiske komponentene in vitro, og ensidighet kan unngås ved å studere de enkelte bestanddelene14. Ved å sammenligne sammensetningene av CR og CRV i blodet, kan endringer i de aktive ingrediensene i den behandlede CR detekteres effektivt og raskt. Narkotikaeffektivitet er prosessen der et stoff påvirker kroppen. Endringer i legemiddelkomponentene på grunn av kroppens metabolske respons, som kan være relatert til virkningsmekanismen til legemidlet, kan bestemmes med metabonomikk. Metabonomics tar sikte på å måle den generelle og dynamiske metabolske responsen, noe som stemmer overens med å bestemme den generelle effekten av tradisjonell kinesisk medisin15. Videre er metabolitter sluttproduktet av genuttrykk, som er nærmest beslektet med fenotyper16. Dermed kan metabonomikk være egnet for å utforske forskjellene i metabolske veier mellom CR og CRV i behandlingen av PD. Væskekromatografi-høyoppløselig tandemmassespektrometri (LC-MS / MS)-basert ikke-målrettet metabolomikk er preget av høy gjennomstrømning, høy følsomhet og høy oppløsning og kan brukes til å måle mange forskjellige små molekylære komponenter17,18 . Denne metoden kan samtidig bestemme de endogene metabolitter og eksogene bestanddeler absorbert i blodet. Metabonomics har blitt mye brukt i studier på TCM19, narkotikatoksikologi 20, helsestyring 21, sport22, mat 23 og andre felt.

I denne studien ble forskjellene i de eksogene bestanddelene absorbert i blodet og de endogene metabolittene målt mellom CR-behandlede og CRV-behandlede dysmenorémodellrotter ved bruk av LC-MS / MS-baserte ikke-målrettede metabolomics for å avsløre mekanismene for de smertestillende effektene av CRV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrerelaterte eksperimenter ble utført med godkjenning fra eksperimentets etiske komité ved Chongqing Institute of TCM. Tjuefire kvinnelige Sprague Dawley-rotter (SD) som var 8-10 uker gamle og veide 200 g ± 20 g ble brukt i dette forsøket.

1. Forberedelse av utvinningen

  1. Beregning
    1. Planlegg administrering av CR- eller CRV-ekstraktet til en behandlingsgruppe på seks Sprague-Dawley-rotter (10 g/[kg∙dag]) i 3 dager. Bruk en CR- eller CRV-ekstraktkonsentrasjon på 1 g / ml (1 ml av ekstraktet er oppnådd fra 1 g urter).
      MERK: Doseringen av CR er 6-10 g. I denne studien ble maksimal dose på 10 g brukt som dosering. Siden gjennomsnittsvekten til en voksen person er 60 kg, er den voksne dosen 0,1667 g/kg. I henhold til vektomregningsalgoritmen24, da dosekonverteringskoeffisienten mellom mennesker og rotter er 6,3, er dosen for rotter 1,05 g / kg. Legemiddeldosen ble økt med 10 ganger til 10,5 g/kg for rotter. Doseringen ble satt til 10 g/kg for enkel beregning og selve eksperimentet. For eksempel, ved beregningen, hvis totalt 36 g CR eller CRV er nødvendig, bør kinesisk urtemedisin fremstilles minst to ganger. Dermed var 200 g CR nødvendig - 100 g CR ble brukt som CR, og 100 g CR ble behandlet til CRV.
    2. Beregn volumet av CR eller CRV som skal brukes per rotte ved hjelp av ligning (1):
      V = 10 g/(kg∙dag) × 200 g/(1 g/ml) = 2 ml (1)
  2. Behandling av CRV
    1. Bland 100 g CR og 20 g eddik (>5,5 g eddiksyre/100 ml) grundig og inkuber i 12 timer.
      MERK: For å sikre at det indre av CR ble fuktet av eddik etter 12 timer, ble CR og eddik blandet, rørt godt og deretter rørt igjen til den indre delen var fuktig.
    2. Stek blandingen i en jernpanne i 10 min ved 110-120 °C. Ta deretter ut blandingen, og la den avkjøles ved romtemperatur.
      NOTAT: For å forhindre at CR brenner, er det nødvendig å røre kontinuerlig under oppvarming. Hvis den behandlede CRV er for våt, kan den tørkes ved 60 °C. Når overflaten av CR er sepia, kan stekingen stoppes.
  3. Utvinning
    1. CR ekstrakt
      1. Tilsett 10 ganger (mengden CR) rent vann til CR, og suge i 2 timer. Forsikre deg om at legemidlene er under væskenivået når de bløtlegges.
        MERK: CR trenger bare å bli kuttet i to før utvinning. Hensikten med bløtlegging er å trekke ut de aktive bestanddelene mer effektivt. Prosessen med soaking er viktig.
      2. Kok opp blandingen av vann og medisin over høy varme, og hold den kokende over lav varme i 20 minutter. Filter med en filterduk (100 mesh), og samle filtratet.
        NOTAT: Ved avkok ble det brukt høy varme før koking, og lav varme ble brukt for å opprettholde kokingen.
      3. Gjenta trinn 1.3.1.2 én gang, og bland filtratene.
      4. Konsentrer ekstrakten med en roterende fordamper til 1 g/ml (basert på originalpreparatet må konsentrasjonstemperaturen være under 60 °C).
        MERK: De aktive komponentene i CR er flyktige, så konsentrasjonstemperaturen bør ikke være høyere enn 60 ° C.
    2. CRV-ekstrakt
      1. Utfør de samme trinnene (1.3.1.1-1.3.1.3) som for CR-ekstraksjonsmetoden.
    3. CR-ekstrakt for testing
      1. Pipette 500 μL av CR-ekstraktet og 500 μL metanol i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og virvel i 30 s for å blande.
        MERK: En blanding av metanol og vann trekker ut de aktive komponentene bedre. Ekstraktet skal ikke filtreres direkte for testing.
      2. Sentrifuger hver prøve i 15 minutter ved 1,6502 × g ved 4 °C. Filtrer supernatanten, og overfør den deretter til prøvehetteglasset for testing.
        MERK: Etter høyhastighets sentrifugering av blandingen av metanol og ekstrakt, kan supernatanten overføres direkte til prøveflasken for bestemmelse uten filtrering. På grunn av varmen som genereres av sentrifugeringsprosessen, er det å foretrekke å bruke en kryogen sentrifuge.
    4. CRV-ekstrakt for testing
      1. Utfør trinn 1.3.3.1-1.3.3.2 for å klargjøre CRV-ekstraktet for testing.

2. Dyr

  1. Beregning
    1. Ta 50 mg østradiolbenzoat, og legg det til 50 ml olivenolje for å lage en 1 mg / ml løsning. Ta 50 mg oksytocin, og legg det til 50 ml vanlig saltoppløsning for å forberede en 1 mg / ml løsning.
      MERK: Dosen av intraperitoneal injeksjon av østradiolbenzoat og oksytocin er 10 mg / (kg ∙ dag). Østradiolbenzoat oppløses i olivenolje, og oksytocin oppløses i vanlig saltvann. Østradiolbenzoat er ikke lett å oppløse i olivenolje og kan behandles med ultralyd for å akselerere oppløsningen. Både østradiolbenzoat- og oksytocinoppløsningene må fremstilles daglig.
    2. Beregn volumet av østradiolbenzoatoppløsning som skal påføres per rotte (dvs. V = 10 mg / [kg ∙ dag] × 200 g / [1 g / ml] = 2 ml). Beregn volumet av oksytocinoppløsning som skal påføres per rotte (dvs. V = 10 mg/[kg∙dag] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Dyregruppering og administrasjon
    MERK: Ti dager ble tildelt for administrasjon25,26. Under behandlingen hadde rottene ubegrenset tilgang til standard chow og vann. Innen 30 minutter etter oksytocinadministrasjon ble hver rottes vridende aktivitet sporet. PD-rottemodellen ble utviklet vellykket, som det fremgår av modellrotternes vridningsresponser, som inkluderte livmorkontraksjon, en lemmerrotasjon, forlengelse av bakre lemmer, en hul stamme og abdominal sammentrekning26.
    1. Tilordne 24 kvinnelige Sprague-Dawley-rotter (SD-rotter, 8-10 uker, veier 200 g ± 20 g) i fire grupper ved tilfeldig kontroll, modell, CR og CRV - og mate dem i 7 dager.
    2. Dyr administrasjon
      1. Intraperitonealt injiser rotter i modell-, CR- og CRV-gruppene med 2 ml østradiolbenzoatoppløsning hver dag. Injiser rottene i kontrollgruppen intraperitonealt med 2 ml vanlig saltvann.
      2. Fullfør trinn 2.2.2.1 fra dag 8. Deretter administreres intragastralt 2 ml CRV-ekstrakt til rottene i CRV-gruppen, 2 ml CR-ekstrakt til rottene i CR-gruppen og 2 ml normalt saltvann til rottene i kontroll- og modellgruppene.
      3. Fullfør trinn 2.2.2.2 på dag 10. Deretter injiserer rottene intraperitonealt i modell-, CR- og CRV-gruppene med 2 ml oksytocinoppløsning og rottene i kontrollgruppen med 2 ml normalt saltvann.
    3. Registrer rottenes vridende tider innen 30 minutter etter oksytocininjeksjonen.
  3. Eksempel på innsamling
    1. Samle abdominal aorta blodprøver, excise livmoren raskt og fullstendig, og forsiktig skille bindevev og fett som fester seg til livmorveggen.
      MERK: Blod ble samlet så nær innen 1 time etter siste dose.
    2. Bruk mikrosentrifugerør for å bevare og overføre livmorvevet til flytende nitrogen. Oppbevar vevsprøvene ved −80 °C.
    3. Sentrifuge blodprøvene i 10 min ved 4,125 × g. Fjern den serumholdige supernatanten og sentrifugen ved 16 502 × g i 10 minutter ved 4 °C. Sentrifuger serumet, og oppbevar det deretter i røret ved -80 °C for oppbevaring.
      MERK: Blodprøvene må stå i romtemperatur i 1 time for reprosessering.
  4. Prøvebehandling
    1. Serumprøver
      1. Sett 400 μL metanol og 200 μL serum i et mikrosentrifugerør, og virvel i 30 s for å blande. Sentrifuger hver prøve i 15 minutter ved 16 502 × g ved 4 °C. Fyll prøveflasker med supernatanten etter oppsamling og filtrering. Bland alle supernatantene fra hver prøve med samme volum for å forberede kvalitetskontrollprøver for testing.
    2. Livmor vevsprøver
      1. Ta 100 mg livmorvev fra det ipsilaterale segmentet og slip det med et nifoldig volum av normal saltvann. Sentrifuge homogenatet i 10 minutter ved 4,125 × g, og samle supernatanten. Plasser supernatanten i kjøleskap ved 4 °C for testing eller ved -80 °C hvis den ikke testes på samme dag.
      2. Plasser normale saltvanns-, vevs- og stålkuler i et 2 ml mikrosentrifugerør, sett mikrosentrifugerøret i flytende nitrogen i 3-5 s, og legg deretter vevet i en vevskvern for sliping.
  5. Prøve testing
    1. Bruk en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for å måle PGF2a - og PGE2-innholdet i livmorvevet i rotteprøvene.
      MERK: PGE2 ELISA-settet fra rotte ble brukt til å måle PGE 2-innholdet, og PGF 2α ELISA-settet for rotte ble brukt til å måle PGF 2α-nivået. De detaljerte trinnene finner du i produsentens instruksjoner. Detaljene i settet er gitt i materialfortegnelsen.
    2. Vurder serumprøven, CR-ekstraktet og CRV-ekstraktet ved hjelp av UPLC-MS / MS.
      1. For UPLC, bruk en C18-kolonne (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) og en binær gradientmetode med mobilfase A inneholdende 0,1% maursyre og mobilfase B som inneholder acetonitril. Still elueringsgradienten som følger: fra 0 min til 1 min, 15% B; fra 1 min til 8,5 min, 15% til 85% B; fra 8,5 min til 11,5 min, 85% B; fra 11,5 min til 11,6 min, 99% til 1% B; og fra 11,6 min til 15 min, 15 % B. Sett strømningshastigheten til 0,35 ml/min og injeksjonsvolumet til 2 μL.
      2. For MS, sett temperaturen til 600 ° C, gardingassens (CUR) strømningshastighet til 0, 17 MPa, og både kappe og hjelpegassstrømningshastigheter til 0, 38 MPa. Sett ionsprayspenningen til positiv ionmodus og negativ ionmodus til henholdsvis 5,5 kV og -4,5 kV, deklosjonspotensialet (DP) spenning til 80 V eller -80 V, kollisjonsenergien (CE) til 40 eV eller -25 eV og kollisjonsenergisuperposisjonen (CES) til 35 eV ± 15 eV.
      3. Utfør testen etter produsentens protokoll ved hjelp av UPLC-MS / MS. Utfør MS for et masseområde på 50-1,000 m / z.
      4. Få UPLC-MS/MS-resultatene ved hjelp av det samsvarende arbeidsstasjonsprogrammet sammen med deteksjonsmodusens informasjonsavhengige anskaffelse, filter for flere massedefekter og dynamisk bakgrunnsfradrag. Bruk kvalitetskontrollprøvene av samlet serum for å teste repeterbarheten og stabiliteten til UPLC-MS / MS-utstyret for å verifisere den konvensjonelle tilnærmingen. Før forskningsprøvene, injiser kvalitetskontrollprøvene i fire påfølgende løp, og injiser dem deretter etter hver femte serumprøve.

3. Databehandling

  1. Forberedelse av data
    1. Bruk konverteringsprogramvare til å konvertere rådataene til mzXML-formatet. Normaliser de totale ionstrømdataene (TIC) for hver prøve.
      MERK: En intern R-basert applikasjon (www.lims2.com) bygget på XCMS ble brukt til å analysere informasjonen for integrering, justering, utvinning og toppdeteksjon27.
    2. Utfør metabolittmerknad ved hjelp av en proprietær MS2-database (www.lims2.com). Sett merknadsterskelen til 0,328.
      MERK: De endogene metabolittene ble identifisert i hver gruppe.
  2. Prinsipal komponentanalyse og ortogonal partiell minste kvadratiske diskriminantanalyse
    1. Bruk analyseprogramvare til å utføre hovedkomponentanalysen (PCA) og modelleringen. Importer standardiserte data for metabolittene til analyseprogramvaren. Deretter bruker du beste tilpassing til å bygge analysemodellen. Til slutt bruker du poengsum for å få poengsumplottet til PCA.
      MERK: Klyngingen av hver gruppe ble oppnådd med poengsumplottet til PCA. PCA er en uovervåket analysemodus som hovedsakelig grupperer prøvene gjennom dimensjonsreduksjon uten intervensjon.
    2. Bruk analyseprogrammet til å utføre den ortogonale partielle minste kvadratiske diskriminantanalysen (OPLS-DA).
      1. Importer de standardiserte dataene om metabolittene i CR- og CRV-gruppene til analyseprogramvaren.
      2. Importer dataene fra CR-gruppen til den opprettede CR-gruppen, og importer dataene fra CRV-gruppen til den opprettede CRV-gruppen.
        MERK: OPLS-DA er en overvåket analysemodus, og gruppering av prøvene er nødvendig.
      3. Deretter bruker du beste tilpassing til å bygge analysemodellen, og bruker poengsum til å hente poengsumplottet for OPLS-DA. Til slutt bruker du VIP for å få den variable signifikansen i projeksjonsverdien (VIP) i OPLS-DA.
        MERK: Den variable signifikansen i projeksjonsverdiene (VIP) av metabolittene i CR- og CRV-gruppene ble oppnådd gjennom OPLS-DA.
  3. Identifisering av potensielle differensialmetabolitter
    1. Sil ut metabolittene med VIP-verdier større enn 1 i trinn 3.2.2.3.
    2. Bruk statistisk programvare til å beregne P-verdien av metabolittene som ble screenet ut i trinn 3.3.1 av Student t-test.
      MERK: Signifikante forskjeller i potensielle differensialmetabolitter i CR- og CRV-gruppene ble bestemt ved en Student t-test. De potensielle differensialmetabolittene var de med en Student t-test p-verdi < 0,05 og en variabel signifikans i projeksjonen (VIP) større enn 1. Representasjonen ble oppnådd ved hjelp av et vulkansk plott.
  4. Identifisering av differensialmetabolittene
    1. Sil ut de potensielle differensialmetabolittene i trinn 3.3. Bruk resultatene fra trinn 3.1.2 til å identifisere disse differensialmetabolittene.
      MERK: Et lite antall potensielle differensialmetabolitter ble identifisert, og de ble kandidatdifferensialmetabolittene.
    2. Sil ut differensialmetabolittene som skal matches i KEGG-databasen. Vis endringene i differensialmetabolittene i CR- og CRV-gruppene ved å tegne et varmekart.
      MERK: Et lite antall kandidatdifferensialmetabolitter ble matchet, og de ble differensialmetabolittene.
  5. Undersøkelse av potensielle metabolske veier
    1. Last opp de forskjellige metabolittene til databasen Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Bruk Pathways Analysis for å oppnå potensielle metabolske veier.
      MERK: De potensielle metabolske veiene ble oppnådd i CR- og CRV-gruppene. P-verdi og effektverdi var to svært viktige indikatorer i valget av de kritiske banene. P-verdien var viktigere enn virkningsverdien. Signifikans ble definert av en P-verdi < 0,05; Større effektverdier var assosiert med bedre korrelasjoner.
    3. Analyser potensielle metabolske veier ved å laste opp de forskjellige metabolittene til KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) databasen.
      MERK: Forholdet mellom funksjonen til metabolsk vei og PD bør også vurderes. De kritiske metabolske veiene ble oppnådd.
  6. Identifisering av bestanddelene absorbert i blodet
    1. Identifiser de kjemiske bestanddelene i CR- og CRV-ekstraktene ved hjelp av den interne MS2-databasen (www.lims2.com), Human Metabolome Database (HMDB) og Massbank- og Chemspider-databasene.
    2. Bestem bestanddelene absorbert i blodet i CR- og CRV-gruppene, og sammenlign bestanddelene mellom CR- og CRV-gruppene.
      MERK: Innholdsstoffene som absorberes i blodet må detekteres i CR- eller CRV-gruppene, men kan ikke detekteres i kontrollgruppen.
  7. Statistisk analyse
    1. Analysere dataene ved hjelp av univariat analyse (UVA) og multivariate statistiske metoder, inkludert variansanalyse (ANOVA) og Student t-test.
      MERK: Den eksperimentelle informasjonen ble presentert ved hjelp av statistisk programvare som gjennomsnittlig ± standardavvik (±SD). P < 0,01 ble ansett som en svært signifikant forskjell, og P < 0,05 representerte en signifikant forskjell28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse av dysmenoré modelleksperimentet
Det var ingen vridende respons innen 30 minutter i kontrollgruppen fordi disse rottene ikke ble intraperitonealt injisert med oksytocin og østradiolbenzoat for å forårsake smerte. Rottene i modell-, CR- og CRV-gruppene viste betydelige vridende reaksjoner etter oksytocininjeksjonen. Disse resultatene viser effekten av østradiolbenzoat- og oksytocinkombinasjonen for å indusere dysmenoré. Forskjellene i nivåene PGF 2α, PGE 2 og PGF2α/PGE 2 mellom modellen og kontrollgruppene var signifikante (P < 0,001, P < 0,05 ), noe som viser modellens effekt (figur 1).

Figure 1
Figur 1 PGF 2 α og PGE2-innhold i livmorvev og vridende tall i hver gruppe. (A) PGF2α innholdet i livmorvevet i hver gruppe. (B) PGE2-innholdet i livmorvevet i hver gruppe. (C) PGF 2 α/PGE2-innholdet i livmorvevet i hver gruppe. (D) Det vridende nummeret i hver gruppe. Kolonnene representerer gjennomsnittet ± SEM fra fire grupper (seks mus per gruppe). * P < 0,05 eller ** P < 0,01 representerer en signifikant forskjell sammenlignet med modellgruppen, og Δ P < 0,05 eller ΔΔ P < 0,01 representerer en signifikant forskjell sammenlignet med CR-gruppen. Rottene i modell-, CR- og CRV-gruppene viste en betydelig vridende reaksjon etter oksytocininjeksjonen. Forkortelser: PG = prostaglandin; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Konsentrasjonene av PGF 2α og PGF2α/PGE2 ble redusert i CRV- og CR-gruppene, og denne reduksjonen var mer markert i CRV-gruppen. Det var også signifikante (P < 0,001 og P < 0,05) forskjeller i konsentrasjonene av PGF 2α og PGF2α/PGE2 mellom CRV- og CR-gruppene. Sammenlignet med modellgruppen var PGE2-konsentrasjonen signifikant større i CRV- og CR-gruppene (P < 0,001), med nivået som økte mest i CRV-gruppen.

Kvalitetskontroll
Det ble observert godt samsvar mellom retensjonstidene for BPC-kromatografiske topper og signalintensiteter i kvalitetskontrollprøvene, noe som viser høy instrumentstabilitet og bemerkelsesverdig konsistent datakvalitet (tilleggsfil 1 – tilleggsfigur 1 og tilleggsfigur 2). Videre var alle kvalitetskontrollprøvene innenfor ±2 standardavvik (figur 2A,B), og korrelasjonen mellom kvalitetskontrollprøvene var større enn 0,7 (figur 2C,D). Disse resultatene tyder på at prosedyren var pålitelig og at resultatene var troverdige.

Figure 2
Figur 2: PCA-X endimensjonal fordeling av kvalitetskontrollprøvene. (A) Positiv modus, (B) negativ modus; korrelasjonsanalyse av kvalitetskontrollprøvene i (C) positiv modus og (D) negativ modus. Alle kvalitetskontrollprøvene var innenfor ±2 standardavvik, og korrelasjonene mellom kvalitetskontrollprøvene var større enn 0,7. Disse resultatene antydet at prosedyren var pålitelig og informasjonen var troverdig. Forkortelser: PC = hovedkomponent; PCA = prinsipal komponentanalyse; kvalitetskontroll; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Prinsipal komponentanalyse
Som vist i figur 3 angav abscissa PC (1) skårene til de første hovedkomponentene, mens ordinat-PC (2) angav skårene til de andre hovedkomponentene. I figuren indikerer den grønne sirkelen kontrollgruppen, den røde sirkelen representerer modellgruppen, den blå sirkelen indikerer CR-gruppen, den hvite sirkelen angir CRV-gruppen og den rosa sirkelen indikerer kvalitetskontrollgruppen.

Figure 3
Figur 3: Score scatter plot av PCA . (A) Positiv modus og (B) negativ modus. Kvalitetskontrollprøvene overlapper hverandre, noe som indikerer at instrumentet var veldig stabilt. Hver gruppe er fordelt i sitt eget område, med bare CR-gruppen og CRV-gruppen som av og til krysser stier. Forkortelser: PC = hovedkomponent; PCA = prinsipal komponentanalyse; QC = kvalitetskontroll; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

PCA-analyseresultatene viste at klyngene til CR og modellgruppene var signifikant separert i både positiv og negativ ionmodus. Klyngene ble signifikant separert mellom CRV- og modellgruppene i positiv og negativ ionemodus. Kvalitetskontroll-, modell- og kontrollgruppene ble skilt fra de andre behandlingsgruppene (CR, CRV). CR- og CRV-gruppene overlappet av og til i positiv ionemodus. I negativ ion-modus ble hver gruppe separert betydelig.

Ortogonal partiell minste kvadraters metode diskriminerende analyse
OPLS-DA ble brukt til å screene for metabolske forskjeller. OPLS-DA-spredningsplottet viste at alle prøvene var innenfor 95 % konfidensintervall (Hotellings T-kvadratellipse). Figur 4A,C viser at CR- og CRV-gruppene ble separert. Modellovertilpasning ble testet med permutasjonstest (n = 200), og modellens statistiske signifikans ble vurdert. I figur 4B,D viser ordinaten verdien av R 2 Y eller Q2-verdien, og abscissa indikerer erstatningsretensjonen. R 2Y er representert av den grønne prikken, Q2 er representert av den blå firkantede prikken, og de to stiplede linjene representerer deres tilsvarende regresjonslinjer. I de positive og negative modusene var R 2 Y-verdiene 0, 8 og 0, 84, og Q2-verdienevar henholdsvis -0, 59 og -0, 57. Dette demonstrerer modellens høye pålitelighet og fraværet av overmontering.

Figure 4
Figur 4: OPLS-DA-modeller for CR-gruppen versus CRV-gruppen. Score spredningsplott i (A) positiv modus og (C) negativ modus. Permutasjonstest av OPLS-DA-modellen for CR-gruppen versus CRV-gruppen i (B) positiv modus og (D) negativ modus. R 2Y var 0,8 og 0,84, og Q2 var −0,59 og −0,57 i henholdsvis positiv og negativ modus. Dette demonstrerer modellens høye pålitelighet og fraværet av overtilpasningsatferd. Forkortelser: OPLS-DA = ortogonal partiell minste kvadraters diskriminerende analyse; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Univariat statistisk analyse
Univariate statistiske analyser ble utført for å identifisere metabolske variasjoner. Under standard screening av VIP > 1 og P < 0,05 ble 339 og 394 potensielle differensialmetabolitter detektert i henholdsvis positiv og negativ ionemodus. Et vulkanplott er vist i figur 5, hvor hvert punkt tilsvarer en annen metabolitt. Ordinaten viser P-verdien til Student t-testen, og abscissa reflekterer flere endringer i nivået av hvert molekyl i gruppen. Scatter-størrelsen representerer VIP-verdien til OPLS-DA-modellen; VIP-verdien øker med størrelsen på scatteren. De røde prikkene indikerer en økning, de blå prikkene indikerer en reduksjon, og den grå indikerer ingen signifikant forskjell.

En kvalitativ analyse av kandidatdifferensialmetabolittene ble utført ved hjelp av sekundær massespektrometri. Signifikante endringer ble observert i 63 metabolitter i positiv modus (tilleggsfil 1 - tilleggstabell 1) og i 30 metabolitter i negativ modus (tilleggsfil 1 - tilleggstabell 2). Differensialmetabolittene ble bestemt ved hjelp av databasene KEGG og HDMB. De nøyaktig samsvarende forbindelsene ble identifisert som differensialmetabolitter, og disse er listet opp i tabell 3 og tabell 4.

Figure 5
Figur 5: Vulkanplott for CR-gruppen versus CRV-gruppen . (A) Positiv modus og (B) negativ modus. I vulkangrafen som er representert, tilsvarer hvert punkt en annen metabolitt. Ordinaten viser P-verdien til Student t-testen, og abscissa gjenspeiler de mange endringene i hvert stoff i gruppen. Punktstørrelsen representerer VIP-verdien til OPLS-DA-modellen. VIP-verdien øker med størrelsen på scatteren. Røde prikker indikerer økninger, blå prikker indikerer reduksjoner, og grått indikerer ingen signifikante forskjeller. Forkortelser: OPLS-DA = ortogonal partiell minste kvadraters diskriminerende analyse; VIP = variabel signifikans i projeksjonen; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sammenligninger av metabolitter
Den euklidske avstandsmatrisen for de kvantitative verdiene av differensialmetabolittene mellom CR- og CRV-gruppene ble beregnet, og differensialmetabolittene ble gruppert ved hjelp av en omfattende korrelasjonstilnærming.

Abscissa representerer ulike eksperimentelle grupper, mens ordinaten representerer det relative nivået i figur 6. Plasseringen av fargeflekkene indikerer hvordan hver metabolitt uttrykkes i forhold til de andre. I positiv ionemodus, sammenlignet med CR-gruppen, økte nivåene av fire differensialmetabolitter i CRV-gruppen, mens nivåene av 11 differensialmetabolitter ble redusert. I negativ ionemodus, sammenlignet med CR-gruppen, økte nivåene av fire differensialmetabolitter i CRV-gruppen, og nivåene av 7 differensialmetabolitter ble redusert.

Figure 6
Figur 6: Varmekartanalyse for CRV-gruppen versus CR-gruppen . (A) Positiv modus og (B) negativ modus. Abscissa representerer de forskjellige eksperimentelle gruppene, og ordinaten representerer de relative uttrykksnivåene. Plasseringen av fargeflekkene indikerer hvordan hver metabolitt uttrykkes i forhold til de andre. Forkortelser: CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sammenlignet med CR-gruppen var metabolittene som økte i CRV-gruppen sfingosin-1-fosfat, nobiletin, glycerofosfokolin, lysopc (18: 1 (9z)), 2-hydroksy-6-pentadecylbenzoesyre, 9,10-epoksyoktadecensyre, 13s-hydroksyoktadecadiensyre og 2-metoksyestron, mens de som reduserte var kortikosteron, indoleddiksyre, glykokolsyre, berberin, dibutylftalat, retinol, leukotrien B4, prostaglandin J2, 21-hydroksypregnenolon, zeranol, homocystein, propynosyre, stearinsyre, dokosaheksaensyre, fenylacetylglycin, L-fenylalanin, østronglukuronid og sitronsyre (figur 7).

Figure 7
Figur 7: De relative nivåtrendene for potensielle metabolitter i CRV- og CR-gruppene . (A) Positiv modus og (B) negativ modus. I positiv modus, sammenlignet med CR-gruppen, økte nivåene av fire differensialmetabolitter i CRV-gruppen, og nivåene av 11 ble redusert. I negativ modus økte nivåene av fire differensialmetabolitter i CRV-gruppen, og nivåene av syv differensialmetabolitter ble redusert. Kolonnene representerer gjennomsnittet ± SEM fra fire grupper (seks mus per gruppe). * P < 0,05, ** P < 0,01 eller *** P < 0,01 representerer en signifikant forskjell mellom CRV- og CR-gruppene. Forkortelser: CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

KEGG traséanalyse
Differensialmetabolittene ble annotert, og KEGG-banene ble analysert. Resultatene viste at differensialmetabolittene var assosiert med ni veier i henholdsvis positiv og negativ modus (tabell 1 og tabell 2). I figur 8 er de metabolske veiene representert ved hver sin boble i boblediagrammet, med en mer signifikant skala som indikerer en større effektfaktor. Størrelsen på banen som påvirker faktorene i topologianalysen er representert ved abscissa av boblediagrammet og boblestørrelsen. Ordinaten til boblediagrammet og boblefargen indikerer P-verdien til anrikningsanalysen (tar den negative naturlige logaritmen, dvs. −ln (p)). Graden av berikelse er mer signifikant, P-verdien er mindre, ordinatverdien er mer fremtredende, og fargen er mørkere. P-verdien og effektverdien er to svært viktige indikatorer i valg av kritiske veier. Generelt er P-verdien viktigere enn virkningsverdien.

Figure 8
Figur 8: Baneanalyse for CRV-gruppen versus CR-gruppen . (A) Positiv modus og (B) negativ modus. De metabolske veiene er hver representert av en boble i boblediagrammet. Abscissa av boblediagrammet og boblestørrelsen indikerer størrelsen på banepåvirkende faktorer i topologianalysen. Ordinaten for boblediagrammet og boblefargen angir P-verdien for berikelsesanalysen. De viktigste metabolske veiene inkluderer biosyntese av umettede fettsyrer og linolsyremetabolisme. Forkortelser: CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 3 og tabell 4 viser metabolske veier med signifikante forskjeller - fenylalaninmetabolisme og linolsyremetabolisme, samt biosyntese av umettede fettsyrer, fenylalanin, tyrosin og tryptofan. Selv om de metabolske veiene inkluderte steroidhormonbiosyntese, sfingolipid og arakidonsyremetabolisme, var det ingen signifikante forskjeller, som var relatert til dysmenoré. Resultatene viste at linolsyremetabolisme og biosyntese av umettede fettsyrer var de kritiske metabolske veiene forbundet med den forbedrede effekten av CRV.

Bestanddeler absorbert i blodet
Femten innholdsstoffer og to metabolske produkter fra CRV- og CR-ekstraktene ble påvist i rotteserum i CR- og CRV-gruppene (tab 5). Alle de 17 komponentene ble funnet i positiv ionemodus.

De relative bestanddelene i blodprøvene fra de to gruppene ble sammenlignet med Student t-test. Abscissa i figur 9 viser ulike eksperimentelle grupper; Ordinaten representerer massespekterets responsverdi. Det var to komponenter med betydelige forskjeller. Analysen viste at nivåene av disse to komponentene var forhøyet i CRV-gruppen sammenlignet med CR-gruppen, mens nivåene av 15 elementer ikke viste noen signifikante endringer.

Figure 9
Figur 9: Innholdsstoffer absorbert i blodet for CRV-gruppen versus CR-gruppen. Det var 15 bestanddeler og to metabolske produkter fra CRV- og CR-ekstraktene i rotteserum i CR- og CRV-gruppene. Analysen viste at blodnivåer av to komponenter ble økt i CRV-gruppen sammenlignet med CR-gruppen, mens blodnivåene av 15 komponenter ikke viste noen signifikante endringer. Blant dem var nivået av (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroksy-1,4,7,7-tetrametylbisyklo[2.2.1]hept-2-yl]eddiksyre i CRV-gruppen betydelig høyere enn i CR-gruppen. * P < 0,05 eller ** P < 0,01 representerer en signifikant forskjell mellom CRV-gruppen og CR-gruppen. Forkortelser: CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Metabolske forskjeller i positiv modus. Forkortelser: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = variabel signifikans i projeksjonen; RT = oppbevaringstid. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Metabolske forskjeller i negativ modus. Forkortelser: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = variabel signifikans i projeksjonen; RT = oppbevaringstid. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Analyse av metabolsk vei i positiv modus. Forkortelse: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4 Analyse av metabolske veier i negativ modus. Forkortelse: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: Identifisering av prototype ingredienser og metabolitter i rotteserum. Merk: M1 og M2 er metabolitter; Andre bestanddeler er prototype ingredienser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: BPC-diagrammer og MS 2-kromatogramme av bestanddelene absorbert i blodet fra nakne mus. BPC-diagrammer av alle kvalitetskontrollprøvene i positive og negative moduser; MS2 kromatogram av de 17 bestanddelene absorbert i blodet av rotter: D-camphene, (-)-myrtenol, etylparaben, calamenene, α-cyperone, (+)-nootkatone, (1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetrametylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddiksyre, 4-(2-(2.2.1)-bicycloheptylmethyl)benzoesyre, 10,12-peroksycalamenene, (1aS,10aR)-1a,5,9-trimetyl-1a,3,6,10a-tetrahydrooxireno[4,5]cyklodeka[1,2-b]furan-10(2H)-en, pterosin D, terresyklisk syre, sugeonylacetat, 3-acetyl-13-deoksyfomanom, isocurcumenol, ligukyperonol, procurcumadiol. Differensialmetabolittene identifisert ved sekundær massespektrometri, samt HDMB- og KEGG-databasene, i positiv og negativ ionemodus er også inkludert. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grunn av TCMs store variasjon og forskjellige natur, virker disse urter noen ganger ikke i klinisk praksis, og dette kan skyldes upassende behandling og avkok av TCM. Mekanismene til TCM blir tydeligere ved bruk av moderne vitenskap og teknologi29,30. Denne studien viser at både CR og CRV har terapeutisk effekt hos PD-modellrotter og at den terapeutiske effekten av CRV er større. Virkningsmekanismen for CRV kan være relatert til det faktum at eddikbehandling kan påvirke bestanddelene av CR som absorberes i blodet og kan være assosiert med linolsyremetabolisme og biosyntese av umettede fettsyrer. Figur 10 viser potensielle veier for CRVs virkning i smertelindring.

Figure 10
Figur 10: Mekanismer for den forsterkede smertestillende effekten av CRV. Resultatene viste at 15 bestanddeler og to metabolitter ble funnet i blodet. Blant dem var nivåene av (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroksy-1,4,7,7-tetrametylbisyklo[2.2.1]hept-2-yl]eddiksyre i CRV-gruppen betydelig høyere enn i CR-gruppen. CRV kan redusere nivået av 2-serie prostanoider og 4-serie leukotriener laget av ARA og oppnå smertestillende effekter via modulering av arakidonsyremetabolisme, biosyntese av umettede fettsyrer og linolsyremetabolisme. Forkortelser: ARA = arakidonsyre; COX = cyklooksygenase; LA = linolsyre; PUFA = flerumettede fettsyrer; GLA = γ-linolensyre; DGLA = dihomo-γ-linolensyre; PD = primær dysmenoré; PG = prostaglandin; LT = leukotriener; TX = tromboksan; SDA = stearidonsyre; ETA = eikosatetraensyre; EPA = eikosapentaensyre; CR = Cyperi rhizom; CRV = CR behandlet med eddik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Forholdsregler under forsøket
Siden oljen av den effektive komponenten av CR er flyktig, bør tiden for utvinning av CR ikke overstige 20 minutter, og når den kokes, bør den være på lav varme med en temperatur som ikke overstiger 60 ° C under konsentrasjon. For å sikre vellykket ekstraksjon av de effektive ingrediensene, må urter bli gjennomvåt i vann i minst 2 timer før avkok, slik at urter er våte når soaking er fullført. Under CR-behandlingen må eddiken blandes godt med urtene slik at eddiken kan trenge helt inn i dem. Hvis eddikvolumet er for lavt til å fukte urtene grundig, kan en liten mengde vann tilsettes for å fortynne eddiken, og deretter kan eddiken blandes helt med urter. Når blandingen er fullført, vil urtene absorbere all eddik. Siden eddik inneholder eddiksyre, bør blandingen ikke komme i kontakt med jern for å unngå en kjemisk reaksjon.

I rotteforsøket blir den første intraperitoneale injeksjonen av østradiolbenzoat gitt på dag 10, deretter gis den intragastriske administreringen av ekstraktet av CR eller CRV, og til slutt administreres den intraperitoneale injeksjonen av oksytocin. Etter intraperitoneal injeksjon av oksytocin observeres dyret i 30 minutter, og blod tas umiddelbart. Vanligvis når blodkonsentrasjonen en topp innen 1 time etter intragastrisk administrering13, som er den beste tiden å ta blod.

Ved bestemmelse av ekstrakt og serumprøver med LC-MS/MS, bør de bestemmes i samme batch for å sikre at retensjonstiden for den samme komponenten i forskjellige prøver er konsistent. I dette eksperimentet var identifiseringen av komponentene et vanskelig punkt. Selv om en relativt moden database kan brukes for endogene metabolitter, var det ingen matchende database for å identifisere bestanddelene absorbert i blodet, så mer forsiktighet bør utvises i identifikasjon.

Forskjeller i bestanddelene absorbert i blodet mellom CR- og CRV-gruppene
For å bestemme den aktive ingrediensen i CR, undersøkte dette eksperimentet bestanddelene absorbert i blodet i dysmenoré modellrotter. I dette eksperimentet ble det funnet at 15 bestanddeler og to metabolitter i blodet varierte mellom CR- og CRV-gruppene. Blant dem var nivåene av (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroksy-1,4,7,7-tetrametylbisyklo[2.2.1]hept-2-yl]eddiksyre i CRV-gruppen betydelig høyere enn i CR-gruppen, men nivåene av andre komponenter var ikke signifikant forskjellige. (-)-Myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroksy-1,4,7,7-tetrametylbisyklo[2.2.1]hept-2-yl]eddiksyre er terpenoider og regnes som de effektive komponentene i CRV.

Ligucyperonol og procurcumadiol fremstilles ved oksydasjon av henholdsvis α-cyperon og isocurcumenol, og α-cyperon har en sterk smertestillende effekt. Den foreslåtte virkningsmekanismen kan redusere LPS-indusert COX-2-uttrykk og PGE2-syntese gjennom negativ regulering av NF-kB-signalering31. (+)-Nootkatone hemmer også COX-2 aktivitet32,33. Isocurcumenol er kjernekomponenten i Curcumae rhizoma i behandling av dysmenoré3, og dets metabolitt procurcumadiol kan ha en smertestillende effekt. Sammenlignet med CR-gruppen viste CRV-gruppen betydelig høyere nivåer av (-)-myrtenol, som har en smertestillende effekt34. Den mulige virkningsmekanismen kan være at endringer i uttrykket av COX-2 35 øker nivåene av antiinflammatorisk cytokin (IL-10, IFN-γ) og reduserer nivåene av proinflammatoriske cytokiner (TNF-α, IL-1β) nivåer36. Behandling med eddik forbedrer nivåene av de aktive ingrediensene i blodet, noe som kan være grunnen til at produkter produsert med eddik er mer effektive.

Forskjeller i metabolske veier mellom CR- og CRV-gruppene
Baneanalyse viste signifikant forskjellige metabolske veier mellom CR- og CRV-gruppene, inkludert når det gjelder fenylalaninmetabolisme, biosyntese av umettede fettsyrer, fenylalanin, tyrosin og tryptofanbiosyntese og linolsyremetabolisme. Imidlertid er de metabolske veiene for fenylalaninmetabolisme og fenylalanin-, tyrosin- og tryptofanbiosyntese ikke relatert til PD. Disse resultatene viser at de metabolske veiene forbundet med den forbedrede effekten av CRV er linolsyremetabolisme og biosyntese av umettede fettsyrer.

Umettede fettsyrer inkluderer to typer: omega-3 og omega-637. Tre forløpere til mediatorer, inkludert eikosapentaensyre (20:5ω3; EPA), dokosaheksaensyre (22:5ω3; DHA) og arakidonsyre (20:5ω6; ARA), er involvert i biosyntesen av umettede fettsyrer vei37,38. EPA- og ARA-metabolisme produserer begge prostaglandiner og leukotriener under virkningen av COX. ARA produserer 2-serie prostanoider, inkludert PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 og tromboksan (TXA 2, TXB 2), og 4-serie leukotriener, inkludert leukotrien A 4 (LTA 4) leukotrien B 4 (LTB 4), leukotrien C 4 (LTC 4) og leukotrien D 4 (LTD 4). 3-serien prostanoider inkluderer prostaglandin E 3 (PGE 3), prostacyklin I 3 (PGI 3) og tromboksan A2 (TXA 3), og 5-serien leukotriener inkluderer leukotrien A 5 (LTA 5) leukotrien B 5 (LTB 5), leukotrien C 5 (LTC 5) og leukotrien D 5 (LTD 5), som i stor grad produseres av EPA.

Transformasjonsprosessen til EPA er den samme som for ARA og formidles av lignende enzymer39. 2-serien prostanoider og 4-serie leukotriener har hovedsakelig proinflammatoriske, blodplateaggregering og vasokonstriksjonseffekter. I motsetning til dette viser 3-serie prostanoider og 5-serie leukotriener antiinflammatoriske, antiplatelet og vasodilatoriske effekter38. TXA 2 og TXB2 produseres fra ARA, noe som får blodårene til å trekke seg inn. EPA-avledet PGI 3, PGE 3 og TXA 3 fungerer bare som vasodilatorer38,40. EPA og ARA konkurrerer om konvertering til PG av COX-enzymet. Når membranen EPA / AA-forholdet økes, kan eikosanoidene PGI 2 og TXA2, som fremmer aggregering, omdannes til TXA 3 og PGI3, som fremmer antiaggregering, noe som resulterer i antiinflammatoriske og antiaggregerende effekter40. I tillegg er kombinert bruk av EPA, DHA og linolsyre (C18: 2ω6; LIN) kan redusere PGF 2α og PGE2 frigjøring i storfe endometrium og trofoblaster41,42.

PD er sannsynligvis forårsaket av produksjon av PG og leukotriener 43,44,45, spesielt PG 46. I mellomtiden kan en ubalanse i vasopressin, β-endorfiner, østrogen, progesteron, nevrotransmittere, IL, ET-1 og NO også være relatert til dysmenoré47. Ifølge ELISA-resultatene ble PGF 2a- og PGF2a/PGE 2-nivåene i CRV-gruppen redusert, mens PGE2-nivået økte i forhold tilCR-gruppen. I tillegg var leukotrienB4 (C02165) og prostaglandin J2(C05957) lavere i CRV-gruppen. Dette indikerer at i CRV-gruppen var det lavere nivåer av 2-serie prostanoider laget av ARA, inkludert PGF2a, som er den viktigste faktoren for dysmenoré. Terapi med PGE 2 ved høye konsentrasjoner utvider blodkarene, og PGE2 forårsaker vasokonstriksjon ved lave konsentrasjoner48. Derfor er livmoren avslappet med vasodilatasjon, og dysmenoré er lettet.

Siden menneskekroppen ikke kan syntetisere en tilstrekkelig mengde C18 umettede fettsyrer, er linolsyre og α-linolensyre, som er den eneste kilden til C18 umettede fettsyrer, svært viktige38. Linolsyre og α-linolensyre er kilden til henholdsvis omega-6 og omega-3 umettet fettsyremetabolisme. Spesielt er forløperen for prostaglandinsyntese ARA, og ARA syntetiseres fra linolsyre49. Linolsyre er en forløper, og en serie metabolitter syntetiseres fra den, inkludert ARA, prostaglandiner (PGF 2 α, PGE 2), prostacyklin (PGI 2) og tromboksan (TXA 2) 50. Linolsyre er nært knyttet til den forbedrede smertestillende effekten av CRV. Videre kan den metabolske veien til steroidhormonbiosyntese produsere progesteron 51,52,53 og sfingosin-1-fosfat (C06124), som produseres av den metabolske veien for sfingolipidmetabolisme, indusere COX-2 og produsere PGE2 til TNF54,55,56,57. Disse kan også være relatert til PD.

Det er noen begrensninger i protokollen. Bare de relative nivåene av bestanddelene ble sammenlignet, og standardprøven ble ikke brukt til å kvantifisere bestanddelene i urten og de som ble absorbert i blodet. Avføring og urin fra rotter ble ikke samlet inn i dyreforsøkene, noe som resulterte i oppdagelsen av færre metabolitter av CR in vivo. Valideringseksperimenter bør ytterligere bekrefte mekanismen oppdaget av metabonomikkanalysen.

Strategien og protokollen som ble brukt i denne studien unngikk blindhet i studiet av kjemiske komponenter in vitro og den ensidige studien av individuelle komponenter in vivo. Derfor var det veldig egnet for mekanismeutforskning. Strategien kan spare mye tid og arbeid og kan nøyaktig identifisere de kritiske bestanddelene og mekanismen for terapeutisk effekt.

I denne studien ble det funnet at det var 15 bestanddeler og to metabolitter i blodet. Blant dem ble nivåene av (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroksy-1,4,7,7-tetrametylbisyklo[2.2.1]hept-2-yl]eddiksyre signifikant økt i CRV-gruppen sammenlignet med CR-gruppen, noe som viser at behandling med eddik kan øke nivåene av de aktive ingrediensene i blodet. Etter at CR ble behandlet med eddik, ble nivåene av 2-serie prostanoider og 4-serie leukotriener med proinflammatoriske, blodplateaggregasjon og vasokonstriksjonsegenskaper redusert, inkludert PGF2a, leukotrien B4 og prostaglandin J2. Dette kan være mekanismen der CRV demonstrerer en forbedret smertestillende effekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Chongqing Municipal Health and Family Planning Commission Chinese Medicine Science and Technology Project (prosjektnummer: ZY201802297), Generelt prosjekt fra Chongqing Natural Science Foundation (prosjektnummer: cstc2019jcyj-msxmX065), Chongqing Modern Mountain Area Karakteristisk High-efficiency Agricultural Technology System Innovation Team Building Plan 2022 [10], og Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Medica behandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Tags

Tilbaketrekking utgave 190
Analyse av rå og behandlede Cyperi Rhizoma-prøver ved bruk av væskekromatografi-tandemmassespektrometri hos rotter med primær dysmenoré
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter