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Analyse d’échantillons bruts et traités de Cyperi rhizoma par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem chez des rats atteints de dysménorrhée primaire

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Ici, une analyse comparative d’échantillons bruts et traités de Cyperi rhizoma (CR) est présentée à l’aide de la chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (UPLC-MS/MS) chez des rats atteints de dysménorrhée primaire. Les changements dans les taux sanguins des métabolites et des constituants de l’échantillon ont été examinés entre des rats traités par RC et des rats traités au vinaigre (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) est largement utilisé en gynécologie et est un médicament général pour traiter les maladies des femmes en Chine. Étant donné que l’effet analgésique de la RC est renforcé après le traitement avec du vinaigre, la RC traitée avec du vinaigre (CRV) est généralement utilisée cliniquement. Cependant, le mécanisme par lequel l’effet analgésique est renforcé par le traitement du vinaigre n’est pas clair. Dans cette étude, la technique de chromatographie liquide à ultra-haute pression par spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS) a été utilisée pour examiner les changements dans les concentrations sanguines des constituants exogènes et des métabolites entre les rats atteints de dysménorrhée traités par RC et traités par CRV. Les résultats ont révélé des niveaux différents de 15 constituants et deux métabolites dans le sang de ces rats. Parmi eux, les taux de (-)-myrténol et d’acide [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tétraméthylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acétique dans le groupe CRV étaient considérablement plus élevés que dans le groupe CR. La CRV a réduit le niveau de prostanoïdes de la série 2 et des leucotriènes de la série 4 avec des activités pro-inflammatoires, d’agrégation plaquettaire et de vasoconstriction et a fourni des effets analgésiques en modulant le métabolisme de l’acide arachidonique et de l’acide linoléique et la biosynthèse des acides gras insaturés. Cette étude a révélé que le traitement du vinaigre améliore l’effet analgésique de la RC et contribue à notre compréhension du mécanisme d’action de la CRV.

Introduction

La dysménorrhée primaire (MP) est l’affection la plus fréquente en gynécologie clinique. Elle se caractérise par des maux de dos, un gonflement, des douleurs abdominales ou une gêne avant ou pendant la menstruation sans pathologie pelvienne dans le système reproducteur1. Un rapport sur sa prévalence a montré que 85,7% des étudiants souffrent de2. Les contraceptifs oraux à faible dose sont le traitement standard, mais leurs effets secondaires indésirables, tels que la thrombose veineuse profonde, attirent de plus en plus l’attention3. La prévalence de la thrombose veineuse profonde chez les utilisatrices de contraceptifs oraux est de >1 pour 1 000 femmes, et le risque est le plus élevé au cours des 6 à 12 premiers mois et chez les utilisatrices âgées de plus de 40 ans4.

Longtemps utilisé en médecine traditionnelle chinoise (MTC), le Cyperi rhizoma (CR) est dérivé du rhizome séché du Cyperus rotundus L. de la famille des Cyperaceae. La RC régule les troubles menstruels et soulage la dépression et la douleur5. La RC est largement utilisée en gynécologie et est considérée comme un médicament général pour traiter les maladies féminines6. La RC traitée avec du vinaigre (CRV) est généralement utilisée cliniquement. Par rapport à la RC, la CRV montre une meilleure régulation de la menstruation et un soulagement de la douleur. Des études modernes ont montré que la RC inhibe la cyclooxygénase-2 (COX-2) et la synthèse ultérieure des prostaglandines (PG), obtenant ainsi un effet anti-inflammatoire. Pendant ce temps, la RC présente un effet analgésique sans effets secondaires7, ce qui fait de la RC un bon choix pour les patients dysménorrhées. Cependant, le mécanisme sous-jacent à la régulation des menstruations et à la fourniture d’un soulagement de la douleur par CRV n’est pas clair. La recherche sur la RC s’est principalement concentrée sur les changements dans ses composants chimiques actifs et ses activités pharmacologiques, telles que ses effets anti-inflammatoires, antidépresseurs et analgésiques 8,9,10,11,12.

Bien que les ingrédients de la MTC soient complexes, ils sont absorbés dans le sang et doivent atteindre une concentration sanguine spécifique pour être efficaces13. La portée du dépistage des ingrédients actifs de la MTC peut être réduite en utilisant la stratégie de détermination des constituants dans le sang. La cécité peut être évitée en étudiant les composants chimiques in vitro, et l’unilatéralité peut être évitée en étudiant les constituants individuels14. En comparant les compositions de CR et de CRV dans le sang, les changements dans les ingrédients actifs de la CR traitée peuvent être détectés efficacement et rapidement. L’efficacité d’un médicament est le processus par lequel un médicament influence le corps. Les changements dans les composants du médicament dus à la réponse métabolique du corps, qui peuvent être liés au mécanisme d’action du médicament, peuvent être déterminés avec la métabonomique. Metabonomics vise à mesurer les réponses métaboliques globales et dynamiques, ce qui est cohérent avec la détermination de l’efficacité globale de la médecine traditionnelle chinoise15. En outre, les métabolites sont le produit final de l’expression génique, qui est la plus étroitement liée aux phénotypes16. Ainsi, la métabonomique peut convenir pour explorer les différences dans les voies métaboliques entre la RC et la CRV dans le traitement de la MP. La métabolomique non ciblée basée sur la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (LC-MS/MS) se caractérise par un débit élevé, une sensibilité élevée et une haute résolution et peut être utilisée pour mesurer de nombreux petits composants moléculaires différents17,18 . Cette méthode permet de déterminer simultanément les métabolites endogènes et les constituants exogènes absorbés dans le sang. La métabonomie a été largement utilisée dans des études sur la MTC19, la toxicologie des médicaments20, la gestion de la santé 21, le sport 22, l’alimentation 23 et d’autres domaines.

Dans cette étude, les différences entre les constituants exogènes absorbés dans le sang et les métabolites endogènes ont été mesurées entre des rats modèles de dysménorrhée traités par RC et traités par CRV en utilisant une métabolomique non ciblée basée sur la LC-MS / MS pour révéler les mécanismes des effets analgésiques de la CRV.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées avec l’approbation du Comité d’éthique des expériences de l’Institut de MTC de Chongqing. Vingt-quatre rats Sprague Dawley femelles âgés de 8 à 10 semaines et pesant 200 g ± 20 g ont été utilisés dans cette expérience.

1. Préparation de l’extraction

  1. Calcul
    1. Prévoyez d’administrer l’extrait de RC ou de CRV à un groupe de traitement de six rats Sprague-Dawley (10 g/[kg∙jour]) pendant 3 jours. Utilisez une concentration d’extrait CR ou CRV de 1 g/mL (1 mL de l’extrait est obtenu à partir de 1 g d’herbes).
      REMARQUE: La posologie de CR est de 6-10 g. Dans cette étude, la dose maximale de 10 g a été utilisée comme dosage. Comme le poids moyen d’une personne adulte est de 60 kg, la dose adulte est de 0,1667 g / kg. Selon l’algorithme de conversion de poids24, comme le coefficient de conversion de dose entre les humains et les rats est de 6,3, la posologie pour les rats est de 1,05 g / kg. La posologie du médicament a été augmentée de 10 fois à 10,5 g / kg pour les rats. La posologie a été fixée à 10 g/kg pour faciliter le calcul et l’expérience réelle. Par exemple, selon le calcul, si un total de 36 g de RC ou de CRV est nécessaire, la phytothérapie chinoise doit être préparée au moins deux fois. Ainsi, 200 g de RC ont été nécessaires - 100 g de RC ont été utilisés comme RC, et 100 g de CR ont été transformés en CRV.
    2. Calculer le volume de RC ou de CRV à appliquer par rat à l’aide de l’équation (1):
      V = 10 g/(kg∙jour) × 200 g/(1 g/mL) = 2 mL (1)
  2. Traitement du CRV
    1. Bien mélanger 100 g de CR et 20 g de vinaigre (>5,5 g d’acide acétique/100 mL) et incuber pendant 12 h.
      REMARQUE: Pour s’assurer que l’intérieur du CR a été humidifié par du vinaigre après 12 heures, le CR et le vinaigre ont été mélangés, bien agités, puis agités à nouveau jusqu’à ce que la partie intérieure soit humide.
    2. Faire sauter le mélange dans une poêle en fer pendant 10 min à 110-120 °C. Ensuite, sortez le mélange et laissez-le refroidir à température ambiante.
      REMARQUE: Pour éviter que le CR ne brûle, il est nécessaire de remuer continuellement pendant le chauffage. Si le CRV traité est trop humide, il peut être séché à 60 °C. Lorsque la surface du CR est sépia, le sauté peut être arrêté.
  3. Extraction
    1. Extrait CR
      1. Ajouter 10 fois (la quantité de CR) d’eau pure au CR et laisser tremper pendant 2 h. Assurez-vous que les matières médicinales sont en dessous du niveau de liquide lors du trempage.
        REMARQUE: Le CR doit seulement être coupé en deux avant l’extraction. Le but du trempage est d’extraire les constituants actifs plus efficacement. Le processus de trempage est essentiel.
      2. Porter le mélange d’eau et de médicament à ébullition à feu vif et le maintenir à ébullition à feu doux pendant 20 minutes. Filtrer avec une toile filtrante (100 mesh) et recueillir le filtrat.
        REMARQUE: Lors de la décoctation, une chaleur élevée a été utilisée avant l’ébullition et une chaleur basse a été utilisée pour maintenir l’ébullition.
      3. Répétez l’étape 1.3.1.2 une fois et combinez les filtrats.
      4. Concentrer l’extrait avec un évaporateur rotatif à 1 g/mL (sur la base du médicament original, la température de concentration doit être inférieure à 60 °C).
        NOTE: Les composants actifs de CR sont volatils, de sorte que la température de concentration ne doit pas être supérieure à 60 ° C.
    2. Extrait CRV
      1. Effectuez les mêmes étapes (1.3.1.1-1.3.1.3) que pour la méthode d’extraction CR.
    3. Extrait CR pour test
      1. Pipeter 500 μL de l’extrait CR et 500 μL de méthanol dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, et vortex pendant 30 s pour mélanger.
        REMARQUE: Un mélange de méthanol et d’eau extrait mieux les composants actifs. L’extrait ne doit pas être filtré directement pour les tests.
      2. Centrifuger chaque échantillon pendant 15 min à 1,6502 × g à 4 °C. Filtrez le surnageant, puis transférez-le dans le flacon d’échantillon pour le tester.
        NOTE: Après la centrifugation à grande vitesse du mélange de méthanol et d’extrait, le surnageant peut être directement transféré dans le flacon d’échantillon pour être déterminé sans filtration. En raison de la chaleur générée par le processus de centrifugation, il est préférable d’utiliser une centrifugeuse cryogénique.
    4. Extrait CRV pour les tests
      1. Effectuez les étapes 1.3.3.1-1.3.3.2 pour préparer l’extrait CRV pour les tests.

2. Animaux

  1. Calcul
    1. Prenez 50 mg de benzoate d’estradiol et ajoutez-le à 50 ml d’huile d’olive pour préparer une solution de 1 mg / mL. Prenez 50 mg d’ocytocine et ajoutez-la à 50 mL de solution saline normale pour préparer une solution à 1 mg/mL.
      NOTE: La dose de l’injection intrapéritonéale de benzoate d’œstradiol et d’ocytocine est de 10 mg / (kg ∙jour). Le benzoate d’estradiol est dissous dans l’huile d’olive et l’ocytocine est dissoute dans une solution saline normale. Le benzoate d’estradiol n’est pas facile à dissoudre dans l’huile d’olive et peut être traité par ultrasons pour accélérer la dissolution. Les solutions de benzoate d’œstradiol et d’ocytocine doivent être préparées quotidiennement.
    2. Calculer le volume de solution de benzoate d’œstradiol à appliquer par rat (c.-à-d. V = 10 mg/[kg∙jour] × 200 g/[1 g/mL] = 2 mL). Calculer le volume de solution d’ocytocine à appliquer par rat (c.-à-d. V = 10 mg/[kg∙jour] × 200 g/[1 g/mL] = 2 mL).
  2. Groupement et administration d’animaux
    NOTE: Dix jours ont été attribués pour l’administration25,26. Pendant le traitement, les rats avaient un accès illimité au chow et à l’eau standard. Dans les 30 minutes suivant l’administration d’ocytocine, l’activité de tordage de chaque rat a été suivie. Le modèle de rat a été développé avec succès, comme en témoignent les réponses de torsion des rats modèles, qui comprenaient la contraction utérine, la rotation d’un membre, l’extension du membre postérieur, un tronc creux et la contraction abdominale26.
    1. Assigner 24 rats Sprague-Dawley femelles (rats SD, âgés de 8 à 10 semaines, pesant 200 g ± 20 g) en quatre groupes au hasard - contrôle, modèle, CR et CRV - et les nourrir pendant 7 jours.
    2. Administration animale
      1. Injecter par voie intrapéritonéale aux rats des groupes modèle, CR et CRV 2 mL de solution de benzoate d’estradiol chaque jour. Injecter par voie intrapéritonéale aux rats du groupe témoin 2 mL de solution saline normale.
      2. À partir du jour 8, complétez l’étape 2.2.2.1. Ensuite, administrer par voie intragastrique 2 mL d’extrait de CRV aux rats du groupe CRV, 2 mL d’extrait CR aux rats du groupe CR et 2 mL de solution saline normale aux rats du groupe témoin et du groupe modèle.
      3. Le jour 10, terminez l’étape 2.2.2.2. Ensuite, injecter par voie intrapéritonéale aux rats des groupes modèle, CR et CRV 2 mL de solution d’ocytocine et aux rats du groupe témoin 2 mL de solution saline normale.
    3. Notez les temps de tordion des rats dans les 30 minutes suivant l’injection d’ocytocine.
  3. Prélèvement d’échantillons
    1. Prélevez des échantillons de sang de l’aorte abdominale, excisez l’utérus rapidement et complètement, et séparez soigneusement le tissu conjonctif et la graisse adhérant à la paroi utérine.
      REMARQUE : Le sang a été prélevé près de 1 heure après la dose finale.
    2. Utilisez des tubes microcentrifugés pour préserver et transférer le tissu utérin à l’azote liquide. Conservez les échantillons de tissus à −80 °C.
    3. Centrifuger les échantillons de sang pendant 10 min à 4 125 × g. Retirer le surnageant contenant le sérum et centrifuger à 16 502 × g pendant 10 min à 4 °C. Centrifuger le sérum, puis le conserver dans le tube à −80 °C pour le stockage.
      NOTE: Les échantillons de sang doivent être laissés à température ambiante pendant 1 h pour être retraités.
  4. Traitement des échantillons
    1. Échantillons de sérum
      1. Mettez 400 μL de méthanol et 200 μL de sérum dans un tube microcentrifugeux, et vortex pendant 30 s pour mélanger. Centrifuger chaque échantillon pendant 15 min à 16 502 × g à 4 °C. Remplir les flacons d’échantillons avec le surnageant après la collecte et la filtration. Mélanger tous les surnageants de chaque échantillon avec le même volume pour préparer les échantillons de contrôle de la qualité pour les tests.
    2. Échantillons de tissus utérins
      1. Prenez 100 mg de tissu utérin du segment ipsilatéral et broyez-le avec un volume neuf fois de solution saline normale. Centrifuger l’homogénat pendant 10 min à 4 125 × g et recueillir le surnageant. Placer le surnageant au réfrigérateur à 4 °C pour l’essai ou à −80 °C s’il ne doit pas être testé le même jour.
      2. Placez la solution saline, le mouchoir et les billes d’acier normaux dans un tube microcentrifuge de 2 mL, mettez le tube de microcentrifugeuse dans de l’azote liquide pendant 3 à 5 s, puis mettez le tissu dans un broyeur de tissus pour le broyage.
  5. Analyse d’échantillons
    1. Utiliser un test immuno-enzymatique (ELISA) pour mesurer la teneur en PGF2α et PGE2 dans les tissus utérins des échantillons de rats.
      NOTE: Le kit ELISA PGE 2 chez le rat a été utilisé pour mesurer la teneur en PGE 2, et le kit ELISA PGF2α chez rat a été utilisé pour mesurer le niveau de PGF2α. Les étapes détaillées se trouvent dans les instructions du fabricant. Les détails du kit sont donnés dans le tableau des matériaux.
    2. Évaluez l’échantillon de sérum, l’extrait de RC et l’extrait de CRV à l’aide de UPLC-MS/MS.
      1. Pour UPLC, utiliser une colonne C18 (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) et une méthode de gradient binaire avec phase mobile A contenant 0,1% d’acide formique et phase mobile B contenant de l’acétonitrile. Régler le gradient d’élution comme suit : de 0 min à 1 min, 15 % B ; de 1 min à 8,5 min, 15 % à 85 % B ; de 8,5 min à 11,5 min, 85 % B ; de 11,5 min à 11,6 min, 99 % à 1 % B; et de 11,6 min à 15 min, 15 % B. Régler le débit à 0,35 mL/min et le volume d’injection à 2 μL.
      2. Pour la SM, réglez la température à 600 °C, le débit de gaz rideau (CUR) à 0,17 MPa et les débits de gaz de gaine et auxiliaire à 0,38 MPa. Réglez la tension de projection ionique du mode ion positif et du mode ion négatif sur 5,5 kV et −4,5 kV, respectivement, la tension du potentiel de dégroupage (DP) sur 80 V ou −80 V, l’énergie de collision (CE) sur 40 eV ou −25 eV, et la superposition d’énergie de collision (CES) sur 35 eV ± 15 eV.
      3. Effectuez le test en suivant le protocole du fabricant à l’aide de UPLC-MS/MS. Effectuez la MS pour une plage de masse de 50 à 1 000 m/z.
      4. Obtenez les résultats UPLC-MS/MS à l’aide du programme de station de travail correspondant en conjonction avec l’acquisition dépendante des informations, le filtre de défauts de masse multiples et la déduction dynamique de l’arrière-plan du mode de détection. Utiliser les échantillons de contrôle de la qualité du sérum combiné pour tester la répétabilité et la stabilité de l’équipement UPLC-MS/MS afin de vérifier l’approche conventionnelle. Avant les échantillons de recherche, injectez les échantillons de contrôle de la qualité pendant quatre cycles successifs, puis injectez-les tous les cinq échantillons de sérum.

3. Traitement des données

  1. Préparation des données
    1. Utilisez un logiciel de conversion pour convertir les données brutes au format mzXML. Normaliser les données de courant ionique total (TIC) de chaque échantillon.
      REMARQUE : Une application interne basée sur R (www.lims2.com) basée sur XCMS a été utilisée pour analyser les informations pour l’intégration, l’alignement, l’extraction et la détection des pics27.
    2. Effectuer l’annotation des métabolites à l’aide d’une base de données MS2 propriétaire (www.lims2.com). Définissez le seuil d’annotation sur 0,328.
      NOTE: Les métabolites endogènes ont été identifiés dans chaque groupe.
  2. Analyse en composantes principales et analyse discriminante partielle orthogonale des moindres carrés
    1. Utilisez un logiciel d’analyse pour effectuer l’analyse en composantes principales (ACP) et la modélisation. Importer les données normalisées des métabolites dans le logiciel d’analyse. Ensuite, utilisez l’ajustement automatique pour générer le modèle d’analyse. Enfin, utilisez le score pour obtenir le nuage de points de l’ACP.
      NOTE: Le regroupement de chaque groupe a été obtenu avec le diagramme de dispersion des scores de l’ACP. L’ACP est un mode d’analyse non supervisé qui regroupe principalement les échantillons par réduction de dimension sans intervention.
    2. Utilisez le logiciel d’analyse pour effectuer l’analyse discriminante orthogonale partielle des moindres carrés (OPLS-DA).
      1. Importez les données normalisées sur les métabolites des groupes CR et CRV dans le logiciel d’analyse.
      2. Importez les données du groupe CR dans le groupe CR créé et importez les données du groupe CRV dans le groupe CRV créé.
        NOTE : OPLS-DA est un mode d’analyse supervisé et le regroupement des échantillons est nécessaire.
      3. Ensuite, utilisez l’ajustement automatique pour créer le modèle d’analyse et utilisez le score pour obtenir le nuage de points de score de l’OPLS-DA. Enfin, utilisez VIP pour obtenir la signification variable dans la valeur de projection (VIP) dans l’OPLS-DA.
        REMARQUE : La signification variable dans les valeurs de projection (VIP) des métabolites dans les groupes CR et CRV a été obtenue par l’intermédiaire de l’OPLS-DA.
  3. Identification des métabolites différentiels potentiels
    1. Éliminer les métabolites dont la valeur VIP est supérieure à 1 à l’étape 3.2.2.3.
    2. Utiliser un logiciel statistique pour calculer la valeur P des métabolites qui ont été éliminés à l’étape 3.3.1 par le test t du Student.
      REMARQUE : Les différences significatives dans les métabolites différentiels potentiels dans les groupes RC et CRV ont été déterminées par un test t de Student. Les métabolites différentiels potentiels étaient ceux dont la valeur p du test t de Student était < 0,05 et dont la signification variable dans la projection (VIP) était supérieure à 1. La représentation a été réalisée à l’aide d’une parcelle volcanique.
  4. Identification des métabolites différentiels
    1. Éliminer les métabolites différentiels potentiels à l’étape 3.3. Utilisez les résultats de l’étape 3.1.2 pour identifier ces métabolites différentiels.
      REMARQUE : Un petit nombre de métabolites différentiels potentiels ont été identifiés, et ils sont devenus les métabolites différentiels candidats.
    2. Filtrer les métabolites différentiels à apparier dans la base de données KEGG. Montrez les changements dans les métabolites différentiels dans les groupes CR et CRV en dessinant une carte thermique.
      REMARQUE : Un petit nombre de métabolites différentiels candidats ont été appariés, et ils sont devenus les métabolites différentiels.
  5. Examen des voies métaboliques potentielles
    1. Téléchargez les différents métabolites dans la base de données Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Utilisez l’analyse des voies pour obtenir les voies métaboliques potentielles.
      NOTE: Les voies métaboliques potentielles ont été obtenues dans les groupes CR et CRV. La valeur P et la valeur d’impact étaient deux indicateurs très importants dans le choix des voies critiques. La valeur P était plus importante que la valeur d’impact. La signification a été définie par une valeur P < 0,05; Des valeurs d’impact plus élevées étaient associées à de meilleures corrélations.
    3. Analyser les voies métaboliques potentielles en téléchargeant les différents métabolites dans la base de données KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      REMARQUE: La relation entre la fonction de la voie métabolique et la MP doit également être prise en compte. Les voies métaboliques critiques ont été obtenues.
  6. Identification des constituants absorbés dans le sang
    1. Identifier les constituants chimiques dans les extraits CR et CRV à l’aide de la base de données MS2 interne (www.lims2.com), de la base de données sur le métabolome humain (HMDB) et des bases de données Massbank et Chemspider.
    2. Déterminer les constituants absorbés dans le sang dans les groupes RC et CRV, et comparer les constituants entre les groupes CR et CRV.
      NOTE: Les constituants absorbés dans le sang doivent être détectés dans les groupes CR ou CRV mais ne peuvent pas être détectés dans le groupe témoin.
  7. Analyse statistique
    1. Analyser les données à l’aide de l’analyse univariée (UVA) et de méthodes statistiques multivariées, y compris l’analyse de variance (ANOVA) et le test t de Student.
      REMARQUE : Les informations expérimentales ont été présentées à l’aide d’un logiciel statistique sous forme d’écart type moyen ± (±écart-type). P < 0,01 a été considéré comme une différence très significative, et P < 0,05 représentait une différence significative28.

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Representative Results

Analyse de l’expérience du modèle de dysménorrhée
Il n’y a pas eu de réponse tordue dans les 30 minutes dans le groupe témoin parce que ces rats n’ont pas reçu d’injection intrapéritonéale d’ocytocine et de benzoate d’œstradiol pour causer de la douleur. Les rats des groupes modèle, CR et CRV ont présenté des réactions de torsion substantielles après l’injection d’ocytocine. Ces résultats démontrent l’efficacité de la combinaison benzoate d’œstradiol et ocytocine pour induire la dysménorrhée. Les différences dans les niveaux de PGF 2α, PGE 2 et PGF2α/PGE 2 entre le modèle et les groupes témoins étaient significatives (P < 0,001, P < 0,05), démontrant l’efficacité du modèle (Figure 1).

Figure 1
Figure 1 : La teneur en PGF 2 α et en PGE2 dans le tissu utérin et le nombre de tords dans chaque groupe. (A) Le PGF2α contenu dans le tissu utérin de chaque groupe. (B) La teneur en EGP2 dans le tissu utérin de chaque groupe. (C) La teneur en PGF 2 α/PGE2 dans le tissu utérin de chaque groupe. (D) Le nombre de tords dans chaque groupe. Les colonnes représentent la moyenne ± MEB de quatre groupes (six souris par groupe). * P < 0,05 ou ** P < 0,01 représentent une différence significative par rapport au groupe modèle, et Δ P < 0,05 ou ΔΔ P < 0,01 représentent une différence significative par rapport au groupe RC. Les rats des groupes modèle, CR et CRV ont montré une réaction de torsion substantielle après l’injection d’ocytocine. Abréviations : PG = prostaglandine; CR = rhizome de cypéri; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les concentrations de PGF 2α et de PGF2α/PGE2 ont été réduites dans les groupes CRV et CR, et cette réduction était plus marquée dans le groupe CRV. Il y avait également des différences significatives (P < 0,001 et P < 0,05) dans les concentrations de PGF 2α et PGF2α/PGE2 entre les groupes CRV et CR. Par rapport au groupe témoin, la concentration de PGE2 était significativement plus élevée dans les groupes CRV et CR (P < 0,001), le niveau augmentant le plus dans le groupe CRV.

Contrôle qualité
Une bonne correspondance a été observée entre les temps de rétention des pics chromatographiques BPC et les intensités du signal dans les échantillons de contrôle de la qualité, démontrant un niveau élevé de stabilité de l’instrument et une qualité des données remarquablement constante (dossier supplémentaire 1 - figure supplémentaire 1 et figure supplémentaire 2). De plus, tous les échantillons de contrôle de la qualité se situaient à l’intérieur de ±2 écarts-types (figure 2A, B), et la corrélation entre les échantillons de contrôle de la qualité était supérieure à 0,7 (figure 2C, D). Ces résultats suggèrent que la procédure était fiable et que les résultats étaient crédibles.

Figure 2
Figure 2 : Distribution unidimensionnelle PCA-X des échantillons de contrôle de la qualité. (A) Mode positif, (B) Mode négatif; analyse de corrélation des échantillons de contrôle de la qualité en mode (C) positif et (D) négatif. Tous les échantillons de contrôle de la qualité se situaient à l’intérieur de ±2 écarts-types, et les corrélations entre les échantillons de contrôle de la qualité étaient supérieures à 0,7. Ces résultats suggèrent que la procédure était fiable et que l’information était crédible. Abréviations : PC = composant principal; ACP = analyse en composantes principales; contrôle qualité; CR = rhizome de cypéri; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse en composantes principales
Comme le montre la figure 3, le PC en abscisse (1) indiquait les scores des premières composantes principales, tandis que le PC ordonné (2) indiquait les scores des deuxièmes composantes principales. Dans la figure, le cercle vert indique le groupe témoin, le cercle rouge représente le groupe modèle, le cercle bleu indique le groupe CR, le cercle blanc indique le groupe CRV et le cercle rose indique le groupe contrôle de la qualité.

Figure 3
Figure 3 : Nuage de points de l’ACP. (A) mode positif et (B) mode négatif. Les échantillons de contrôle de la qualité se chevauchent, ce qui indique que l’instrument était très stable. Chaque groupe est réparti dans sa propre zone, seuls le groupe CR et le groupe CRV se croisant occasionnellement. Abréviations : PC = composant principal; ACP = analyse en composantes principales; CQ = contrôle de la qualité; CR = rhizome de cypéri; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les résultats de l’analyse de l’ACP ont démontré que les grappes du groupe RC et des groupes modèles étaient significativement séparées dans les modes ioniques positifs et négatifs. Les grappes ont été significativement séparées entre le CRV et les groupes modèles dans les modes d’ions positifs et négatifs. Les groupes de contrôle de la qualité, de modèle et de contrôle ont été séparés des autres groupes de traitement (RC, CRV). Les groupes CR et CRV se chevauchaient parfois en mode ion positif. En mode ion négatif, chaque groupe a été séparé de manière significative.

Méthode orthogonale des moindres carrés partiels analyse discriminante
OPLS-DA a été utilisé pour dépister les différences métaboliques. Le diagramme de dispersion OPLS-DA a montré que tous les échantillons se situaient dans l’intervalle de confiance à 95 % (ellipse T-carré de Hotelling). Les figures 4A et C montrent que les groupes CR et CRV ont été séparés. Le surajustement du modèle a été testé à l’aide du test de permutation (n = 200), et la signification statistique du modèle a été évaluée. Dans la figure 4B,D, l’ordonnée représente la valeur de R 2Y ou la valeur Q2, et l’abscisse indique la rétention de remplacement. R 2Y est représenté par le point vert, Q2 est représenté par le point carré bleu et les deux lignes pointillées représentent leurs droites de régression correspondantes. Dans les modes positif et négatif, les valeurs R 2Y étaient respectivement de 0,8 et 0,84, et les valeurs de Q2 étaient respectivement de -0,59 et -0,57. Cela démontre la grande fiabilité du modèle et l’absence de surmontage.

Figure 4
Figure 4 : Modèles OPLS-DA pour le groupe CR par rapport au groupe CRV. Diagramme de dispersion des scores en mode (A) positif et (C) mode négatif. Test de permutation du modèle OPLS-DA pour le groupe CR versus le groupe CRV en (B) mode positif et (D) mode négatif. R 2Y était de 0,8 et 0,84, et Q2 était de -0,59 et -0,57 dans les modes positif et négatif, respectivement. Cela démontre la grande fiabilité du modèle et l’absence de comportement de surajustement. Abréviations : OPLS-DA = analyse discriminante orthogonale partielle des moindres carrés; CR = rhizome de cypéri; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse statistique univariée
Des analyses statistiques univariées ont été effectuées pour identifier les variations métaboliques. Dans le cadre du criblage standard des > VIP 1 et P < 0,05, 339 et 394, des métabolites différentiels potentiels ont été détectés dans les modes ioniques positifs et négatifs, respectivement. Un diagramme de volcan est montré à la figure 5, dans lequel chaque point correspond à un métabolite différent. L’ordonnée montre la valeur P du test t de Student, et l’abscisse reflète de multiples changements dans le niveau de chaque molécule dans le groupe. La taille de dispersion représente la valeur VIP du modèle OPLS-DA; la valeur VIP augmente avec la taille de la dispersion. Les points rouges indiquent une augmentation, les points bleus indiquent une diminution et le gris indique aucune différence significative.

Une analyse qualitative des métabolites différentiels candidats a été réalisée par spectrométrie de masse secondaire. Des changements significatifs ont été observés dans 63 métabolites en mode positif (Fichier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire 1) et dans 30 métabolites en mode négatif (Fichier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire 2). Les métabolites différentiels ont été déterminés à l’aide des bases de données KEGG et HDMB. Les composés appariés avec précision ont été identifiés comme des métabolites différentiels, et ceux-ci sont énumérés dans les tableaux 3 et 4.

Figure 5
Figure 5 : Diagramme du volcan pour le groupe CR par rapport au groupe CRV. (A) Mode positif et (B) mode négatif. Dans le graphe volcanologique représenté, chaque point correspond à un métabolite différent. L’ordonnée montre la valeur P du test t de Student, et l’abscisse reflète les multiples changements dans chaque substance du groupe. La taille de dispersion représente la valeur VIP du modèle OPLS-DA. La valeur VIP augmente avec la taille de la dispersion. Les points rouges indiquent les augmentations, les points bleus indiquent les diminutions et le gris indique aucune différence significative. Abréviations : OPLS-DA = analyse discriminante orthogonale partielle des moindres carrés; PAAC = importance variable dans la projection; CR = rhizome de cypéri; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comparaisons de métabolites
La matrice de distance euclidienne des valeurs quantitatives des métabolites différentiels entre les groupes CR et CRV a été calculée, et les métabolites différentiels ont été regroupés à l’aide d’une approche de corrélation globale.

L’abscisse représente différents groupes expérimentaux, tandis que l’ordonnée représente le niveau relatif de la figure 6. L’emplacement des taches de couleur indique comment chaque métabolite est exprimé par rapport aux autres. En mode ion positif, par rapport au groupe CR, les niveaux de quatre métabolites différentiels dans le groupe CRV ont augmenté, tandis que les niveaux de 11 métabolites différentiels ont diminué. En mode ion négatif, par rapport au groupe CR, les niveaux de quatre métabolites différentiels dans le groupe CRV ont augmenté, et les niveaux de 7 métabolites différentiels ont diminué.

Figure 6
Figure 6 : Analyse de la carte thermique pour le groupe CRV par rapport au groupe CR. (A) Mode positif et (B) Mode négatif. L’abscisse représente les différents groupes expérimentaux et l’ordonnée représente les niveaux d’expression relatifs. L’emplacement des taches de couleur indique comment chaque métabolite est exprimé par rapport aux autres. Abréviations : CR = rhizome de Cyperi; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Par rapport au groupe RC, les métabolites qui ont augmenté dans le groupe CRV étaient la sphingosine 1-phosphate, la nobilétine, la glycérophosphocholine, le lysopc (18:1 (9z)), l’acide 2-hydroxy-6-pentadécylbenzoïque, l’acide 9,10-époxyoctadécénoïque, l’acide 13s-hydroxyoctadécadiénoïque et le 2-méthoxyestrone, tandis que ceux qui ont diminué étaient la corticostérone, l’acide indoleacétique, l’acide glycocholique, la berbérine, le phtalate de dibutyle, le rétinol, le leucotriène B4, la prostaglandine J2, la 21-hydroxyprégnénolone, le zéranol, l’homocystéine, l’acide propynoïque, acide stéarique, acide docosahexaénoïque, phénylacétylglycine, L-phénylalanine, glucuronide d’œstrone et acide citrique (figure 7).

Figure 7
Figure 7: Tendances relatives des métabolites potentiels dans les groupes CRV et CR. (A) Mode positif et (B) Mode négatif. En mode positif, par rapport au groupe RC, les niveaux de quatre métabolites différentiels ont augmenté dans le groupe CRV, et les niveaux de 11 ont diminué. En mode négatif, les niveaux de quatre métabolites différentiels ont augmenté dans le groupe CRV, et les niveaux de sept métabolites différentiels ont diminué. Les colonnes représentent la moyenne ± MEB de quatre groupes (six souris par groupe). * P < 0,05, ** P < 0,01 ou *** P < 0,01 représentent une différence significative entre les groupes CRV et CR. Abréviations : CR = rhizome de Cyperi; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse de la voie KEGG
Les métabolites différentiels ont été annotés et les voies KEGG ont été analysées. Les résultats ont montré que les métabolites différentiels étaient associés à neuf voies dans les modes positif et négatif, respectivement (tableau 1 et tableau 2). Dans la figure 8, les voies métaboliques sont chacune représentées par une bulle dans le graphique à bulles, avec une échelle plus significative indiquant un facteur d’effet plus important. La taille du chemin influençant les facteurs de l’analyse topologique est représentée par l’abscisse du graphique à bulles et la taille de la bulle. L’ordonnée du graphique à bulles et la couleur de la bulle indiquent la valeur P de l’analyse d’enrichissement (en prenant le logarithme naturel négatif, c’est-à-dire −ln (p)). Le degré d’enrichissement est plus important, la valeur P est plus petite, la valeur ordonnée est plus proéminente et la couleur est plus foncée. La valeur P et la valeur d’impact sont deux indicateurs très importants dans le choix des voies critiques. En général, la valeur P est plus importante que la valeur d’impact.

Figure 8
Figure 8 : Analyse du cheminement pour le groupe CRV par rapport au groupe CR. (A) Mode positif et (B) Mode négatif. Les voies métaboliques sont chacune représentées par une bulle dans le graphique à bulles. L’abscisse du graphique à bulles et la taille de la bulle indiquent la taille des facteurs influençant le chemin dans l’analyse topologique. L’ordonnée du graphique à bulles et la couleur de la bulle indiquent la valeur P de l’analyse d’enrichissement. Les principales voies métaboliques comprennent la biosynthèse des acides gras insaturés et le métabolisme de l’acide linoléique. Abréviations : CR = rhizome de Cyperi; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les tableaux 3 et 4 montrent les voies métaboliques avec des différences significatives - le métabolisme de la phénylalanine et le métabolisme de l’acide linoléique, ainsi que la biosynthèse des acides gras insaturés, de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane. Bien que les voies métaboliques comprenaient la biosynthèse des hormones stéroïdes, le métabolisme des sphingolipides et de l’acide arachidonique, il n’y avait pas de différences significatives, qui étaient liées à la dysménorrhée. Les résultats ont montré que le métabolisme de l’acide linoléique et la biosynthèse des acides gras insaturés étaient les voies métaboliques critiques associées à l’efficacité accrue du CRV.

Constituants absorbés dans le sang
Quinze constituants et deux produits du métabolisme provenant des extraits de CRV et de CR ont été détectés dans le sérum de rat dans les groupes CR et CRV (tableau 5). Les 17 composants ont été trouvés en mode ion positif.

Les niveaux relatifs de constituants dans les échantillons de sang des deux groupes ont été comparés à l’aide du test t de Student. L’abscisse de la figure 9 montre divers groupes expérimentaux; L’ordonnée représente la valeur de réponse du spectre de masse. Il y avait deux composantes avec des différences significatives. L’analyse a montré que les niveaux de ces deux composantes étaient élevés dans le groupe CRV par rapport au groupe CR, tandis que les niveaux de 15 éléments ne montraient aucun changement significatif.

Figure 9
Figure 9 : Constituants absorbés dans le sang pour le groupe CRV par rapport au groupe CR. Il y avait 15 constituants et deux produits du métabolisme des extraits de CRV et CR dans le sérum de rat dans les groupes CR et CRV. L’analyse a montré que les taux sanguins de deux composants ont augmenté dans le groupe CRV par rapport au groupe CR, tandis que les taux sanguins de 15 composants n’ont montré aucun changement significatif. Parmi eux, le taux de (-)-myrténol et d’acide [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tétraméthylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acétique dans le groupe CRV était considérablement plus élevé que dans le groupe CR. * P < 0,05 ou ** P < 0,01 représentent une différence significative entre le groupe CRV et le groupe CR. Abréviations : CR = rhizome de Cyperi; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Différences métaboliques en mode positif. Abréviations : KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; PAAC = importance variable dans la projection; RT = temps de rétention. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Différences métaboliques en mode négatif. Abréviations : KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; PAAC = importance variable dans la projection; RT = temps de rétention. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Analyse des voies métaboliques en mode positif. Abréviation : KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 Analyse des voies métaboliques en mode négatif. Abréviation : KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Identification des ingrédients et métabolites prototypes dans le sérum de rat. Note : M1 et M2 sont des métabolites; D’autres constituants sont des ingrédients prototypes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Dossier supplémentaire 1 : diagrammes BPC et chromatogramme MS2 des constituants absorbés dans le sang de souris nues. Diagrammes BPC de tous les échantillons de contrôle de la qualité en mode positif et négatif; Chromatogramme MS 2 des 17 constituants absorbés dans le sang des rats : D-camphène, (-)-myrténol, éthylparabène, calamenène, α-cypérone, (+)-nootkatone, (1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tétraméthylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acétique, acide 4-(2-(2.2.1)-bicycloheptylméthyl)benzoïque, 10,12-peroxycalamenène, (1aS,10aR)-1a,5,9-triméthyl-1a,3,6,10a-tétrahydrooxyréno[4,5]cyclodéca[1,2-b ]furan-10(2H)-one, ptérosine D, acide terrecyclique, acétate de sugeonyle, 3-acétyl-13-désoxyphoménome, isocurcumenol, ligucypéronol, procurcumadiol. Les métabolites différentiels identifiés par spectrométrie de masse secondaire, ainsi que les bases de données HDMB et KEGG, dans les modes ioniques positifs et négatifs sont également inclus. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

En raison de la grande variété et de la nature différente des MTC, ces herbes ne fonctionnent parfois pas dans la pratique clinique, ce qui peut être dû au traitement et à la décocation inappropriés des MTC. Les mécanismes de la MTC deviennent de plus en plus apparents avec l’utilisation de la science et de la technologie contemporaines29,30. Cette étude montre que la RC et la CRV ont des effets thérapeutiques chez les rats modèles de MP et que l’effet thérapeutique de la CRV est plus important. Le mécanisme d’action de la CRV pourrait être lié au fait que le traitement du vinaigre peut influencer les constituants de CR qui sont absorbés dans le sang et pourrait être associé au métabolisme de l’acide linoléique et à la biosynthèse des acides gras insaturés. La figure 10 illustre les voies potentielles de l’action de CRV dans le soulagement de la douleur.

Figure 10
Figure 10 : Mécanismes de l’effet analgésique renforcé de la CRV. Les résultats ont montré que 15 constituants et deux métabolites ont été trouvés dans le sang. Parmi eux, les niveaux de (-)-myrténol et d’acide [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tétraméthylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acétique dans le groupe CRV étaient considérablement plus élevés que dans le groupe CR. Le CRV peut réduire le niveau de prostanoïdes de la série 2 et des leucotriènes de la série 4 fabriqués à partir d’ARA et obtenir des effets analgésiques via la modulation du métabolisme de l’acide arachidonique, la biosynthèse des acides gras insaturés et le métabolisme de l’acide linoléique. Abréviations : ARA = acide arachidonique; COX = cyclooxygénase; LA = acide linoléique; AGPI = acides gras polyinsaturés; GLA =γ-acide linolénique; DGLA = dihomo-γ-linolénique; MP = dysménorrhée primaire; PG = prostaglandine; LT = leucotriènes; TX = thromboxane; SDA = acide stéaridonique; ETA = acide eicosatétraénoïque; EPA = acide eicosapentaénoïque; CR = rhizome de cypéri; CRV = CR traité avec du vinaigre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Précautions pendant l’expérience
Étant donné que l’huile du composant efficace de CR est volatile, le temps d’extraction de la CR ne doit pas dépasser 20 minutes et, lorsqu’elle bout, elle doit être à feu doux avec une température ne dépassant pas 60 ° C pendant la concentration. Pour assurer une extraction réussie des ingrédients efficaces, les herbes doivent être trempées dans l’eau pendant au moins 2 h avant la décoction afin que les herbes soient mouillées lorsque le trempage est terminé. Pendant le traitement CR, le vinaigre doit être bien mélangé avec les herbes afin que le vinaigre puisse y pénétrer complètement. Si le volume de vinaigre est trop faible pour mouiller les herbes à fond, une petite quantité d’eau peut être ajoutée pour diluer le vinaigre, puis le vinaigre peut être complètement mélangé avec les herbes. Lorsque le mélange est terminé, les herbes absorberont tout le vinaigre. Puisque le vinaigre contient de l’acide acétique, le mélange ne doit pas entrer en contact avec le fer pour éviter une réaction chimique.

Dans l’expérience chez le rat, la première injection intrapéritonéale de benzoate d’œstradiol est administrée le jour 10, puis l’administration intragastrique de l’extrait de CR ou de CRV est administrée et, enfin, l’injection intrapéritonéale d’ocytocine est administrée. Après l’injection intrapéritonéale d’ocytocine, l’animal est observé pendant 30 minutes et le sang est immédiatement prélevé. Habituellement, la concentration sanguine atteint un pic dans les 1 heure suivant l’administration intragastrique13, qui est le meilleur moment pour prélever du sang.

Lors de la détermination des échantillons d’extrait et de sérum par LC-MS/MS, ils doivent être déterminés dans le même lot afin de garantir que le temps de rétention du même composant dans différents échantillons est cohérent. Dans cette expérience, l’identification des composants était un point difficile. Bien qu’une base de données relativement mature puisse être utilisée pour les métabolites endogènes, il n’existait pas de base de données correspondante pour identifier les constituants absorbés dans le sang, de sorte qu’il fallait faire preuve de plus de prudence dans l’identification.

Différences dans les constituants absorbés dans le sang entre les groupes CR et CRV
Pour déterminer l’ingrédient actif de la RC, cette expérience a étudié les constituants absorbés dans le sang chez des rats modèles de dysménorrhée. Dans cette expérience, il a été constaté que 15 constituants et deux métabolites dans le sang différaient entre les groupes CR et CRV. Parmi eux, les niveaux de (-)-myrténol et d’acide [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tétraméthylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acétique dans le groupe CRV étaient considérablement plus élevés que dans le groupe CR, mais les niveaux des autres composants n’étaient pas significativement différents. Le (-)-myrténol et l’acide [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tétraméthylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acétique sont des terpénoïdes et sont considérés comme les composants efficaces du CRV.

Le ligucypéronol et le procurcumadiol sont produits par l’oxydation du α-cypérone et de l’isocurcuménol, respectivement, et le α-cypérone a un fort effet analgésique. Le mécanisme d’action proposé pourrait réduire l’expression de la COX-2 induite par le LPS et la synthèse de PGE2 par la régulation négative de la signalisation NF-kB31. (+)-La nootkatone inhibe également l’activité de la COX-232,33. L’isocurcuménol est le composant central du rhizome Curcumae dans le traitement de la dysménorrhée3, et son métabolite procurcumadiol peut avoir un effet analgésique. Par rapport au groupe CR, le groupe CRV a montré des niveaux considérablement plus élevés de (-)-myrtenol, qui a un effet analgésique34. Le mécanisme d’action possible pourrait être que les changements dans l’expression de la COX-2 35 augmentent les niveaux de cytokines anti-inflammatoires (IL-10, IFN-γ) et réduisent les niveaux de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1β)niveaux 36. Le traitement avec du vinaigre améliore les niveaux des ingrédients actifs dans le sang, ce qui peut expliquer pourquoi les produits fabriqués avec du vinaigre sont plus efficaces.

Différences dans les voies métaboliques entre les groupes RC et CRV
L’analyse des voies a montré des voies métaboliques significativement différentes entre les groupes CR et CRV, y compris en termes de métabolisme de la phénylalanine, de biosynthèse des acides gras insaturés, de phénylalanine, de tyrosine et de biosynthèse du tryptophane et de métabolisme de l’acide linoléique. Cependant, les voies métaboliques du métabolisme de la phénylalanine et de la biosynthèse de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane ne sont pas liées à la MP. Ces résultats montrent que les voies métaboliques associées à l’efficacité accrue du CRV sont le métabolisme de l’acide linoléique et la biosynthèse des acides gras insaturés.

Les acides gras insaturés comprennent deux types: oméga-3 et oméga-637. Trois précurseurs de médiateurs, dont l’acide eicosapentaénoïque (20:5ω3; EPA), acide docosahexaénoïque (22:5ω3; DHA) et l’acide arachidonique (20:5ω6; ARA), sont impliqués dans la biosynthèse des acides gras insaturésvoie 37,38. Les métabolismes EPA et ARA produisent tous deux des prostaglandines et des leucotriènes sous l’action de la COX. ARA produit des prostanoïdes de série 2, y compris PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 et thromboxane (TXA 2, TXB 2), et des leucotriènes de série 4, y compris les leucotriènes A 4 (LTA 4), les leucotriènes B 4 (LTB 4), les leucotriènes C 4 (LTC 4) et les leucotriènes D 4 (LTD 4). Les prostanoïdes de la série 3 comprennent la prostaglandine E 3 (PGE 3), la prostacycline I 3 (PGI 3) et le thromboxane A2 (TXA 3), et les leucotriènes de la série 5 comprennent les leucotriènes A 5 (LTA 5), les leucotriènes B 5 (LTB 5), les leucotriènes C 5 (LTC 5) et les leucotriènes D 5 (LTD 5), qui sont en grande partie produits par l’EPA.

Le processus de transformation de l’EPA est le même que celui de l’ARA et est médié par des enzymes similaires39. Les prostanoïdes de la série 2 et les leucotriènes de la série 4 ont principalement des effets pro-inflammatoires, d’agrégation plaquettaire et de vasoconstriction. En revanche, les prostanoïdes de la série 3 et les leucotriènes de la série 5 présentent des effets anti-inflammatoires, antiplaquettaires et vasodilatateurs38. TXA 2 et TXB2 sont produits à partir d’ARA, provoquant le rétrécissement des vaisseaux sanguins. Les PGI 3, PGE 3 et TXA3 dérivés de l’EPA agissent uniquement comme vasodilatateurs38,40. L’EPA et l’ARA sont en concurrence pour la conversion en PG par l’enzyme COX. Lorsque le rapport EPA/AA membranaire est augmenté, les eicosanoïdes PGI2 et TXA2, qui favorisent l’agrégation, peuvent être transformés en TXA 3 et PGI 3, qui favorisent l’anti-agrégation, entraînant des effets anti-inflammatoires et anti-agrégateurs40. De plus, l’utilisation combinée de l’EPA, du DHA et de l’acide linoléique (C18:2ω6; LIN) peut réduire la libération de PGF 2 α et de PGE2 dans l’endomètre bovin et les trophoblastes41,42.

La MP est probablement causée par la production de GE et de leucotriènes 43,44,45, en particulier de GE 46. Pendant ce temps, un déséquilibre de la vasopressine, des β-endorphines, des œstrogènes, de la progestérone, des neurotransmetteurs, de l’IL, de l’ET-1 et du NO peut également être lié à la dysménorrhée47. Selon les résultats ELISA, les niveaux de PGF 2α et de PGF2α/PGE 2 dans le groupe CRV ont diminué, tandis que le niveau de PGE 2 a augmenté par rapport au groupe CR. De plus, les leucotriènes B4 (C02165) et les prostaglandines J2 (C05957) étaient plus faibles dans le groupe CRV. Cela indique que, dans le groupe CRV, il y avait des niveaux plus faibles de prostanoïdes de la série 2 fabriqués à partir d’ARA, y compris PGF2α, qui est le facteur le plus important pour la dysménorrhée. Le traitement par PGE 2 à des concentrations élevées dilate les vaisseaux sanguins, et PGE2 provoque une vasoconstriction à de faibles concentrations48. Par conséquent, l’utérus est détendu avec une vasodilatation et la dysménorrhée est soulagée.

Comme le corps humain ne peut pas synthétiser une quantité suffisante d’acides gras insaturés en C18, l’acide linoléique et l’acide α-linolénique, qui sont la seule source d’acides gras insaturés en C18, sont très importants38. L’acide linoléique et l’acide α-linolénique sont la source du métabolisme des acides gras insaturés oméga-6 et oméga-3, respectivement. En particulier, le précurseur de la synthèse des prostaglandines est l’ARA, et l’ARA est synthétisé à partir de l’acide linoléique49. L’acide linoléique est un précurseur, et une série de métabolites en sont synthétisés, notamment l’ARA, les prostaglandines (PGF 2 α, PGE 2), la prostacycline (PGI 2) et le thromboxane (TXA 2)50. L’acide linoléique est étroitement lié à l’effet analgésique accru du CRV. En outre, la voie métabolique de la biosynthèse des hormones stéroïdes peut produire de la progestérone 51,52,53 et de la sphingosine-1-phosphate (C06124), qui sont produites par la voie métabolique du métabolisme des sphingolipides, induisent la COX-2 et produisent des EGP2 par TNF54,55,56,57. Ceux-ci peuvent également être liés à la MP.

Le protocole comporte certaines limites. Seuls les niveaux relatifs des constituants ont été comparés, et l’échantillon standard n’a pas été utilisé pour quantifier les constituants de l’herbe et ceux absorbés dans le sang. Les excréments et l’urine de rats n’ont pas été recueillis lors des expériences sur les animaux, ce qui a entraîné la découverte de moins de métabolites de la RC in vivo. Les expériences de validation devraient confirmer davantage le mécanisme découvert par l’analyse métabonomique.

La stratégie et le protocole utilisés dans cette étude ont évité la cécité dans l’étude des composants chimiques in vitro et l’étude unilatérale des composants individuels in vivo. Par conséquent, il était très approprié pour l’exploration du mécanisme. La stratégie peut économiser beaucoup de temps et de travail et peut identifier avec précision les constituants critiques et le mécanisme d’efficacité thérapeutique.

Dans cette étude, il a été constaté qu’il y avait 15 constituants et deux métabolites dans le sang. Parmi eux, les niveaux de (-)-myrténol et d’acide [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tétraméthylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acétique ont été significativement augmentés dans le groupe CRV par rapport au groupe CR, montrant que le traitement au vinaigre peut augmenter les niveaux des ingrédients actifs dans le sang. Après le traitement de la RC avec du vinaigre, les niveaux de prostanoïdes de la série 2 et de leucotriènes de la série 4 ayant des propriétés pro-inflammatoires, d’agrégation plaquettaire et de vasoconstriction ont diminué, y compris PGF2α, leucotriène B4 et prostaglandine J2. C’est peut-être le mécanisme par lequel le CRV démontre un effet analgésique amélioré.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le projet scientifique et technologique de la médecine chinoise de la Commission municipale de la santé et de la planification familiale de Chongqing (numéro de projet: ZY201802297), le projet général de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing (numéro de projet: cstc2019jcyj-msxmX065), le plan de renforcement de l’équipe d’innovation du système de technologie agricole à haute efficacité de la région montagneuse moderne de Chongqing [10] et le projet de construction de la discipline clé de la Commission municipale de la santé de Chongqing de la matéria chinoise Traitement médicamenteux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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rétractation numéro 190
Analyse d’échantillons bruts et traités de Cyperi rhizoma par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem chez des rats atteints de dysménorrhée primaire
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Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

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