Summary
В этом протоколе описывается метод мониторинга прогрессирования морфологических изменений с течением времени в матке в индуцируемой мышиной модели рака эндометрия с использованием ультразвуковой визуализации с корреляцией с грубыми и гистологическими изменениями.
Abstract
Рак матки может быть изучен на мышах из-за простоты обращения и генетических манипуляций в этих моделях. Тем не менее, эти исследования часто ограничиваются оценкой патологии посмертно у животных, усыпленных в несколько моментов времени в разных когортах, что увеличивает количество мышей, необходимых для исследования. Визуализация мышей в лонгитюдных исследованиях может отслеживать прогрессирование заболевания у отдельных животных, уменьшая количество необходимых мышей. Достижения в области ультразвуковой технологии позволили обнаружить изменения в тканях на микрометровом уровне. Ультразвук использовался для изучения созревания фолликулов в яичниках и роста ксенотрансплантата, но не применялся к морфологическим изменениям в матке мыши. В этом протоколе исследуется сопоставление патологии со сравнением изображений in vivo в мышиной модели с индуцированным раком эндометрия. Признаки, наблюдаемые при УЗИ, соответствовали степени изменения, наблюдаемым при грубой патологии и гистологии. Было обнаружено, что ультразвук обладает высокой степенью прогнозирования наблюдаемой патологии, поддерживая включение ультразвукового исследования в лонгитюдные исследования заболеваний матки, таких как рак у мышей.
Introduction
Мыши остаются одной из наиболее важных животных моделей репродуктивных расстройств 1,2,3. Существует несколько генетически модифицированных или индуцированных моделей рака яичников и матки у грызунов. Эти исследования обычно опираются на несколько когорт, подвергшихся эвтаназии в разные моменты времени, чтобы зафиксировать продольные тенденции морфологических и патологических изменений. Это препятствует получению непрерывных данных о развитии рака у отдельной мыши. Кроме того, не зная отдельного состояния прогрессирования заболевания мыши, интервенционные исследования основаны на заранее определенных временных точках и усредненных результатах предыдущих когорт, а не на отдельных пороговых значениях для обнаружения прогрессирования у конкретного животного 4,5. Таким образом, подходы к визуализации, которые позволяют проводить продольную оценку на живых животных, необходимы для облегчения доклинических моделей для тестирования новых лекарств или соединений и ускорения понимания патобиологии, а также повышения строгости и воспроизводимости6.
Ультразвуковая визуализация (УЗИ) является привлекательным методом для продольного мониторинга прогрессирования рака матки мышей, поскольку она относительно проста и недорога по сравнению с другими методами визуализации, проста в выполнении и может иметь замечательное разрешение 6,7. Этот неинвазивный метод может фиксировать особенности в микронном масштабе у бодрствующих мышей или у мышей, находящихся под кратковременной седацией, с использованием 5-10-минутного исследования. Ультразвуковая микроскопия была валидирована как метод измерения развития фолликулов яичников мыши 8 и роста имплантированной или индуцированной неоплазии 9,10,11. Высокочастотное УЗИ также использовалось для чрескожных внутриматочных инъекций12 и наблюдения за изменениями матки у крыс в течение циклатечки 13. Высокочастотный УЗИ можно использовать с мышами, удерживаемыми на специализированных стационарных платформах с использованием рельсовой системы для удержания преобразователя/зонда для захвата изображений с высоким разрешением со стандартизированным положением и давлением; Однако это оборудование доступно не во всех учреждениях. Методы сканирования с помощью ручного датчика могут быть приняты с менее специализированным оборудованием и использоваться как для клинической диагностики, так и для исследований на мышах.
Остается открытым вопрос о том, можно ли использовать визуализацию УЗИ с помощью портативных высокочастотных зондов для мониторинга развития рака матки в течение нескольких недель. Подобно кишечнику, матка грызунов представляет собой тонкостенную тонкую структуру, которая очень подвижна в брюшной полости и непрерывна через несколько глубин тканей, что делает визуализацию более сложной, чем с относительно неподвижными органами, такими как почки. Это исследование было направлено на установление корреляции между тканями, наблюдаемыми с помощью ультразвука, и гистопатологией, определение ориентиров для определения местоположения матки мыши и определение возможности продольной оценки рака эндометрия. В этом исследовании представлены данные, показывающие качественное соответствие между внешним видом матки, сфотографированной с помощью УЗИ, и гистопатологией, а также серийной визуализацией мышей в течение нескольких недель. Эти результаты показывают, что портативный УЗИ можно использовать для мониторинга развития рака эндометрия у мышей, тем самым создавая возможность для сбора индивидуальных продольных данных мыши для изучения рака матки без необходимости использования специального оборудования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры и эксперименты с участием мышей проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию Джонса Хопкинса. Для всех процедур надевались соответствующие СИЗ, включая перчатки и одноразовые изолирующие халаты. Были приняты меры предосторожности при обращении с острыми предметами, которые были надлежащим образом утилизированы в красных контейнерах для острых предметов сразу после использования. Подробные сведения обо всех материалах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Индукция рака эндометрия у мышей iPAD (индуцируемая двойная делеция Pten, Arid1a ) доксициклином
- Поддерживайте 10 трансгенных мышей Pax8-Cre-Arid1a-Pten с двойной делецией (iPAD) (рис. 1) на смешанном генетическом фоне (129S, BALB/C, C57BL/6), как описано ранее14.
- Соберите исходные ультразвуковые (2D) изображения яичников, яйцевода и матки каждой мыши перед лечением доксициклином.
- Обеспечьте исключительно доксициклинсодержащие рационы мышей (доксициклин гиклат в дозе 625 мг / кг корма) самкам мышей iPAD в течение как минимум 2 недель, начиная с 7-8-недельного возраста, чтобы вызвать делецию гена.
2. Настройка оборудования
- Включите грелку и накройте чистой впитывающей прокладкой (целевая температура: 38 °C).
- Убедитесь, что испаритель изофлурана и бак O2 заполнены достаточно. Долейте и замените, если содержимое низкое.
- Подключите индукционную камеру, носовой обтекатель и систему продувки к испарителю.
- Настройте аппарат УЗИ.
- Выберите датчик (зонд) с диапазоном 32-56 МГц или до 70 МГц для визуализации матки или яичника соответственно.
- Подсоедините зонд и включите машину.
- После загрузки системы используйте панель управления, чтобы войти в систему с учетными данными пользователя и получить доступ к главному экрану.
- На главном экране перейдите на вкладку « Приложения » и выберите «Мышь (маленькая) в режиме живота».
- Нажмите « Сканировать », чтобы вернуться на главный экран, и дождитесь отображения живого изображения.
- Выберите B-Mode из параметров на левой панели инструментов.
- Нажмите « Дополнительные элементы управления », чтобы просмотреть дополнительные инструменты для уточнения изображения, такие как усиление и глубина изображения, или настроить параметры захвата клипа, такие как количество кадров в секунду.
- После выбора настроек изображения вернитесь на главный экран, нажав « Сканировать».
- Включитебак Ø2, направьте поток в индукционную камеру и установите скорость потока 1 л/мин.
3. Подготовка мышей к ультразвуковому скринингу, включая эпиляцию
- Поместите мышь в индукционную камеру. Установите испаритель изофлурана на 2%-3% об./об. для индукции анестезии.
- Определите подходящую глубину анестезии по отсутствию реакции на защемление пальца ноги и частоте дыхания около 1-2 вдохов / с.
- Нанесите стерильную офтальмологическую смазку на каждый глаз. Удалите шерсть со спинки и брюшной полости между последним ребром и тазом с помощью машинок для стрижки соответствующего размера.
- Нанесите тонкий слой крема для депиляции на вентральную и дорсальную области для визуализации (при необходимости).
- Поместите мышь обратно в индукционную камеру примерно на 3-5 минут, чтобы поддерживать соответствующую глубину анестезии, пока крем для депиляции удаляет волосы. Через ≤4 минуты аккуратно сотрите крем чистым влажным бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие крема для депиляции вызывает раздражение и может вызвать поражения кожи.
4. Внутрибрюшинное введение жидкости для увеличения контраста между органами
- Нагрейте шприц объемом 3-10 мл, наполненный стерильным раствором изотонической жидкости (например, стерильным 0,9% NaCl или раствором Lactated Ringers) до 35-40 °C, поместив его между грелкой и абсорбирующей прокладкой на несколько минут. Поместите флакон с ультразвуковым гелем на грелку, если в аппарате нет грелки.
- Для мыши 20-25 г вводят 1-2 мл раствора в брюшную полость.
- Закрепите мышь за загривок в одной руке, обнажив брюшное отверстие.
- Держите мышь под углом ~ 20 °, нос направлен к полу, чтобы направить органы краниально под действием силы тяжести.
- С помощью иглы малого калибра (25 G, длиной 5/8, туберкулиновый шприц) прокалывают кожу и брюшную стенку каудального правого квадранта живота.
- Перед введением жидкости, чтобы избежать инъекции в сосудистую сеть или желудочно-кишечный тракт, оттяните назад с минимальным давлением. Если в шприц попала кровь или другой материал, извлеките иглу. Используйте новую иглу и шприц и повторите попытку в немного другом положении.
- Если мышь просыпается во время инъекций, поместите ее обратно в маленькую индукционную камеру для анестезии с 2%-3% изофлураном.
5. Ультразвуковая визуализация при дорсальном доступе
- Расположите мышь в подфюзеляжном положении лежа на впитывающей прокладке над грелкой (рис. 2A-C).
- Надежно поместите носовой конус грызуна на нос и морду мыши. Поддерживайте глубину анестезии с помощью изофлурана, доставляемого через носовой конус, на уровне 1-2% об./об. при 100%O2. При необходимости нанесите стерильную офтальмологическую смазку на каждый глаз.
- Следите за регулярной частотой дыхания мыши (1-2 / с) и отсутствием реакции на ущипывание пальцев ног, чтобы указать, нужно ли корректировать анестезию.
- Поместите небольшое количество (~ 0,5-1 мл) предварительно подогретого ультразвукового геля абаксиально (латерально) к позвоночнику по обе стороны от анестезированной мыши, между последним ребром и тазом.
- Нанесите небольшое количество геля на ультразвуковой датчик.
- Поместите зонд параллельно позвонкам так, чтобы передняя часть зонда находилась на черепной стороне. На головке датчика имеется индикаторная метка, указывающая на правильную ориентацию датчика. Запишите день, время, идентификатор животного, ориентацию зонда и сторону животного (справа, слева, спинной, брюшной) для каждого нового набора собираемых изображений.
- Когда мышь находится в вентральном лежачем положении (спинная кожа касается зонда), медленно просканируйте область в поисках ориентира для почек (рис. 2B и рис. 3). Потянув почку в поле зрения, потяните зонд каудально, чтобы найти яичник - слегка гиперэхогенную овальную или круглую структуру (рис. 4A, B) в очень гиперэхогенном жировом пакете яичников, который граничит кранио-вентрально с почкой и дорсо-латерально с дорсальной брюшной стенкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каудальное и боковое давление на яичник может направить яичник ближе к брюшной стенке и от петель кишечника. Яичник анатомически расположен у дорсальной брюшной стенки, только вентрально и латерально к эпаксиальным мышцам и каудально к почке. - Отрегулируйте усиление сигнала с помощью ползунка в нижней части экрана управления, чтобы улучшить контрастность изображения.
- Чтобы улучшить визуализацию почки, надавите пальцем на контралатеральную часть живота. Изменяйте давление и угол от прямо параллельного позвоночнику до ~20° вентрального.
- Как только интересующий вас орган окажется в поле зрения, соберите видео, нажав « Сохранить клип » или « Начать запись», а затем «Остановить запись », когда закончите, чтобы сохранить изображения с заданным количеством кадров.
- Сохраняйте отдельные кадры из живого изображения или записи с помощью кнопки «Сохранить кадр».
- Чтобы визуализировать матку, потяните зонд каудально до тех пор, пока яичник не окажется в самом краниальном аспекте поля зрения. Варьируйте давление зонда и угол наклона до тех пор, пока матка не окажется в поле зрения.
- Повторите сбор видео и кадров для каждого интересующего органа.
- Найдите матку, идущую продольно вдоль дорсальной брюшной стенки, с боковой мускулатурой ног (рис. 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер матки и диаметр просвета могут варьироваться в зависимости от фазы течки и состояния заболевания. - Следите за перистальтическим движением ткани, чтобы дифференцировать петли кишечника от неподвижных рогов матки.
6. Соберите изображения с вентрального подхода
- Поместите мышь в спинное лежачее положение и убедитесь, что смазка глаз достаточна, а морда надежно находится в носовом конусе (рис. 2A).
- Нанесите небольшое количество (~ 0,5-1 мл) предварительно подогретого ультразвукового геля на вентральную часть живота и нанесите зонд на среднюю линию черепа лобка, чтобы определить местонахождение мочевого пузыря в качестве гипоэхогенного ориентира (рис. 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мочевой пузырь слишком большой и скрывает визуализацию матки, можно слегка надавить на нижнюю часть живота для сцеживания мочи. - Потяните зонд сбоку к мочевому пузырю, чтобы найти рога матки. Приложите легкое цифровое давление с одной или обеих сторон мыши, чтобы вывести рога в поле зрения. Держите зонд перпендикулярно мыши и сканируйте обе стороны живота, чтобы получить поперечные виды (поперечные сечения) обоих рогов. Поверните зонд, чтобы захватить сагиттальные виды.
- После УЗИ протрите мышь бумажным полотенцем от геля и верните ее в клетку для восстановления. Мыши полностью просыпаются через 2-5 минут. Как только он полностью проснулся и начал передвигаться, верните мышь в комнату для животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Под клетку можно поместить грелку на слабом огне, чтобы согреть клетку для восстановления. - В экспериментальной или гуманной конечной точке усыпьте мышь. В идеале усыпить мышь в домашней клетке, чтобы уменьшить стресс; Как вариант, поместите мышь в чистую камеру. Подавайте CO2 под давлением со скоростью вытеснения 10-30% от объема камеры в минуту. Примерно через 5 минут отсутствия видимого дыхания подтвердите смерть от вывиха шейки матки. Приступайте к вскрытию брюшной полости для удаления опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Трансгенные мыши Pax8-Cre-Arid1a-Pten с двойной делецией (iPAD) поддерживались на смешанном генетическом фоне (129S, BALB/C, C57BL/6), как описано ранее14. Всех мышей кормили доксициклином в течение 2 недель, чтобы индуцировать Cre рекомбиназу. В предыдущей работе нашей группы доксициклин дозировали черезжелудочный зонд 14; Тем не менее, в этом текущем исследовании метод индукции корма доксициклином работал эффективно и снижал стресс зонда для мышей. Важно проверить, является ли метод введения доксициклина адекватным для индукции экспрессии рекомбиназы Cre, необходимой для иссечения ДНК опухолевых супрессоров (Arid1a и Pten) в клетках, экспрессирующих Pax8, таких как матка. Иммуногистохимия с антителами, направленными против ARID1a и pTEN14, была использована для проверки того, была ли достигнута адекватная потеря белка-супрессора опухоли в эпителиальных клетках матки по сравнению с соседней стромальной тканью, как показано на рисунке 6. Схема мышиной модели и регуляции экспрессии опухолевых супрессоров представлена на рисунке 1.
После 2 недель приема доксициклина матка существенно не изменилась в размерах по сравнению с контрольной группой или той же мышью, изображенной до введения доксициклина. Тем не менее, в течение следующих 2-6 недель после введения доксициклина УЗИ показало, что у мышей развился ряд патологий матки, начиная с гиперплазии и прогрессируя до аденокарциномы. На рисунке 7A,B показаны УЗИ матки мыши с ранними патологическими изменениями, наблюдаемыми после 3 недель лечения доксициклином. На рисунке 7C, D показана грубая патология и гистопатология той же матки, изображенные на рисунке 7A, B после эвтаназии мыши сразу после визуализации через 3 недели. Может наблюдаться меньшая (но расширенная) тонкостенная матка и ранняя гиперплазия эндометрия с сохранением отчетливого просвета (центральной гиперэхогенной маточной жидкости). У мышей, подвергшихся эвтаназии в более поздние моменты времени, матка была намного больше, имела меньший просвет и имела утолщенную стенку (рис. 8 и рис. 9). Примеры расширенных просветов и тонких изменений гиперпластического эндометрия сравниваются с плотной тканью и ростом узлового рака в матке на рисунках 8 и 9. Ультразвуковые и грубые изображения хорошо согласовывались друг с другом для всех представленных мышей. На рисунке 9 представлены изображения нескольких маток одной и той же мыши в исследовании с течением времени и демонстрируются морфологические изменения, наблюдаемые в течение 6 недель по мере развития аденокарциномы. На рисунке 5 представлен вентральный доступ с поперечными срезами рогов матки, прилегающих к гипоэхогенному мочевому пузырю.
Чтобы усилить контраст в брюшной полости, введение физиологического раствора в брюшную полость непосредственно перед визуализацией улучшило визуализацию органов брюшной полости, включая матку и яичники. На рисунке 3 показано ультразвуковое сравнение одной и той же мыши до и после инъекции 1 мл физиологического раствора. При физрастворе наблюдалось увеличенное гипоэхогенное пространство (черное) между органами, что позволяло почкам, жировому пакету, яичникам, рогам матки, кишечнику и селезенке легче индивидуализироваться друг от друга. На всех остальных рисунках, представленных здесь, инъекции физиологического раствора были сделаны перед визуализацией для улучшения четкости изображения.
Взятые вместе, этот протокол показывает, что эта индуцируемая мышиная модель развивает аденокарциному в течение 6-недельного периода и может контролироваться с помощью ультразвука, чтобы установить исходный уровень и наблюдать морфологические изменения в матке по мере развития рака. Здесь показано, что неинвазивное ультразвуковое исследование позволяет последовательно оценивать рога матки у мыши в течение нескольких недель с помощью изображений, которые предсказывают фактические патологические изменения матки.
Рисунок 1: Стратегия генерации индуцируемых Pax8-Cre двойных трансгенных мышей KO. (A) Конститутивная продукция обратного тетрациклин-контролируемого трансактиватора (rtTA) в эпителиальных клетках матки, экспрессирующих Pax8, приводит к индуцируемой активации Cre-рекомбиназы в присутствии тетрациклина или его аналога доксициклина путем связывания с элементами тетрациклинового ответа (TRE). Флокс-сайты, расположенные выше и ниже по течению от экзона 8 (Arid1a) и экзона 5 (Pten), являются мишенью Cre recombinase. Делеция экзона 8 в Arid1a приводит к мутации со сдвигом рамки и раннему стоп-кодону (p.Gly809Hisfs*6). Кре-таргетированная делеция экзона 5 в Pten приводит к мутации со сдвигом рамки (p.Val85Glyfs*14). (B) Мышь Pax8-rtTA экспрессирует обратный трансактиватор, контролируемый тетрациклином (rtTA) под контролем промотора Pax8. Эту мышь скрещивают с мышью TetO-Cre, которая экспрессирует рекомбинациазу Cre тетрациклин-зависимым образом. Потомство от этого скрещивания экспрессирует тетрациклиновую (или доксициклин)-активированную Cre рекомбиназу, специфичную для Pax8-экспрессирующих эпителиальных клеток матки (трансактиватор Pax8-Cre). (C) Мышей Arid1a flox/flox на фоне 129S1 скрещивали с Pten flox/flox на фоне BALB/C (штамм C;129S4-Ptentm1Hwu/J) для получения мыши-трансреспондера Arid1a flox/flox/Ptenflox/flox. (D) Мышь-трансактиватор Pax8-Cre скрещена с мышью-трансреспондером Arid1a flox/flox/ptenflox/flox. Потомство от этого скрещивания приводит к трансгенной мышиной модели с индуцируемой доксициклином делецией Arid1a и Pten (iPAD), специфичной для эпителиальных клеток матки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процедура визуализации . (A) Мышь, находящаяся под наркозом, с удалением брюшной и спинной шерсти с помощью машинки для стрижки и крема для депиляции. Мышь поддерживается на ингаляционной изофлурановой анестезии через носовой конус и помещается на грелку, покрытую абсорбирующей прокладкой. (B) Небольшое количество предварительно нагретого ультразвукового геля помещают на интересующую область мыши и на зонд. Здесь мышь находится в вентральном лежачем положении, и зонд правильно размещен, чтобы найти почку, анатомический ориентир непосредственно краниально к яичнику. (C) В спинном лежачем положении зондом можно манипулировать вручную, чтобы сначала найти ориентиры, такие как мочевой пузырь, чтобы найти приблизительное расположение рогов матки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Улучшение видимости и определения органов путем инъекции физиологического раствора. (A) Изображение почки и петель желудочно-кишечного тракта (внизу слева) перед инъекцией IP 1,5 мл подогретого стерильного физиологического раствора. Левая сторона снимка находится в черепе по отношению к почке. (B) Изображение почки после инъекции физиологического раствора, показывающее увеличение (гипоэхогенное пространство, черный) между органами. Для обоих изображений, с точки зрения ориентации, мышь находится дорсальной поверхностью вверх, а краниально-каудальная — слева направо. (С,Д) Выделенная красным цветом область показывает ориентиры почек на 2D-изображениях, представленных в A и B. Изображения были сделаны с помощью датчика MS550. Масштабные линейки = 2 мм на каждом изображении. Сокращения: желудочно-кишечный тракт = желудочно-кишечный тракт; IP = внутрибрюшинный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репродуктивный тракт с ориентирами . (А) Яичник (стрелка) расположен непосредственно каудально к каудальному полюсу почки. (B) Рог матки (узкая стрелка) глубокий и начинается краниально к спинным мышцам проксимальной задней конечности (наконечник стрелы), при этом яичник также виден (большая стрелка). Масштабные линейки = 2 мм. Для всех изображений, с точки зрения ориентации, мышь находится спинной поверхностью вверх, а краниально-каудальная — слева направо. Изображения были сделаны с помощью датчика MS550. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Рога матки и мочевой пузырь, полученные из спинного лежачего положения. Ультразвуковые снимки двух мышей до индукции рака. (A) Просвет мочевого пузыря виден как гипоэхогенная яйцевидная структура с гиперэхогенной слизистой оболочкой. Оба рога матки видны вместе, границы каждого из них прочерчены светло-голубым цветом. (B) Тот же вид у другой мыши с гораздо более полным мочевым пузырем. Для обоих изображений, с точки зрения ориентации, мышь находится вентральной поверхностью вверх, а изображение слева - это мышь слева. Границы каждого рога матки нарисованы светло-голубым цветом, с областями, указанными в соседних текстовых полях (датчик MS550). Масштабные линейки = 3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Примеры H&E и иммуногистохимии срезов матки через 6 недель после индукции у мыши iPAD. (A) Репрезентативная H&E ткани матки мыши iPAD. (B) Репрезентативная иммуногистохимия ARID1a. Окрашивание показывает потерю Arid1a, специфичного для ядер Pax8-экспрессирующих эпителиальных клеток матки (черная стрелка), с удержанием Arid1a в ядрах стромальных клеток матки (белая стрелка). (C) Репрезентативная иммуногистохимия pTEN. Окрашивание показывает потерю pTEN в цитоплазме Pax 8-экспрессирующих эпителиальных клеток матки (черная стрелка), с удержанием pTEN в цитоплазме стромальных клеток матки (белая стрелка). Подробные методы ИГХ были ранее опубликованы14. Масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: iPAD = индуцируемый Pten, двойное удаление Arid1a; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Примеры ультразвуковых изображений мышей с ранними изменениями патологии. (А, Б) Предсмертное ультразвуковое изображение матки, заполненной маточной жидкостью, которая является естественно гиперэхогенной Узкие стрелки указывают на гипоэхогенный, расширенный просвет матки. Наконечник стрелки указывает на утолщенный участок маточной стенки. (C) Общее изображение всей матки от мыши, изображенной в B. Белая звездочка находится примерно в том же месте, что и на изображении A. (D) У этой же мыши матка была обработана и окрашена H&E. Гистологический срез показывает утолщение стенки матки из-за гиперплазии эндометрия; Область примера обозначена стрелкой. Для всех изображений США, с точки зрения ориентации, мышь находится дорсальной поверхностью вверх, а краниально-каудальная — слева направо (датчик MS550). Масштабные линейки = (A,B) 3 мм; (D) 500 мкм. Сокращения: УЗИ = УЗИ; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Разнообразие патологии матки, видимое на УЗИ . (А) Матка с гиперплазией и растяжением жидкости, вызывающей расширение просвета до диаметра ~2,5 мм. (Б) Вторая матка с гиперплазией, которая в большей степени растянута. (C) Матка, которая одновременно расширена и заполнена массой мягких тканей. Масштабные линейки = 3 мм. На всех изображениях стрелки направлены на вентральную сторону рога матки, а с точки зрения ориентации изображения мышь находится дорсальной поверхностью вверх, а краниально-каудальная — слева направо (датчик MS550). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Изменения опухолевого развития матки с течением времени у одной мыши. (A) Ультразвуковое изображение мыши iPAD, показывающее почку (более широкая стрелка), яичник (каудально по отношению к почке) и матку (узкая стрелка), при этом также видна мышца ноги (наконечник стрелки), снятый в три момента времени: после того, как мышь была переведена на диету с доксициклином (неделя 0), а затем снова через 5 недель и 6 недель. Доксициклин индуцировал экспрессию Cre с потерей опухолевого супрессора, что со временем способствует раку эндометрия. (B) Те же ультразвуковые изображения, что и А, но с рогом матки, выделенным красным цветом. (C) Грубые изображения матки in situ (узкая стрелка) за 6 недель; Ткань просматривается с вентральной поверхности. (D) та же матка, что и в С, рассеченная ex vivo; Ткань просматривается с вентральной поверхности. (E) Гистология маточной массы (окрашивание H&E), указывающая на аденокарциному из этого примера. Для A и B, с точки зрения ориентации, мышь находится дорсальной поверхностью вверх, а краниально-каудальная — слева направо (датчик MS550). Масштабные линейки = (A, B, первые два изображения в каждой строке) 1 мм; (A,B, третье изображение) 2 мм; (E) 500 мкм. Сокращения: iPAD = индуцируемый Pten, двойное удаление Arid1a; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе исследуется полезность ультразвука для оценки морфологических изменений матки при прогрессировании аденокарциномы в матке у мышей. В этом исследовании, проследив за индукцией рака эндометрия у мышей в продольном направлении, анатомические детали, обнаруженные с помощью ультразвука, оказались индикаторами грубой и гистологической патологии. Это открывает двери для использования лонгитюдных исследований с меньшим количеством мышей, контролируемых ультразвуком в несколько временных точек, чтобы следить за прогрессированием рака матки у мышей. Это продольное обнаружение было выполнено с помощью ручного зонда и без использования ультразвукового оборудования рельсовой системы. Используемые высокочастотные датчики (преобразователи) широко доступны, что делает этот подход воспроизводимым во многих учреждениях по всему миру. Критические шаги в протоколе включают использование правильного зонда для уровня разрешения, необходимого для эксперимента, и подготовку мыши к визуализации перед ультразвуком.
Важнейшими шагами в подготовке мыши являются удаление всех волос из исследуемых областей и введение жидкости в брюшную полость. Мех, оставшийся на коже, может привести к улавливанию пузырьков в ультразвуковом геле, что может привести к появлению артефактов на изображениях; Следовательно, следует позаботиться о том, чтобы волосы равномерно удалялись по исследуемой области. В качестве метода удаления волос был выбран крем для депиляции, так как он равномерно удаляет шерсть по коже. Травмирование кожи может произойти, если крем оставить на коже на чрезмерное количество времени (>3-4 мин). У мышей, более чувствительных к крему для депиляции, крем следует оставлять на коже только на 1-2 минуты, чтобы удалить волосы. Далее мышь следует протереть серией влажных бумажных полотенец, чтобы полностью удалить крем. После того, как все волосы были удалены из исследуемой области, стерильные теплые изотонические жидкости вводятся во внутрибрюшинную полость, чтобы увеличить контраст и помочь в определении границ органов брюшной полости. В этом исследовании инъекции 1-2 мл жидкости было достаточно для дифференциации яичников, яйцевода и рогов матки. Жидкость постепенно всасывается, и лучше всего вводить ее непосредственно перед визуализацией. Мыши быстро переохлаждаются под изофлурановой анестезией. Этого можно избежать, вводя теплый физиологический раствор (хранящийся в шприцах на грелке), а также помещая мышь на грелку и предварительно нагревая ультразвуковой гель, когда это возможно. Сеансы визуализации с опытными сонографистами проходят со скоростью 5-10 минут на мышь, и за это короткое время значительного переохлаждения не произошло. При необходимости в брюшную полость можно ввести дополнительно до 2 мл физиологического раствора для большего разделения органов.
Методы, описанные здесь, предназначены для того, чтобы их можно было легко воспроизвести без специального оборудования, кроме ультразвукового аппарата и датчика (зондов). В представленном способе зондом манипулируют вручную без помощи рельсовой системы. Этот ручной метод быстрее и обеспечивает большую гибкость в углах и давлении, применяемых для выделения мелких элементов. Ручное направление зондов через брюшную полость и использование датчиков с более низким разрешением может ограничить качество любых отдельных изображений, полученных по сравнению с изображениями, полученными от датчика, закрепленного на рельсовой системе4. Рельсовая система была бы полезна для инъекций в матку (в плоды) или внутрисердечных инъекций, когда требуется большая стабильность. Тем не менее, существует компромисс в отношении минимального времени манипуляции и повышения доступности для широкого круга учреждений, в которых отсутствует специализированное ультразвуковое оборудование. Успех этого упрощенного метода иллюстрирует, как ультразвук может быть использован для целого ряда исследований. Предлагаемый метод хорошо подходит для захвата продольных изменений тканей в моделях рака матки без необходимости использования специального оборудования и может быть применен к другим моделям прогрессирующих заболеваний. Ручные манипуляции с мышами во время визуализации могут увеличить вариабельность точной глубины и расположения тканей, но для исследований, не полагающихся на эти факторы, качество изображения достаточно для выявления патологических изменений.
Важно сохранять видео во время съемки; Позже на рабочей станции пользователя видео может быть остановлено на любом кадре, представляющем анатомию, которую необходимо захватить и измерить. Можно измерить изображения органов (диаметр, окружность или длина) (рис. 5, измерено поперечное сечение рога матки) и рассчитать площадь опухоли. Видео в большей степени, чем отдельные кадры, облегчают идентификацию органов в более широком анатомическом контексте. Видео также полезно для определения движения тонкого и толстого кишечника, что может помочь дифференцировать кишечник от матки. Получение высококачественных изображений также зависит от знакомства с анатомией мыши. Для визуализации подвижной матки по сравнению с визуализацией более неподвижных тканей (например, имплантированной опухоли ксенотрансплантата, яичников) использование ручного метода имеет преимущество сканирования и отслеживания рогов матки от проксимального до дистального. Во время сканирования можно использовать постепенную регулировку углов наклона руки, чтобы следовать за рупором. Зонд MS550 использовался для всех изображений в этом исследовании и предпочтительнее для матки по сравнению с датчиком MS700 с более высоким разрешением, который лучше подходит для яичников. Недавно была опубликована работа с использованием MS700 для визуализации щитовидной железы мыши, демонстрирующая высокое разрешение, которое возможно в других тканях15. Визуализация с помощью ручного зонда полезна из-за различной степени глубины ткани матки между яичником и мочевым пузырем. В этой работе перемещение между легко узнаваемыми анатомическими ориентирами, такими как почка и анатомия проксимального отдела задних конечностей, помогло получить сопоставимые изображения в разные моменты времени при визуализации матки с дорсальной стороны тела.
Этот ультразвуковой метод высокого разрешения для отслеживания анатомических изменений в матке с течением времени во время онкогенеза превосходит современные методы, которые включают эвтаназию животных из нескольких когорт в разные моменты времени. Ультразвук уточняет модель и уменьшает количество мышей, необходимых для эксперимента, тем самым сокращая затраты и время. Важно отметить, что этот метод позволяет отслеживать прогрессирование заболевания на индивидуальном уровне, что может привести к пониманию, которое маскируется в исследованиях, зависящих от когорт, принесенных в жертву временным моментом, а не стадией заболевания. Благодаря своей неинвазивной природе ультразвуковое исследование мышей имеет множество потенциальных применений для исследований рака матки или яичников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны за финансирование со стороны программы SPORE рака яичников NCI P50CA228991, программы постдокторской подготовки 5T32OD011089 и Фонда Ричарда В. Телинде Университета Джона Хопкинса. Проект также частично финансировался за счет субсидий на текущие расходы частным высшим учебным заведениям от Корпорации содействия и взаимопомощи частным школам Японии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
