Summary
Ce protocole décrit une méthode de surveillance de la progression des changements morphologiques au fil du temps dans l’utérus dans un modèle murin inductible de cancer de l’endomètre utilisant l’imagerie par ultrasons avec corrélation avec les changements macroscopiques et histologiques.
Abstract
Les cancers de l’utérus peuvent être étudiés chez la souris en raison de la facilité de manipulation et de manipulation génétique dans ces modèles. Cependant, ces études se limitent souvent à l’évaluation de la pathologie post-mortem chez les animaux euthanasiés à plusieurs moments dans différentes cohortes, ce qui augmente le nombre de souris nécessaires pour une étude. L’imagerie des souris dans les études longitudinales peut suivre la progression de la maladie chez des animaux individuels, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Les progrès de la technologie des ultrasons ont permis de détecter des changements au niveau micrométrique dans les tissus. L’échographie a été utilisée pour étudier la maturation des follicules dans les ovaires et la croissance de la xénogreffe, mais n’a pas été appliquée aux changements morphologiques dans l’utérus de la souris. Ce protocole examine la juxtaposition de la pathologie avec des comparaisons d’imagerie in vivo dans un modèle murin de cancer de l’endomètre induit. Les caractéristiques observées par échographie correspondaient au degré de changement observé par la pathologie macroscopique et l’histologie. L’échographie s’est avérée hautement prédictive de la pathologie observée, soutenant l’incorporation de l’échographie dans les études longitudinales des maladies utérines telles que le cancer chez la souris.
Introduction
Les souris restent l’un des modèles animaux les plus importants pour les troubles de la reproduction 1,2,3. Il existe plusieurs modèles génétiquement modifiés ou induits de rongeurs de cancers de l’ovaire et de l’utérus. Ces études reposent généralement sur plusieurs cohortes euthanasiées à différents moments pour saisir les tendances longitudinales des changements morphologiques et pathologiques. Cela empêche la capacité d’acquérir des données continues sur le développement du cancer chez une souris individuelle. De plus, sans connaître l’état de progression de la maladie chez la souris, les études d’intervention sont basées sur des points temporels prédéterminés et des résultats moyens des cohortes précédentes plutôt que sur des seuils individuels pour la détection de la progression chez un animal spécifique 4,5. Par conséquent, des approches d’imagerie qui permettent une évaluation longitudinale chez des animaux vivants sont nécessaires pour faciliter les modèles précliniques permettant de tester de nouveaux médicaments ou composés et accélérer la compréhension de la pathobiologie tout en augmentant la rigueur et la reproductibilité6.
L’imagerie par ultrasons (US) est une méthode intéressante pour la surveillance longitudinale de la progression du cancer de l’utérus chez la souris, car elle est relativement facile et peu coûteuse par rapport aux autres méthodes d’imagerie, est facile à réaliser et peut avoir une résolution remarquable 6,7. Cette modalité non invasive peut capturer des caractéristiques à l’échelle du micron chez des souris éveillées ou avec des souris sous sédation brève à l’aide d’un examen de 5 à 10 minutes. La microscopie à ultrasons a été validée comme méthode pour mesurer le développement du follicule ovarien de souris 8 et la croissance de la néoplasie implantée ou induite 9,10,11. L’échographie à haute fréquence a également été utilisée pour les injections intra-utérines percutanées12 et l’observation des changements utérins chez le rat au cours du cycle œstruel13. Les États-Unis à haute fréquence peuvent être utilisés avec des souris maintenues sur des plates-formes fixes spécialisées à l’aide d’un système de rail pour maintenir le transducteur / sonde afin de capturer des images haute résolution avec une position et une pression normalisées; toutefois, cet équipement n’est pas disponible dans tous les établissements. Les méthodes de balayage de transducteurs portatifs peuvent être adoptées avec moins d’équipement dédié et utilisées à la fois pour le diagnostic clinique et les applications de recherche chez la souris.
La question demeure de savoir si l’imagerie américaine avec des sondes portatives à haute fréquence pourrait être utilisée pour surveiller le développement du cancer de l’utérus sur plusieurs semaines. Semblable aux intestins, l’utérus de rongeur est une structure mince à paroi mince qui est très mobile dans l’abdomen et est contiguë à travers plusieurs profondeurs de tissus, ce qui rend l’imagerie plus difficile qu’avec des organes relativement immobiles tels que les reins. Cette étude visait à établir la corrélation entre les tissus observés par échographie et histopathologie, à définir des points de repère pour localiser l’utérus de souris et à déterminer la faisabilité de l’évaluation longitudinale du cancer de l’endomètre. Cette étude présente des données montrant une correspondance qualitative entre l’apparition de l’utérus imagé par US et l’histopathologie, ainsi que l’imagerie en série de souris sur plusieurs semaines. Ces résultats indiquent que les soins intensifs portatifs peuvent être utilisés pour surveiller le développement du cancer de l’endomètre chez la souris, créant ainsi une opportunité de collecter des données longitudinales individuelles sur des souris pour étudier le cancer de l’utérus sans avoir besoin d’équipement dédié.
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Protocol
Toutes les procédures et expériences impliquant des souris ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le comité de soin et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins. Pour toutes les procédures, l’EPI approprié a été porté, y compris des gants et des blouses d’isolement jetables. Des précautions ont été prises lors de la manipulation des objets tranchants, qui ont été éliminés de façon appropriée dans des contenants d’objets pointus ou tranchants de la boîte rouge immédiatement après utilisation. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et équipements utilisés dans ce protocole.
1. Induction du cancer de l’endomètre chez des souris iPAD (Inductible Pten, Arid1a double deletion) avec de la doxycycline
- Maintenir 10 souris transgéniques Pax8-Cre-Arid1a-Pten à double délétion (iPAD) (Figure 1) sur un fond génétique mixte (129S, BALB/C, C57BL/6), comme décrit précédemment14.
- Recueillir des images échographiques (2D) de base des ovaires, de l’oviducte et de l’utérus de chaque souris avant le traitement à la doxycycline.
- Fournir exclusivement des régimes de chow de souris contenant de la doxycycline (hyclate de doxycycline à 625 mg / kg d’aliment) aux souris iPAD femelles pendant au moins 2 semaines à partir de 7-8 semaines pour induire la délétion des gènes.
2. Configuration de l’équipement
- Allumez le coussin chauffant et recouvrez-le d’un tampon absorbant propre (température cible : 38 °C).
- Confirmez que le vaporisateur d’isoflurane et le réservoir d’O2 sont correctement remplis. Remplissez et remplacez si le contenu est faible.
- Connectez la chambre à induction, le cône de nez et le système de récupération au vaporisateur.
- Installez l’appareil à ultrasons.
- Choisissez un transducteur (sonde) avec une plage de 32-56 MHz ou jusqu’à 70 MHz pour l’imagerie de l’utérus ou de l’ovaire, respectivement.
- Fixez la sonde et mettez la machine sous tension.
- Après le démarrage du système, utilisez le panneau de configuration pour vous connecter avec les informations d’identification de l’utilisateur et accéder à l’écran d’accueil.
- À partir de l’écran d’accueil, accédez à l’onglet Applications et sélectionnez Mode abdomen (petit) de la souris.
- Cliquez sur Numériser pour revenir à l’écran d’accueil et attendez qu’une image en direct s’affiche.
- Sélectionnez B-Mode dans les options de la barre d’outils de gauche.
- Cliquez sur Plus de commandes pour afficher des outils supplémentaires pour affiner l’image, tels que le gain et la profondeur de l’image, ou pour ajuster les paramètres d’acquisition de clip, tels que le nombre d’images par seconde.
- Une fois les paramètres d’image sélectionnés, revenez à l’écran d’accueil en cliquant sur Scan.
- Allumez le réservoir O2 , dirigez le débit vers la chambre d’induction et réglez le débit à 1 L/min.
3. Préparation des souris pour le dépistage par ultrasons, y compris l’épilation
- Placez une souris dans la chambre à induction. Réglez le vaporisateur d’isoflurane à 2%-3% vol/vol pour l’induction de l’anesthésie.
- Déterminer la profondeur appropriée de l’anesthésie par une absence de réponse au pincement des orteils et une fréquence respiratoire d’environ 1-2 respirations / s.
- Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur chaque œil. Retirez la fourrure du dos et du ventre entre la dernière côte et le bassin à l’aide d’une tondeuse de taille appropriée.
- Appliquez une fine couche de crème dépilatoire sur les régions ventrale et dorsale à imager (si nécessaire).
- Replacez la souris dans la chambre d’induction pendant environ 3 à 5 minutes pour maintenir la profondeur appropriée de l’anesthésie pendant que la crème dépilatoire élimine les poils. Après ≤4 minutes, essuyez doucement la crème avec une serviette en papier propre et humide.
REMARQUE: Une exposition prolongée à la crème dépilatoire est irritante et peut causer des lésions cutanées.
4. Injection intrapéritonéale de liquide pour augmenter le contraste entre les organes
- Réchauffer une seringue de 3 à 10 mL remplie d’une solution isotonique stérile (p. ex. NaCl stérile à 0,9 % ou solution de sonneurs lactatés) à 35-40 °C en la plaçant entre un coussin chauffant et un tampon absorbant pendant plusieurs minutes. Placez un flacon de gel à ultrasons sur le coussin chauffant si la machine n’a pas de chauffe-eau.
- Pour une souris de 20 à 25 g, injecter 1 à 2 mL de solution dans la cavité péritonéale.
- Fixez la souris par la peau dans une main, exposant le ventre.
- Tenez la souris à un angle de ~20°, avec le nez pointé vers le sol pour diriger les organes crâniennes en raison de la gravité.
- À l’aide d’une aiguille de petit calibre (25 G, 5/8 de longueur, seringue à tuberculine), ponctionner à travers la peau et la paroi abdominale du quadrant caudale droit de l’abdomen.
- Avant l’injection de liquides, pour éviter l’injection dans le système vasculaire ou le tractus gastro-intestinal, retirez avec une pression minimale. Si du sang ou un autre matériau pénètre dans la seringue, retirez l’aiguille. Utilisez une nouvelle aiguille et une nouvelle seringue, puis réessayez dans une position légèrement différente.
- Si la souris se réveille pendant les injections, replacez-la dans la petite chambre d’induction pour l’anesthésie avec 2% -3% vol/vol isoflurane.
5. Imagerie échographique à partir d’une approche dorsale
- Placez la souris en position couchée ventrale sur le tampon absorbant au-dessus d’un coussin chauffant (Figure 2A-C).
- Placez solidement un cône de nez de rongeur sur le nez et le museau de la souris. Maintenir la profondeur anesthésique avec de l’isoflurane délivré à travers le cône nasal à 1%-2% vol/vol dans 100% O2. Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile, au besoin, sur chaque œil.
- Surveillez la souris pour une fréquence respiratoire régulière (1-2 / s) et un manque de réponse de pincement des orteils pour indiquer si l’anesthésie doit être ajustée.
- Placez une petite quantité (~0,5-1 mL) de gel à ultrasons préchauffé abaxial (latéral) sur la colonne vertébrale de chaque côté de la souris anesthésiée, entre la dernière côte et le bassin.
- Mettez une petite quantité de gel sur la sonde à ultrasons.
- Placez la sonde parallèlement aux vertèbres avec l’avant de la sonde du côté crânien. Une marque indicatrice est présente sur la tête de sonde pour indiquer l’orientation correcte de la sonde. Notez le jour, l’heure, l’identification de l’animal, l’orientation de la sonde et le côté animal (droite, gauche, dorsale, ventrale) pour chaque nouvel ensemble d’images collectées.
- Avec une souris en position couchée ventrale (peau dorsale touchant la sonde), balayez lentement la zone à la recherche du repère rénal (Figure 2B et Figure 3). Avec le rein en vue, tirez la sonde caudale pour trouver l’ovaire - une structure ovale à ronde légèrement hyperéchogène (Figure 4A, B) dans un coussinet adipeux ovarien très hyperéchogène bordé crânio-ventralement par le rein et dorso-latéralement par la paroi abdominale dorsale.
REMARQUE: La pression caudale et latérale à l’ovaire peut diriger l’ovaire plus près de la paroi abdominale et loin des anses de l’intestin. L’ovaire est anatomiquement positionné contre la paroi abdominale dorsale, juste ventrale et latérale aux muscles épaxiaux et caudale au rein. - Ajustez le gain du signal à l’aide du curseur situé en bas de l’écran de contrôle pour améliorer le contraste de l’image.
- Pour améliorer l’imagerie du rein, appliquez une pression avec un doigt sur l’abdomen controlatéral. Variez la pression et l’angle directement parallèle à la colonne vertébrale à ~20° ventral.
- Une fois que l’organe d’intérêt est visible, collectez une vidéo en cliquant sur Enregistrer le clip ou Démarrer l’enregistrement, puis Arrêter l’enregistrement lorsque vous avez terminé pour conserver les images à un nombre prédéfini d’images.
- Enregistrez des images uniques à partir d’une image en direct ou d’un enregistrement à l’aide du bouton Enregistrer l’image .
- Pour imager l’utérus, tirez la sonde caudale jusqu’à ce que l’ovaire soit dans l’aspect le plus crânien du champ de vision. Faites varier la pression et l’angle de la sonde jusqu’à ce que l’utérus soit en vue.
- Répétez la collecte de vidéos et d’images pour chaque organe d’intérêt.
- Trouvez l’utérus longitudinal le long de la paroi abdominale dorsale avec la musculature latérale de la jambe également visible (Figure 4B).
REMARQUE: La taille de l’utérus et le diamètre de la lumière peuvent varier avec la phase d’oestrus et l’état de la maladie. - Surveillez le mouvement péristaltique du tissu pour différencier les anses intestinales des cornes stationnaires utérines.
6. Collectez des images à partir d’une approche ventrale
- Placez la souris en position couchée dorsale et vérifiez que la lubrification des yeux est suffisante et que le museau est bien ancré dans le cône nasal (Figure 2A).
- Appliquez une petite quantité (~0,5-1 mL) de gel à ultrasons préchauffé sur l’abdomen ventral et appliquez la sonde à la ligne médiane juste crânienne du pubis pour localiser la vessie comme point de repère hypoéchogène (Figure 5).
REMARQUE: Si la vessie est trop grande et obscurcit l’imagerie utérine, une légère pression peut être exercée sur le bas-ventre pour exprimer l’urine. - Tirez la sonde latéralement vers la vessie pour trouver les cornes utérines. Appliquez une légère pression numérique de l’un ou des deux côtés de la souris pour amener les cornes dans le champ de vision. Tenez la sonde perpendiculairement à la souris et balayez les deux côtés de l’abdomen pour capturer des vues transversales (coupes transversales) des deux cornes. Faites pivoter la sonde pour capturer des vues sagittales.
- Après l’échographie, essuyez la souris du gel avec une serviette en papier et remettez-la dans sa cage pour récupérer. Les souris sont complètement éveillées en 2-5 min. Une fois qu’elle est complètement éveillée et ambulatoire, ramenez la souris dans la salle des animaux.
REMARQUE: Un coussin chauffant à feu doux peut être placé sous la cage pour réchauffer la cage pour la récupération. - Au point final expérimental ou humain, euthanasier la souris. Idéalement, euthanasier la souris dans la cage domestique pour réduire le stress; Sinon, placez la souris dans une chambre propre. Délivrer du CO2 sous pression à un taux de déplacement de 10% à 30% du volume de la chambre par minute. Après environ 5 minutes sans respiration visible, vérifier la mort par luxation cervicale. Procéder à une nécropsie abdominale pour la récolte de tumeurs.
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Representative Results
Les souris transgéniques Pax8-Cre-Arid1a-Pten à double délétion (iPAD) ont été maintenues sur un fond génétique mixte (129S, BALB/C, C57BL/6), comme décrit précédemment14. Les souris ont toutes été nourries avec une alimentation en doxycycline pendant 2 semaines pour induire la Cre recombinase. Dans des travaux antérieurs de notre groupe, la doxycycline a été administrée par gavage14; Cependant, dans cette étude, la méthode d’induction de l’alimentation en doxycycline a fonctionné efficacement et a réduit le stress du gavage pour les souris. Il est important de vérifier que la méthode d’administration de la doxycycline est adéquate pour induire l’expression de la Cre recombinase nécessaire pour exciser l’ADN des suppresseurs de tumeurs (Arid1a et Pten) dans les cellules exprimant Pax8, telles que l’utérus. L’immunohistochimie avec des anticorps dirigés contre ARID1a et pTEN14 a été utilisée pour vérifier si une perte adéquate de protéines suppresseurs de tumeurs a été obtenue dans les cellules épithéliales utérines par rapport au tissu stromal voisin, comme le montre la figure 6. Le schéma du modèle murin et de la régulation de l’expression du suppresseur de tumeur est présenté à la figure 1.
Après 2 semaines de doxycycline, la taille de l’utérus n’a pas changé de manière significative par rapport aux témoins ou à la même souris imagée avant l’administration de doxycycline. Pourtant, au cours des 2 à 6 semaines suivant la doxycycline, l’échographie a montré que les souris développaient une gamme de pathologies utérines, commençant par une hyperplasie et progressant vers un adénocarcinome. La figure 7A,B représente des images américaines d’un utérus de souris présentant des changements pathologiques précoces observés après 3 semaines de traitement à la doxycycline. La figure 7C,D montre la pathologie macroscopique et l’histopathologie du même utérus imagé à la figure 7A,B après que la souris ait été euthanasiée immédiatement après l’imagerie à 3 semaines. L’utérus à paroi mince plus petit (mais dilaté) et l’hyperplasie précoce de l’endomètre avec préservation de la lumière distincte (liquide utérin hyperéchogène central) peuvent être observés. Chez les souris euthanasiées à des moments ultérieurs, l’utérus était beaucoup plus grand, avait une lumière plus petite et avait une paroi épaissie (Figure 8 et Figure 9). Des exemples de lumières dilatées et de changements subtils dans l’endomètre hyperplasique sont comparés à la croissance du tissu dense et du cancer nodulaire dans l’utérus dans les figures 8 et 9. L’échographie et les images brutes étaient très cohérentes les unes avec les autres pour toutes les souris représentées. La figure 9 présente plusieurs images de l’utérus de la même souris dans une étude de l’évolution temporelle et montre les changements morphologiques observés pendant 6 semaines au fur et à mesure que l’adénocarcinome se développait. La figure 5 présente une approche ventrale avec des coupes transversales des cornes utérines adjacentes à la vessie hypoéchogénique.
Pour améliorer le contraste dans l’abdomen, l’injection de solution saline dans la cavité abdominale directement avant l’imagerie a amélioré la visualisation des organes abdominaux, y compris l’utérus et les ovaires. La figure 3 montre des comparaisons échographiques de la même souris avant et après l’injection de 1 mL de solution saline. Avec la solution saline, il y avait un espace hypoéchogène accru (noir) entre les organes, ce qui permettait aux reins, aux coussinets adipeux, aux ovaires, aux cornes utérines, aux intestins et à la rate d’être plus facilement individualisés les uns des autres. Dans toutes les autres figures présentées ici, des injections de solution saline ont été effectuées avant l’imagerie pour améliorer la clarté de l’image.
Pris ensemble, ce protocole montre que ce modèle murin inductible développe un adénocarcinome sur une période de 6 semaines et peut être surveillé par échographie pour établir une base de référence et observer les changements morphologiques dans l’utérus à mesure que le cancer se développe. Ici, il est démontré que l’échographie non invasive permet d’évaluer en série les cornes utérines d’une souris sur plusieurs semaines avec des images prédictives des changements pathologiques utérins réels.
Figure 1 : Stratégie de génération des souris transgéniques double KO inductibles par Pax8-Cre. (A) La production constitutive d’un transactivateur inverse contrôlé par la tétracycline (rtTA) dans les cellules épithéliales utérines exprimant Pax8 entraîne l’activation inductible de la Cre recombinase en présence de tétracycline, ou de son analogue doxycycline, en se liant aux éléments de réponse à la tétracycline (TRE). Les sites flox situés en amont et en aval de l’exon 8 (Arid1a) et de l’exon 5 (Pten) sont ciblés par Cre recombinase. La délétion ciblée Cre-targeted de l’exon 8 dans Arid1a entraîne une mutation de décalage de trame et un codon stop précoce (p.Gly809Hisfs*6). La délétion ciblée par Cre-target de l’exon 5 dans Pten entraîne une mutation de décalage de trame (p.Val85Glyfs*14). (B) La souris Pax8-rtTA exprime un transactivateur inverse contrôlé par tétracycline (rtTA) sous le contrôle du promoteur Pax8. Cette souris est croisée avec la souris TetO-Cre qui exprime la Cre recombinase d’une manière dépendante de la tétracycline. La descendance issue de ce croisement exprime une recombinase Cre activée par la tétracycline (ou la doxycycline) spécifique aux cellules épithéliales utérines exprimant Pax8 (transactivateur Pax8-Cre). (C) Les souris Arid1a flox/flox sur le fond 129S1 ont été croisées avec Pten flox/flox sur le fond BALB/C (souche C;129S4-Ptentm1Hwu/J) pour générer la souris transrépondrice Arid1aflox/flox/Pten flox/flox. (D) La souris transactivatrice Pax8-Cre est croisée avec une souris transrépondeur Arid1a flox/flox/Pten flox/flox. La descendance issue de ce croisement aboutit à un modèle murin transgénique avec une délétion Arid1a et Pten inductible par la doxycycline (iPAD) spécifique aux cellules épithéliales utérines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Procédure d’imagerie. (A) Une souris anesthésiée avec la fourrure abdominale et dorsale enlevée avec une tondeuse et une crème dépilatoire. La souris est maintenue sous anesthésie à l’isoflurane inhalée via un cône nasal et placée sur un coussin chauffant recouvert d’un tampon absorbant. (B) Une petite quantité de gel à ultrasons préchauffé est placée sur la région d’intérêt sur la souris et sur la sonde. Ici, la souris est en position couchée ventrale, et la sonde est correctement placée pour localiser le rein, le repère anatomique directement crânien à l’ovaire. (C) Dans la position couchée dorsale, la sonde peut être manipulée manuellement pour trouver d’abord des points de repère tels que la vessie afin de trouver l’emplacement approximatif des cornes utérines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Amélioration de la visibilité et de la définition des organes par injection de solution saline. (A) Image d’un rein et de boucles du tractus gastro-intestinal (en bas à gauche) avant l’injection IP de 1,5 mL de solution saline stérile chauffée. Le côté gauche de l’image est crânien par rapport au rein. (B) Image du rein après l’injection de solution saline, montrant une augmentation (espace hypoéchogénique, noir) entre les organes. Pour les deux images, en termes d’orientation, la souris est la surface dorsale vers le haut, et crânienne à caudale est de gauche à droite. (C, D) La section rouge surlignée montre les repères des reins dans les images 2D présentées en A et B. Les images ont été prises à l’aide d’un transducteur MS550. Barres d’échelle = 2 mm dans chaque image. Abréviations : tractus gastro-intestinal = tractus gastro-intestinal; IP = intrapéritonéale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Appareil reproducteur avec repères. (A) L’ovaire (flèche) est situé immédiatement du pôle caudale au pôle caudal du rein. (B) La corne utérine (flèche étroite) est profonde et commence crânienne jusqu’aux muscles dorsaux du membre postérieur proximal (pointe de flèche), avec l’ovaire également visible (flèche plus grande). Barres d’échelle = 2 mm. Pour toutes les images, en termes d’orientation, la souris est la surface dorsale vers le haut, et crânienne à caudale est de gauche à droite. Les images ont été prises à l’aide d’un transducteur MS550. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Cornes utérines et vessie imagées à partir de la position couchée dorsale. Images échographiques de deux souris avant l’induction du cancer. (A) La lumière de la vessie est visible comme une structure ovoïde hypoéchogène avec une muqueuse hyperéchogénique. Les deux cornes utérines sont visibles ensemble, les limites de chacune étant tracées en bleu clair. (B) La même vue chez une autre souris avec une vessie beaucoup plus pleine. Pour les deux images, en termes d’orientation, la souris est la surface ventrale vers le haut, et l’image de gauche est la souris de gauche. Les limites de chaque corne utérine sont dessinées en bleu clair, avec des zones indiquées dans les zones de texte voisines (transducteur MS550). Barres d’échelle = 3 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Exemples de H&E et d’immunohistochimie de coupes d’utérus 6 semaines après l’induction chez une souris iPAD. (A) TH & E représentatif du tissu utérin de souris iPAD. (B) Immunohistochimie ARID1a représentative. La coloration montre une perte d’Arid1a spécifique aux noyaux des cellules épithéliales utérines exprimant Pax8 (flèche noire), avec rétention d’Arid1a dans les noyaux des cellules stromales utérines (flèche blanche). (C) Immunohistochimie représentative des TEN. La coloration montre une perte de pTEN dans le cytoplasme des cellules épithéliales utérines exprimant Pax 8 (flèche noire), avec rétention de pTEN dans le cytoplasme des cellules stromales utérines (flèche blanche). Des méthodes détaillées de l’IHC ont déjà été publiées14. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : iPAD = Pten inductible, double délétion Arid1a; H & E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Exemples d’images échographiques de souris présentant des changements précoces de pathologie. (A,B) Image échographique ante mortem d’un utérus rempli de liquide utérin naturellement hyperéchogène Les flèches étroites indiquent la lumière hypoéchogène et dilatée de l’utérus. La pointe de flèche indique la zone épaissie de la paroi utérine. (C) Image brute de l’utérus entier de la souris imagée en B. L’astérisque blanc est à peu près au même endroit que celui illustré en A. (D) Chez cette même souris, l’utérus a été traité et coloré avec H & E. La section histologique montre un épaississement de la paroi utérine dû à l’hyperplasie de l’endomètre; L’exemple de région est indiqué par une pointe de flèche. Pour toutes les images américaines, en termes d’orientation, la souris est de la surface dorsale vers le haut, et crânienne à caudale est de gauche à droite (transducteur MS550). Barres d’échelle = (A,B) 3 mm; D) 500 μm. Abréviations : US = échographie; H & E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Diversité des pathologies utérines visibles par échographie. (A) Un utérus avec hyperplasie et distension des fluides provoquant une dilatation luminale à un diamètre de ~2,5 mm. (B) Un deuxième utérus avec hyperplasie qui est distendue à un degré plus élevé. (C) Un utérus qui est à la fois dilaté et rempli d’une masse de tissus mous. Barres d’échelle = 3 mm. Pour toutes les images, les flèches sont vers le côté ventral de la corne utérine, et en termes d’orientation de l’image, la souris est la surface dorsale vers le haut, et crânienne à caudale est de gauche à droite (transducteur MS550). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Changements dans le développement néoplasique de l’utérus au fil du temps chez une souris. (A) Image échographique d’une souris iPAD montrant le rein (flèche plus large), l’ovaire (caudale au rein) et l’utérus (flèche étroite), avec le muscle de la jambe également visible (pointe de flèche), capturée à trois moments : après que la souris a commencé un régime à base de doxycycline (semaine 0), puis à nouveau après 5 semaines et 6 semaines. La doxycycline a induit l’expression de Cre avec perte de suppresseur de tumeur, ce qui favorise le cancer de l’endomètre au fil du temps. (B) Les mêmes images échographiques que A mais avec la corne utérine surlignée en rouge. (C) Images brutes de l’utérus in situ (flèche étroite) à partir du point de 6 semaines; Le tissu est vu de la surface ventrale. (D) Le même utérus que dans C disséqué ex vivo; Le tissu est vu de la surface ventrale. (E) Histologie de la masse utérine (coloration H&E), indiquant un adénocarcinome à partir de cet exemple. Pour A et B, en termes d’orientation, la souris est la surface dorsale vers le haut, et crânienne à caudale est de gauche à droite (transducteur MS550). Barres d’échelle = (A,B, les deux premières images de chaque rangée) 1 mm; (A,B, troisième image) 2 mm; E) 500 μm. Abréviations : iPAD = Pten inductible, double délétion Arid1a; H & E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole examine l’utilité de l’échographie pour évaluer les changements morphologiques utérins dans la progression de l’adénocarcinome dans l’utérus chez la souris. Dans cette étude, en suivant longitudinalement l’induction du cancer de l’endomètre chez la souris, les détails anatomiques détectés par échographie se sont révélés être des indicateurs de pathologie macroscopique et histologique. Cela ouvre la porte à l’utilisation d’études longitudinales avec un plus petit nombre de souris surveillées par ultrasons à plusieurs moments pour suivre la progression des cancers de l’utérus chez la souris. Cette détection longitudinale a été réalisée à l’aide d’une sonde portative et sans l’utilisation d’un système d’échographie ferroviaire. Les sondes haute fréquence (transducteurs) utilisées sont largement disponibles, ce qui rend cette approche reproductible dans plusieurs institutions dans le monde. Les étapes critiques du protocole comprennent l’utilisation de la sonde correcte pour le niveau de résolution requis pour l’expérience et la préparation de la souris pour l’imagerie avant l’échographie.
Les étapes critiques de la préparation de la souris consistent à retirer tous les poils des zones d’étude et à injecter du liquide dans la cavité péritonéale. La fourrure laissée sur la peau peut entraîner le piégeage de bulles dans le gel à ultrasons, ce qui peut produire des artefacts dans les images; Par conséquent, il faut prendre soin d’enlever les poils uniformément sur la zone d’étude. La crème dépilatoire a été choisie comme méthode d’épilation car elle enlève la fourrure uniformément sur la peau. Des blessures à la peau peuvent survenir si la crème est laissée sur la peau pendant une durée excessive (>3-4 min). Chez les souris plus sensibles à la crème dépilatoire, la crème ne doit être laissée sur la peau que pendant 1-2 minutes pour enlever les poils. Ensuite, la souris doit être essuyée avec une série de serviettes en papier humides pour éliminer complètement la crème. Une fois que tous les poils ont été retirés de la zone d’étude, des liquides isotoniques stériles et chauds sont injectés dans la cavité intrapéritonéale pour augmenter le contraste et aider à définir les limites des organes abdominaux. Dans cette étude, l’injection de 1 à 2 mL de liquide était suffisante pour différencier l’ovaire, l’oviducte et les cornes utérines. Le liquide est progressivement absorbé et il est préférable de l’injecter immédiatement avant l’imagerie. Les souris deviennent rapidement hypothermiques sous anesthésie à l’isoflurane. Cela peut être évité en injectant une solution saline chaude (stockée dans des seringues sur un coussin chauffant) et en positionnant également la souris sur un coussin chauffant et en préchauffant le gel à ultrasons lorsque cela est possible. Les séances d’imagerie avec des échographistes expérimentés durent 5 à 10 minutes par souris, et avec ce court laps de temps, une hypothermie significative ne s’est pas produite. Si nécessaire, jusqu’à 2 mL supplémentaires de solution saline peuvent être injectés dans l’abdomen pour une plus grande séparation des organes.
Les méthodes décrites ici sont destinées à être facilement reproductibles sans équipement spécialisé autre que l’appareil à ultrasons et les sondes. Dans la méthode présentée, la sonde est manipulée manuellement sans l’aide d’un système ferroviaire. Cette méthode manuelle est plus rapide et offre une grande flexibilité dans les angles et la pression appliqués pour mettre en évidence les petites caractéristiques. La direction manuelle des sondes sur l’abdomen et l’utilisation de transducteurs à faible résolution pourraient limiter la qualité des images individuelles acquises par rapport aux images d’un transducteur fixé sur le système de rails4. Un système de rail serait utile pour les injections dans l’utérus (chez les fœtus) ou les injections intracardiaques lorsqu’une plus grande stabilité est nécessaire. Cependant, il y a un compromis à faire en ce qui concerne le temps de manipulation minimal et l’accessibilité accrue pour le large éventail d’établissements qui ne disposent pas d’installations d’échographie spécialisées. Le succès de cette méthode simplifiée illustre comment les ultrasons peuvent être utilisés pour une gamme d’études. La méthode proposée est bien adaptée pour saisir les changements tissulaires longitudinaux dans les modèles de cancer de l’utérus sans nécessiter d’équipement dédié et pourrait être appliquée à d’autres modèles de maladies progressives. La manipulation manuelle des souris pendant l’imagerie peut augmenter la variabilité de la profondeur et de l’emplacement exacts des tissus, mais pour les études ne reposant pas sur ces facteurs, la qualité de l’image est suffisante pour détecter les changements pathologiques.
Il est important d’enregistrer les vidéos pendant l’imagerie; Plus tard, sur le poste de travail de l’utilisateur, les vidéos peuvent être arrêtées à n’importe quelle image représentative de l’anatomie qui doit être capturée et mesurée. Les images des organes peuvent être mesurées (diamètre, circonférence ou longueur) (Figure 5, section transversale de la corne utérine mesurée), et la zone tumorale peut être calculée. Les vidéos, plus que les images uniques, facilitent l’identification des organes dans un contexte anatomique plus large. Les vidéos sont également utiles pour déterminer le mouvement de l’intestin grêle et du gros intestin, ce qui peut aider à différencier les intestins de l’utérus. L’obtention d’images de haute qualité dépend également de la familiarité avec l’anatomie de la souris. Pour l’imagerie de l’utérus mobile par rapport à l’imagerie de tissus plus stationnaires (par exemple, une tumeur xénogreffée implantée, ovaires), l’utilisation de la méthode manuelle présente l’avantage de scanner et de suivre les cornes utérines de proximale à distale. Pendant la numérisation, un ajustement progressif des angles de la main peut être utilisé pour suivre le klaxon. La sonde MS550 a été utilisée pour toute l’imagerie de cette étude et est préférable pour l’utérus par rapport à la sonde MS700 à plus haute résolution, qui est meilleure pour les ovaires. Des travaux utilisant le MS700 pour imager la thyroïde de la souris ont récemment été publiés, mettant en évidence la haute résolution possible dans d’autres tissus15. L’imagerie par sonde portative est utile en raison des différents degrés de profondeur tissulaire de l’utérus entre l’ovaire et la vessie. Dans ce travail, le déplacement entre des repères anatomiques facilement reconnaissables, tels que le rein et l’anatomie proximale des membres postérieurs, a aidé à capturer des images comparables à différents moments lors de l’imagerie de l’utérus de l’aspect dorsal sur le corps.
Cette méthode d’échographie à haute résolution pour suivre les changements anatomiques dans l’utérus au fil du temps au cours de la tumorigenèse est supérieure aux méthodes actuelles qui impliquent l’euthanasie d’animaux de plusieurs cohortes à différents moments. Les ultrasons affinent le modèle et réduisent le nombre de souris nécessaires à l’expérience, réduisant ainsi les coûts et le temps. Il est important de noter que cette méthode permet de suivre la progression de la maladie au niveau individuel, ce qui peut conduire à des informations qui sont masquées dans des études dépendantes de cohortes sacrifiées par le point temporel plutôt que par le stade de la maladie. En raison de sa nature non invasive, l’échographie de souris a de nombreuses applications potentielles pour la recherche sur le cancer de l’utérus ou de l’ovaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants du financement du programme SPORE du cancer de l’ovaire P50CA228991 du NCI, du programme de formation postdoctorale 5T32OD011089 et du Fonds de dotation Richard W. TeLinde de l’Université Johns Hopkins. Le projet a également été financé en partie par les subventions accordées aux établissements privés d’enseignement supérieur par la Société de promotion et d’aide mutuelle pour les écoles privées du Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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