Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لمراقبة تطور التغيرات المورفولوجية بمرور الوقت في الرحم في نموذج فأر محفز لسرطان بطانة الرحم باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية مع الارتباط بالتغيرات الإجمالية والنسيجية.
Abstract
يمكن دراسة سرطانات الرحم في الفئران بسبب سهولة التعامل والتلاعب الجيني في هذه النماذج. ومع ذلك ، غالبا ما تقتصر هذه الدراسات على تقييم علم الأمراض بعد الوفاة في الحيوانات التي تم قتلها رحيما في نقاط زمنية متعددة في مجموعات مختلفة ، مما يزيد من عدد الفئران اللازمة للدراسة. يمكن لفئران التصوير في الدراسات الطولية تتبع تطور المرض في الحيوانات الفردية ، مما يقلل من عدد الفئران اللازمة. سمحت التطورات في تكنولوجيا الموجات فوق الصوتية بالكشف عن التغيرات على مستوى الميكرومتر في الأنسجة. تم استخدام الموجات فوق الصوتية لدراسة نضوج الجريب في المبايض ونمو الطعم الأجنبي ولكن لم يتم تطبيقه على التغيرات المورفولوجية في رحم الفأر. يفحص هذا البروتوكول تجاور علم الأمراض مع مقارنات التصوير في الجسم الحي في نموذج فأر سرطان بطانة الرحم المستحث. كانت الميزات التي لوحظت بواسطة الموجات فوق الصوتية متسقة مع درجة التغيير التي شوهدت من قبل علم الأمراض الإجمالي والأنسجة. تم العثور على الموجات فوق الصوتية لتكون تنبؤية للغاية من علم الأمراض المرصودة ، ودعم دمج الموجات فوق الصوتية في الدراسات الطولية لأمراض الرحم مثل السرطان في الفئران.
Introduction
تظل الفئران واحدة من أهم النماذج الحيوانية للاضطرابات التناسلية1،2،3. هناك العديد من نماذج القوارض المعدلة وراثيا أو المستحثة لسرطانات المبيض والرحم. تعتمد هذه الدراسات عادة على مجموعات متعددة تم قتلها رحيما في نقاط زمنية مختلفة لالتقاط الاتجاهات الطولية في التغيرات المورفولوجية والمرضية. هذا يمنع القدرة على الحصول على بيانات مستمرة عن تطور السرطان في الماوس الفردي. بالإضافة إلى ذلك ، دون معرفة حالة تطور مرض الفئران الفردية ، تستند دراسات التدخل إلى نقاط زمنية محددة مسبقا ومتوسط نتائج الأفواج السابقة بدلا من العتبات الفردية للكشف عن التقدم فيمعين 4,5. لذلك ، هناك حاجة إلى مناهج التصوير التي تسمح بالتقييم الطولي في الحيوانات الحية لتسهيل النماذج قبل السريرية لاختبار الأدوية أو المركبات الجديدة وتسريع فهم البيولوجيا المرضية مع زيادة الدقة والتكاثر6.
يعد التصوير بالموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) طريقة جذابة للمراقبة الطولية لتطور سرطان رحم الفأر لأنه سهل نسبيا وغير مكلف مقارنة بطرق التصوير الأخرى ، وسهل الأداء ، ويمكن أن يكون له دقة رائعة 6,7. يمكن لهذه الطريقة غير الغازية التقاط الميزات على مقياس ميكرون في الفئران المستيقظة أو مع الفئران تحت التخدير القصير باستخدام اختبار 5-10 دقائق. تم التحقق من صحة الفحص المجهري بالموجات فوق الصوتية كطريقة لقياس تطور جريب مبيض الفأر 8 ونمو الأورام المزروعة أو المستحثة9،10،11. كما تم استخدام الولايات المتحدة عالية التردد للحقن داخل الرحم عن طريق الجلد12 ومراقبة تغير رحم الفئران خلال دورة الشبق13. يمكن استخدام الولايات المتحدة عالية التردد مع الفئران الموجودة على منصات ثابتة متخصصة باستخدام نظام السكك الحديدية لعقد محول الطاقة / المسبار لالتقاط صور عالية الدقة مع وضع وضغط قياسيين ؛ ومع ذلك ، فإن هذه المعدات غير متوفرة في جميع المؤسسات. يمكن اعتماد طرق مسح محول الطاقة المحمولة باليد مع معدات أقل تكريسا واستخدامها لكل من التشخيص السريري والتطبيقات البحثية في الفئران.
ويبقى السؤال حول ما إذا كان يمكن استخدام التصوير الأمريكي باستخدام مجسات عالية التردد محمولة باليد لمراقبة تطور سرطان الرحم على مدى عدة أسابيع. على غرار الأمعاء ، فإن رحم القوارض عبارة عن بنية نحيلة رقيقة الجدران متحركة للغاية داخل البطن ومتجاورة عبر أعماق الأنسجة المتعددة ، مما يجعل التصوير أكثر صعوبة من الأعضاء غير المتحركة نسبيا مثل الكلى. سعت هذه الدراسة إلى إثبات العلاقة بين الأنسجة التي لوحظت بواسطة الموجات فوق الصوتية وعلم أمراض الأنسجة ، وتحديد معالم لتحديد موقع رحم الفأر ، وتحديد جدوى التقييم الطولي لسرطان بطانة الرحم. تقدم هذه الدراسة بيانات تظهر تطابقا نوعيا بين ظهور الرحم الذي تم تصويره بواسطة الولايات المتحدة وعلم أمراض الأنسجة ، بالإضافة إلى التصوير التسلسلي للفئران على مدى عدة أسابيع. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام الولايات المتحدة المحمولة باليد لمراقبة تطور سرطان بطانة الرحم في الفئران ، مما يخلق فرصة لجمع البيانات الطولية الفردية للفأر لدراسة سرطان الرحم دون الحاجة إلى معدات مخصصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات والتجارب التي شملت الفئران وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية واستخدام الحيوان. بالنسبة لجميع الإجراءات ، تم ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات وأردية العزل التي تستخدم لمرة واحدة. تم اتخاذ الاحتياطات عند التعامل مع الأدوات الحادة ، والتي تم التخلص منها بشكل صحيح في حاويات الأدوات الحادة ذات الصندوق الأحمر مباشرة بعد الاستخدام. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. تحريض سرطان بطانة الرحم في الفئران iPAD ( Pten المحرض ، Arid1a الحذف المزدوج) مع الدوكسيسيكلين
- الحفاظ على 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten الفئران المعدلة وراثيا (iPAD) (الشكل 1) على خلفية وراثية مختلطة (129S ، BALB / C ، C57BL / 6) ، كما هو موضح سابقا14.
- اجمع صور خط الأساس بالموجات فوق الصوتية (2D) للمبيض وقناة البيض والرحم لكل فأر قبل العلاج بالدوكسيسيكلين.
- توفير وجبات تشاو تحتوي على الدوكسيسيكلين حصريا (دوكسيسيكلين هيكلات عند 625 مجم / كجم من العلف) لإناث الفئران iPAD لمدة لا تقل عن 2 أسابيع بدءا من 7-8 أسابيع من العمر للحث على حذف الجينات.
2. إعداد المعدات
- قم بتشغيل وسادة التدفئة ، وقم بتغطيتها بوسادة ماصة نظيفة (درجة الحرارة المستهدفة: 38 درجة مئوية).
- تأكد من ملء مبخر الأيزوفلوران وخزان O2 بشكل كاف. أعد التعبئة واستبدل إذا كانت المحتويات منخفضة.
- قم بتوصيل غرفة الحث ومخروط الأنف ونظام الكسح بالمبخر.
- قم بإعداد جهاز الموجات فوق الصوتية.
- حدد محول (مسبار) بمدى 32-56 ميجاهرتز أو حتى 70 ميجاهرتز لتصوير الرحم أو المبيض ، على التوالي.
- قم بتوصيل المسبار والطاقة على الجهاز.
- بعد تمهيد النظام ، استخدم لوحة التحكم لتسجيل الدخول باستخدام بيانات اعتماد المستخدم والوصول إلى الشاشة الرئيسية.
- من الشاشة الرئيسية ، انتقل إلى علامة التبويب التطبيقات ، وحدد وضع الماوس (الصغير) في البطن.
- انقر فوق مسح ضوئي للعودة إلى الشاشة الرئيسية ، وانتظر حتى يتم عرض صورة حية.
- حدد B-Mode من الخيارات الموجودة على شريط الأدوات الأيسر.
- انقر فوق المزيد من عناصر التحكم لعرض أدوات إضافية لتحسين الصورة ، مثل اكتساب الصورة وعمقها ، أو لضبط إعدادات الحصول على المقطع ، مثل عدد الإطارات في الثانية.
- بمجرد تحديد إعدادات الصورة ، ارجع إلى الشاشة الرئيسية بالنقر فوق مسح ضوئي.
- قم بتشغيل خزان O2 ، وقم بتوجيه التدفق إلى غرفة الحث ، واضبط معدل التدفق على 1 لتر / دقيقة.
3. إعداد الفئران للفحص بالموجات فوق الصوتية ، بما في ذلك إزالة الشعر
- ضع الماوس في غرفة الحث. اضبط مبخر الأيزوفلوران على 2٪ -3٪ حجم / حجم لتحريض التخدير.
- تحديد عمق التخدير المناسب من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم ومعدل التنفس حوالي 1-2 أنفاس / ثانية.
- ضع مادة تشحيم العيون المعقمة على كل عين. قم بإزالة الفراء من الظهر والبطن بين الضلع الأخير والحوض باستخدام كليبرز بحجم مناسب.
- ضع طبقة رقيقة من كريم مزيل الشعر على المناطق البطنية والظهرية ليتم تصويرها (إذا لزم الأمر).
- ضع الفأرة مرة أخرى في غرفة الحث لمدة 3-5 دقائق تقريبا للحفاظ على عمق التخدير المناسب بينما يعمل كريم مزيل الشعر على إزالة الشعر. بعد ≤4 دقيقة ، امسح الكريم برفق بمنشفة ورقية رطبة نظيفة.
ملاحظة: التعرض لفترة أطول لكريم مزيل الشعر أمر مزعج وقد يسبب آفات جلدية.
4. حقن السائل داخل الصفاق لزيادة التباين بين الأعضاء
- قم بتسخين حقنة سعة 3-10 مل مملوءة بمحلول سائل متساوي التوتر معقم (على سبيل المثال ، محلول كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ أو محلول رنين الرضاعة) إلى 35-40 درجة مئوية عن طريق وضعه بين وسادة تسخين ووسادة ماصة لعدة دقائق. ضع زجاجة من جل الموجات فوق الصوتية على وسادة التدفئة إذا لم يكن الجهاز يحتوي على جهاز تدفئة.
- للحصول على ماوس 20-25 جم ، قم بحقن 1-2 مل من المحلول في التجويف البريتوني.
- تأمين الماوس من القفا في يد واحدة ، وفضح البطن.
- امسك الماوس بزاوية ~ 20 درجة ، مع توجيه الأنف إلى الأرض لتوجيه الأعضاء بشكل جمجمي بسبب الجاذبية.
- باستخدام إبرة قياس صغيرة (25 جم ، 5/8 في الطول ، حقنة السلين) ، ثقب من خلال الجلد وجدار البطن من الربع الأيمن الذيلي من البطن.
- قبل حقن السوائل ، لتجنب الحقن في الأوعية الدموية أو الجهاز الهضمي ، اسحب بأقل قدر من الضغط. إذا دخل الدم أو أي مادة أخرى إلى المحقنة ، فقم بإزالة الإبرة. استخدم إبرة ومحقنة جديدة ، وحاول مرة أخرى في وضع مختلف قليلا.
- إذا استيقظ الفأر أثناء الحقن ، ضعه مرة أخرى في غرفة الحث الصغيرة للتخدير باستخدام 2٪ -3٪ حجم / حجم إيزوفلوران.
5. التصوير بالموجات فوق الصوتية من النهج الظهري
- ضع الماوس في الاستلقاء البطني على وسادة الامتصاص فوق وسادة التدفئة (الشكل 2A-C).
- ضع مخروط أنف القوارض بإحكام على أنف الفأر وكمامة. الحفاظ على عمق التخدير مع إيزوفلوران تسليمها من خلال مخروط الأنف في 1٪ -2٪ حجم / حجم في 100٪ O2. ضع مادة تشحيم العيون المعقمة ، حسب الحاجة ، على كل عين.
- راقب الماوس للحصول على معدل تنفس منتظم (1-2 / ثانية) وعدم استجابة قرصة إصبع القدم للإشارة إلى ما إذا كان التخدير بحاجة إلى تعديل.
- ضع كمية صغيرة (~ 0.5-1 مل) من هلام الموجات فوق الصوتية المسخن مسبقا (الجانبي) على العمود الفقري على جانبي الفأر المخدر ، بين الضلع الأخير والحوض.
- ضع كمية صغيرة من الجل على مسبار الموجات فوق الصوتية.
- ضع المسبار بالتوازي مع الفقرات مع مقدمة المسبار على جانب الجمجمة. توجد علامة مؤشر على رأس المسبار للإشارة إلى الاتجاه الصحيح للمسبار. سجل اليوم والوقت ومعرف الحيوان واتجاه المسبار وجانب الحيوان (اليمين واليسار والظهر والبطن) لكل مجموعة جديدة من الصور التي يتم جمعها.
- باستخدام فأر في الاستلقاء البطني (الجلد الظهري يلامس المسبار) ، امسح المنطقة ببطء بحثا عن معلم الكلى (الشكل 2 ب والشكل 3). مع وضع الكلى في العرض ، اسحب المسبار الذيلي للعثور على المبيض - وهو شكل بيضاوي مفرط الصدى قليلا إلى هيكل دائري (الشكل 4 أ ، ب) داخل وسادة دهنية مبيضة مفرطة الصدى للغاية تحدها الكلية القحفية البطنية والظهرية الجانبية جدار البطن الظهري.
ملاحظة: الضغط الذيلي والجانبي للمبيض يمكن أن يوجه المبيض أقرب إلى جدار البطن وبعيدا عن حلقات الأمعاء. يتم وضع المبيض تشريحيا مقابل جدار البطن الظهري ، فقط البطني والجانبي للعضلات المحورية والذيلية إلى الكلى. - اضبط كسب الإشارة باستخدام شريط التمرير الموجود أسفل شاشة التحكم لتحسين تباين الصورة.
- لتحسين تصوير الكلى ، اضغط بإصبعك على البطن المقابل. قم بتغيير الضغط والزاوية من موازية مباشرة للعمود الفقري إلى ~ 20 درجة بطنية.
- بمجرد عرض الجهاز محل الاهتمام ، اجمع مقطع فيديو بالنقر فوق حفظ مقطع أو بدء التسجيل ثم إيقاف التسجيل عند الانتهاء للاحتفاظ بالصور بعدد محدد مسبقا من الإطارات.
- احفظ إطارات مفردة من صورة مباشرة أو تسجيل باستخدام زر حفظ الإطار .
- لتصوير الرحم ، اسحب المسبار ذيليا حتى يصبح المبيض في الجانب الأكثر جمجمة من مجال الرؤية. قم بتغيير ضغط المسبار وزاويته حتى يصبح الرحم في الأفق.
- كرر جمع الفيديو والإطار لكل جهاز مهم.
- ابحث عن الرحم الذي يمتد طوليا على طول جدار البطن الظهري مع وجود عضلات الساق الجانبية أيضا في العرض (الشكل 4 ب).
ملاحظة: قد يختلف حجم الرحم وقطر التجويف باختلاف مرحلة الشبق وحالة المرض. - مراقبة الأنسجة للحركة التمعجية لتمييز الحلقات المعوية عن قرون الرحم الثابتة.
6. جمع الصور من النهج البطني
- ضع الفأر في الاستلقاء الظهري ، وتأكد من أن تزييت العين كاف وأن الكمامة مثبتة بإحكام في مخروط الأنف (الشكل 2 أ).
- ضع كمية صغيرة (~ 0.5-1 مل) من جل الموجات فوق الصوتية المسخن مسبقا على البطن البطني ، وقم بتطبيق المسبار عند خط الوسط فقط في الجمجمة من العانة لتحديد موقع المثانة كمعلم ناقص الصدى (الشكل 5).
ملاحظة: إذا كانت المثانة كبيرة جدا وتحجب تصوير الرحم ، فيمكن وضع ضغط لطيف على أسفل البطن للتعبير عن البول. - اسحب المسبار الجانبي إلى المثانة للعثور على قرون الرحم. قم بتطبيق ضغط رقمي خفيف من أي من جانبي الماوس أو كليهما لإدخال الأبواق في مجال الرؤية. أمسك المسبار بشكل عمودي على الماوس ، وامسح جانبي البطن لالتقاط مناظر عرضية (مقاطع عرضية) لكلا القرنين. قم بتدوير المسبار لالتقاط طرق العرض السهمية.
- بعد الموجات فوق الصوتية ، امسح الماوس نظيفا من الجل بمنشفة ورقية ، وأعده إلى قفصه للتعافي. الفئران مستيقظة تماما في 2-5 دقائق. بمجرد أن يكون مستيقظا تماما ومتنقلا ، أعد الماوس إلى غرفة الحيوانات.
ملاحظة: يمكن وضع وسادة تدفئة على نار خفيفة أسفل القفص لتدفئة القفص للتعافي. - عند نقطة النهاية التجريبية أو الإنسانية ، القتل الرحيم للماوس. من الناحية المثالية ، القتل الرحيم للفأر في قفص المنزل لتقليل التوتر ؛ بدلا من ذلك ، ضع الماوس في غرفة نظيفة. تسليم CO 2 المضغوطبمعدل إزاحة 10٪ -30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. بعد حوالي 5 دقائق من عدم وجود تنفس مرئي ، تحقق من الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم. المضي قدما في تشريح البطن لحصاد الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الحفاظ على الفئران المعدلة وراثيا Pax8-Cre-Arid1a-Pten (iPAD) على خلفية وراثية مختلطة (129S ، BALB / C ، C57BL / 6) ، كما هو موضح سابقا14. تم تغذية جميع الفئران تغذية الدوكسيسيكلين لمدة 2 أسابيع للحث على Cre recombinase. في العمل السابق من قبل مجموعتنا ، تم تناول الدوكسيسيكلين بواسطة gavage14. ومع ذلك ، في هذه الدراسة الحالية ، عملت طريقة تحريض تغذية الدوكسيسيكلين بكفاءة وقللت من إجهاد التزويج للفئران. من المهم التحقق من أن طريقة إعطاء الدوكسيسيكلين كافية للحث على تعبير Cre recombinase اللازم لاستئصال الحمض النووي لمثبطات الورم (Arid1a و Pten) في الخلايا المعبرة عن Pax8 ، مثل الرحم. تم استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية مع الأجسام المضادة الموجهة ضد ARID1a و pTEN14 للتحقق مما إذا كان قد تم تحقيق فقدان البروتين الكابت للورم الكافي في الخلايا الظهارية الرحمية مقارنة بالأنسجة اللحمية المجاورة ، كما هو موضح في الشكل 6. يتم عرض الرسم التخطيطي لنموذج الماوس وتنظيم التعبير عن مثبط الورم في الشكل 1.
بعد 2 أسابيع من الدوكسيسيكلين ، لم يتغير حجم الرحم بشكل كبير مقارنة بالضوابط أو نفس الفأر الذي تم تصويره قبل إعطاء الدوكسيسيكلين. ومع ذلك ، على مدى الأسابيع 2-6 التالية بعد الدوكسيسيكلين ، أظهرت الموجات فوق الصوتية أن الفئران طورت مجموعة من أمراض الرحم ، بدءا من تضخم والتقدم إلى غدية. يصور الشكل 7 أ ، ب صورا أمريكية لرحم فأر مع تغيرات مرضية مبكرة شوهدت بعد 3 أسابيع من العلاج بالدوكسيسيكلين. يوضح الشكل 7C ، D علم الأمراض الإجمالي وعلم أمراض الأنسجة لنفس الرحم المصور في الشكل 7A ، B بعد القتل الرحيم للفأر مباشرة بعد التصوير في 3 أسابيع. يمكن ملاحظة الرحم الأصغر (ولكن المتوسع) ذو الجدران الرقيقة وتضخم بطانة الرحم المبكر مع الحفاظ على التجويف المميز (سائل الرحم المركزي مفرط الصدى). في الفئران التي تم قتلها رحيما في نقاط زمنية لاحقة ، كان الرحم أكبر بكثير ، وكان تجويفه أصغر ، وكان له جدار سميك (الشكل 8 والشكل 9). تتم مقارنة أمثلة اللومن المتوسعة والتغيرات الطفيفة في بطانة الرحم المفرطة التنسج بالأنسجة الكثيفة ونمو سرطان العقيدات في الرحم في الشكل 8 والشكل 9. كانت الموجات فوق الصوتية والصور الإجمالية متسقة للغاية مع بعضها البعض لجميع الفئران الممثلة. يعرض الشكل 9 صورا متعددة للرحم من نفس الفأر في دراسة دورة زمنية ويوضح التغيرات المورفولوجية التي لوحظت على مدار 6 أسابيع مع تطور السرطان الغدي. يوضح الشكل 5 نهجا بطنيا مع مقاطع عرضية لقرون الرحم المجاورة للمثانة ناقص الصدى.
لتعزيز التباين في البطن ، أدى حقن محلول ملحي في تجويف البطن مباشرة قبل التصوير إلى تحسين تصور أعضاء البطن ، بما في ذلك الرحم والمبيض. يوضح الشكل 3 مقارنات الموجات فوق الصوتية من نفس الفأر قبل وبعد حقن 1 مل من المحلول الملحي. مع المحلول الملحي ، كان هناك مساحة ناقصة الصدى متزايدة (سوداء) بين الأعضاء التي سمحت للكلى ، وسادة الدهون ، المبيض ، قرون الرحم ، الأمعاء ، والطحال لتكون أكثر سهولة من بعضها البعض. في جميع الأشكال الأخرى المعروضة هنا ، تم إجراء حقن المحلول الملحي قبل التصوير لتحسين وضوح الصورة.
مجتمعة ، يوضح هذا البروتوكول أن نموذج الفأر المستحث هذا يطور سرطانا غديا على مدار 6 أسابيع ويمكن مراقبته بالموجات فوق الصوتية لإنشاء خط أساس ومراقبة التغيرات المورفولوجية في الرحم مع تطور السرطان. هنا ، ثبت أن الموجات فوق الصوتية غير الغازية تسمح بتقييم قرون الرحم في الفأر بشكل متسلسل على مدى عدة أسابيع مع الصور التي تنبئ بالتغيرات المرضية الفعلية في الرحم.
الشكل 1: استراتيجية لتوليد الفئران المعدلة وراثيا Pax8-Cre المزدوجة المحرضة. (أ) ينتج عن الإنتاج التأسيسي لمنشط عكسي متحكم فيه بالتتراسيكلين (rtTA) في الخلايا الظهارية الرحمية المعبرة عن Pax8 التنشيط المستحث ل Cre recombinase في وجود التتراسيكلين ، أو الدوكسيسيكلين التناظري ، عن طريق الارتباط بعناصر استجابة التتراسيكلين (TRE). يتم استهداف مواقع Flox الموجودة في المنبع والمصب من exon 8 (Arid1a) و exon 5 (Pten) بواسطة Cre recombinase. يؤدي الحذف المستهدف Cre ل exon 8 في Arid1a إلى طفرة في إزاحة الإطار وكودون توقف مبكر (p.Gly809Hisfs * 6). يؤدي الحذف المستهدف Cre ل exon 5 في Pten إلى طفرة إزاحة الإطار (p.Val85Glyfs * 14). (ب) يعبر ماوس Pax8-rtTA عن منشط عكسي يتم التحكم فيه بالتتراسيكلين (rtTA) تحت سيطرة مروج Pax8. يتم عبور هذا الماوس مع ماوس TetO-Cre الذي يعبر عن Cre recombinase بطريقة تعتمد على التتراسيكلين. يعبر النسل من هذا العبور عن التتراسيكلين (أو الدوكسيسيكلين) المنشط Cre recombinase الخاص بالخلايا الظهارية الرحمية التي تعبر عن Pax8 (منشط Pax8-Cre). (C) تم عبور الفئران Arid1a flox / flox على خلفية 129S1 مع Pten flox / flox على خلفية BALB / C (Strain C ؛ 129S4-Ptentm1Hwu / J) لتوليد ماوس المحول Arid1a flox/ flox / Ptenflox / flox. (د) يتم عبور ماوس المنشط Pax8-Cre بماوس Arid1a flox / flox / Ptenflox / flox. ينتج عن النسل من هذا التهجين نموذج فأر معدل وراثيا مع حذف Arid1a و Pten المحرض بالدوكسيسيكلين (iPAD) الخاص بالخلايا الظهارية الرحمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراء التصوير. أ: فأر مخدر مع إزالة فرو البطن والظهر باستخدام مقص وكريم مزيل الشعر. يتم الحفاظ على الماوس على تخدير isoflurane المستنشق عن طريق مخروط الأنف ووضعها على وسادة الحرارة مغطاة وسادة ماصة. (ب) توضع كمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية المسخن مسبقا فوق المنطقة محل الاهتمام على الفأر والمسبار. هنا ، يكون الفأر في راقد بطني ، ويتم وضع المسبار بشكل صحيح لتحديد موقع الكلى ، وهو المعلم التشريحي مباشرة الجمجمة إلى المبيض. (ج) في الاستلقاء الظهري، يمكن التعامل مع المسبار يدويا للعثور أولا على معالم مثل المثانة من أجل العثور على الموقع التقريبي لقرون الرحم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحسين الرؤية وتعريف الأعضاء عن طريق حقن محلول ملحي . (أ) صورة لكلية وحلقات من الجهاز الهضمي (أسفل اليسار) قبل حقن IP بمقدار 1.5 mL من محلول ملحي معقم دافئ. الجانب الأيسر من الصورة هو الجمجمة إلى الكلى. (ب) صورة للكلية بعد الحقن بالمحلول الملحي، تظهر زيادة (مساحة ناقصة الصدى، سوداء) بين الأعضاء. بالنسبة لكلتا الصورتين ، من حيث الاتجاه ، يكون الماوس سطحا ظهريا لأعلى ، والجمجمة إلى الذيلية من اليسار إلى اليمين. (ج، د) يظهر القسم الأحمر المميز معالم الكلى في صور 2D المعروضة في A و B. تم التقاط الصور باستخدام محول MS550. أشرطة المقياس = 2 مم في كل صورة. الاختصارات: الجهاز الهضمي = الجهاز الهضمي. IP = داخل الصفاق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الجهاز التناسلي مع المعالم. أ: يقع المبيض (السهم) مباشرة من الذيلية إلى القطب الذيلي للكلية. (ب) قرن الرحم (السهم الضيق) عميق ويبدأ من الجمجمة إلى العضلات الظهرية للطرف الخلفي القريب (رأس السهم)، مع ظهور المبيض أيضا (السهم الأكبر). قضبان المقياس = 2 مم. بالنسبة لجميع الصور ، من حيث الاتجاه ، يكون الماوس سطحا ظهريا لأعلى ، والجمجمة إلى الذيلية من اليسار إلى اليمين. تم التقاط الصور باستخدام محول MS550. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصوير قرون الرحم والمثانة من الاستلقاء الظهري. صور الموجات فوق الصوتية من فأرين قبل تحريض السرطان. (أ) يكون تجويف المثانة مرئيا في صورة تركيب بيضاوي ناقص الصدى مع غشاء مخاطي مفرط الصدى. يمكن رؤية قرني الرحم معا ، مع تتبع حدود كل منهما باللون الأزرق الفاتح. ب: المنظر نفسه في فأر آخر مع مثانة أكثر امتلاء. بالنسبة لكلتا الصورتين ، من حيث الاتجاه ، يكون الماوس سطحا بطنيا لأعلى ، والصورة اليسرى هي الماوس إلى اليسار. يتم رسم حدود كل قرن رحم باللون الأزرق الفاتح ، مع وجود مناطق في مربعات النص المجاورة (محول MS550). قضبان المقياس = 3 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: أمثلة على H&E والكيمياء الهيستولوجية المناعية لأقسام الرحم بعد 6 أسابيع من الحث في فأر iPAD. (أ) ممثل H&E لأنسجة رحم الفأر iPAD. (ب) الكيمياء الهيستولوجية المناعية ARID1a التمثيلية. يظهر التلوين فقدان Arid1a الخاص بنوى الخلايا الظهارية الرحمية المعبرة عن Pax8 (السهم الأسود) ، مع الاحتفاظ ب Arid1a في نوى الخلايا اللحمية الرحمية (السهم الأبيض). (ج) الكيمياء الهيستولوجية المناعية pTEN التمثيلية. يظهر التلوين فقدان pTEN في سيتوبلازم الخلايا الظهارية الرحمية التي تعبر عن Pax 8 (السهم الأسود) ، مع الاحتفاظ ب pTEN في السيتوبلازم للخلايا اللحمية الرحمية (السهم الأبيض). تم نشر طرق IHC التفصيلية سابقا14. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: iPAD = Inducible Pten ، Arid1a حذف مزدوج ؛ H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: أمثلة على صور الموجات فوق الصوتية من الفئران مع التغيرات المبكرة في علم الأمراض . (أ ، ب) صورة بالموجات فوق الصوتية قبل الوفاة لرحم مملوء بسائل الرحم الذي يكون مفرط الصدى بشكل طبيعي تشير الأسهم الضيقة إلى تجويف الرحم المتوسع ناقص الصدى. يشير رأس السهم إلى المنطقة السميكة لجدار الرحم. (ج) الصورة الإجمالية للرحم بأكمله من الفأر الموضح في الحرف (ب). تقع العلامة النجمية البيضاء تقريبا في نفس الموقع الموضح في الحرف (أ). (د) في هذا الفأر نفسه، تمت معالجة الرحم وتلطيخه بحمض H&E . يظهر قسم الأنسجة سماكة جدار الرحم بسبب تضخم بطانة الرحم. يشار إلى منطقة المثال برأس سهم. بالنسبة لجميع الصور الأمريكية ، من حيث الاتجاه ، يكون الماوس سطحا ظهريا لأعلى ، والجمجمة إلى الذيلية من اليسار إلى اليمين (محول MS550). قضبان المقياس = (أ ، ب) 3 مم ؛ د: ٥٠٠ ميكرومتر. الاختصارات: الولايات المتحدة = الموجات فوق الصوتية. H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تنوع أمراض الرحم المرئي بواسطة الموجات فوق الصوتية. أ: رحم به تضخم وانتفاخ سوائل، مما يسبب تمدد اللمعان إلى قطر ~ 2.5 مم. ب: رحم ثان مصاب بتضخم منتفخ بدرجة أكبر. ج: رحم متوسع ومملوء بكتلة من الأنسجة الرخوة. قضبان المقياس = 3 مم. بالنسبة لجميع الصور ، تكون الأسهم على الجانب البطني من قرن الرحم ، ومن حيث اتجاه الصورة ، يكون الفأر سطحا ظهريا لأعلى ، والجمجمة إلى الذيلية من اليسار إلى اليمين (محول MS550). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: التغيرات في تطور الأورام في الرحم بمرور الوقت في فأر واحد. (أ) صورة بالموجات فوق الصوتية لفأر iPAD تظهر الكلى (سهم أوسع) ، المبيض (الذيلية إلى الكلى) ، والرحم (سهم ضيق) ، مع ظهور عضلة الساق أيضا (رأس السهم) ، تم التقاطها في ثلاث نقاط زمنية: بعد بدء الفأر في اتباع نظام غذائي للدوكسيسيكلين (الأسبوع 0) ، ثم مرة أخرى بعد 5 أسابيع و 6 أسابيع. الدوكسيسيكلين الناجم عن تعبير Cre مع فقدان مثبط الورم ، مما يعزز سرطان بطانة الرحم بمرور الوقت. (ب) نفس صور الموجات فوق الصوتية مثل A ولكن مع تمييز قرن الرحم باللون الأحمر. (ج) الصور الإجمالية للرحم في الموقع (سهم ضيق) من النقطة الزمنية 6 أسابيع ؛ ينظر إلى الأنسجة من السطح البطني. (د) نفس الرحم كما في C تشريح خارج الجسم الحي. ينظر إلى الأنسجة من السطح البطني. ه: نسيجات كتلة الرحم (صبغة H&E)، تشير إلى السرطان الغدي من هذا المثال. بالنسبة إلى A و B ، من حيث الاتجاه ، يكون الفأر سطحا ظهريا لأعلى ، والجمجمة إلى الذيلية من اليسار إلى اليمين (محول MS550). أشرطة المقياس = (A ، B ، أول صورتين في كل صف) 1 مم ؛ (أ ، ب ، الصورة الثالثة) 2 مم ؛ ه: 500 ميكرومتر. الاختصارات: iPAD = Inducible Pten ، Arid1a حذف مزدوج ؛ H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يفحص هذا البروتوكول فائدة الموجات فوق الصوتية لتقييم التغيرات المورفولوجية الرحمية في تطور السرطان الغدي في الرحم في الفئران. في هذه الدراسة ، من خلال اتباع تحريض سرطان بطانة الرحم في الفئران طوليا ، تم العثور على التفاصيل التشريحية المكتشفة بواسطة الموجات فوق الصوتية لتكون مؤشرات على علم الأمراض الإجمالي والنسيجي. هذا يفتح الباب لاستخدام الدراسات الطولية مع أعداد أقل من الفئران التي تتم مراقبتها بواسطة الموجات فوق الصوتية في نقاط زمنية متعددة لمتابعة تطور سرطانات الرحم في الفئران. تم إنجاز هذا الكشف الطولي باستخدام مسبار محمول باليد وبدون استخدام معدات الموجات فوق الصوتية لنظام السكك الحديدية. تتوفر المجسات عالية التردد (محولات الطاقة) المستخدمة على نطاق واسع ، مما يجعل هذا النهج قابلا للتكرار في مؤسسات متعددة في جميع أنحاء العالم. تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول استخدام المسبار الصحيح لمستوى الدقة المطلوب للتجربة وإعداد الماوس للتصوير قبل الموجات فوق الصوتية.
الخطوات الحاسمة في تحضير الفأر هي إزالة كل الشعر من مناطق الدراسة وحقن السوائل في التجويف البريتوني. يمكن أن يؤدي الفراء المتبقي على الجلد إلى محاصرة الفقاعات في هلام الموجات فوق الصوتية ، والتي يمكن أن تنتج القطع الأثرية في الصور ؛ وبالتالي ، يجب توخي الحذر لإزالة الشعر بالتساوي على منطقة الدراسة. تم اختيار كريم مزيل الشعر كطريقة لإزالة الشعر لأنه يزيل الفراء بالتساوي عبر الجلد. يمكن أن تحدث إصابة الجلد إذا ترك الكريم على الجلد لفترة طويلة من الوقت (>3-4 دقائق). في الفئران الأكثر حساسية لكريم مزيل الشعر ، يجب ترك الكريم على الجلد لمدة 1-2 دقيقة فقط لإزالة الشعر. بعد ذلك ، يجب مسح الماوس بسلسلة من المناشف الورقية المبللة لإزالة الكريم تماما. بعد إزالة كل الشعر من منطقة الدراسة ، يتم حقن سوائل معقمة ودافئة متساوية التوتر في التجويف داخل الصفاق لزيادة التباين والمساعدة في تحديد حدود أعضاء البطن. في هذه الدراسة ، كان حقن 1-2 مل من السوائل كافيا للتمييز بين قرون المبيض وقناة البيض والرحم. يتم امتصاص السائل تدريجيا ، ومن الأفضل حقنه مباشرة قبل التصوير. تصبح الفئران منخفضة الحرارة بسرعة تحت تخدير الأيزوفلوران. يمكن منع ذلك عن طريق حقن محلول ملحي دافئ (مخزن في محاقن على وسادة تدفئة) وأيضا عن طريق وضع الماوس على وسادة التدفئة وتسخين هلام الموجات فوق الصوتية عندما يكون ذلك ممكنا. تعمل جلسات التصوير مع أخصائيي التصوير بالموجات فوق الصوتية ذوي الخبرة بسرعة 5-10 دقائق / فأرة ، ومع هذا الوقت القصير ، لم يحدث انخفاض كبير في حرارة الجسم. إذا لزم الأمر ، يمكن حقن ما يصل إلى 2 مل إضافي من المياه المالحة في البطن لفصل أكبر للأعضاء.
تهدف الطرق الموضحة هنا إلى أن تكون قابلة للتكرار بسهولة بدون معدات متخصصة تتجاوز جهاز الموجات فوق الصوتية والمسبار (التحقيقات). في الطريقة المقدمة ، يتم التعامل مع المسبار يدويا طوال الوقت دون مساعدة من نظام السكك الحديدية. هذه الطريقة اليدوية أسرع وتوفر مرونة كبيرة في الزوايا والضغط المطبق لتسليط الضوء على الميزات الصغيرة. يمكن أن يؤدي توجيه المجسات يدويا فوق البطن واستخدام محولات طاقة منخفضة الدقة إلى الحد من جودة أي صور فردية يتم الحصول عليها مقارنة بالصور من محول طاقة مثبت على نظام السكك الحديدية4. سيكون نظام السكك الحديدية مفيدا للحقن في الرحم (في الأجنة) أو الحقن داخل القلب عند الحاجة إلى مزيد من الاستقرار. ومع ذلك ، هناك مقايضة فيما يتعلق بالحد الأدنى من وقت التلاعب وزيادة إمكانية الوصول لمجموعة واسعة من المؤسسات التي تفتقر إلى مرافق الموجات فوق الصوتية المتخصصة. يجسد نجاح هذه الطريقة المبسطة كيف يمكن استخدام الموجات فوق الصوتية لمجموعة من الدراسات. الطريقة المقترحة مناسبة تماما لالتقاط التغيرات الطولية في الأنسجة في نماذج سرطان الرحم دون الحاجة إلى معدات مخصصة ويمكن تطبيقها على نماذج الأمراض التقدمية الأخرى. يمكن أن يؤدي التلاعب اليدوي بالفئران أثناء التصوير إلى زيادة التباين في عمق الأنسجة وموقعها بالضبط ، ولكن بالنسبة للدراسات التي لا تعتمد على هذه العوامل ، فإن جودة الصورة كافية للكشف عن التغيرات المرضية.
من المهم حفظ مقاطع الفيديو أثناء التصوير ؛ في وقت لاحق في محطة عمل المستخدم ، يمكن إيقاف مقاطع الفيديو في أي إطار يمثل التشريح الذي يجب التقاطه وقياسه. يمكن قياس صور الأعضاء (القطر أو المحيط أو الطول) (الشكل 5 ، قياس المقطع العرضي لقرن الرحم) ، ويمكن حساب منطقة الورم. تسهل مقاطع الفيديو ، أكثر من الإطارات الفردية ، تحديد الأعضاء في سياق تشريحي أكبر. مقاطع الفيديو مفيدة أيضا لتحديد حركة الأمعاء الدقيقة والكبيرة ، والتي يمكن أن تساعد في تمييز الأمعاء عن الرحم. يعتمد الحصول على صور عالية الجودة أيضا على الإلمام بتشريح الماوس. لتصوير الرحم المتحرك مقابل تصوير المزيد من الأنسجة الثابتة (على سبيل المثال ، ورم xenograft المزروع ، المبايض) ، فإن استخدام الطريقة اليدوية له ميزة مسح ومتابعة قرون الرحم من القريب إلى البعيد. أثناء المسح ، يمكن استخدام الضبط التدريجي لزوايا اليد لمتابعة القرن. تم استخدام مسبار MS550 لجميع عمليات التصوير في هذه الدراسة وهو مفضل للرحم مقارنة بمسبار MS700 عالي الدقة ، وهو أفضل للمبيضين. تم مؤخرا نشر العمل باستخدام MS700 لتصوير الغدة الدرقية للفأر ، مما يعرض الدقة العالية الممكنة في الأنسجةالأخرى 15. يعد التصوير بالمسبار المحمول باليد مفيدا بسبب الدرجات المتفاوتة لعمق أنسجة الرحم بين المبيض والمثانة. في هذا العمل ، ساعد التنقل بين المعالم التشريحية التي يمكن التعرف عليها بسهولة ، مثل الكلى وتشريح الأطراف الخلفية القريبة ، في التقاط صور قابلة للمقارنة عبر النقاط الزمنية المختلفة عند تصوير الرحم من الجانب الظهري على الجسم.
تتفوق طريقة الموجات فوق الصوتية عالية الدقة هذه لمتابعة التغيرات التشريحية في الرحم بمرور الوقت أثناء تكوين الورم على الطرق الحالية التي تتضمن القتل الرحيم للحيوانات من مجموعات متعددة في نقاط زمنية مختلفة. تعمل الموجات فوق الصوتية على تحسين النموذج وتقليل عدد الفئران اللازمة للتجربة ، وبالتالي تقليل التكاليف والوقت. الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة تسمح باتباع تطور المرض على المستوى الفردي ، مما قد يؤدي إلى رؤى مقنعة في الدراسات التي تعتمد على الأتراب التي تم التضحية بها حسب النقطة الزمنية بدلا من مرحلة المرض. نظرا لطبيعتها غير الغازية ، فإن الموجات فوق الصوتية للفأر لها العديد من التطبيقات المحتملة للبحث في سرطان الرحم أو المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون للتمويل من برنامج NCI Ovarian Cancer SPORE P50CA228991 ، وبرنامج تدريب ما بعد الدكتوراه 5T32OD011089 ، ووقف ريتشارد دبليو تيليندي ، جامعة جونز هوبكنز. كما تم تمويل المشروع جزئيا من خلال الإعانات المقدمة للنفقات الجارية لمؤسسات التعليم العالي الخاصة من مؤسسة الترويج والمساعدة المتبادلة للمدارس الخاصة في اليابان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
