Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å overvåke progresjonen av morfologiske forandringer over tid i livmoren i en induserbar musemodell av endometriekreft ved hjelp av ultralydavbildning med korrelasjon til brutto og histologiske forandringer.
Abstract
Livmorkreft kan studeres hos mus på grunn av enkel håndtering og genetisk manipulering i disse modellene. Imidlertid er disse studiene ofte begrenset til å vurdere patologi post mortem hos dyr som er euthanisert på flere tidspunkter i forskjellige kohorter, noe som øker antall mus som trengs for en studie. Imaging mus i longitudinelle studier kan spore sykdomsprogresjonen hos enkelte dyr, og redusere antall mus som trengs. Fremskritt innen ultralydteknologi har gjort det mulig å oppdage endringer i mikrometernivå i vev. Ultralyd har blitt brukt til å studere follikkelmodning i eggstokkene og xenograftvekst, men har ikke blitt brukt på morfologiske endringer i musens livmor. Denne protokollen undersøker sammenstillingen av patologi med in vivo bildesammenligninger i en indusert musemodell for livmorkreft. Karakteristika observert ved ultralyd var forenlig med graden av endring sett ved brutto patologi og histologi. Ultralyd ble funnet å være svært prediktiv for den observerte patologien, og støttet inkorporering av ultralyd i langsgående studier av livmorsykdommer som kreft hos mus.
Introduction
Mus er fortsatt en av de viktigste dyremodellene for reproduktive lidelser 1,2,3. Det finnes flere genetisk modifiserte eller induserte gnagermodeller av eggstokkreft og livmorkreft. Disse studiene er vanligvis avhengige av flere kohorter som avlives på forskjellige tidspunkter for å fange langsgående trender i morfologiske og patologiske endringer. Dette forhindrer muligheten til å skaffe kontinuerlige data om kreftutvikling i en individuell mus. I tillegg, uten å vite den individuelle mussykdomsprogresjonstilstanden, er intervensjonsstudier basert på forhåndsbestemte tidspunkter og gjennomsnittlige funn fra tidligere kohorter i stedet for individuelle terskler for påvisning av progresjon i et bestemt dyr 4,5. Derfor er det behov for bildebehandlingsmetoder som muliggjør longitudinell vurdering hos levende dyr for å legge til rette for prekliniske modeller for testing av nye stoffer eller forbindelser og akselerere forståelsen av patobiologi samtidig som det øker strengheten og reproduserbarheten6.
Ultralydavbildning (US) er en tiltalende metode for langsgående overvåking av progresjon av livmorkreft hos mus fordi den er relativt lett og billig sammenlignet med andre bildebehandlingsmetoder, er enkel å utføre og kan ha bemerkelsesverdig oppløsning 6,7. Denne ikke-invasive modaliteten kan fange funksjoner til mikronskalaen hos våkne mus eller med mus under kort sedasjon ved hjelp av en 5-10 minutters eksamen. Ultralydmikroskopi har blitt validert som en metode for å måle utvikling av eggstokkfollikkel hos mus 8 og veksten av implantert eller indusert neoplasi 9,10,11. Høyfrekvent USA har også blitt brukt til perkutane intrauterine injeksjoner12 og observere rotte livmor endring over østrus syklus13. Høyfrekvent USA kan brukes med mus holdt på spesialiserte stasjonære plattformer ved hjelp av et skinnesystem for å holde transduseren / sonden for å ta bilder med høy oppløsning med standardisert posisjon og trykk; Dette utstyret er imidlertid ikke tilgjengelig ved alle institusjoner. Håndholdte transduserskannemetoder kan tas i bruk med mindre dedikert utstyr og brukes til både klinisk diagnostikk og forskningsapplikasjoner på mus.
Spørsmålet er om amerikansk bildebehandling med håndholdte, høyfrekvente sonder kan brukes til å overvåke livmorkreftutviklingen over flere uker. I likhet med tarmene er gnagerlivmoren en tynnvegget, slank struktur som er veldig mobil i magen og er sammenhengende gjennom flere vevsdybder, noe som gjør avbildning mer utfordrende enn med relativt immobile organer som nyrene. Denne studien forsøkte å etablere sammenhengen mellom vev observert ved ultralyd og histopatologi, definere landemerker for lokalisering av musens livmor og bestemme muligheten for den langsgående vurderingen av endometrisk kreft. Denne studien presenterer data som viser en kvalitativ korrespondanse mellom utseendet til livmor avbildet av amerikansk og histopatologi, samt seriell avbildning av mus over flere uker. Disse resultatene indikerer at håndholdt USA kan brukes til å overvåke endometriekreftutvikling hos mus, og dermed skape en mulighet for å samle individuelle mus langsgående data for å studere livmorkreft uten behov for dedikert utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer og eksperimenter som involverte mus ble utført i henhold til protokoller godkjent av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. For alle prosedyrer ble passende PPE brukt, inkludert hansker og engangs isolasjonsfrakker. Forholdsregler ble tatt ved håndtering av skarpe gjenstander, som ble forsvarlig avhendet i røde boksbeholdere umiddelbart etter bruk. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Induksjon av endometriekreft i iPAD (induserbar Pten, Arid1a dobbel delesjon) mus med doksycyklin
- Oppretthold 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten double deletion (iPAD) transgene mus (figur 1) på en blandet genetisk bakgrunn (129S, BALB/C, C57BL/6), som tidligere beskrevet14.
- Samle baseline ultralyd (2D) bilder av eggstokkene, ovidukten og livmoren til hver mus før doxycyklinbehandling.
- Gi utelukkende doksycyklinholdige musechowdietter (doksycyklinhyklat ved 625 mg / kg mat) til de kvinnelige iPAD-musene i minst 2 uker fra 7-8 ukers alder for å indusere gendelesjon.
2. Oppsett av utstyr
- Slå på varmeputen, og dekk til med en ren absorberende pute (måltemperatur: 38 °C).
- Bekreft at isofluran fordamper ogO2 tank er tilstrekkelig fylt. Påfyll og bytt ut hvis innholdet er lavt.
- Koble induksjonskammeret, nesekjeglen og avtrekkssystemet til fordamperen.
- Sett opp ultralydmaskinen.
- Velg en svinger (sonde) med et område på 32-56 MHz eller opptil 70 MHz for avbildning av henholdsvis livmor eller eggstokk.
- Fest sonden, og slå på maskinen.
- Etter systemoppstart, bruk kontrollpanelet til å logge på med brukeropplysningene og få tilgang til startskjermen.
- Fra startskjermen går du til kategorien Programmer og velger Mus (liten) magemodus.
- Klikk på Skann for å gå tilbake til startskjermen, og vent til et levende bilde vises.
- Velg B-modus fra alternativene på venstre verktøylinje.
- Klikk på Flere kontroller for å vise flere verktøy for bilderaffinering, for eksempel bildeøkning og dybde, eller for å justere innstillingene for klippopptak, for eksempel antall bilder per sekund.
- Når bildeinnstillingene er valgt, går du tilbake til startskjermen ved å klikke på Skann.
- Slå på O2-tanken , styr strømmen til induksjonskammeret og sett strømningshastigheten til 1 l / min.
3. Forberedelse av mus for ultralyd screening, inkludert hårfjerning
- Plasser en mus i induksjonskammeret. Sett isofluran fordamper til 2% -3% vol / vol for induksjon av anestesi.
- Bestem riktig anestesidybde ved manglende respons på tåklemme og en respirasjonsfrekvens rundt 1-2 pust / s.
- Påfør sterilt oftalmisk smøremiddel på hvert øye. Fjern pelsen fra dorsum og ventrum mellom siste ribbe og bekken med klippemaskiner av passende størrelse.
- Påfør et tynt lag hårfjerningskrem på ventral- og dorsale regioner som skal avbildes (om nødvendig).
- Plasser musen tilbake i induksjonskammeret i ca. 3-5 min for å opprettholde riktig anestesidybde mens hårfjerningskremen arbeider for å fjerne håret. Etter ≤4 minutter, tørk forsiktig bort kremen med et rent, fuktig papirhåndkle.
MERK: Lengre eksponering for hårfjerningskrem er irriterende og kan forårsake hudlesjoner.
4. Intraperitoneal injeksjon av væske for å øke kontrasten mellom organer
- Varm en 3-10 ml sprøyte fylt med steril isoton væskeoppløsning (f.eks. steril 0,9 % NaCl eller laktert ringeroppløsning) til 35-40 °C ved å plassere den mellom en varmepute og en absorberende pute i flere minutter. Plasser en flaske ultralydgel på varmeputen hvis maskinen ikke har en varmere.
- For en 20-25 g mus, injiser 1-2 ml oppløsning i bukhulen.
- Fest musen ved skrubben i den ene hånden, og utsett ventrum.
- Hold musen i en ~ 20 ° vinkel, med nesen pekende mot gulvet for å lede organene kranialt på grunn av tyngdekraften.
- Bruk en liten gauge nål (25 G, 5/8 i lengde, tuberkulin sprøyte), punktere gjennom huden og bukveggen i caudal høyre kvadrant av magen.
- Før injeksjon av væsker, for å unngå injeksjon i vaskulaturen eller GI-kanalen, trekk tilbake med minimalt trykk. Hvis blod eller annet materiale kommer inn i sprøyten, fjern nålen. Bruk en ny nål og sprøyte, og prøv igjen i en litt annen posisjon.
- Hvis musen våkner under injeksjonene, plasser den tilbake i det lille induksjonskammeret for anestesi med 2-3 % vol/vol isofluran.
5. Ultralydavbildning fra en dorsaltilnærming
- Plasser musen i ventral liggetid på den absorberende puten over en varmepute (figur 2A-C).
- Plasser en gnagernesekegle sikkert over musens nese og snute. Oppretthold bedøvelsesdybden med isofluran levert gjennom nesekjeglen ved 1% -2% vol / vol i 100% O2. Påfør sterilt oftalmisk smøremiddel, etter behov, til hvert øye.
- Overvåk musen for regelmessig respirasjonsfrekvens (1-2 / s) og mangel på tåklemmrespons for å indikere om anestesien må justeres.
- Plasser en liten mengde (~ 0,5-1 ml) av forvarmet ultralyd gel abaxial (lateral) til ryggraden på hver side av bedøvet mus, mellom den siste ribben og bekkenet.
- Sett en liten mengde gel på ultralydssonden.
- Plasser sonden parallelt med ryggvirvlene med fronten av sonden på kranialsiden. Et indikatormerke er tilstede på sondehodet for å indikere riktig sondeorientering. Registrer dag, klokkeslett, dyre-ID, sondeorientering og dyreside (høyre, venstre, dorsal, ventral) for hvert nytt sett med bilder som samles inn.
- Med en mus i ventral liggetid (dorsumhud som berører sonden), skanner du sakte området for nyrelandemerket (figur 2B og figur 3). Med nyren i sikte, trekk sonden kaudal for å finne eggstokken - en litt hyperekkoisk oval til rund struktur (figur 4A, B) innenfor en veldig hyperekkoisk eggstokkfettpute som grenser kranio-ventralt av nyrene og dorso-lateralt av den dorsale bukveggen.
MERK: Trykk kaudalt og lateralt til eggstokken kan lede eggstokken nærmere bukveggen og bort fra tarmens sløyfer. Eggstokken er anatomisk plassert opp mot den dorsale bukveggen, bare ventral og lateral til epaxial muskulatur og kaudal til nyrene. - Juster signalforsterkningen ved hjelp av glidebryteren nederst på kontrollskjermen for å forbedre bildekontrasten.
- For å forbedre avbildningen av nyrene, bruk trykk med en finger til den kontralaterale magen. Varier trykk og vinkel fra direkte parallell til ryggraden til ~ 20 ° ventral.
- Når organet av interesse er i sikte, samle en video ved å klikke på Lagre klipp eller Start opptak og deretter Stopp opptak når du er ferdig for å beholde bilder på et forhåndsinnstilt antall rammer.
- Lagre enkeltbilder fra enten et levende bilde eller opptak med Lagre ramme-knappen .
- For å avbilde livmoren, trekk sonden kaudalt til eggstokken er i det mest kraniale aspektet av synsfeltet. Varier sondens trykk og vinkel til livmoren er i sikte.
- Gjenta video- og rammesamlingen for hvert organ av interesse.
- Finn livmoren løpende i lengderetningen langs den dorsale bukveggen med lateral leggmuskulatur også i sikte (figur 4B).
MERK: Livmorstørrelsen og lumendiameteren kan variere med østrusfasen og sykdomstilstanden. - Overvåk vevet for peristaltisk bevegelse for å skille tarmsløyfene fra livmorens stasjonære horn.
6. Samle bilder fra en ventral tilnærming
- Plasser musen i liggende rygg, og kontroller at øyesmøringen er tilstrekkelig og at snuten sitter godt i nesekjeglen (figur 2A).
- Påfør en liten mengde (~ 0,5-1 ml) forvarmet ultralydgel på ventral abdomen, og påfør sonden på midtlinjen like kranial av pubis for å lokalisere blæren som et hypoekkoisk landemerke (figur 5).
MERK: Hvis blæren er for stor og skjuler livmoravbildningen, kan det legges forsiktig trykk på underlivet for å uttrykke urin. - Trekk sonden lateralt til blæren for å finne livmorhornene. Påfør lett digitalt trykk fra en eller begge sider av musen for å bringe hornene inn i synsfeltet. Hold sonden vinkelrett på musen, og skann begge sider av magen for å fange tverrgående visninger (tverrsnitt) av begge hornene. Roter sonden for å fange sagittale visninger.
- Etter ultralydet, tørk musen ren av gel med et papirhåndkle, og sett det tilbake til buret for å gjenopprette. Mus er helt våkne på 2-5 min. Når den er helt våken og ambulerende, returner musen til dyrerommet.
NOTAT: En varmepute på lav varme kan plasseres under buret for å varme buret for gjenvinning. - Ved det eksperimentelle eller humane endepunktet, avlive musen. Ideelt sett avlive musen i hjemmeburet for å redusere stress; Alternativt kan du plassere musen i et rent kammer. Lever trykksatt CO2 ved en forskyvningshastighet på 10% -30% av kammervolumet per minutt. Etter ca. 5 min uten synlig respirasjon, verifiser død ved cervikal dislokasjon. Fortsett med abdominal nekropsi for tumorhøsting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten double deletion (iPAD) transgene mus ble opprettholdt på en blandet genetisk bakgrunn (129S, BALB/C, C57BL/6), som tidligere beskrevet14. Musene ble alle fôret med et doksysyklinfôr i 2 uker for å indusere Cre recombinase. I tidligere arbeid av vår gruppe ble doxycyklin dosert av gavage14; Men i denne nåværende studien fungerte doxycyklinfôrinduksjonsmetoden effektivt og reduserte stresset av gavage for musene. Det er viktig å kontrollere at doksysyklinadministrasjonsmetoden er tilstrekkelig til å indusere Cre rekombinase-uttrykket som er nødvendig for å ekskludere DNA for tumorsuppressorer (Arid1a og Pten) i Pax8-uttrykkende celler, slik som livmoren. Immunhistokjemi med antistoffer rettet mot ARID1a og pTEN14 ble brukt for å kontrollere om adekvat tumorsuppressorproteintap ble oppnådd i livmorepitelcellene sammenliknet med det nærliggende stromale vevet, som vist i figur 6. Skjematisk fremstilling av musemodell og regulering av tumorsuppressoruttrykk er presentert i figur 1.
Etter 2 uker med doksysyklin endret ikke livmoren seg signifikant i størrelse sammenlignet med kontroller eller samme mus avbildet før doksysyklinadministrasjon. Likevel, i løpet av de neste 2-6 ukene etter doxycyklin, viste ultralyd at musene utviklet en rekke livmorpatologier, som begynte med hyperplasi og utviklet seg til adenokarsinom. Figur 7A,B viser amerikanske bilder av en muselivmor med tidlige patologiske forandringer sett etter 3 ukers doksysyklinbehandling. Figur 7C,D viser grov patologi og histopatologi av samme livmor avbildet i figur 7A,B etter at musen ble avlivet umiddelbart etter avbildning ved 3 uker. Den mindre (men dilaterte) tynnveggede livmoren og tidlig endometriehyperplasi med bevaring av det distinkte lumen (sentral hyperekkoisk livmorvæske) kan observeres. Hos mus som ble avlivet på senere tidspunkter, var livmoren mye større, hadde et mindre lumen og hadde en fortykket vegg (figur 8 og figur 9). Eksempler på dilatert lumen og subtile forandringer i hyperplastisk endometrium sammenlignes med tett vev og nodulær kreftvekst i livmoren i figur 8 og figur 9. Ultralyd- og grovbildene var svært konsistente med hverandre for alle de representerte musene. Figur 9 presenterer flere livmorbilder fra samme mus i en tidsløpsstudie og viser de morfologiske forandringene som ble observert over 6 uker etter hvert som adenokarsinom utviklet seg. Figur 5 viser en ventral tilnærming med tverrsnitt av livmorhornene ved siden av hypoekkoisk blære.
For å øke kontrasten i magen, forbedret injeksjon av saltvann i bukhulen rett før avbildning visualiseringen av bukorganene, inkludert livmor og eggstokkene. Figur 3 viser ultralydsammenligninger fra samme mus før og etter injeksjon av 1 ml saltvann. Med saltvann var det et økt hypoekkoisk mellomrom (svart) mellom organene som tillot nyre, fettpute, eggstokk, livmorhorn, tarm og milt å bli lettere individualisert fra hverandre. I alle de andre figurene som presenteres her, ble saltvannsinjeksjoner gjort før avbildning for å forbedre bildeklarheten.
Samlet viser denne protokollen at denne induserbare musemodellen utvikler adenokarsinom over en 6 ukers periode og kan overvåkes med ultralyd for å etablere en baseline og observere morfologiske endringer i livmoren når kreften utvikler seg. Her er det demonstrert at ikke-invasiv ultralyd gjør det mulig for livmorhornene i en mus å bli serielt vurdert over flere uker med bilder som predikterer de faktiske livmorpatologiske forandringene.
Figur 1: Strategi for generering av Pax8-Cre induserbare doble KO transgene mus. (A) Den konstitutive produksjonen av en omvendt tetracyklinkontrollert transaktivator (rtTA) i Pax8-uttrykkende livmorepitelceller resulterer i induserbar aktivering av Cre rekombinase i nærvær av tetracyklin, eller dets analoge doksycyklin, ved binding til tetracyklinresponselementer (TRE). Flox nettsteder som ligger oppstrøms og nedstrøms for ekson 8 (Arid1a) og ekson 5 (Pten) er målrettet av Cre recombinase. Cre-målrettet sletting av ekson 8 i Arid1a resulterer i en frameshift-mutasjon og et tidlig stoppkodon (p.Gly809Hisfs*6). Cre-målrettet sletting av ekson 5 i Pten resulterer i en frameshift-mutasjon (p.Val85Glyfs*14). (B) Pax8-rtTA-musen uttrykker en omvendt tetracyklinkontrollert transaktivator (rtTA) under kontroll av Pax8-promotoren. Denne musen krysses med TetO-Cre-musen som uttrykker Cre recombinase på en tetracyklinavhengig måte. Avkommet fra denne krysningen uttrykker en tetracyklin (eller doksysyklin)-aktivert Cre rekombinase spesifikk for Pax8-uttrykkende livmorepitelceller (Pax8-Cre transactivator). (C) Arid1a flox / flox mus på 129S1 bakgrunnen ble krysset med Pten flox / flox på BALB / C bakgrunn (stamme C; 129S4-Ptentm1Hwu / J) for å generere Arid1a flox / flox / Pten flox / flox transresponder mus. (D) Pax8-Cre transactivator musen krysses med en Arid1a flox / flox / Ptenflox / flox Transresponder mus. Avkom fra denne krysningen resulterer i en transgen murinmodell med en doksysyklininduserbar Arid1a og Pten delesjon (iPAD) spesifikk for livmorepitelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Avbildningsprosedyre . (A) En bedøvet mus med buk- og dorsalpels fjernet med en klipper og hårfjerningskrem. Musen vedlikeholdes på isoflurananestesi til sniffestoffer via en nesekjegle og plasseres på en varmepute dekket med en absorberende pute. (B) En liten mengde forvarmet ultralydgel plasseres over interesseområdet på musen og på sonden. Her er musen i ventral recumbency, og sonden er riktig plassert for å lokalisere nyren, det anatomiske landemerket direkte kranialt til eggstokken. (C) I dorsalleie kan sonden manipuleres manuelt for først å finne landemerker som blæren for å finne den omtrentlige plasseringen av livmorhornene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bedring av synlighet og organdefinisjon ved injeksjon av saltvann. (A) Bilde av en nyre og løkker i GI-kanalen (nederst til venstre) før IP-injeksjonen av 1,5 ml oppvarmet, sterilt saltvann. Venstre side av bildet er kranial til nyrene. (B) Bilde av nyrene etter saltvannsinjeksjonen, som viser økt (hypoekkoisk rom, svart) mellom organene. For begge bildene, når det gjelder retningen, er musen dorsalflate opp, og kranial til kaudal er venstre til høyre. (C,D) Den uthevede røde delen viser nyrelandemerker i 2D-bildene som presenteres i A og B. Bildene ble tatt med en MS550-svinger. Skalastenger = 2 mm i hvert bilde. Forkortelser: GI-kanalen = mage-tarmkanalen; IP = intraperitoneal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Reproduksjonskanal med landemerker . (A) Eggstokken (pilen) ligger umiddelbart kaudal til kaudal pol av nyrene. (B) Livmorhornet (smal pil) er dypt og begynner kranialt til ryggmuskulaturen i den proksimale baklemmen (pilspissen), med eggstokken også i sikte (større pil). Skalastenger = 2 mm. For alle bildene, når det gjelder orientering, er musen dorsalflate opp, og kranial til kaudal er venstre til høyre. Bildene ble tatt med en MS550-svinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Livmorhorn og blære avbildet fra dorsalhvile. Ultralydbilder fra to mus før kreftinduksjon. (A) Blærelumen er synlig som en hypoekkoisk, ovoid struktur med en hyperekkoisk slimhinne. Begge livmorhornene er synlige sammen, med grensene til hver sporet i lyseblått. (B) Det samme synet i en annen mus med en mye fyldigere blære. For begge bildene, når det gjelder orientering, er musen ventral overflate opp, og bildet til venstre er musen til venstre. Grensene for hvert livmorhorn er tegnet i lyseblått, med områder angitt i de nærliggende tekstboksene (MS550-svinger). Skalastenger = 3 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempler på H&E og immunhistokjemi av uterussnitt 6 uker etter induksjon i iPAD-mus. (A) Representativ H&E for iPAD-musens livmorvev. (B) Representant ARID1a immunhistokjemi. Fargingen viser tap av Arid1a spesifikt for kjernene til Pax8-uttrykkende livmorepitelceller (svart pil), med retensjon av Arid1a i kjernene i stromale celler i livmoren (hvit pil). (C) Representativ pTEN immunhistokjemi. Fargingen viser tap av pTEN i cytoplasma av Pax 8-uttrykkende livmorepitelceller (svart pil), med retensjon av pTEN i cytoplasma av livmorstromale celler (hvit pil). Detaljerte IHC-metoder er tidligere publisert14. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: iPAD = induserbar Pten, Arid1a dobbel sletting; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Eksempler på ultralydbilder fra mus med tidlige endringer i patologi. (A,B) Antemortem ultralydbilde av en livmor fylt med livmorvæske som er naturlig hyperekkoisk De smale pilene indikerer det hypoekkoiske, dilaterte lumen i livmoren. Pilspissen indikerer det fortykkede området av livmorveggen. (C) Grovt bilde av hele livmoren fra musen avbildet i B. Den hvite stjernen er omtrent på samme sted som den som er avbildet i A. (D) I den samme musen ble livmoren behandlet og farget med H&E. Histologiseksjonen viser fortykkelse av livmorveggen på grunn av endometrisk hyperplasi; Eksempelområdet angis med et pilhode. For alle de amerikanske bildene, når det gjelder orientering, er musen dorsaloverflaten opp, og kranial til kaudal er venstre til høyre (MS550-svinger). Skalastenger = (A,B) 3 mm; (D) 500 μm. Forkortelser: US = ultralyd; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Mangfold av livmorpatologi synlig ved ultralyd . (A) En livmor med hyperplasi og væskedistensjon som forårsaker luminal dilatasjon til en diameter på ~ 2,5 mm. (B) En annen livmor med hyperplasi som er distendert i større grad. (C) En livmor som er både utvidet og fylt med en bløtvevsmasse. Skalastenger = 3 mm. For alle bildene er pilene til den ventrale siden av livmorhornet, og når det gjelder bilderetningen, er musen dorsalflate opp, og kranial til kaudal er venstre mot høyre (MS550-svinger). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Forandringer i uterusens neoplastiske utvikling over tid hos én mus. (A) Ultralydbilde av en iPAD-mus som viser nyrene (bredere pil), eggstokkene (kaudal til nyre) og livmor (smal pil), med benmuskelen også synlig (pilspiss), fanget på tre tidspunkter: etter at musen ble startet på en doksysyklindiett (uke 0), og så igjen etter 5 uker og 6 uker. Doxycyklin induserte Cre-uttrykk med tumorsuppressortap, som fremmer endometriekreft over tid. (B) De samme ultralydbildene som A, men med livmorhornet uthevet i rødt. (C) Grove bilder av livmoren in situ (smal pil) fra 6 ukers tidspunkt; Vevet ses fra ventraloverflaten. (D) samme livmor som i C dissekert ex vivo; Vevet ses fra ventraloverflaten. (E) Histologi av livmormassen (H&E-flekken), som indikerer adenokarsinom fra dette eksemplet. For A og B, når det gjelder orientering, er musen dorsalflate opp, og kranial til kaudal er venstre til høyre (MS550-svinger). Skalastenger = (A,B, de to første bildene i hver rad) 1 mm; (A, B, tredje bilde) 2 mm; (E) 500 μm. Forkortelser: iPAD = induserbar Pten, Arid1a dobbel sletting; H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen undersøker nytten av ultralyd for å vurdere livmormorfologiske endringer i utviklingen av adenokarsinom i livmoren hos mus. I denne studien, ved å følge induksjon av endometriekreft hos mus langsgående, ble de anatomiske detaljene oppdaget ved ultralyd funnet å være indikatorer på brutto og histologisk patologi. Dette åpner døren for bruk av longitudinelle studier med mindre antall mus overvåket av ultralyd på flere tidspunkter for å følge utviklingen av livmorkreft hos mus. Denne langsgående deteksjonen ble oppnådd ved hjelp av en håndholdt sonde og uten bruk av ultralydutstyr for skinnesystem. De høyfrekvente probene (transduserne) som brukes er allment tilgjengelige, noe som gjør denne tilnærmingen reproduserbar ved flere institusjoner over hele verden. Kritiske trinn i protokollen inkluderer bruk av riktig sonde for oppløsningsnivået som kreves for eksperimentet og forbereder musen for avbildning før ultralydet.
Kritiske trinn i å forberede musen fjerner alt håret fra studieområdene og injiserer væske inn i bukhulen. Pels igjen på huden kan føre til fangst av bobler i ultralydgelen, som kan produsere gjenstander i bildene; Derfor bør det tas hensyn til å fjerne håret jevnt over studieområdet. Hårfjerningskrem ble valgt som metode for hårfjerning da den fjerner pelsen jevnt over huden. Skader på huden kan oppstå hvis kremen blir liggende på huden i for lang tid (>3-4 min). Hos mus som er mer følsomme for hårfjerningskrem, bør kremen bare stå på huden i 1-2 min for å fjerne håret. Deretter skal musen tørkes med en serie våte papirhåndklær for å fjerne kremet helt. Etter at alt håret er fjernet fra studieområdet, injiseres sterile, varme isotoniske væsker i det intraperitoneale hulrommet for å øke kontrasten og hjelpe til med å definere grensene til bukorganene. I denne studien var injeksjon av 1-2 ml væske tilstrekkelig til å skille eggstokk-, ovidukt- og livmorhornene. Væsken absorberes gradvis, og det er best å injisere umiddelbart før avbildning. Mus blir raskt hypoterme under isoflurananestesi. Dette kan forebygges ved å injisere varmt saltvann (lagret i sprøyter på en varmepute) og ved også å plassere musen på en varmepute og forvarme ultralydgelen når det er mulig. Bildebehandling med erfarne sonografer går på 5-10 min / mus, og med denne korte tiden oppstod ikke signifikant hypotermi. Om nødvendig kan opptil ytterligere 2 ml saltvann injiseres i magen for større separasjon av organene.
Metodene beskrevet her er ment å være lett reproduserbare uten spesialutstyr utover ultralydmaskinen og sonden(e). I den presenterte metoden manipuleres sonden manuelt gjennom uten hjelp fra et skinnesystem. Denne manuelle metoden er raskere og gir stor fleksibilitet i vinklene og trykket som brukes for å markere små funksjoner. Manuell styring av sonder over magen og bruk av transdusere med lavere oppløsning kan begrense kvaliteten på individuelle bilder som er oppnådd sammenlignet med bilder fra en svinger festet på skinnesystemet4. Et skinnesystem vil være nyttig for injeksjoner i livmoren (i fostre) eller intrakardiale injeksjoner når mer stabilitet er nødvendig. Det er imidlertid en avveining om minimal manipulasjonstid og økt tilgjengelighet for det brede spekteret av institusjoner som mangler spesialiserte ultralydfasiliteter. Suksessen til denne forenklede metoden eksemplifiserer hvordan ultralyd kan brukes til en rekke studier. Den foreslåtte metoden er velegnet for å fange langsgående vevsendringer i livmorkreftmodeller uten krav om dedikert utstyr og kan brukes på andre progressive sykdomsmodeller. Manuell manipulering av musene under avbildning kan øke variabiliteten i nøyaktig vevsdybde og plassering, men for studier som ikke stoler på disse faktorene, er bildekvaliteten tilstrekkelig til å oppdage patologiske forandringer.
Det er viktig å lagre videoer under bildebehandling; Senere på brukerens arbeidsstasjon kan videoene stoppes i en hvilken som helst ramme som er representativ for anatomien som må fanges og måles. Bilder av organene kan måles (diameter, omkrets eller lengde) (figur 5, livmorhorntverrsnitt målt), og svulstområdet kan beregnes. Videoer, mer enn enkeltbilder, letter identifiseringen av organer i større anatomisk sammenheng. Videoer er også nyttige for å bestemme bevegelsen av de små og store tarmene, noe som kan bidra til å skille tarmene fra livmoren. Å skaffe bilder av høy kvalitet avhenger også av kjennskap til museanatomi. For avbildning av bevegelig livmor versus avbildning av mer stasjonært vev (f.eks. en implantert xenografttumor, eggstokkene), har den manuelle metoden fordelen av å skanne og følge livmorhornene fra proksimal til distal. Under skanning kan gradvis justering av håndvinklene brukes til å følge hornet. MS550-sonden ble brukt til all avbildning i denne studien og er å foretrekke for livmoren sammenlignet med MS700-sonden med høyere oppløsning, noe som er bedre for eggstokkene. Arbeid med MS700 til å avbilde musens skjoldbruskkjertel har nylig blitt publisert, og viser den høye oppløsningen som er mulig i andre vev15. Håndholdt sondeavbildning er nyttig på grunn av varierende grad av vevsdybde i livmoren mellom eggstokken og blæren. I dette arbeidet ble det å bevege seg mellom lett gjenkjennelige anatomiske landemerker, som nyren og den proksimale bakbensanatomien, hjulpet til med å fange sammenlignbare bilder over de forskjellige tidspunktene når man avbilder livmoren fra det dorsale aspektet på kroppen.
Denne høyoppløselige ultralydmetoden for å følge de anatomiske endringene i livmoren over tid under tumorigenese, er bedre enn dagens metoder som involverer euthanisering av dyr fra flere kohorter på forskjellige tidspunkter. Ultralyd forbedrer modellen og reduserer antall mus som trengs for forsøket, og reduserer dermed kostnader og tid. Det er viktig at denne metoden gjør det mulig å følge sykdomsprogresjon på individnivå, noe som kan føre til innsikt som maskeres i studier avhengig av kohorter ofret etter tidspunkt i stedet for sykdomsstadium. På grunn av sin ikke-invasive natur har mus ultralyd mange potensielle bruksområder for forskning i livmor- eller eggstokkreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for finansiering fra NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, postdoktorale opplæringsprogram 5T32OD011089, og Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Prosjektet ble også delvis finansiert av tilskudd til løpende utgifter til private institusjoner for høyere utdanning fra Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
