Summary
Questo protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione dei cambiamenti morfologici nel tempo nell'utero in un modello murino inducibile di cancro dell'endometrio utilizzando l'imaging ad ultrasuoni con correlazione ai cambiamenti grossolani e istologici.
Abstract
I tumori uterini possono essere studiati nei topi a causa della facilità di manipolazione e manipolazione genetica in questi modelli. Tuttavia, questi studi sono spesso limitati a valutare la patologia post-mortem negli animali sottoposti a eutanasia in più punti temporali in diverse coorti, il che aumenta il numero di topi necessari per uno studio. L'imaging dei topi negli studi longitudinali può monitorare la progressione della malattia nei singoli animali, riducendo il numero di topi necessari. I progressi nella tecnologia a ultrasuoni hanno permesso di rilevare cambiamenti a livello micrometrico nei tessuti. L'ecografia è stata utilizzata per studiare la maturazione del follicolo nelle ovaie e la crescita dello xenotrapianto, ma non è stata applicata ai cambiamenti morfologici nell'utero del topo. Questo protocollo esamina la giustapposizione della patologia con confronti di imaging in vivo in un modello murino di cancro dell'endometrio indotto. Le caratteristiche osservate dagli ultrasuoni erano coerenti con il grado di cambiamento osservato dalla patologia grossolana e dall'istologia. L'ecografia è risultata altamente predittiva della patologia osservata, supportando l'incorporazione dell'ecografia negli studi longitudinali delle malattie uterine come il cancro nei topi.
Introduction
I topi rimangono uno dei modelli animali più importanti per i disturbi riproduttivi 1,2,3. Esistono diversi modelli di roditori geneticamente modificati o indotti di tumori ovarici e uterini. Questi studi in genere si basano su più coorti eutanasiche in diversi punti temporali per catturare le tendenze longitudinali nei cambiamenti morfologici e patologici. Ciò impedisce la capacità di acquisire dati continui sullo sviluppo del cancro in un singolo topo. Inoltre, senza conoscere lo stato di progressione della malattia del singolo topo, gli studi di intervento si basano su punti temporali predeterminati e risultati medi di coorti precedenti piuttosto che soglie individuali per il rilevamento della progressione in un animale specifico 4,5. Pertanto, sono necessari approcci di imaging che consentano la valutazione longitudinale negli animali vivi per facilitare i modelli preclinici per testare nuovi farmaci o composti e accelerare la comprensione della patobiologia, aumentando al contempo il rigore e la riproducibilità6.
L'ecografia (US) è un metodo interessante per il monitoraggio longitudinale della progressione del cancro uterino del topo perché è relativamente facile e poco costoso rispetto ad altri metodi di imaging, è facile da eseguire e può avere una notevole risoluzione 6,7. Questa modalità non invasiva può catturare caratteristiche su scala micron in topi svegli o con topi sotto breve sedazione utilizzando un esame di 5-10 minuti. La microscopia ecografica è stata validata come metodo per misurare lo sviluppo del follicolo ovarico di topo 8 e la crescita di neoplasie impiantate o indotte 9,10,11. L'US ad alta frequenza è stata utilizzata anche per iniezioni intrauterine percutanee12 e per osservare il cambiamento uterino del ratto durante il ciclo di estro13. Gli US ad alta frequenza possono essere utilizzati con mouse tenuti su piattaforme fisse specializzate utilizzando un sistema di binari per tenere il trasduttore / sonda per catturare immagini ad alta risoluzione con posizione e pressione standardizzate; Tuttavia, questa apparecchiatura non è disponibile in tutte le istituzioni. I metodi di scansione dei trasduttori portatili possono essere adottati con apparecchiature meno dedicate e utilizzati sia per la diagnostica clinica che per le applicazioni di ricerca nei topi.
Rimane la domanda se l'imaging statunitense con sonde portatili ad alta frequenza possa essere utilizzato per monitorare lo sviluppo del cancro uterino per più settimane. Simile all'intestino, l'utero del roditore è una struttura sottile e sottile che è molto mobile all'interno dell'addome ed è contigua attraverso più profondità di tessuto, rendendo l'imaging più difficile rispetto a organi relativamente immobili come i reni. Questo studio ha cercato di stabilire la correlazione tra i tessuti osservati dagli ultrasuoni e dall'istopatologia, definire i punti di riferimento per localizzare l'utero del topo e determinare la fattibilità della valutazione longitudinale del cancro dell'endometrio. Questo studio presenta dati che mostrano una corrispondenza qualitativa tra l'aspetto dell'utero ripreso da US e l'istopatologia, nonché l'imaging seriale dei topi per diverse settimane. Questi risultati indicano che gli US portatili possono essere utilizzati per monitorare lo sviluppo del cancro dell'endometrio nei topi, creando così un'opportunità per raccogliere dati longitudinali sui singoli topi per studiare il cancro uterino senza la necessità di attrezzature dedicate.
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Protocol
Tutte le procedure e gli esperimenti che coinvolgono i topi sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Per tutte le procedure, sono stati indossati DPI appropriati, compresi guanti e camici isolanti monouso. Sono state prese precauzioni durante la manipolazione di oggetti taglienti, che sono stati smaltiti correttamente in contenitori di taglienti a scatola rossa immediatamente dopo l'uso. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo.
1. Induzione del cancro dell'endometrio in topi iPAD ( Pten inducibile, doppia delezione Arid1a ) con doxiciclina
- Mantenere 10 topi transgenici a doppia delezione (iPAD) Pax8-Cre-Arid1a-Pten (Figura 1) su un background genetico misto (129S, BALB/C, C57BL/6), come descritto in precedenza14.
- Raccogliere immagini ecografiche di base (2D) delle ovaie, dell'ovidotto e dell'utero di ciascun topo prima del trattamento con doxiciclina.
- Fornire esclusivamente diete di topo contenenti doxiciclina (doxiciclina iclato a 625 mg/kg di mangime) ai topi femmina iPAD per un minimo di 2 settimane a partire da 7-8 settimane di età per indurre la delezione genica.
2. Configurazione dell'attrezzatura
- Accendere il termoforo e coprire con un tampone assorbente pulito (temperatura target: 38 °C).
- Verificare che il vaporizzatore isoflurano e il serbatoio O2 siano adeguatamente riempiti. Riempire e sostituire se il contenuto è basso.
- Collegare la camera di induzione, il cono del naso e il sistema di scavenging al vaporizzatore.
- Configurare la macchina ad ultrasuoni.
- Selezionare un trasduttore (sonda) con un intervallo di 32-56 MHz o fino a 70 MHz per l'imaging dell'utero o dell'ovaio, rispettivamente.
- Collegare la sonda e accendere la macchina.
- Dopo l'avvio del sistema, utilizzare il pannello di controllo per accedere con le credenziali utente e accedere alla schermata iniziale.
- Dalla schermata iniziale, vai alla scheda Applicazioni e seleziona Modalità addome (piccolo) del mouse.
- Fare clic su Scansione per tornare alla schermata iniziale e attendere che venga visualizzata un'immagine dal vivo.
- Seleziona B-Mode dalle opzioni sulla barra degli strumenti a sinistra.
- Fare clic su Altri controlli per visualizzare strumenti aggiuntivi per il perfezionamento dell'immagine, come il guadagno e la profondità dell'immagine, o per regolare le impostazioni di acquisizione della clip, ad esempio il numero di fotogrammi al secondo.
- Una volta selezionate le impostazioni dell'immagine, tornare alla schermata iniziale facendo clic su Scansione.
- Accendere il serbatoio O2 , dirigere il flusso verso la camera di induzione e impostare la portata su 1 L/min.
3. Preparazione di topi per lo screening ecografico, compresa la depilazione
- Posizionare un mouse nella camera di induzione. Impostare il vaporizzatore isoflurano al 2%-3% vol/vol per l'induzione dell'anestesia.
- Determinare la profondità appropriata dell'anestesia da una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e una frequenza respiratoria intorno a 1-2 respiri / s.
- Applicare lubrificante oftalmico sterile su ciascun occhio. Rimuovere la pelliccia dal dorso e dal ventrum tra l'ultima costola e il bacino con tosatrici di dimensioni appropriate.
- Applicare un sottile strato di crema depilatoria sulle regioni ventrale e dorsale da visualizzare (se necessario).
- Rimettere il mouse nella camera di induzione per circa 3-5 minuti per mantenere la profondità appropriata dell'anestesia mentre la crema depilatoria lavora per rimuovere i capelli. Dopo ≤4 minuti, pulire delicatamente la crema con un tovagliolo di carta umido pulito.
NOTA: L'esposizione prolungata alla crema depilatoria è irritante e può causare lesioni cutanee.
4. Iniezione intraperitoneale di liquido per aumentare il contrasto tra gli organi
- Riscaldare a 35-40 °C una siringa da 3-10 mL riempita con una soluzione di liquido isotonico sterile (ad es. soluzione sterile di NaCl allo 0,9% o di suonerie lattate) posizionandola tra una piastra riscaldante e un tampone assorbente per diversi minuti. Posizionare una bottiglia di gel per ultrasuoni sulla piastra riscaldante se la macchina non ha uno scaldavivande.
- Per un topo da 20-25 g, iniettare 1-2 ml di soluzione nella cavità peritoneale.
- Fissare il mouse per la collottola in una mano, esponendo lo sventro.
- Tenere il mouse con un angolo di ~ 20 °, con il naso puntato verso il pavimento per dirigere gli organi cranialmente a causa della gravità.
- Utilizzando un ago di piccolo calibro (25 G, 5/8 di lunghezza, siringa di tubercolina), perforare la pelle e la parete addominale del quadrante caudale destro dell'addome.
- Prima dell'iniezione di liquidi, per evitare l'iniezione nel sistema vascolare o nel tratto gastrointestinale, tirare indietro con una pressione minima. Se sangue o altro materiale entra nella siringa, rimuovere l'ago. Usi un ago e una siringa nuovi e riprovi in una posizione leggermente diversa.
- Se il topo si sveglia durante le iniezioni, rimetterlo nella piccola camera di induzione per l'anestesia con isoflurano 2% -3% vol/vol.
5. Imaging ecografico da un approccio dorsale
- Posizionare il mouse in posizione ventrale sdraiata sul tampone assorbente sopra una piastra riscaldante (Figura 2A-C).
- Posizionare un cono del naso del roditore in modo sicuro sul naso e sul muso del topo. Mantenere la profondità dell'anestetico con isoflurano erogato attraverso il cono del naso a 1% -2% vol / vol in 100% O2. Applicare lubrificante oftalmico sterile, se necessario, su ciascun occhio.
- Monitorare il mouse per una frequenza respiratoria regolare (1-2 / s) e una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi per indicare se l'anestesia deve essere regolata.
- Posizionare una piccola quantità (~ 0,5-1 ml) di gel abassiale ad ultrasuoni preriscaldato (laterale) sulla colonna vertebrale su entrambi i lati del topo anestetizzato, tra l'ultima costola e il bacino.
- Metti una piccola quantità di gel sulla sonda ad ultrasuoni.
- Posizionare la sonda parallelamente alle vertebre con la parte anteriore della sonda sul lato cranico. Un segno indicatore è presente sulla testa della sonda per indicare il corretto orientamento della sonda. Registrare il giorno, l'ora, l'ID dell'animale, l'orientamento della sonda e il lato dell'animale (destro, sinistro, dorsale, ventrale) per ogni nuova serie di immagini raccolte.
- Con un topo in posizione reclinata ventrale (pelle dorsale che tocca la sonda), scansionare lentamente l'area per il punto di riferimento del rene (Figura 2B e Figura 3). Con il rene in vista, tirare la sonda caudale per trovare l'ovaio, una struttura ovale o rotonda leggermente iperecogena (Figura 4A, B) all'interno di un cuscinetto di grasso ovarico molto iperecogeno che è delimitato cranio-ventralmente dal rene e dorso-lateralmente dalla parete addominale dorsale.
NOTA: La pressione caudale e laterale all'ovaio può dirigere l'ovaio più vicino alla parete addominale e lontano dalle anse dell'intestino. L'ovaio è anatomicamente posizionato contro la parete addominale dorsale, appena ventrale e laterale ai muscoli epaxiali e caudale al rene. - Regola il guadagno del segnale utilizzando il cursore nella parte inferiore dello schermo di controllo per migliorare il contrasto dell'immagine.
- Per migliorare l'imaging del rene, applicare pressione con un dito sull'addome controlaterale. Variare la pressione e l'angolo da direttamente parallelo alla colonna vertebrale a ~ 20 ° ventrale.
- Una volta che l'organo di interesse è in vista, raccogli un video facendo clic su Salva clip o Avvia registrazione e quindi Interrompi registrazione al termine per conservare le immagini a un numero preimpostato di fotogrammi.
- Salva singoli fotogrammi da un'immagine live o da una registrazione con il pulsante Salva fotogramma .
- Per visualizzare l'utero, tirare la sonda caudalmente fino a quando l'ovaio è nell'aspetto più cranico del campo visivo. Variare la pressione e l'angolo della sonda fino a quando l'utero è in vista.
- Ripeti la raccolta di video e fotogrammi per ogni organo di interesse.
- Trova l'utero che corre longitudinale lungo la parete addominale dorsale con la muscolatura laterale della gamba anche in vista (Figura 4B).
NOTA: La dimensione dell'utero e il diametro del lume possono variare con la fase di estro e lo stato di malattia. - Monitorare il tessuto per il movimento peristaltico per differenziare le anse intestinali dalle corna stazionarie uterine.
6. Raccogli immagini da un approccio ventrale
- Posizionare il topo in posizione dorsale sdraiata e verificare che la lubrificazione oculare sia sufficiente e che il muso sia saldamente nel cono del naso (Figura 2A).
- Applicare una piccola quantità (~ 0,5-1 ml) di gel ecografico preriscaldato sull'addome ventrale e applicare la sonda sulla linea mediana appena craniale del pube per individuare la vescica come punto di riferimento ipoecogeno (Figura 5).
NOTA: Se la vescica è troppo grande e oscura l'imaging dell'utero, è possibile esercitare una leggera pressione sull'addome inferiore per esprimere l'urina. - Tirare la sonda lateralmente alla vescica per trovare le corna uterine. Applicare una leggera pressione digitale da uno o entrambi i lati del mouse per portare le trombe nel campo visivo. Tenere la sonda perpendicolare al mouse e scansionare entrambi i lati dell'addome per catturare viste trasversali (sezioni trasversali) di entrambe le corna. Ruotare la sonda per acquisire viste sagittali.
- Dopo l'ecografia, pulire il mouse dal gel con un tovagliolo di carta e riportarlo nella sua gabbia per recuperare. I topi sono completamente svegli in 2-5 minuti. Una volta che è completamente sveglio e deambulante, riporta il topo nella stanza degli animali.
NOTA: Una piastra riscaldante a fuoco basso può essere posizionata sotto la gabbia per riscaldare la gabbia per il recupero. - Al punto finale sperimentale o umano, eutanasia del topo. Idealmente, eutanasia il topo nella gabbia di casa per ridurre lo stress; In alternativa, posizionare il mouse in una camera pulita. Erogare CO2 pressurizzato a una velocità di spostamento del 10%-30% del volume della camera al minuto. Dopo circa 5 minuti di assenza di respirazione visibile, verificare la morte per lussazione cervicale. Procedere con l'autopsia addominale per la raccolta del tumore.
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Representative Results
I topi transgenici a doppia delezione (iPAD) Pax8-Cre-Arid1a-Pten sono stati mantenuti su un background genetico misto (129S, BALB/C, C57BL/6), come descritto in precedenza14. I topi sono stati tutti alimentati con doxiciclina per 2 settimane per indurre Cre ricombinasi. In precedenti lavori del nostro gruppo, la doxiciclina è stata dosata con sonda gastrica14; Tuttavia, in questo studio, il metodo di induzione del mangime per doxiciclina ha funzionato in modo efficiente e ha ridotto lo stress del gavage per i topi. È importante verificare che il metodo di somministrazione della doxiciclina sia adeguato per indurre l'espressione di Cre ricombinasi necessaria per asportare il DNA per i soppressori tumorali (Arid1a e Pten) nelle cellule che esprimono Pax8, come l'utero. L'immunoistochimica con anticorpi diretti contro ARID1a e pTEN14 è stata utilizzata per verificare se fosse stata raggiunta un'adeguata perdita di proteina oncosoppressore nelle cellule epiteliali uterine rispetto al tessuto stromale vicino, come mostrato nella Figura 6. Lo schema del modello murino e la regolazione dell'espressione oncosoppressore sono presentati nella Figura 1.
Dopo 2 settimane di doxiciclina, l'utero non è cambiato significativamente in termini di dimensioni rispetto ai controlli o allo stesso topo fotografato prima della somministrazione di doxiciclina. Tuttavia, nelle successive 2-6 settimane dopo la doxiciclina, l'ecografia ha mostrato che i topi hanno sviluppato una serie di patologie uterine, iniziando con l'iperplasia e progredendo verso l'adenocarcinoma. La figura 7A,B mostra le immagini statunitensi di un utero di topo con cambiamenti patologici precoci osservati dopo 3 settimane di trattamento con doxiciclina. La Figura 7C,D mostra la patologia grossolana e l'istopatologia dello stesso utero fotografate nella Figura 7A,B dopo che il topo è stato eutanasia immediatamente dopo l'imaging a 3 settimane. Si possono osservare l'utero a parete sottile più piccolo (ma dilatato) e l'iperplasia endometriale precoce con conservazione del lume distinto (liquido uterino iperecogeno centrale). Nei topi sottoposti a eutanasia in momenti successivi, l'utero era molto più grande, aveva un lume più piccolo e aveva una parete ispessita (Figura 8 e Figura 9). Esempi di lumi dilatati e sottili cambiamenti nell'endometrio iperplastico sono confrontati con la crescita del tessuto denso e del cancro nodulare nell'utero nella Figura 8 e nella Figura 9. Gli ultrasuoni e le immagini grossolane erano altamente coerenti tra loro per tutti i topi rappresentati. La Figura 9 presenta più immagini dell'utero dallo stesso topo in uno studio del corso del tempo e dimostra i cambiamenti morfologici osservati nell'arco di 6 settimane con lo sviluppo dell'adenocarcinoma. La figura 5 presenta un approccio ventrale con sezioni trasversali delle corna uterine adiacenti alla vescica ipoecogena.
Per migliorare il contrasto nell'addome, l'iniezione salina nella cavità addominale direttamente prima dell'imaging ha migliorato la visualizzazione degli organi addominali, tra cui l'utero e le ovaie. La figura 3 mostra i confronti ecografici dello stesso topo prima e dopo l'iniezione di 1 mL di soluzione salina. Con la soluzione salina, c'era un aumento dello spazio ipoecogeno (nero) tra gli organi che consentiva al rene, al cuscinetto adiposo, all'ovaio, alle corna uterine, all'intestino e alla milza di essere più facilmente individualizzati l'uno dall'altro. In tutte le altre figure qui presentate, le iniezioni saline sono state eseguite prima dell'imaging per migliorare la chiarezza dell'immagine.
Nel complesso, questo protocollo mostra che questo modello murino inducibile sviluppa adenocarcinoma per un periodo di 6 settimane e può essere monitorato con ultrasuoni per stabilire una linea di base e osservare i cambiamenti morfologici nell'utero mentre il cancro si sviluppa. Qui, è dimostrato che l'ecografia non invasiva consente di valutare in serie le corna uterine in un topo per più settimane con immagini predittive degli effettivi cambiamenti patologici uterini.
Figura 1: Strategia per la generazione di topi transgenici doppi KO inducibili da Pax8-Cre. (A) La produzione costitutiva di un transattivatore controllato con tetraciclina inversa (rtTA) nelle cellule epiteliali uterine che esprimono Pax8 determina l'attivazione inducibile della Cre ricombinasi in presenza di tetraciclina, o della sua doxiciclina analogica, legandosi agli elementi di risposta della tetraciclina (TRE). I siti flox situati a monte e a valle dell'esone 8 (Arid1a) e dell'esone 5 (Pten) sono presi di mira dalla Cre ricombinasi. La delezione mirata a Cre dell'esone 8 in Arid1a provoca una mutazione frameshift e un codone di arresto precoce (p.Gly809Hisfs*6). La delezione mirata a Cre dell'esone 5 in Pten provoca una mutazione frameshift (p.Val85Glyfs*14). (B) Il topo Pax8-rtTA esprime un transattivatore controllato da tetraciclina inversa (rtTA) sotto il controllo del promotore Pax8. Questo topo è incrociato con il topo TetO-Cre che esprime Cre ricombinasi in modo tetraciclina-dipendente. La progenie di questo incrocio esprime una Cre ricombinasi attivata da tetraciclina (o doxiciclina) specifica per le cellule epiteliali uterine che esprimono Pax8 (transattivatore Pax8-Cre). (C) I topi flox/flox Arid1a sullo sfondo 129S1 sono stati incrociati con Pten flox/flox sullo sfondo BALB/C (Ceppo C;129S4-Ptentm1Hwu/J) per generare il mouse transresponder Arid1a flox/flox/Pten flox/flox. (D) Il mouse transattivatore Pax8-Cre è incrociato con un mouse Arid1a flox/flox/Ptenflox/flox Transresponder. La progenie di questo incrocio ha portato a un modello murino transgenico con una delezione inducibile da doxiciclina Arid1a e Pten (iPAD) specifica per le cellule epiteliali uterine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Procedura di imaging . (A) Un topo anestetizzato con la pelliccia addominale e dorsale rimossa con un tagliacapelli e una crema depilatoria. Il topo viene mantenuto in anestesia isoflurana inalante tramite un cono nasale e posto su un termoforo coperto da un tampone assorbente. (B) Una piccola quantità di gel ecografico preriscaldato viene posta sopra la regione di interesse sul topo e sulla sonda. Qui, il topo è in posizione ventrale e la sonda è posizionata correttamente per localizzare il rene, il punto di riferimento anatomico direttamente craniale all'ovaio. (C) Nella reclinazione dorsale, la sonda può essere manipolata manualmente per trovare prima punti di riferimento come la vescica al fine di trovare la posizione approssimativa delle corna uterine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Miglioramento della visibilità e della definizione degli organi mediante iniezione di soluzione salina. (A) Immagine di un rene e anse del tratto gastrointestinale (in basso a sinistra) prima dell'iniezione IP di 1,5 ml di soluzione salina riscaldata e sterile. Il lato sinistro dell'immagine è craniale al rene. (B) Immagine del rene dopo l'iniezione salina, che mostra un aumento (spazio ipoecogeno, nero) tra gli organi. Per entrambe le immagini, in termini di orientamento, il topo è la superficie dorsale verso l'alto e il cranio alla caudale è da sinistra a destra. (C,D) La sezione rossa evidenziata mostra i punti di riferimento renali nelle immagini 2D presentate in A e B. Le immagini sono state scattate utilizzando un trasduttore MS550. Barre della scala = 2 mm in ogni immagine. Abbreviazioni: tratto gastrointestinale = tratto gastrointestinale; IP = intraperitoneale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Tratto riproduttivo con punti di riferimento . (A) L'ovaio (freccia) si trova immediatamente dal polo caudale al polo caudale del rene. (B) Il corno uterino (freccia stretta) è profondo e inizia cranialmente ai muscoli dorsali dell'arto posteriore prossimale (punta di freccia), con l'ovaio anche in vista (freccia più grande). Barre della scala = 2 mm. Per tutte le immagini, in termini di orientamento, il topo è sulla superficie dorsale verso l'alto e cranico-caudale è da sinistra a destra. Le immagini sono state scattate utilizzando un trasduttore MS550. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Corna uterine e vescica ripresi dalla recumbency dorsale. Immagini ecografiche di due topi prima dell'induzione del cancro. (A) Il lume della vescica è visibile come una struttura ipoecogena, ovoidale con una mucosa iperecogena. Entrambe le corna uterine sono visibili insieme, con i confini di ciascuno tracciati in azzurro. (B) La stessa vista in un altro topo con una vescica molto più piena. Per entrambe le immagini, in termini di orientamento, il mouse è la superficie ventrale verso l'alto e l'immagine sinistra è il mouse a sinistra. I bordi di ciascun corno uterino sono disegnati in azzurro, con aree indicate nelle caselle di testo vicine (trasduttore MS550). Barre della scala = 3 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Esempi di H&E e immunoistochimica di sezioni dell'utero a 6 settimane dopo l'induzione in un topo iPAD. (A) H&E rappresentativo del tessuto uterino del topo iPAD. (B) Immunoistochimica rappresentativa di ARID1a. La colorazione mostra una perdita di Arid1a specifica per i nuclei delle cellule epiteliali uterine che esprimono Pax8 (freccia nera), con la ritenzione di Arid1a nei nuclei delle cellule stromali uterine (freccia bianca). (C) Immunoistochimica pTEN rappresentativa. La colorazione mostra una perdita di pTEN nel citoplasma delle cellule epiteliali uterine che esprimono Pax 8 (freccia nera), con la ritenzione di pTEN nel citoplasma delle cellule stromali uterine (freccia bianca). I metodi IHC dettagliati sono stati precedentemente pubblicati14. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: iPAD = inducible Pten, Arid1a double deletion; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Esempi di immagini ecografiche di topi con alterazioni precoci della patologia. (A,B) Immagine ecografica antemortem di un utero pieno di liquido uterino che è naturalmente iperecogeno Le frecce strette indicano il lume ipoecogeno e dilatato dell'utero. La punta della freccia indica l'area ispessita della parete uterina. (C) Immagine grossolana dell'intero utero dal topo ripreso in B. L'asterisco bianco si trova all'incirca nella stessa posizione di quello raffigurato in A. (D) In questo stesso topo, l'utero è stato elaborato e colorato con H & E. La sezione istologica mostra ispessimento della parete uterina a causa di iperplasia endometriale; La regione di esempio è indicata con una punta di freccia. Per tutte le immagini statunitensi, in termini di orientamento, il mouse è sulla superficie dorsale verso l'alto e cranico-caudale è da sinistra a destra (trasduttore MS550). Barre della scala = (A,B) 3 mm; (D) 500 μm. Abbreviazioni: US = ultrasuoni; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Diversità della patologia uterina visibile dagli ultrasuoni . (A) Un utero con iperplasia e distensione del fluido che causa dilatazione luminale ad un diametro di ~ 2,5 mm. (B) Un secondo utero con iperplasia che è distesa in misura maggiore. (C) Un utero che è sia dilatato che riempito con una massa di tessuti molli. Barre della scala = 3 mm. Per tutte le immagini, le frecce sono sul lato ventrale del corno uterino e, in termini di orientamento dell'immagine, il mouse è sulla superficie dorsale verso l'alto e cranico-caudale è da sinistra a destra (trasduttore MS550). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Cambiamenti nello sviluppo neoplastico dell'utero nel tempo in un topo. (A) Immagine ecografica di un topo iPAD che mostra il rene (freccia più larga), l'ovaio (da caudale a rene) e l'utero (freccia stretta), con il muscolo della gamba visibile anche (punta di freccia), catturata in tre punti temporali: dopo che il topo è stato iniziato a una dieta doxiciclina (settimana 0), e poi di nuovo dopo 5 settimane e 6 settimane. La doxiciclina ha indotto l'espressione di Cre con perdita di oncosoppressore, che promuove il cancro dell'endometrio nel tempo. (B) Le stesse immagini ecografiche di A ma con il corno uterino evidenziato in rosso. (C) Immagini grossolane dell'utero in situ (freccia stretta) dal punto temporale di 6 settimane; Il tessuto è visto dalla superficie ventrale. (D) Lo stesso utero del C sezionato ex vivo; Il tessuto è visto dalla superficie ventrale. (E) Istologia della massa uterina (colorazione H & E), che indica adenocarcinoma da questo esempio. Per A e B, in termini di orientamento, il topo è la superficie dorsale verso l'alto e cranico-caudale è da sinistra a destra (trasduttore MS550). Barre della scala = (A,B, prime due immagini in ogni riga) 1 mm; (A,B, terza immagine) 2 mm; (E) 500 μm. Abbreviazioni: iPAD = inducible Pten, Arid1a double deletion; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo esamina l'utilità degli ultrasuoni per valutare i cambiamenti morfologici uterini nella progressione dell'adenocarcinoma nell'utero nei topi. In questo studio, seguendo l'induzione del cancro dell'endometrio nei topi longitudinalmente, i dettagli anatomici rilevati dagli ultrasuoni sono risultati essere indicatori di patologia grossolana e istologica. Questo apre la porta all'uso di studi longitudinali con un numero minore di topi monitorati mediante ultrasuoni in più punti temporali per seguire la progressione dei tumori uterini nei topi. Questo rilevamento longitudinale è stato realizzato utilizzando una sonda portatile e senza l'uso di apparecchiature a ultrasuoni del sistema ferroviario. Le sonde ad alta frequenza (trasduttori) utilizzate sono ampiamente disponibili, rendendo questo approccio riproducibile presso più istituzioni in tutto il mondo. I passaggi critici del protocollo includono l'utilizzo della sonda corretta per il livello di risoluzione richiesto per l'esperimento e la preparazione del mouse per l'imaging prima dell'ecografia.
I passaggi critici nella preparazione del topo sono la rimozione di tutti i peli dalle aree di studio e l'iniezione di liquido nella cavità peritoneale. La pelliccia lasciata sulla pelle può portare all'intrappolamento di bolle nel gel ad ultrasuoni, che può produrre artefatti nelle immagini; Quindi, bisogna fare attenzione a rimuovere i capelli uniformemente sull'area di studio. La crema depilatoria è stata scelta come metodo per la depilazione in quanto rimuove la pelliccia uniformemente sulla pelle. Possono verificarsi lesioni alla pelle se la crema viene lasciata sulla pelle per un periodo di tempo eccessivo (>3-4 min). Nei topi più sensibili alla crema depilatoria, la crema deve essere lasciata sulla pelle solo per 1-2 minuti per rimuovere i peli. Successivamente, il mouse deve essere pulito con una serie di tovaglioli di carta bagnati per rimuovere completamente la crema. Dopo che tutti i capelli sono stati rimossi dall'area di studio, fluidi isotonici sterili e caldi vengono iniettati nella cavità intraperitoneale per aumentare il contrasto e aiutare a definire i confini degli organi addominali. In questo studio, l'iniezione di 1-2 ml di liquido era sufficiente per differenziare l'ovaio, l'ovidotto e le corna uterine. Il fluido viene gradualmente assorbito ed è meglio iniettarlo immediatamente prima dell'imaging. I topi diventano rapidamente ipotermici in anestesia con isoflurano. Ciò può essere evitato iniettando soluzione salina calda (conservata in siringhe su una piastra riscaldante) e posizionando anche il mouse su una piastra riscaldante e preriscaldando il gel ad ultrasuoni quando possibile. Le sessioni di imaging con ecografisti esperti vengono eseguite a 5-10 minuti / topo e, con questo breve tempo, non si è verificata un'ipotermia significativa. Se necessario, è possibile iniettare fino a ulteriori 2 ml di soluzione salina nell'addome per una maggiore separazione degli organi.
I metodi qui descritti sono destinati ad essere facilmente riproducibili senza attrezzature specializzate oltre alla macchina ad ultrasuoni e alle sonde (sonda). Nel metodo presentato, la sonda viene manipolata manualmente senza l'assistenza di un sistema ferroviario. Questo metodo manuale è più veloce e offre una grande flessibilità negli angoli e nella pressione applicata per evidenziare piccole caratteristiche. L'orientamento manuale delle sonde sull'addome e l'uso di trasduttori a bassa risoluzione potrebbero limitare la qualità delle singole immagini acquisite rispetto alle immagini di un trasduttore fissato sul sistema di binari4. Un sistema di binari sarebbe utile per le iniezioni nell'utero (nei feti) o le iniezioni intracardiache quando è necessaria una maggiore stabilità. Tuttavia, esiste un compromesso per quanto riguarda il tempo minimo di manipolazione e una maggiore accessibilità per l'ampia gamma di istituzioni che non dispongono di strutture ecografiche specializzate. Il successo di questo metodo semplificato esemplifica come gli ultrasuoni possono essere utilizzati per una serie di studi. Il metodo proposto è adatto per catturare i cambiamenti del tessuto longitudinale nei modelli di cancro uterino senza la necessità di attrezzature dedicate e potrebbe essere applicato ad altri modelli di malattia progressiva. La manipolazione manuale dei topi durante l'imaging può aumentare la variabilità della profondità e della posizione esatte del tessuto, ma per gli studi che non si basano su questi fattori, la qualità dell'immagine è sufficiente per rilevare cambiamenti patologici.
È importante salvare i video durante l'imaging; Successivamente, nella workstation dell'utente, i video possono essere fermati in qualsiasi fotogramma rappresentativo dell'anatomia che deve essere catturata e misurata. Le immagini degli organi possono essere misurate (diametro, circonferenza o lunghezza) (Figura 5, sezione trasversale del corno uterino misurata) e l'area del tumore può essere calcolata. I video, più dei singoli fotogrammi, facilitano l'identificazione degli organi in un contesto anatomico più ampio. I video sono anche utili per determinare il movimento dell'intestino tenue e crasso, che può aiutare a differenziare l'intestino dall'utero. Ottenere immagini di alta qualità dipende anche dalla familiarità con l'anatomia del topo. Per l'imaging dell'utero mobile rispetto all'imaging di più tessuti stazionari (ad esempio, un tumore xenotrapianto impiantato, ovaie), l'utilizzo del metodo manuale ha il vantaggio di scansionare e seguire le corna uterine da prossimale a distale. Durante la scansione, è possibile utilizzare la regolazione graduale degli angoli della mano per seguire il corno. La sonda MS550 è stata utilizzata per tutte le immagini in questo studio ed è preferibile per l'utero rispetto alla sonda MS700 ad alta risoluzione, che è migliore per le ovaie. Il lavoro che utilizza l'MS700 per visualizzare la tiroide del topo è stato recentemente pubblicato, mostrando l'alta risoluzione possibile in altri tessuti15. L'imaging della sonda portatile è utile a causa dei vari gradi di profondità del tessuto dell'utero tra l'ovaio e la vescica. In questo lavoro, muoversi tra punti di riferimento anatomici facilmente riconoscibili, come il rene e l'anatomia prossimale degli arti posteriori, ha aiutato a catturare immagini comparabili attraverso i diversi punti temporali quando si visualizza l'utero dall'aspetto dorsale sul corpo.
Questo metodo ad ultrasuoni ad alta risoluzione per seguire i cambiamenti anatomici nell'utero nel tempo durante la tumorigenesi è superiore agli attuali metodi che comportano l'eutanasia degli animali da più coorti in diversi punti temporali. Gli ultrasuoni perfezionano il modello e riducono il numero di topi necessari per l'esperimento, riducendo così costi e tempi. È importante sottolineare che questo metodo consente di seguire la progressione della malattia a livello individuale, il che può portare a intuizioni che sono mascherate negli studi dipendenti da coorti sacrificate dal punto temporale piuttosto che dallo stadio della malattia. Grazie alla sua natura non invasiva, l'ecografia del topo ha molte potenziali applicazioni per la ricerca nel cancro uterino o ovarico.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati per il finanziamento del programma NCI Ovarian Cancer SPORE P50CA228991, del programma di formazione post-dottorato 5T32OD011089 e del Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Il progetto è stato anche in parte finanziato dai sussidi per le spese correnti agli istituti privati di istruzione superiore della Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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