Summary
このプロトコルは、肉眼的および組織学的変化との相関を有する超音波画像を用いて、子宮内膜癌の誘導性マウスモデルにおける子宮内の形態学的変化の経時的な進行をモニターするための方法を記載する。
Abstract
子宮がんは、これらのモデルでの取り扱いと遺伝子操作の容易さのためにマウスで研究することができます。ただし、これらの研究は、異なるコホートの複数の時点で安楽死させた動物の死後の病理の評価に限定されることが多く、研究に必要なマウスの数が増加します。縦断的研究でマウスをイメージングすると、個々の動物の病気の進行を追跡できるため、必要なマウスの数を減らすことができます。超音波技術の進歩により、組織のマイクロメートルレベルの変化を検出できるようになりました。超音波は、卵巣の卵胞成熟および異種移植片の成長を研究するために使用されてきましたが、マウスの子宮の形態学的変化には適用されていません。このプロトコルは、誘発された子宮内膜がんマウスモデルにおける in vivo イメージング比較と病理学の並置を調べます。超音波によって観察された特徴は、肉眼的病理学および組織学によって見られる変化の程度と一致していた。超音波は観察された病状を高度に予測することがわかり、マウスの癌などの子宮疾患の縦断的研究への超音波検査の組み込みを支持しました。
Introduction
マウスは、生殖障害の最も重要な動物モデルの1つであり続けています1,2,3。卵巣がんおよび子宮がんの遺伝子組み換えまたは誘発されたげっ歯類モデルがいくつかあります。これらの研究は通常、形態学的および病理学的変化の縦断的傾向を把握するために、異なる時点で安楽死させた複数のコホートに依存しています。これにより、個々のマウスにおける癌発生に関する継続的なデータを取得する能力が妨げられる。さらに、個々のマウス疾患進行状態を知らなくても、介入研究は、特定の動物における進行を検出するための個々の閾値ではなく、所定の時点および以前のコホートの平均所見に基づいている4,5。したがって、新薬や化合物を試験するための前臨床モデルを促進し、病理生物学の理解を加速すると同時に、厳密さと再現性を高めるために、生きた動物での縦断的評価を可能にするイメージングアプローチが必要です6。
超音波イメージング(米国)は、他のイメージング方法と比較して比較的簡単で安価であり、実行が容易であり、驚くべき解像度を持つことができるため、マウス子宮がんの進行の縦断的モニタリングにとって魅力的な方法です6,7。この非侵襲的モダリティは、覚醒マウスまたは5〜10分の検査を使用して短時間の鎮静下にあるマウスでミクロンスケールの特徴をキャプチャできます。超音波顕微鏡は、マウス卵巣卵胞の発達8および移植または誘発された腫瘍の成長を測定する方法として検証されています9、10、11。高周波USはまた、経皮的子宮内注射12および発情周期13にわたるラット子宮変化の観察にも使用されている。高周波USは、レールシステムを使用してトランスデューサ/プローブを保持し、標準化された位置と圧力で高解像度の画像をキャプチャする特殊な固定プラットフォームにマウスを保持します。ただし、この機器はすべての機関で利用できるわけではありません。ハンドヘルドトランスデューサースキャン法は、より少ない専用機器で採用でき、マウスの臨床診断と研究アプリケーションの両方に使用できます。
ハンドヘルド高周波プローブを使用した米国のイメージングを使用して、数週間にわたって子宮がんの発生を監視できるかどうかという疑問が残ります。腸と同様に、げっ歯類の子宮は薄壁の細い構造であり、腹部内で非常に可動性があり、複数の組織の深さに隣接しているため、腎臓などの比較的動かない臓器よりもイメージングが困難です。この研究は、超音波によって観察された組織と組織病理学の間の相関を確立し、マウスの子宮を見つけるためのランドマークを定義し、 子宮内膜がんの縦断的評価の実現可能性。この研究は、米国によって画像化された子宮の出現と組織病理学との間の定性的対応を示すデータを提示し、数週間にわたるマウスの連続画像も提示します。これらの結果は、ハンドヘルドUSを使用してマウスの子宮内膜がんの発生をモニタリングできるため、専用の機器を必要とせずに個々のマウス縦断データを収集して子宮がんを研究する機会が生まれることを示しています。
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Protocol
マウスを含むすべての手順および実験は、ジョンズホプキンス動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。すべての手順で、手袋や使い捨ての隔離ガウンなど、適切なPPEを着用しました。使用直後に赤い箱の鋭利物の容器に適切に廃棄された鋭利物を取り扱う際には注意が払われました。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器の詳細については、 材料の表 を参照してください。
1.ドキシサイクリンを用いたiPAD(誘導性 Pten、Arid1a 二重欠失)マウスにおける子宮内膜癌の誘導
- 前述のように、10匹のPax8-Cre-Arid1a-Pten二重欠失(iPAD)トランスジェニックマウス(図1)を混合遺伝的背景(129S、BALB/C、C57BL/6)で維持します14。
- ドキシサイクリン治療の前に、各マウスの卵巣、卵管、子宮のベースライン超音波(2D)画像を収集します。
- ドキシサイクリン含有マウス固形飼料(625 mg / kg飼料のドキシサイクリンヒクレート)を雌iPADマウスに7〜8週齢から最低2週間提供して、遺伝子欠失を誘発します。.
2.機器のセットアップ
- 加熱パッドの電源を入れ、清潔な吸収パッド(目標温度:38°C)で覆います。
- イソフルラン気化器とO2 タンクが適切に満たされていることを確認してください。内容物が少ない場合は補充して交換してください。
- 誘導チャンバー、ノーズコーン、および清掃システムを気化器に接続します。
- 超音波装置をセットアップします。
- 子宮または卵巣のイメージングには、それぞれ32〜56MHzまたは最大70MHzの範囲のトランスデューサー(プローブ)を選択します。
- プローブを取り付け、マシンの電源を入れます。
- システムの起動後、コントロールパネルを使用してユーザー資格情報でログインし、ホーム画面にアクセスします。
- ホーム画面から、[ アプリケーション ]タブに移動し、[ マウス(小)腹部モード]を選択します。
- [ スキャン ]をクリックしてホーム画面に戻り、ライブ画像が表示されるのを待ちます。
- 左側のツールバーのオプションからBモードを選択します。
- 「 その他のコントロール」 をクリックすると、画像のゲインや深度などの画像補正のための追加ツールを表示したり、フレーム/秒などのクリップ取得設定を調整したりできます。
- 画像設定を選択したら、[ スキャン]をクリックしてホーム画面に戻ります。
- O2 タンクの電源を入れ、流量を誘導チャンバーに向け、流量を1 L / minに設定します。
3.脱毛を含む超音波スクリーニングのためのマウスの準備
- 誘導チャンバーにマウスを置きます。麻酔の誘導のためにイソフルラン気化器を2%-3%vol / volに設定します。
- つま先のつまみに対する反応の欠如と1〜2呼吸/秒前後の呼吸数によって、適切な麻酔の深さを決定します。
- 滅菌眼科用潤滑剤を各眼に塗布します。適切なサイズのバリカンを使用して、最後の肋骨と骨盤の間の背側と腹側から毛皮を取り除きます。
- 画像化する腹側と背側の領域に脱毛クリームの薄層を適用します(必要な場合)。
- マウスを誘導室に約3〜5分間戻し、脱毛クリームが脱毛に作用している間、適切な麻酔深度を維持します。≤4分後、清潔で湿ったペーパータオルでクリームをそっと拭き取ります。
注意: 脱毛クリームに長時間さらされると刺激があり、皮膚病変を引き起こす可能性があります。
4.臓器間のコントラストを高めるための体液の腹腔内注射
- 滅菌等張液溶液(滅菌0.9%NaClまたは乳酸リンガー溶液など)で満たされた3〜10 mLシリンジを加熱パッドと吸収パッドの間に数分間置き、35〜40°Cに温めます。機械にウォーマーがない場合は、加熱パッドに超音波ジェルのボトルを置きます。
- 20〜25 gのマウスの場合、1〜2 mLの溶液を腹腔に注入します。
- 片手で首筋でマウスを固定し、腹側を露出させます。
- マウスを~20°の角度で持ち、鼻を床に向けて、重力によって臓器を頭蓋に向けます。
- 小さなゲージ針(25 G、長さ5/8、ツベルクリン注射器)を使用して、腹部の尾右象限の皮膚と腹壁に穴を開けます。
- 液体を注入する前に、血管系または消化管への注入を避けるために、最小限の圧力で引き戻します。血液やその他の物質が注射器に入った場合は、針を外してください。新しい針と注射器を使用して、少し異なる位置で再試行してください。
- 注射中にマウスが目覚めた場合は、2%〜3%vol/volイソフルランを含む麻酔用の小さな誘導チャンバーに戻します。
5. 背側アプローチからの超音波イメージング
- マウスを加熱パッドの上の吸収パッドの腹側横臥状態に配置します(図2A-C)。
- げっ歯類のノーズコーンをマウスの鼻と銃口の上にしっかりと置きます。鼻コーンを通して送達されるイソフルランで麻酔薬の深さを100%O 2で1%-2%vol / volで維持します。.必要に応じて、滅菌眼科用潤滑剤を各眼に塗布します。.
- マウスの定期的な呼吸数(1-2 / s)とつま先のつまみ反応の欠如を監視して、麻酔を調整する必要があるかどうかを示します。
- 麻酔をかけたマウスの両側、最後の肋骨と骨盤の間の脊椎に、少量(~0.5-1 mL)の予熱した超音波ゲルを軸方向(外側)に置きます。
- 超音波プローブに少量のゲルを置きます。
- プローブを椎骨と平行に配置し、プローブの前面を頭蓋側に向けます。プローブヘッドには、プローブの向きを示すインジケーターマークがあります。収集される新しい画像セットごとに、曜日、時刻、動物ID、プローブの向き、および動物側(右、左、背側、腹側)を記録します。
- マウスが腹側横臥(背側の皮膚がプローブに触れている)の状態で、腎臓のランドマークがないかその領域をゆっくりとスキャンします(図2B および 図3)。腎臓を視野に入れた状態で、プローブの尾を引いて、腎臓によって頭蓋腹側、背側腹壁によって背外側に接している非常に高エコー性の卵巣脂肪パッド内の卵巣-わずかに高エコーの楕円形から円形の構造(図4A、B)を見つけます。
注:卵巣の尾側および外側の圧力は、卵巣を腹壁に近づけ、腸のループから遠ざける可能性があります。卵巣は解剖学的に背腹壁に対して位置しており、腹側と外側に上軸筋、腎臓に対して尾側にあります。 - コントロール画面の下部にあるスライダーを使用して 信号ゲイン を調整し、画像のコントラストを向上させます。
- 腎臓の画像を改善するには、反対側の腹部に指で圧力をかけます。圧力と角度を脊椎に直接平行から~20°の腹側まで変化させます。
- 目的の臓器が表示されたら、[ クリップの保存 ]または [録画の開始 ]をクリックしてビデオを収集し、[完了したら 録画を停止 ]をクリックして、事前設定されたフレーム数で画像を保持します。
- ライブ画像または録画から 1 つのフレームを Save Frame ボタンで保存します。
- 子宮を画像化するには、卵巣が視野の最も頭蓋的な側面になるまでプローブを尾側に引きます。子宮が見えるまでプローブの圧力と角度を変えます。
- 関心のある臓器ごとにビデオとフレームの収集を繰り返します。
- 外側の脚の筋肉組織も視野に入れて、背側腹壁に沿って縦方向に走る子宮を見つけます(図4B)。
注:子宮のサイズと内腔の直径は、発情期と病状によって異なる場合があります。 - 蠕動運動について組織を監視して、腸ループを子宮静止角と区別します。
6.腹側アプローチから画像を収集する
- マウスを背側横臥状態に置き、目の潤滑が十分であり、銃口がノーズコーンにしっかりと収まっていることを確認します(図2A)。
- 少量(~0.5-1 mL)の予熱した超音波ゲルを腹側腹部に塗布し、恥骨の頭蓋の正中線にプローブを当てて、膀胱を低エコーのランドマークとして特定します(図5)。
注:膀胱が大きすぎて子宮の画像が不明瞭になる場合は、下腹部に穏やかな圧力をかけ、尿を表現できます。 - プローブを膀胱の外側に引いて、子宮角を見つけます。マウスの両側または両側から軽いデジタル圧力を加えて、ホーンを視野に入れます。プローブをマウスに対して垂直に持ち、腹部の両側をスキャンして、両方の角の横方向(断面図)をキャプチャします。プローブを回転させて矢状ビューをキャプチャします。
- 超音波検査の後、ペーパータオルでマウスのゲルをきれいに拭き取り、ケージに戻して回復させます。マウスは2〜5分で完全に目覚めます。完全に目覚めて歩行可能になったら、マウスを動物室に戻します。
注意: 弱火の加熱パッドをケージの下に置いて、回復のためにケージを温めることができます。 - 実験的または人道的なエンドポイントで、マウスを安楽死させます。理想的には、ストレスを軽減するためにホームケージでマウスを安楽死させます。または、マウスをクリーンチャンバーに入れます。加圧されたCO2 を、毎分チャンバ容積の10%〜30%の変位率で送達する。約5分間の目に見える呼吸が見られなくなった後、頸部脱臼による死亡を確認します。腫瘍摘出のために腹部剖検に進みます。
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Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten二重欠失(iPAD)トランスジェニックマウスは、前述のように、混合遺伝的背景(129S、BALB/C、C57BL/6)で維持された14。マウス全員にドキシサイクリン飼料を2週間与えて、Creリコンビナーゼを誘導した。私たちのグループによる以前の研究では、ドキシサイクリンは経管投与14によって投与されました。しかし、この現在の研究では、ドキシサイクリン飼料誘導法が効率的に機能し、マウスの経管栄養のストレスを軽減しました。子宮などのPax8発現細胞の腫瘍抑制因子(Arid1aおよびPten)のDNAを切除するために必要なCreリコンビナーゼ発現を誘導するには、ドキシサイクリン投与法が適切であることを確認することが重要です。図6に示すように、ARID1aおよびpTEN14に対する抗体を用いた免疫組織化学を用いて、隣接する間質組織と比較して子宮上皮細胞において適切な腫瘍抑制タンパク質喪失が達成されたかどうかを確認した。マウスモデルおよび腫瘍抑制因子発現調節の概略を図1に示す。
ドキシサイクリンの2週間後、子宮のサイズは、対照またはドキシサイクリン投与前に画像化された同じマウスと比較して有意に変化しませんでした。.それでも、ドキシサイクリン後の次の2〜6週間で、超音波はマウスが過形成から始まり腺癌に進行するさまざまな子宮病理を発症したことを示しました。 図7A、B は、ドキシサイクリン治療の3週間後に見られた初期の病理学的変化を伴うマウス子宮の米国の画像を示しています。 図7C、D は、図 7A、B で画像化されたマウスが3週目に画像化された直後に安楽死させた後の同じ子宮の肉眼病理および組織病理を示す。より小さな(しかし拡張した)薄壁の子宮および明確な内腔(中枢性高エコー性子宮液)の保存を伴う早期子宮内膜増殖症が観察され得る。後の時点で安楽死させたマウスでは、子宮ははるかに大きく、内腔が小さく、壁が厚くなっていました(図8 および 図9)。拡張した内腔および過形成性子宮内膜の微妙な変化の例を、図 8 および 図9の子宮内の高密度組織および結節性癌増殖と比較する。超音波画像と肉眼画像は、表されたすべてのマウスについて互いに非常に一致していました。 図9 は、時間経過研究における同じマウスからの複数の子宮画像を示し、腺癌が発症するにつれて6週間にわたって観察された形態学的変化を示しています。 図5 は、低エコー性膀胱に隣接する子宮角の断面による腹側アプローチを示しています。
腹部のコントラストを高めるために、イメージングの直前に生理食塩水を腹腔内に注入すると、子宮や卵巣などの腹部臓器の視覚化が改善されました。 図3 は、生理食塩水1mLの注射前後の同じマウスからの超音波比較を示す。生理食塩水では、臓器間の低エコー空間(黒)が増加し、腎臓、脂肪パッド、卵巣、子宮角、腸、および脾臓が互いにより容易に個別化されるようになりました。ここに提示された他のすべての図では、画像の鮮明さを改善するために、画像化の前に生理食塩水注入が行われた。
まとめると、このプロトコルは、この誘導性マウスモデルが6週間にわたって腺癌を発症し、超音波で監視してベースラインを確立し、癌が進行するにつれて子宮の形態学的変化を観察できることを示しています。ここでは、非侵襲的超音波により、マウスの子宮角を実際の子宮病理学的変化を予測する画像で数週間にわたって連続的に評価できることが実証されています。
図1:Pax8-Cre誘導性ダブルKOトランスジェニックマウスの作製戦略。 (A)Pax8発現子宮上皮細胞における逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター(rtTA)の構成的産生は、テトラサイクリン応答要素(TRE)に結合することにより、テトラサイクリンまたはその類似体ドキシサイクリンの存在下でCreリコンビナーゼの誘導可能な活性化をもたらします。エクソン8(Arid1a)およびエクソン5(Pten)の上流および下流に位置するフロックス部位は、Creリコンビナーゼの標的となる。Arid1aにおけるエクソン8のCre標的欠失は、フレームシフト変異と早期終止コドンをもたらします(p.Gly809Hisfs*6)。Ptenのエクソン5をCre標的で欠失させると、フレームシフト変異が発生します(p.Val85Glyfs*14)。(B)Pax8-rtTAマウスは、Pax8プロモーターの制御下で逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター(rtTA)を発現する。このマウスは、テトラサイクリン依存的にCreリコンビナーゼを発現するTetO-Creマウスと交配されています。この交配からの子孫は、Pax8発現子宮上皮細胞に特異的なテトラサイクリン(またはドキシサイクリン)活性化Creリコンビナーゼ(Pax8-Creトランスアクチベーター)を発現する。(C)129S1バックグラウンドのArid1aフロックス/フロックスマウスをBALB/CバックグラウンドのPtenフロックス/フロックス(株C;129S4-Ptentm1Hwu/J)と交配して、Arid1aフロックス/フロックス/Ptenフロックス/フロックストランスレスポンダーマウスを作製した。(D)Pax8-CreトランスアクティベーターマウスをArid1aフロックス/フロックス/Ptenフロックス/フロックストランスレスポンダーマウスと交配します。この交配からの子孫は、子宮上皮細胞に特異的なドキシサイクリン誘導性Arid1aおよびPten欠失(iPAD)を有するトランスジェニックマウスモデルをもたらす。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:イメージング手順 。 (A)腹部と背部の毛皮をバリカンと脱毛クリームで除去した麻酔をかけたマウス。マウスをノーズコーン を介して 吸入剤イソフルラン麻酔で維持し、吸収パッドで覆われたヒートパッドに置く。(B)少量の予熱された超音波ゲルを、マウスおよびプローブ上の関心領域上に配置します。ここでは、マウスは腹側横臥状態にあり、プローブは腎臓、卵巣に直接頭蓋の解剖学的ランドマークを見つけるために正しく配置されています。(C)背側横臥では、プローブを手動で操作して、子宮角のおおよその位置を見つけるために、最初に膀胱などのランドマークを見つけることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生理食塩水の注入による視認性と臓器定義の改善。 (A)1.5mLの加温滅菌生理食塩水のIP注射前の腎臓と消化管のループ(左下)の画像。画像の左側は腎臓の頭蓋です。(B)生理食塩水注射後の腎臓の画像は、臓器間の増加(低エコー空間、黒)を示す。どちらの画像でも、向きに関しては、マウスは背側表面を上にし、頭蓋から尾側は左から右です。(C,D)強調表示された赤いセクションは、AとBで提示された2D画像の腎臓のランドマークを示しています。画像はMS550トランスデューサを使用して撮影されました。スケールバー = 各画像で2 mm。略語:消化管=胃腸管;IP =腹腔内。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ランドマークのある生殖管 。 (A)卵巣(矢印)は腎臓の尾極のすぐ尾側にあります。(B)子宮角(細い矢印)は深く、近位後肢の背筋(矢じり)から頭蓋骨に始まり、卵巣も見えます(大きな矢印)。スケールバー= 2 mm。すべての画像について、向きに関しては、マウスは背側を上にし、頭蓋から尾側は左から右です。画像はMS550トランスデューサを使用して撮影されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:背側横臥から画像化された子宮角と膀胱。 癌誘発前の2匹のマウスからの超音波画像。(A)膀胱内腔は、高エコー粘膜を有する低エコー性の卵形構造として見える。両方の子宮角が一緒に見え、それぞれの境界は水色でトレースされています。(B)はるかに完全な膀胱を持つ別のマウスの同じビュー。どちらの画像でも、向きに関しては、マウスは腹面を上にして、左の画像はマウスの左です。各子宮角の境界は水色で描画され、隣接するテキストボックス(MS550トランスデューサー)に領域が示されています。スケールバー = 3 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:iPADマウスにおける導入後6週間における子宮切片のH&Eおよび免疫組織化学の例。 (A)iPADマウス子宮組織の代表的なH&E。(B)代表的なARID1a免疫組織化学。染色は、Pax8発現子宮上皮細胞の核に特異的なArid1aの喪失(黒い矢印)を示し、子宮間質細胞の核におけるArid1aの保持(白い矢印)を示す。(C)代表的なpTEN免疫組織化学。染色は、Pax 8発現子宮上皮細胞の細胞質におけるpTENの喪失(黒い矢印)と、子宮間質細胞の細胞質におけるpTENの保持(白い矢印)を示す。詳細なIHCメソッドは以前に公開されています14。スケールバー= 100μm。略語:iPAD =誘導性Pten、Arid1a二重欠失;H&E = ヘマトキシリンとエオシン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:病理に早期変化があったマウスの超音波画像の例 。 (A、B)自然に高エコーである子宮液で満たされた子宮の死前超音波画像 細い矢印は、子宮の低エコー性の拡張した内腔を示しています。矢印は子宮壁の肥厚した領域を示しています。(C) Bで撮影したマウスからの子宮全体の肉眼像。白いアスタリスクは、 Aで画像化されたものとほぼ同じ位置にあります。(D)この同じマウスで、子宮を処理し、H&Eで染色した。組織学切片は、子宮内膜増殖症による子宮壁の肥厚を示す。例の領域は矢印で示されています。すべての米国の画像について、向きに関しては、マウスは背側表面を上にし、頭蓋から尾側は左から右です(MS550トランスデューサー)。スケールバー=(A、B)3ミリメートル;(D)500μm。略語:米国=超音波;H&E = ヘマトキシリンとエオシン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:超音波で見える子宮病理の多様性 。 (A)過形成と体液膨張を伴う子宮で、直径~2.5mmの管腔拡張を引き起こす。 (B)過形成を伴う2番目の子宮は、より大きく膨張しています。(C)拡張され、軟部組織腫瘤で満たされた子宮。スケールバー= 3 mm。すべての画像について、矢印は子宮角の腹側にあり、画像の向きに関しては、マウスは背側表面を上に、頭蓋から尾側は左から右です(MS550トランスデューサー)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:1匹のマウスにおける子宮の腫瘍性発達の経時 変化。 (A)腎臓(幅の広い矢印)、卵巣(尾から腎臓)、子宮(狭い矢印)を示すiPADマウスの超音波画像で、脚の筋肉も見える(矢印)、3つの時点でキャプチャされました。 マウスがドキシサイクリン食を開始した後(0週目)、 そして5週間と6週間後に再び。ドキシサイクリンは腫瘍抑制因子の喪失を伴うCre発現を誘導し、時間の経過とともに子宮内膜癌を促進します。(B) A と同じ超音波画像ですが、子宮角が赤で強調表示されています。(C)6週間時点からの子宮のその 場での 肉眼画像(狭い矢印)。組織は腹面から見られます。(D) C と同じ子宮を エクスビボで解剖する;組織は腹面から見られます。(E)子宮腫瘤の組織像(H&E染色)は、この例から腺癌を示す。 A および Bについては、マウスの向きが背側を上にし、頭蓋から尾側が左から右である(MS550トランスデューサ)。スケールバー=(A、B、各行の最初の2つの画像)1 mm;(A、B、3番目の画像)2ミリメートル;(E)500μm。略語:iPAD =誘導性 Pten、Arid1a 二重欠失;H&E = ヘマトキシリンとエオシン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、マウスの子宮内の腺癌の進行における子宮形態学的変化を評価するための超音波の有用性を調べます。本研究では、マウスの子宮内膜がんの誘導を縦断的に追跡することにより、超音波によって検出された解剖学的詳細が肉眼的および組織学的病理の指標となることが判明した。これにより、マウスの子宮がんの進行を追跡するために、複数の時点で超音波によって監視された少数のマウスによる縦断的研究の使用への扉が開かれます。この縦方向の検出は、ハンドヘルドプローブを使用し、レールシステムの超音波装置を使用せずに達成されました。使用されている高周波プローブ(トランスデューサ)は広く入手可能であり、このアプローチは世界中の複数の機関で再現可能です。プロトコルの重要なステップには、実験に必要な解像度のレベルに適したプローブの使用と、超音波の前にイメージングするためのマウスの準備が含まれます。
マウスを準備する際の重要なステップは、研究領域からすべての毛を取り除き、腹腔に液体を注入することです。皮膚に残った毛皮は、超音波ゲルに泡を閉じ込める可能性があり、画像にアーティファクトを生成する可能性があります。したがって、分析範囲全体で均等に毛を取り除くように注意する必要があります。脱毛クリームは、皮膚全体に毛皮を均等に除去するため、脱毛の方法として選択されました。クリームを長時間(>3〜4分)皮膚に放置すると、皮膚の損傷が発生する可能性があります。脱毛クリームに敏感なマウスでは、クリームは脱毛するために1〜2分間だけ皮膚に残されるべきです。次に、マウスを一連の濡れたペーパータオルで拭いて、クリームを完全に取り除きます。すべての毛髪が研究領域から取り除かれた後、無菌の温かい等張液が腹腔内に注入され、コントラストを高め、腹部臓器の境界を定義するのに役立ちます。この研究では、卵巣、卵管、子宮角を区別するには、1〜2 mLの液体を注入するだけで十分でした。液体は徐々に吸収され、イメージングの直前に注入するのが最善です。マウスはイソフルラン麻酔下で急速に低体温になる。これは、温かい生理食塩水(加熱パッド上の注射器に保管)を注入し、マウスを加熱パッドに配置し、可能な場合は超音波ゲルを予熱することによって防ぐことができます。経験豊富な超音波検査者によるイメージングセッションは5〜10分/マウスで実行され、この短い時間で有意な低体温は発生しませんでした。必要に応じて、最大2mLの生理食塩水を腹部に注入して、臓器の分離を高めることができます。
ここで説明する方法は、超音波装置およびプローブ以外の特殊な機器なしで容易に再現可能であることを意図している。提示された方法では、プローブはレールシステムの支援なしに手動で操作されます。この手動の方法はより速く、小さな特徴を強調するために加えられる角度と圧力に大きな柔軟性を提供します。プローブを手動で腹部に向け、低解像度のトランスデューサを使用すると、レールシステムに固定されたトランスデューサからの画像と比較して、取得された個々の画像の品質が制限される可能性があります4。レールシステムは、子宮(胎児)への注射や、より安定性が必要な場合の心臓内注射に役立ちます。ただし、特殊な超音波設備を持たない幅広い機関にとって、最小限の操作時間とアクセシビリティの向上に関するトレードオフがあります。この単純化された方法の成功は、超音波が様々な研究にどのように利用できるかを例示している。提案手法は,子宮癌モデルにおける縦方向の組織変化を,専用の装置を必要とせずに捉えるのに適しており,他の進行性疾患モデルへの適用が期待できる.イメージング中のマウスの手動操作は、正確な組織の深さと位置の変動性を高める可能性がありますが、これらの要因に依存しない研究では、画質は病理学的変化を検出するのに十分です。
イメージング中にビデオを保存することが重要です。後でユーザーのワークステーションで、キャプチャして測定する必要がある解剖学的構造を代表する任意のフレームでビデオを停止できます。臓器の画像(直径、円周、長さ)を測定し(図5、子宮角断面を測定)、腫瘍面積を計算することができます。ビデオは、単一のフレームよりも、より大きな解剖学的文脈での臓器の識別を容易にします。ビデオは、小腸と大腸の動きを判断するのにも役立ち、腸と子宮を区別するのに役立ちます。高品質の画像を取得するには、マウスの解剖学に精通していることにも依存します。可動子宮を画像化することと、より静止した組織(例えば、移植された異種移植片腫瘍、卵巣)を画像化する場合、手動の方法を使用することは、近位から遠位まで子宮角をスキャンして追跡するという利点を有する。スキャン中は、手の角度を徐々に調整してホーンを追従できます。MS550プローブは、この研究のすべてのイメージングに使用され、卵巣に適した高解像度のMS700プローブと比較して子宮に適しています。マウス甲状腺を画像化するためにMS700を用いた研究が最近公開され、他の組織において可能である高解像度を紹介する15。ハンドヘルドプローブイメージングは、卵巣と膀胱の間の子宮の組織の深さの程度が異なるため、役立ちます。この研究では、腎臓と近位後肢の解剖学的構造などの簡単に認識できる解剖学的ランドマークの間を移動することで、体の背側から子宮を画像化するときに、さまざまな時点で比較可能な画像をキャプチャするのに役立ちました。
腫瘍形成中の経時的な子宮の解剖学的変化を追跡するこの高解像度超音波法は、異なる時点で複数のコホートからの動物を安楽死させることを含む現在の方法よりも優れています。超音波はモデルを改良し、実験に必要なマウスの数を減らし、コストと時間を削減します。重要なことに、この方法では、疾患の進行を個人レベルで追跡することができ、疾患の病期ではなく時点によって犠牲にされたコホートに依存する研究では隠されている洞察につながる可能性があります。その非侵襲性のために、マウス超音波は子宮癌または卵巣癌の研究のための多くの潜在的な用途を有する。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
NCI卵巣がん胞子プログラムP50CA228991、ポスドク研修プログラム5T32OD011089、ジョンズ・ホプキンス大学のリチャード・W・テリンデ基金からの資金提供に感謝している。また、私立学校振興・共済機構の私立高等教育機関への経常支出補助金も一部賄いました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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