Summary
Denne protokol beskriver en metode til overvågning af progressionen af morfologiske ændringer over tid i livmoderen i en inducerbar musemodel af endometriecancer ved hjælp af ultralydsbilleddannelse med korrelation til grove og histologiske ændringer.
Abstract
Livmoderkræft kan undersøges hos mus på grund af den lette håndtering og genetiske manipulation i disse modeller. Imidlertid er disse undersøgelser ofte begrænset til at vurdere patologi post mortem hos dyr, der aflives på flere tidspunkter i forskellige kohorter, hvilket øger antallet af mus, der er nødvendige for en undersøgelse. Billeddannelse af mus i longitudinelle undersøgelser kan spore sygdomsudviklingen hos individuelle dyr, hvilket reducerer antallet af mus, der er nødvendige. Fremskridt inden for ultralydsteknologi har gjort det muligt at detektere ændringer på mikrometerniveau i væv. Ultralyd er blevet brugt til at studere follikelmodning i æggestokke og xenograftvækst, men er ikke blevet anvendt til morfologiske ændringer i muselivmoderen. Denne protokol undersøger sammenstillingen af patologi med in vivo billeddannelsessammenligninger i en induceret endometriecancermusemodel. De funktioner, der blev observeret ved ultralyd, var i overensstemmelse med graden af ændring set ved grov patologi og histologi. Ultralyd viste sig at være meget forudsigelig for den observerede patologi, hvilket understøtter inkorporeringen af ultralyd i langsgående undersøgelser af livmodersygdomme som kræft hos mus.
Introduction
Mus er fortsat en af de vigtigste dyremodeller for reproduktionsforstyrrelser 1,2,3. Der er flere genetisk modificerede eller inducerede gnavermodeller af kræft i æggestokkene og livmoderen. Disse undersøgelser er typisk afhængige af flere kohorter, der aflives på forskellige tidspunkter for at fange langsgående tendenser i morfologiske og patologiske ændringer. Dette forhindrer evnen til at erhverve kontinuerlige data om kræftudvikling i en individuel mus. Uden at kende den enkelte musesygdoms progressionstilstand er interventionsstudierne desuden baseret på forudbestemte tidspunkter og gennemsnitlige fund fra tidligere kohorter snarere end individuelle tærskler for påvisning af progression i et specifikt dyr 4,5. Derfor er der behov for billeddannelsesmetoder, der muliggør langsgående vurdering i levende dyr, for at lette prækliniske modeller til test af nye lægemidler eller forbindelser og fremskynde forståelsen af patobiologi og samtidig øge stringensen og reproducerbarheden6.
Ultralydsbilleddannelse (US) er en tiltalende metode til langsgående overvågning af muselivmoderkræftprogression, fordi den er relativt let og billig sammenlignet med andre billeddannelsesmetoder, er let at udføre og kan have bemærkelsesværdig opløsning 6,7. Denne ikke-invasive modalitet kan fange funktioner til mikronskalaen hos vågne mus eller med mus under kort sedation ved hjælp af en 5-10 minutters eksamen. Ultralydmikroskopi er blevet valideret som en metode til måling af musens ovariefollikeludvikling 8 og væksten af implanteret eller induceret neoplasi 9,10,11. Højfrekvent ULer også blevet anvendt til perkutane intrauterin injektioner12 og observation af rotteuterin ændring i løbet af østruscyklussen13. Højfrekvent US kan bruges med mus, der holdes på specialiserede stationære platforme ved hjælp af et skinnesystem til at holde transduceren / sonden for at optage billeder i høj opløsning med standardiseret position og tryk; Dette udstyr er dog ikke tilgængeligt på alle institutioner. Håndholdte transducerscanningsmetoder kan anvendes med mindre dedikeret udstyr og anvendes til både klinisk diagnostik og forskningsapplikationer i mus.
Spørgsmålet er stadig, om amerikansk billeddannelse med håndholdte, højfrekvente sonder kan bruges til at overvåge livmoderkræftudvikling over flere uger. I lighed med tarmene er gnaverlivmoderen en tyndvægget, slank struktur, der er meget mobil i maven og er sammenhængende gennem flere vævsdybder, hvilket gør billeddannelse mere udfordrende end med relativt immobile organer som nyrerne. Denne undersøgelse søgte at fastslå sammenhængen mellem væv observeret ved ultralyd og histopatologi, definere landemærker til lokalisering af muselivmoderen og bestemme gennemførligheden af den langsgående vurdering af endometriecancer. Denne undersøgelse præsenterer data, der viser en kvalitativ korrespondance mellem udseendet af uteri afbildet af US og histopatologi samt seriel billeddannelse af mus over flere uger. Disse resultater indikerer, at håndholdt ULkan bruges til at overvåge endometriecancerudvikling hos mus, hvilket skaber mulighed for at indsamle individuelle musens langsgående data for at studere livmoderkræft uden behov for dedikeret udstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer og eksperimenter med mus blev udført i henhold til protokoller godkendt af Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Til alle procedurer blev der anvendt passende personlige værnemidler, herunder handsker og engangsisolationskitler. Der blev taget forholdsregler ved håndtering af skarpe genstande, som blev bortskaffet korrekt i beholdere med røde skarpe genstande umiddelbart efter brug. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Induktion af endometriecancer i iPAD (inducerbar Pten, Arid1a dobbelt sletning) mus med doxycyclin
- Bevar 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten transgene mus med dobbelt deletion (iPAD) (figur 1) på en blandet genetisk baggrund (129S, BALB/C, C57BL/6), som tidligere beskrevet14.
- Indsamle baseline ultralyd (2D) billeder af æggestokkene, ovidukten og livmoderen af hver mus før doxycyclin behandling.
- Giv udelukkende doxycyclinholdigt muse-chow-foder (doxycyclinhyklat ved 625 mg/kg foder) til de kvindelige iPAD-mus i mindst 2 uger fra 7-8 ugers alderen for at inducere gensletning.
2. Opsætning af udstyr
- Tænd for varmepuden, og dæk med en ren absorberende pude (måltemperatur: 38 °C).
- Bekræft, at isofluranfordamperen ogO2-tanken er tilstrækkeligt fyldt. Genopfyld og udskift, hvis indholdet er lavt.
- Tilslut induktionskammeret, næsekeglen og skyllesystemet til fordamperen.
- Konfigurer ultralydsmaskinen.
- Vælg en transducer (sonde) med et interval på 32-56 MHz eller op til 70 MHz til billeddannelse af livmoderen eller æggestokken.
- Fastgør sonden, og tænd for maskinen.
- Efter systemstart skal du bruge kontrolpanelet til at logge ind med brugeroplysningerne og få adgang til startskærmen.
- Fra startskærmen skal du gå til fanen Programmer og vælge Musens (lille) mavetilstand.
- Klik på Scan for at vende tilbage til startskærmen, og vent på, at et livebillede vises.
- Vælg B-tilstand fra indstillingerne på venstre værktøjslinje.
- Klik på Flere kontroller for at se yderligere værktøjer til billedforbedring, såsom billedforstærkning og dybde, eller for at justere indstillingerne for klipoptagelse, såsom antallet af billeder pr. Sekund.
- Når billedindstillingerne er valgt, skal du vende tilbage til startskærmen ved at klikke på Scan.
- TændO2-tanken , ret strømmen til induktionskammeret, og indstil strømningshastigheden til 1 l / min.
3. Klargøring af mus til ultralydsscreening, herunder hårfjerning
- Placer en mus i induktionskammeret. Indstil isofluranfordamperen til 2% -3% vol / vol til induktion af anæstesi.
- Bestem den passende dybde af anæstesi ved manglende respons på tåklemme og en respirationsfrekvens omkring 1-2 vejrtrækninger / s.
- Påfør sterilt oftalmisk smøremiddel på hvert øje. Fjern pelsen fra dorsum og ventrum mellem den sidste ribben og bækkenet med klippere af passende størrelse.
- Påfør et tyndt lag hårfjerningscreme på de ventrale og dorsale regioner, der skal afbildes (hvis nødvendigt).
- Placer musen tilbage i induktionskammeret i ca. 3-5 minutter for at opretholde den passende dybde af anæstesi, mens hårfjerningscremen arbejder for at fjerne hårene. Efter ≤4 minutter tørres cremen forsigtigt af med et rent, fugtigt køkkenrulle.
BEMÆRK: Længere eksponering for hårfjerningscreme er irriterende og kan forårsage hudlæsioner.
4. Intraperitoneal injektion af væske for at øge kontrasten mellem organer
- Varm en 3-10 ml sprøjte fyldt med steril isotonisk væskeopløsning (f.eks. steril 0,9% NaCl eller lakterede ringeopløsning) til 35-40 °C ved at placere den mellem en varmepude og en absorberende pude i flere minutter. Placer en flaske ultralydsgel på varmepuden, hvis maskinen ikke har en varmere.
- For en 20-25 g mus injiceres 1-2 ml opløsning i bughulen.
- Fastgør musen ved skrubben i den ene hånd og udsæt ventrummet.
- Hold musen i en ~ 20 ° vinkel, med næsen pegende mod gulvet for at lede organerne kranielt på grund af tyngdekraften.
- Brug en lille gauge nål (25 G, 5/8 i længden, tuberkulin sprøjte), punktering gennem huden og abdominalvæggen i den kaudale højre kvadrant i maven.
- Før injektion af væsker, for at undgå injektion i vaskulaturen eller mave-tarmkanalen, træk tilbage med minimalt tryk. Hvis blod eller andet materiale trænger ind i sprøjten, skal nålen fjernes. Brug en ny nål og sprøjte, og prøv igen i en lidt anden position.
- Hvis musen vågner under injektionerne, skal du placere den tilbage i det lille induktionskammer til anæstesi med 2% -3% vol/vol isofluran.
5. Ultralydsbilleddannelse fra en dorsal tilgang
- Placer musen i ventral liggende stilling på den absorberende pude over en varmepude (figur 2A-C).
- Placer en gnavernæsekegle sikkert over musens næse og næseparti. Bevar bedøvelsesdybden med isofluran leveret gennem næsekeglen ved 1% -2% vol / vol i 100%O2. Påfør sterilt oftalmisk smøremiddel efter behov på hvert øje.
- Overvåg musen for en regelmæssig respirationsfrekvens (1-2 / s) og manglende tåklemmerespons for at indikere, om anæstesien skal justeres.
- Placer en lille mængde (~ 0,5-1 ml) forvarmet ultralydgel abaxial (lateral) til rygsøjlen på hver side af den bedøvede mus mellem det sidste ribben og bækkenet.
- Sæt en lille mængde gel på ultralydssonden.
- Placer sonden parallelt med ryghvirvlerne med sondens forside på kraniesiden. Et indikatormærke er til stede på sondehovedet for at indikere den korrekte sonderetning. Registrer dag, klokkeslæt, dyre-id, sondeorientering og dyreside (højre, venstre, dorsal, ventral) for hvert nyt sæt billeder, der indsamles.
- Med en mus i ventral liggende stilling (dorsum hud, der berører sonden), skal du langsomt scanne området for nyremærket (figur 2B og figur 3). Med nyren i betragtning skal du trække sonden kaudal for at finde æggestokken - en let hyperechoisk oval til rund struktur (figur 4A, B) inden for en meget hyperechoisk ovariefedtpude, der grænser op til kranio-ventralt ved nyrerne og dorso-lateralt ved den dorsale abdominalvæg.
BEMÆRK: Tryk kaudal og lateral til æggestokken kan lede æggestokken tættere på abdominalvæggen og væk fra tarmens sløjfer. Æggestokken er anatomisk placeret op mod den dorsale abdominalvæg, lige ventral og lateral til de epaxiale muskler og kaudale til nyrerne. - Juster signalforstærkningen ved hjælp af skyderen nederst på kontrolskærmen for at forbedre billedkontrasten.
- For at forbedre billeddannelsen af nyrerne skal du trykke med en finger på den kontralaterale mave. Varier trykket og vinklen fra direkte parallel med rygsøjlen til ~ 20 ° ventral.
- Når interesseorganet er synligt, skal du indsamle en video ved at klikke på Gem klip eller Start optagelse og derefter Stop optagelse , når du er færdig for at bevare billeder på et forudindstillet antal rammer.
- Gem enkelte billeder fra enten et levende billede eller optagelse med knappen Gem ramme .
- For at afbilde livmoderen skal du trække sonden kausalt, indtil æggestokken er i det mest kraniale aspekt af synsfeltet. Varier sondens tryk og vinkel, indtil livmoderen er synlig.
- Gentag video- og rammesamling for hvert organ af interesse.
- Find livmoderen, der løber langsgående langs rygvæggen med sidebenmuskulaturen også i betragtning (figur 4B).
BEMÆRK: Livmoderstørrelsen og lumendiameteren kan variere med østrusfasen og sygdomstilstanden. - Overvåg vævet for peristaltisk bevægelse for at differentiere tarmsløjferne fra livmoderens stationære horn.
6. Saml billeder fra en ventral tilgang
- Placer musen i rygliggende stilling, og kontroller, at øjensmøringen er tilstrækkelig, og at næsepartiet er sikkert i næsekeglen (figur 2A).
- Påfør en lille mængde (~ 0,5-1 ml) forvarmet ultralydgel på den ventrale mave, og påfør sonden ved midterlinjen lige kranial af pubis for at lokalisere blæren som et hypoechoisk vartegn (figur 5).
BEMÆRK: Hvis blæren er for stor og skjuler livmoderbilleddannelsen, kan der lægges let tryk på underlivet for at udtrykke urin. - Træk sonden lateralt til blæren for at finde livmoderhornene. Anvend let digitalt tryk fra den ene eller begge sider af musen for at bringe hornene ind i synsfeltet. Hold sonden vinkelret på musen, og scan begge sider af maven for at fange tværgående billeder (tværsnit) af begge horn. Drej sonden for at fange sagittale synspunkter.
- Efter ultralydet skal du tørre musen ren for gel med et papirhåndklæde og returnere det til buret for at komme sig. Mus er helt vågne på 2-5 min. Når den er helt vågen og ambulant, skal du returnere musen til dyrerummet.
BEMÆRK: En varmepude ved lav varme kan placeres under buret for at opvarme buret til genopretning. - Ved det eksperimentelle eller humane endepunkt aflives musen. Ideelt set skal du aflive musen i hjemmeburet for at reducere stress; Alternativt kan du placere musen i et rent kammer. Aflever CO2 under tryk med en forskydningshastighed på 10% -30% af kammerets volumen pr. Minut. Efter ca. 5 minutter uden synlig åndedræt skal du kontrollere døden ved cervikal dislokation. Fortsæt med abdominal obduktion til tumorhøst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten transgene mus med dobbelt deletion (iPAD) blev opretholdt på en blandet genetisk baggrund (129S, BALB/C, C57BL/6), som tidligere beskrevet14. Musene blev alle fodret med et doxycyclinfoder i 2 uger for at inducere Cre-rekombinase. I tidligere arbejde fra vores gruppe blev doxycyclin doseret med sonde14; I denne aktuelle undersøgelse fungerede doxycyclinfødeinduktionsmetoden imidlertid effektivt og reducerede stresset af sonde for musene. Det er vigtigt at kontrollere, at doxycyclinadministrationsmetoden er tilstrækkelig til at inducere Cre-rekombinaseekspressionen, der er nødvendig for at udskille DNA'et for tumorsuppressorer (Arid1a og Pten) i Pax8-ekspressive celler, såsom livmoderen. Immunhistokemi med antistoffer rettet mod ARID1a og pTEN14 blev brugt til at kontrollere, om der blev opnået tilstrækkeligt tumorsuppressorproteintab i livmoderepitelcellerne sammenlignet med det nærliggende stromale væv, som det ses i figur 6. Skematisk af musemodellen og tumorsuppressorekspressionsregulering er vist i figur 1.
Efter 2 ugers behandling med doxycyclin ændrede livmoderen sig ikke signifikant i størrelse sammenlignet med kontrolpersoner eller den samme mus afbildet før administration af doxycyclin. Men i løbet af de næste 2-6 uger efter doxycyclin viste ultralyd, at musene udviklede en række livmoderpatologier, begyndende med hyperplasi og udviklede sig til adenokarcinom. Figur 7A,B viser amerikanske billeder af en muselivmoder med tidlige patologiske ændringer set efter 3 ugers doxycyclinbehandling. Figur 7C,D viser den grove patologi og histopatologi i den samme livmoder afbildet i figur 7A,B, efter at musen blev aflivet umiddelbart efter billeddannelse efter 3 uger. Den mindre (men udvidede) tyndvæggede livmoder og tidlig endometriehyperplasi med bevarelse af det særskilte lumen (central hyperechoisk livmodervæske) kan observeres. Hos mus, der blev aflivet på senere tidspunkter, var livmoderen meget større, havde et mindre lumen og havde en fortykket væg (figur 8 og figur 9). Eksempler på dilateret lumen og subtile ændringer i det hyperplastiske endometrium sammenlignes med tæt væv og nodulær kræftvækst i livmoderen i figur 8 og figur 9. Ultralyd og grove billeder var meget konsistente med hinanden for alle de repræsenterede mus. Figur 9 viser flere livmoderbilleder fra den samme mus i et tidsforløbsstudie og viser de morfologiske ændringer, der blev observeret over 6 uger, efterhånden som adenokarcinom udviklede sig. Figur 5 viser en ventral tilgang med tværsnit af livmoderhornene ved siden af den hypoechoiske blære.
For at øge kontrasten i maven forbedrede injektion af saltvand i bughulen direkte før billeddannelse visualiseringen af abdominale organer, herunder livmoderen og æggestokkene. Figur 3 viser ultralydssammenligninger fra den samme mus før og efter injektion af 1 ml saltvand. Med saltvand var der et øget hypoechoisk rum (sort) mellem organerne, der gjorde det muligt for nyre, fedtpude, æggestok, livmoderhorn, tarme og milt lettere at individualiseres fra hinanden. I alle de andre figurer, der præsenteres her, blev saltvandsinjektioner udført før billeddannelse for at forbedre billedets klarhed.
Samlet set viser denne protokol, at denne inducerbare musemodel udvikler adenokarcinom over en 6 ugers periode og kan overvåges med ultralyd for at etablere en baseline og observere morfologiske ændringer i livmoderen, når kræften udvikler sig. Her er det påvist, at ikke-invasiv ultralyd gør det muligt at vurdere livmoderhornene i en mus serielt over flere uger med billeder, der forudsiger de faktiske livmoderpatologiske ændringer.
Figur 1: Strategi for generering af Pax8-Cre-inducerbare dobbelte KO-transgene mus. (A) Den konstitutive produktion af en omvendt tetracyklinstyret transaktivator (rtTA) i Pax8-ekspressive livmoderepitelceller resulterer i den inducerbare aktivering af Cre-rekombinase, når der er tale om tetracyklin eller dets analoge doxycyclin, ved binding til tetracyklinresponselementer (TRE). Flox-steder placeret opstrøms og nedstrøms for exon 8 (Arid1a) og exon 5 (Pten) er målrettet mod Cre-rekombinase. Cre-målrettet sletning af exon 8 i Arid1a resulterer i en frameshift-mutation og et tidligt stopcodon (p.Gly809Hisfs*6). Cre-målrettet sletning af exon 5 i Pten resulterer i en frameshift-mutation (p.Val85Glyfs * 14). (B) Pax8-rtTA-musen udtrykker en omvendt tetracyklinstyret transaktivator (rtTA) under kontrol af Pax8-promotoren. Denne mus krydses med TetO-Cre-musen, der udtrykker Cre-rekombinase på en tetracyklinafhængig måde. Afkom fra denne krydsning udtrykker en tetracyklin (eller doxycyclin)-aktiveret Cre-rekombinase, der er specifik for Pax8-ekspressive livmoderepitelceller (Pax8-Cre-transaktivator). (C) Arid1a flox/flox-mus på 129S1-baggrunden blev krydset med Pten flox/flox på BALB/C-baggrunden (stamme C;129S4-Ptentm1Hwu/J) for at generere Arid1a flox/flox/Pten flox/flox transrespondermusen. (D) Pax8-Cre-transaktivatormusen krydses med en Arid1a flox/flox/Pten flox/flox Transresponder-mus. Afkom fra denne krydsning resulterer i en transgen murinmodel med en doxycyclininducerbar Arid1a og Pten-deletion (iPAD), der er specifik for livmoderepitelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeddannelsesprocedure . (A) En bedøvet mus med mave- og rygpels fjernet med en klipper og hårfjerningscreme. Musen holdes på inhalationsisofluranbedøvelse via en næsekegle og placeres på en varmepude dækket med en absorberende pude. (B) En lille mængde forvarmet ultralydgel placeres over interesseområdet på musen og på sonden. Her er musen i ventral liggende, og sonden er korrekt placeret for at lokalisere nyrerne, det anatomiske vartegn direkte kranialt til æggestokken. (C) I dorsal liggende kan sonden manuelt manipuleres til først at finde landemærker såsom blæren for at finde den omtrentlige placering af livmoderhornene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forbedring af synlighed og organdefinition ved injektion af saltvand. (A) Billede af en nyre og sløjfer af mavetarmkanalen (nederst til venstre) før IP-injektion af 1,5 ml opvarmet, sterilt saltvand. Den venstre side af billedet er kranial til nyrerne. (B) Billede af nyrerne efter saltvandsinjektionen, der viser øget (hypoechoisk rum, sort) mellem organerne. For begge billeder, hvad angår orienteringen, er musen dorsal overflade op, og kranial til kaudal er venstre mod højre. (C,D) Det fremhævede røde afsnit viser nyremærker i 2D-billederne, der præsenteres i A og B. Billederne er taget med en MS550-transducer. Skalabjælker = 2 mm i hvert billede. Forkortelser: mave-tarmkanalen = mave-tarmkanalen; IP = intraperitoneal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Reproduktionskanal med vartegn . (A) Æggestokken (pilen) er placeret umiddelbart kaudale til kaudale pol i nyrerne. (B) Livmoderhornet (smal pil) er dybt og begynder kraniale til dorsale muskler i det proksimale bagben (pilespids), med æggestokken også i betragtning (større pil). Skalastænger = 2 mm. For alle billederne, hvad angår orientering, er musen dorsal overflade opad, og kranial til kaudal er venstre mod højre. Billederne er taget med en MS550-transducer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Livmoderhorn og blære afbildet fra dorsal liggetid. Ultralydsbilleder fra to mus før kræftinduktion. (A) Blærens lumen er synlig som en hypoechoisk, ovoid struktur med en hyperechoic slimhinde. Begge livmoderhorn er synlige sammen, med grænserne for hver sporet i lyseblå. (B) Det samme billede i en anden mus med en meget fyldigere blære. For begge billeder, hvad angår orientering, er musen ventral overflade op, og billedet tilbage er musen tilbage. Grænserne for hvert livmoderhorn er tegnet i lyseblåt med områder angivet i de tilstødende tekstbokse (MS550-transducer). Vægtstænger = 3 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Eksempler på H&E og immunhistokemi af livmodersektioner 6 uger efter induktion i en iPAD-mus. (A) Repræsentativ H&E af livmodervæv fra iPAD-mus. B) Repræsentativ ARID1a-immunhistokemi. Farvningen viser et tab af Arid1a, der er specifik for kernerne i Pax8-ekspressive livmoderepitelceller (sort pil), med tilbageholdelse af Arid1a i kernerne i livmoderstromale celler (hvid pil). C) Repræsentativ pTEN-immunhistokemi. Farvningen viser et tab af pTEN i cytoplasmaet af Pax 8-ekspressive livmoderepitelceller (sort pil) med tilbageholdelse af pTEN i cytoplasmaet i livmoderstromale celler (hvid pil). Detaljerede IHC-metoder er tidligere offentliggjort14. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: iPAD = inducerbar Pten, Arid1a dobbelt sletning; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Eksempler på ultralydsbilleder fra mus med tidlige ændringer i patologi. (A, B) Antemortem ultralydsbillede af en livmoder fyldt med livmodervæske, der er naturligt hyperechoic De smalle pile angiver livmoderens hypoechoiske, udvidede lumen. Pilespidsen angiver det fortykkede område af livmodervæggen. (C) Groft billede af hele livmoderen fra musen afbildet i B. Den hvide stjerne er omtrent på samme sted som den, der er afbildet i A. (D) I den samme mus blev livmoderen behandlet og farvet med H&E. Histologiafsnittet viser fortykkelse af livmodervæggen på grund af endometriehyperplasi; Eksempelområdet er angivet med en pilespids. For alle de amerikanske billeder, hvad angår retning, er musen dorsal overflade opad, og kranial til kaudal er venstre mod højre (MS550 transducer). Skalastænger = (A,B) 3 mm; D) 500 μm. Forkortelser: US = ultralyd; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Mangfoldighed af livmoderpatologi synlig ved ultralyd . (A) En livmoder med hyperplasi og væskeudspiling, der forårsager luminal dilatation til en diameter på ~ 2,5 mm. (B) En anden livmoder med hyperplasi, der er udspilet i større grad. (C) En livmoder, der både er udvidet og fyldt med en blødt vævsmasse. Skalastænger = 3 mm. For alle billederne er pilene til den ventrale side af livmoderhornet, og med hensyn til billedretningen er musen dorsal overflade opad, og kranial til kaudal er venstre mod højre (MS550 transducer). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Ændringer i livmoderens neoplastiske udvikling over tid i én mus. (A) Ultralydsbillede af en iPAD-mus, der viser nyren (bredere pil), æggestokken (kaudal til nyre) og livmoderen (smal pil), med benmusklen også synlig (pilespids), fanget på tre tidspunkter: efter at musen blev startet på en doxycyclindiæt (uge 0), og derefter igen efter 5 uger og 6 uger. Doxycyclin induceret Cre-ekspression med tumorsuppressortab, som fremmer endometriecancer over tid. (B) De samme ultralydsbilleder som A, men med livmoderhornet fremhævet med rødt. (C) Grove billeder af livmoderen in situ (smal pil) fra 6 ugers tidspunktet; Vævet ses fra den ventrale overflade. D) samme livmoder som i C dissekeret ex vivo Vævet ses fra den ventrale overflade. (E) Histologi af livmodermassen (H&E-plet), hvilket indikerer adenokarcinom fra dette eksempel. For A og B, hvad angår orientering, er musen dorsal overflade opad, og kranial til kaudal er venstre mod højre (MS550 transducer). Skalabjælker = (A,B, de to første billeder i hver række) 1 mm; (A,B, tredje billede) 2 mm; E) 500 μm. Forkortelser: iPAD = inducerbar Pten, Arid1a dobbelt sletning; H&E = hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol undersøger nytten af ultralyd til vurdering af livmodermorfologiske ændringer i progressionen af adenocarcinom i livmoderen hos mus. I denne undersøgelse, ved at følge induktionen af endometriecancer hos mus i længderetningen, viste de anatomiske detaljer detekteret ved ultralyd sig at være indikatorer for grov og histologisk patologi. Dette åbner døren for brugen af langsgående undersøgelser med mindre antal mus overvåget af ultralyd på flere tidspunkter for at følge udviklingen af livmoderkræft hos mus. Denne langsgående detektion blev opnået ved hjælp af en håndholdt sonde og uden brug af ultralydsudstyr til jernbanesystemet. De anvendte højfrekvente sonder (transducere) er bredt tilgængelige, hvilket gør denne tilgang reproducerbar på flere institutioner verden over. Kritiske trin i protokollen inkluderer brug af den korrekte sonde til det opløsningsniveau, der kræves til eksperimentet, og forberedelse af musen til billeddannelse før ultralydet.
Kritiske trin i forberedelsen af musen fjerner alt hår fra undersøgelsesområderne og injicerer væske i bughulen. Pels tilbage på huden kan føre til fangst af bobler i ultralydgelen, som kan producere artefakter i billederne; Derfor skal man sørge for at fjerne håret jævnt over undersøgelsesområdet. Hårfjerningscreme blev valgt som metode til hårfjerning, da den fjerner pelsen jævnt over huden. Skader på huden kan opstå, hvis cremen efterlades på huden i for lang tid (>3-4 min). Hos mus, der er mere følsomme over for hårfjerningscreme, bør cremen kun efterlades på huden i 1-2 minutter for at fjerne håret. Dernæst skal musen tørres af med en række våde papirhåndklæder for helt at fjerne cremen. Når alt håret er fjernet fra undersøgelsesområdet, injiceres sterile, varme isotoniske væsker i det intraperitoneale hulrum for at øge kontrasten og hjælpe med at definere grænserne for abdominale organer. I denne undersøgelse var injektion af 1-2 ml væske tilstrækkelig til at differentiere æggestokken, ovidukten og livmoderhornene. Væsken absorberes gradvist, og det er bedst at injicere umiddelbart før billeddannelse. Mus bliver hurtigt hypotermiske under isofluranbedøvelse. Dette kan forhindres ved at injicere varmt saltvand (opbevares i sprøjter på en varmepude) og ved også at placere musen på en varmepude og forvarme ultralydgelen, når det er muligt. Billeddannelsessessioner med erfarne sonografer kører ved 5-10 min / mus, og med denne korte tid forekom signifikant hypotermi ikke. Om nødvendigt kan op til yderligere 2 ml saltvand injiceres i maven for større adskillelse af organerne.
De metoder, der er beskrevet her, er beregnet til at være let reproducerbare uden specialudstyr ud over ultralydsmaskinen og sonden (erne). I den præsenterede metode manipuleres sonden manuelt hele vejen igennem uden hjælp fra et jernbanesystem. Denne manuelle metode er hurtigere og giver stor fleksibilitet i vinklerne og trykket, der anvendes til at fremhæve små funktioner. Manuel styring af sonderne over maven og brugen af transducere med lavere opløsning kan begrænse kvaliteten af individuelle billeder, der er taget, sammenlignet med billeder fra en transducer, der er fastgjort på skinnesystemet4. Et jernbanesystem ville være nyttigt til injektioner i livmoderen (i fostre) eller intrakardiale injektioner, når der er behov for mere stabilitet. Der er dog en afvejning med hensyn til minimal manipulationstid og øget tilgængelighed for den brede vifte af institutioner, der mangler specialiserede ultralydsfaciliteter. Succesen med denne forenklede metode eksemplificerer, hvordan ultralyd kan bruges til en række undersøgelser. Den foreslåede metode er velegnet til at registrere ændringer i langsgående væv i livmoderkræftmodeller uden krav om dedikeret udstyr og kan anvendes på andre progressive sygdomsmodeller. Manuel manipulation af musene under billeddannelse kan øge variabiliteten i den nøjagtige vævsdybde og placering, men for undersøgelser, der ikke er afhængige af disse faktorer, er billedkvaliteten tilstrækkelig til at detektere patologiske ændringer.
Det er vigtigt at gemme videoer under billeddannelse; Senere på brugerens arbejdsstation kan videoerne stoppes ved enhver ramme, der er repræsentativ for den anatomi, der skal fanges og måles. Billeder af organerne kan måles (diameter, omkreds eller længde) (figur 5, livmoderhornets tværsnit måles), og tumorområdet kan beregnes. Videoer, mere end enkeltbilleder, letter identifikationen af organer i større anatomisk sammenhæng. Videoer er også nyttige til at bestemme bevægelsen af de små og tyktarmen, hvilket kan hjælpe med at skelne tarmene fra livmoderen. Opnåelse af billeder af høj kvalitet afhænger også af kendskab til musens anatomi. Til billeddannelse af den bevægelige livmoder versus billeddannelse af mere stationære væv (f.eks. En implanteret xenografttumor, æggestokke) har brug af den manuelle metode fordelen ved at scanne og følge livmoderhornene fra proksimal til distal. Under scanning kan gradvis justering af håndvinklerne bruges til at følge hornet. MS550-sonden blev brugt til al billeddannelse i denne undersøgelse og foretrækkes til livmoderen sammenlignet med MS700-sonden med højere opløsning, hvilket er bedre for æggestokke. Arbejde ved hjælp af MS700 til at afbilde musens skjoldbruskkirtel er for nylig blevet offentliggjort, der viser den høje opløsning, der er mulig i andre væv15. Håndholdt sondebilleddannelse er nyttig på grund af de varierende grader af vævsdybde i livmoderen mellem æggestokken og blæren. I dette arbejde hjalp bevægelse mellem let genkendelige anatomiske landemærker, såsom nyren og den proksimale bagbensanatomi, med at fange sammenlignelige billeder på tværs af de forskellige tidspunkter, når man afbilder livmoderen fra det dorsale aspekt på kroppen.
Denne ultralydsmetode med høj opløsning til at følge de anatomiske ændringer i livmoderen over tid under tumorigenese er bedre end de nuværende metoder, der involverer aflivning af dyr fra flere kohorter på forskellige tidspunkter. Ultralyd forfiner modellen og reducerer antallet af mus, der er nødvendige til eksperimentet, hvilket reducerer omkostninger og tid. Det er vigtigt, at denne metode gør det muligt at følge sygdomsprogression på individuelt niveau, hvilket kan føre til indsigt, der maskeres i undersøgelser, der er afhængige af kohorter, der ofres efter tidspunkt snarere end sygdomsstadium. På grund af sin ikke-invasive karakter har mus ultralyd mange potentielle anvendelser til forskning i livmoder- eller ovariecancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for finansiering fra NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, postdoktoralt træningsprogram 5T32OD011089 og Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Projektet blev også delvist finansieret af tilskud til løbende udgifter til private højere læreanstalter fra Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
